CN100442053C - 血样特定成分的浓度测量方法及浓度测量装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及含血细胞的血样中的特定成分,例如葡萄糖的浓度测量技术。在本发明中,考虑了上述特定成分从血细胞内向血细胞外扩散的扩散速度,计算得出上述特定成分的浓度。在理想情况下,扩散速度(V)可如下式(1)所示的米-门方程式所示,V=VmaxΔS/(Km+ΔS)(1);在式(1)中,Vmax是特定成分从血细胞内部向外部扩散的可能的最大膜透过速度,Km是米凯利斯常数(V=Vmax/2时的ΔS值),ΔS是血细胞内外特定成分的浓度差。
Description
技术领域
本发明涉及含血细胞的血样特定成分,如葡萄糖的浓度测量技术。
背景技术
测量血样中的特定成分,例如葡萄糖浓度的方法,有称为电极法的方法。该方法是将与血样中的葡萄糖浓度相关的信息输出到与血样接触的电极,根据该输出值计算葡萄糖浓度。电极法大致分为平衡点法(端点法)和微分法(速率法)。平衡点法根据来自电极的输出随时间的变化趋近某一定值时的平衡值计算葡萄糖浓度。而微分法根据输出值n次微分(n为正整数)后的极大值计算葡萄糖浓度。
已知,在一般的电极法中,当将含血细胞的全血用作血样时,测量值会因受血细胞的影响而偏低。所以,在测量血液中的葡萄糖浓度时,人们将全血离心分离后除去血细胞后的血浆(或血清)用作血样。使用该方法时,为调制血样需进行离心分离,所以不仅操作复杂,而且还存在着包括调制试样在内的整个测量操作所需时间延长的问题。为解决该问题,曾有人想出了将平衡点法的计算结果与微分法的计算结果相关联的方法(例如参照日本特公平7-37991号公报、日本特开平9-33533号公报以及日本特公平9-318634号公报)。
日本特公平7-37991号公报所揭示的方法着眼于全血稀释后的样品用作血样时因血细胞的存在而导致的表观稀释率与实际稀释率的差异。采用该方法的前提是,在微分法中计算葡萄糖浓度时,至达到与极大值相应的输出为止的期间内,从血细胞内向血细胞外扩散的葡萄糖量小至可忽略不计。而日本特开平9-33533号公报和日本特公平9-318634号公报所揭示的方法则考虑到了在微分法中计算葡萄糖浓度时至达到与极大值相应的输出为止的期间内扩散到血细胞外的葡萄糖的总量。在向血细胞外扩散的葡萄糖总量与血细胞密度(红细胞比例)之间建立联系。
但上述任一方法均仅将测量精度差的原因归因于血细胞密度。结果,在现有技术中,当血液中的葡萄糖浓度较低时(例如400mg/dL),使用血浆(或血清)测量葡萄糖浓度时的相关程度高。而在血液中的葡萄糖浓度较高时(例如500mg/dL),使用血浆(或血清)测量葡萄糖浓度时的相关程度低,测量值有偏低的趋势。故就上述方法中的高浓度区域的测量精度及测量范围而言,还有改善的余地。
发明内容
本发明的目的在于,无需离心分离等复杂操作,就能在高浓度区域(例如,具体到葡萄糖为500mg/dL左右)以高精度测量含血细胞的血样中的特定成分(例如葡萄糖)的浓度,并确保较较大量程。
本发明人等为解决上述问题,进行了深入的研究。结果,本发明人等发现:从血细胞内向血细胞外的葡萄糖等特定成分的扩散是以血细胞膜为介质的输送,即促进扩散,从而完成本发明。而促进扩散的扩散速度与血细胞膜的扩散能力相关。所以,特定成分,例如葡萄糖向血细胞外扩散的速度不是与血细胞内外的浓度差成正比的单纯扩散,而是有极限值。即,当血细胞内外的特定成分的浓度差达到某一定值以上时,无论特定成分的浓度差的大小是多少,可实现血细胞内的特定成分,例如葡萄糖向血细胞外(血浆中)扩散的速度为定值。所以,求取向血细胞外扩散的特定成分,例如葡萄糖的总量时,仅考虑与血细胞量(血细胞密度)相关是不够的,而还需考虑血细胞膜对特定成分,例如葡萄糖的输送能力。当扩散速度为极限值或在接近极限值的高浓度区域内,就更需考虑这一点。
