JPH09281107A - 抗原又は抗体測定用試薬の製造方法 - Google Patents
抗原又は抗体測定用試薬の製造方法Info
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- JPH09281107A JPH09281107A JP8836796A JP8836796A JPH09281107A JP H09281107 A JPH09281107 A JP H09281107A JP 8836796 A JP8836796 A JP 8836796A JP 8836796 A JP8836796 A JP 8836796A JP H09281107 A JPH09281107 A JP H09281107A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 検体試料中の微量成分の測定に際し抗原抗体
反応の進行を安定化させ、かつ、被測定物質の濃度に対
する不溶性担体凝集による吸光度もしくは散乱光強度の
増加率を一定に保ったまま、より広い測定範囲を持った
抗体又は抗原測定用試薬を製造する方法を提供する。 【解決手段】 不溶性担体が分散された懸濁液中で、該
不溶性担体に抗原又は抗体を担持する際に、上記抗原又
は抗体と非イオン性又は陰イオン性界面活性剤とを該不
溶性担体に同時に接触させること、及び、上記界面活性
剤の上記濃度が０．０００５〜０．１ｍｇ／ｍｌである
ことを特徴とする抗原又は抗体測定用試薬の製造方法で
ある。
反応の進行を安定化させ、かつ、被測定物質の濃度に対
する不溶性担体凝集による吸光度もしくは散乱光強度の
増加率を一定に保ったまま、より広い測定範囲を持った
抗体又は抗原測定用試薬を製造する方法を提供する。 【解決手段】 不溶性担体が分散された懸濁液中で、該
不溶性担体に抗原又は抗体を担持する際に、上記抗原又
は抗体と非イオン性又は陰イオン性界面活性剤とを該不
溶性担体に同時に接触させること、及び、上記界面活性
剤の上記濃度が０．０００５〜０．１ｍｇ