所以,本发明提供了一种在含血细胞的血样中从血细胞内向血细胞外扩散的特定成分的浓度测量方法,将上述特定成分从血细胞内向血细胞外扩散的扩散速度V与下式(1)所示的米-门方程式相关联,计算得出上述特定成分的浓度。
V=VmaxΔS/(Km+ΔS)…(1)
在式(1)中,Vmax是特定成分从血细胞内部向外部扩散的可能的最大膜透过速度,Km是米凯利斯常数(V=Vmax/2时的ΔS值),ΔS是血细胞内外特定成分的浓度差。
本发明的浓度测量方法,可适用于浓度测量,其典型例为葡萄糖浓度的测量,另外,还可适用于钾离子或LDH(乳酸脱氢酶)等存在于血细胞内的成分的浓度的测量。
本发明的浓度测量方法,包括:经例如传感器部得到与上述得失电子量相关的输出值,并根据该输出值随时间变化趋近某一定值时的平衡值,计算平衡点法葡萄糖浓度(CEP)的第1步骤(相当于平衡点法);根据将上述输出值随时间变化的曲线进行了n次微分(n为正整数)后的极大值计算微分法葡萄糖浓度(CDI)的第2步骤(相当于微分法);使用所述平衡点法葡萄糖浓度(CEP)、所述微分法葡萄糖浓度(CDI)和所述式(1)计算最终葡萄糖浓度(CGL)的第3步骤。第2步骤的微分次数优选为1次或2次。
在本发明中,最终葡萄糖浓度计算值(CGL)例如是根据将最终的葡萄糖浓度计算值(CGL)和根据上述平衡值计算的平衡点法葡萄糖浓度(CEP)之间的差值(CGL-CEP),与根据上述平衡值计算的平衡点法葡萄糖浓度(CEP)和根据上述极大值计算的微分法葡萄糖浓度(CDI)之间的差值(CEP-CDI)建立联系的计算式计算而得。
具体而言,最终葡萄糖浓度计算值(CGL)是根据例如扩散速度(V)与下式(2)相关联的下式(2)而得。
CGL=Km{b-(CEP-CDI)}/{(CEP-CDI)-b-aVmax}+CEP …(2)
式(2)中的a和b为常数。
本发明提供了一种血样中的葡萄糖的浓度测量方法,用于测量含血细胞的血样中的葡萄糖浓度,其特征在于,包括:
得到与葡萄糖和传感器部之间的得失电子量相关的输出值,并根据所述输出值随时间的变化趋近某一定值时的平衡值计算平衡点法葡萄糖浓度CEP的第1步骤;
根据将所述输出值随时间变化的曲线进行了n次微分后的极大值计算微分法葡萄糖浓度CDI的第2步骤,其中,n为正整数;和
根据下式(2)计算最终葡萄糖浓度CGL的第3步骤;
CGL=Km{b-(CEP-CDI)}/{(CEP-CDI)-b-aVmax}+CEP …(2)
式(2)中的a和b为常数,Vmax是葡萄糖能够从血细胞内部向外部扩散的最大膜透过速度,Km是米凯利斯常数,在CGL=Vmax/2时是CEP-CDI值。
本发明的浓度测量方法,根据例如葡萄糖和检测介质之间的得失电子量计算葡萄糖浓度。检测介质在例如电极法中适于电极本身或含电极的葡萄糖传感器,在比色法中适于色素等显色剂。在电极法中,检测介质的输出例如可由给检测介质施加刺激(例如施加电学物理量(电压等)时的响应值(例如电学物理量(电流值等))而得。而在比色法中,检测介质(显色剂)的输出可由向检测介质(显色剂)照射光后的反射光或透过光的光量而得。
本发明还提供一种浓度测量装置,用于测量含血细胞的血样中的葡萄糖的浓度,具有:用于测量反映上述葡萄糖浓度的响应值的测量机构;提取上述响应值趋近某一定值时的平衡值,根据该平衡值计算平衡点法葡萄糖浓度(CEP)的计算机构,其特征在于,上述计算机构提取上述响应值随时间变化曲线的n次微分(n为正整数)后的n次微分的极大值,根据该极大值计算微分法葡萄糖浓度(CDI),并按下式(3)计算最终的葡萄糖浓度(CGL)。
CGL=Km{b-(CEP-CDI)}/{(CEP-CDI)-b-aVmax}+CEP…(3)
式(3)中的a和b为常数,Vmax是葡萄糖能够从血细胞内部向外部扩散的最大膜透过速度,Km是米凯利斯常数(CGL=Vmax/2时的(CEP-CDI)值)。
本发明的分析装置的结构需可适用于浓度测量,其典型例为葡萄糖浓度的测量,另外也可适用于钾离子或LDH(乳酸脱氢酶)等浓度的测量。
测量机构测量例如葡萄糖和检测介质之间的得失电子量。测量机构测量给检测介质施加刺激(例如电位差)时的响应值(电流值)。具体而言,测量机构具有固定了例如氧化还原酶的传感器部和用于测量电流值的电流测量部。
测量机构还可将显色剂用作检测介质,利用光学方法测量响应值。
另外,在本发明中,只要未特别限定,则言及血样时,就至少包括全血、全血稀释液、全血离心分离后的上清液,该上清液的稀释液。
附图说明
图1为本发明的葡萄糖浓度测量装置的简要结构示意图。
图2为图1所示葡萄糖浓度测量装置的框图。
图3为图1和图2所示测量单元中测得电流值随时间变化和电流值一次微分值随时间变化的示意图。
图4为血浆葡萄糖浓度(CGL)、由平衡点法算得的葡萄糖浓度(CEP)和由(一次)微分法算得的葡萄糖浓度(CDI)、血细胞密度(Hct)之间关系的示意图。
图5为血浆葡萄糖浓度的由各算式算得的葡萄糖浓度之间的相关性的示意图。
具体实施方式
图1所示葡萄糖浓度测量装置1使用全血测量葡萄糖浓度,用于在测量单元2中得到与含血细胞的血样(全血稀释液)中的葡萄糖浓度相应的信息。测量单元2具有反应槽20、传感器部21、电源22和电流值测量部23。
反应槽20不仅用于提供全血与缓冲液混合调制血样的场所,还提供使血样所含葡萄糖与传感器部21接触的场所。在葡萄糖浓度测量装置1中,全血和缓冲液自动地向反应槽20输送,由反应槽20排出结束测量后的血样(废液)。在葡萄糖浓度测量装置1中,先向反应槽输送缓冲液,然后输送全血。向反应槽20输送全血通过采样器(图示略)的喷嘴30进行。全血供给量设为例如4~20μL。向反应槽20供给缓冲液利用泵31的动力进行,而由反应槽20排出废液则利用泵32的动力进行。通过开闭阀33选择可向反应槽20供给缓冲液的状态和不能供给的状态,而通过开闭阀34选择可从反应槽20排出废液的状态和不能排出的状态。
反应槽20中设有搅拌子35。该搅拌子35用于在向反应槽20输送了缓冲液和全血后对其进行搅拌混合,它由起动器36带动旋转。
传感器部21用于输出与血样中的葡萄糖的得失电子量相应的电学物理量,并可重复使用。该传感器部21具有例如未图示的酶固定层和电极。酶固定层含有例如葡糖氧化酶(GOD)或葡糖脱氢酶(GOH)。另外,电极结构可根据酶固定层中所含酶的种类而选择。例如,当酶使用GOD时,电极使用过氧化氢电极。
电源22用于向传感器部21的电极加电压。电源22可使用例如直流电源,电极所加电压设为例如100~500mV。
电流值测量部23用于测量传感器部21的电极与葡萄糖之间的得失电子量,当作电流值。当考虑酶使用GOD、电极使用过氧化氢电极的情况时,在传感器部21的酶固定层,因GOD的作用而使葡萄糖分解为葡萄糖酸和过氧化氢。过氧化氢因加在传感器部21电极上的电压而被还原,向阳极供电子而分解为氧离子和氢离子。此时,利用输送到阳极的电子而在阳极和阴极之间产生电流,由电流测量部23测定此时的电流。将向反应槽20供给全血的时刻设作0点,则在电流测量部23,测得电流如图3所示的时程。
如图2所示,葡萄糖浓度测量装置1还具有控制部4和计算部5。
控制部4用于控制各部动作。具体而言,控制部4用于控制喷嘴30的移动和全血的吸引排出动作、泵31和32的动作、阀33和34的动作和起动器36(搅拌子35(参照图1)的转动或不转动)。该控制部4还控制测量单元2的动作。具体而言,控制部4控制图1所示电源22,选择给传感器21的电极施加或不加电压的状态,并控制电流值测量部23,以控制测量电流值的时机。由控制部4控制测量动作,使电流值测量部23以例如50~200μsec的间隔反复测量电流值。
另外,图2所示计算部5用于根据电流值测量部23(参照图1)的测量结果计算全血中的葡萄糖浓度。该计算部5储存了计算所需的程序,其动作由控制部4控制。在本实施方式中,计算部5根据下式(4)所示算式计算全血中的葡萄糖浓度(CGL)。
CGL=Km{b-(CEP-CDI)}/{(CEP-CDI)-b-aVmax}+CEP (4)
式(4)中,CEP为平衡点法中算得的葡萄糖浓度,CDI为微分法中算得的葡萄糖浓度,Km为米凯利斯常数(V=Vmax/2时的(CEP-CDI)值),Vmax是特定成分从血细胞内部向外部扩散的可能的最大膜透过速度,a和b为常数。
式(4)不仅是平衡点法和微分法的组合算式,而且还考虑到了葡萄糖向血细胞外扩散的速度。现对平衡点法和微分法进行简单说明,并对算式(4)的计算根据进行说明。
在图1所示的电流值测量部23中,可观察到如图3所示时程的电流。具体而言,电流值(I)在图1所示的反应槽20内供给了待测物的时刻开始上升,经一定时间后趋近平衡值(EP)。平衡值(EP)的大小与待测物中的葡萄糖浓度相关。所以,通过先期研究表示平衡值(EP)与葡萄糖浓度之间关系的测量线,就可根据平衡值(EP)计算葡萄糖浓度。这就是平衡点法。而微分法是根据电流时程n次微分后的极大值计算葡萄糖浓度。例如,图3表示了电流值的一次微分值(dI/dt)的时程,该时程的极大值(DI)与电流值(I)的变化速度的最大值、即反应初始速度的最大值相应。由于该最大值与葡萄糖浓度相关,所以在一次微分法中,可根据一次微分值(dI/dt)的极大值(DI)计算葡萄糖浓度。
但平衡点法和微分法具有受全血的血细胞比例,即血细胞密度(Hct)影响的问题。即,如图4所示,全血的血细胞比例(Hct)愈大,则由平衡点法算得的葡萄糖浓度(CEP)和由(一次)微分法算得的葡萄糖浓度(CDI)就愈偏离血浆中的葡萄糖浓度(葡萄糖实际浓度)(CGL)。与平衡点法相比,微分法比的这一趋势更明显。
平衡点法和微分法中受Hct的影响的理由有,例如,将全血稀释后的表观稀释率与实际稀释率不同,Hct愈大,则稀释率差异愈大。根据该理由,可解释为何Hct愈大,计算值与实际值的偏差愈大。但尚不能充分解释,为何与平衡点法相比,微分法易受Hct的影响。
如果考虑平衡点法与微分法的不同,上述方法的较大不同点可举出用于计算的电流值的取样时机。即,由图3可知,平衡点法是在电流值(I)达到平衡值(EP)的时刻取计算用电流值(EP),而微分法是在电流值(I)上升时刻取计算用电流值(一次微分值(dI/dt))。
这种取样时机的不同,表现为从血细胞内向血细胞外扩散的葡萄糖量的不同。所测电流值为存在于血细胞外的葡萄糖向传感器部21输送的电子,存在于血细胞外的葡萄糖的量为本来存在于血细胞外的葡萄糖和从血细胞内向血细胞外扩散的葡萄糖的总和。所以,如测量电流值的时机不同,则从血细胞内向血细胞外扩散的葡萄糖对测得电流值的影响程度也不同。
因此,基于不同电流值取样时机的平衡点法与微分法之间的差值(CEP-CDI)可表示为扩散速度的函数。如下式(5)所示,暂假设计算值之差(CEP-CDI)为扩散速度(V)的一次函数。如图4点划线所示,因计算值之差(CEP-CDI)与Hct成正比,故可知该假设成立。
CEP-CDI=aV+b (5)
另外,在式(5)中,a和b为常数,该常数的其中一个作用就是修正葡萄糖浓度测量装置1制造时产生的各制品间的误差,如传感器21的灵敏度误差和测量单元2的电路系统(如电流值测量部23)的误差。常数a和b可由试差法求得,例如假设0.5≤a≤2.0、-10≤b≤10的范围内。而对葡萄糖向血细胞外的扩散进行研究后可知,葡萄糖向血细胞外的扩散速度不与血细胞内外的葡萄糖的浓度之差成正比,最大速度有极限。已知,葡萄糖向血细胞外的扩散速度一般与米凯利斯式相关的。所以,将下式(6)所示米凯利斯式代入式(5)后整理,即得到上述式(4)。而将式(6)代入式(5),得到ΔS=CGL-CEP。
V=VmaxΔS/(Km+ΔS)(6)
在本发明中,在考虑到血细胞中所含葡萄糖向血细胞外扩散的速度的情况下,计算最终葡萄糖浓度。为此,在本发明中,无论血细胞内外的葡萄糖浓度差的大小是多少,均能进行恰当反映了葡萄糖向血细胞外的扩散量的计算。结果,即使是高浓度血样,也可进行高精度的浓度测量,并可确保较大的量程。这一点可由后述实施例证明。
本发明不仅限于上述实施方式,还可有各种变形。即,本发明关键在于考虑到特定成分(如葡萄糖)向血细胞外的扩散速度,而计算式的扩散速度的考虑方法可进行各种变换。例如,也可将平衡点法和微分法的计算值之差(CEP-CDI)表示为扩散速度的二次及其以上的高次函数或其它函数,得到计算式。而也可采用不同于米凯利斯式的算式,作成与葡萄糖向血细胞外的扩散速度(V)相关的公式。而在建立扩散速度(V)与米凯利斯式的关系时,ΔS除可由CGL-CEP求得,也可由例如ΔS=k(CGL-CEP)(k为常数),或ΔS=(CGL-CDI)求得。
在上述葡萄糖浓度测量装置1中,测量单元2的传感器部21可利用电极法而反复使用,但只要是用于得到与血样中的葡萄糖浓度相关的输出的结构,就不必限于上述的测量单元2的结构。例如,本发明也可用在使用一次性葡萄糖传感器测量葡萄糖浓度的情况下,或利用比色测量葡萄糖浓度的情况下。
当然,本发明也可用于测量葡萄糖之外的血细胞所含特定成分,例如钾离子或LDH(乳酸脱氢酶)的浓度。
实施例
下面,就来证明根据式(4)计算而得的葡萄糖浓度,即使在较高浓度区域与血浆中的葡萄糖浓度的相关性也很好,且可由利用式(4)的计算方法确保较大量程。
在本实施例中,对不同葡萄糖浓度的多种全血,按照式(4)(本发明计算式)、下式(7)(现有技术计算式)和平衡点法测量了葡萄糖浓度。其中,在式(4)中,a=0.97、b=-4、Km=150.6、Vmax=224.7,式(7)中,a=0.68、b=5.07。
CGL=CEP+a×(CEP-CDI)+b (7)
另外,为便于对比,对上述多种全血进行由离心分离得到的血浆的葡萄糖浓度的测定。而血浆的葡萄糖浓度使用日本爱科来株式会社制GA-1160进行测量。而根据使用GA-1160测得的电流值,对式(4)(本发明计算式)、式(7)(现有技术计算式)以及平衡点法的计算所需的平衡值(EP)和极大值(DI)进行取值。
各测量方法的测量结果示于图5。由该图可知,根据平衡点法算得的葡萄糖浓度与血浆的葡萄糖浓度有很大偏差。由式(7)(现有技术的计算式)算得的葡萄糖浓度与平衡点法相比,与血浆的葡萄糖浓度的相关性高,但在高浓度(500mg/dL左右)范围内,葡萄糖浓度愈高,与血浆葡萄糖浓度的偏差越大。反之,根据式(4)(本发明的计算式)计算而得的葡萄糖浓度包括在高浓度区域内,与血浆的葡萄糖浓度的相关性也很高。由此可知,根据式(4)(本发明的计算式)求得的葡萄糖浓度,不仅可提高高浓度范围的测量精度,且可确保较大量程。
Claims (9)
1.一种血样中的葡萄糖的浓度测量方法,用于测量含血细胞的血样中的葡萄糖浓度,其特征在于,包括:
通过传感器部得到与葡萄糖和所述传感器部之间的得失电子量相关的输出值,并根据所述输出值随时间的变化趋近某一定值时的平衡值计算平衡点法葡萄糖浓度CEP的第1步骤;
根据将所述输出值随时间变化的曲线进行了n次微分后的极大值计算微分法葡萄糖浓度CDI的第2步骤,其中,n为正整数;和
根据下式(2)计算最终葡萄糖浓度CGL的第3步骤;
CGL=Km{b-(CEP-CDI)}/{(CEP-CDI)-b-aVmax}+CEP …(2)
式(2)中的a和b为常数,Vmax是葡萄糖能够从血细胞内部向外部扩散的最大膜透过速度,Km是米凯利斯常数,在CGL=Vmax/2时是CEP-CDI值。
2.如权利要求1所述的血样中的葡萄糖的浓度测量方法,其特征在于,所述第2步骤的n次微分值采用1次或2次微分的微分值。
3.如权利要求1所述的血样中的葡萄糖的浓度测量方法,其特征在于,所述传感器部的输出值由给所述传感器部施加刺激时的响应值而得。
4.如权利要求3所述的血样中的葡萄糖的浓度测量方法,其特征在于,以电位差的形式施加所述刺激,得到的所述响应值为电流值。
5.如权利要求1所述的血样中的葡萄糖的浓度测量方法,其特征在于,所述血样为全血稀释后的试样。
6.一种浓度测量装置,用于测量含血细胞的血样中的葡萄糖的浓度,具有:
用于测量反映所述葡萄糖浓度的响应值的测量机构;和
提取所述响应值趋近某一定值时的平衡值,根据该平衡值计算平衡点法葡萄糖浓度CEP的计算机构,其特征在于,
所述计算机构提取所述响应值随时间变化曲线的n次微分后的极大值,其中,n为正整数,根据该极大值计算微分法葡萄糖浓度CDI,并按下式(3)计算最终的葡萄糖的浓度CGL,
CGL=Km{b-(CEP-CDI)}/{(CEP-CDI)-b-aVmax}+CEP …(3)
式(3)中的a和b为常数,Vmax是葡萄糖能够从血细胞内部向外部扩散的最大膜透过速度,Km是米凯利斯常数,在CGL=Vmax/2时是CEP-CDI值。
7.如权利要求6所述的浓度测量装置,其特征在于,
所述测量机构具有固定了氧化还原酶的传感器部和用于测量电流值的电流测量部,
所述测量机构测量所述响应值,以得出葡萄糖和所述传感器部之间的得失电子量。
8.如权利要求7所述的浓度测量装置,其特征在于,所述测量机构测量给所述传感器部施加刺激时的所述响应值。
9.如权利要求8所述的浓度测量装置,其特征在于,所述测量机构施加的所述刺激为电位差,测量的所述响应值为电流值。
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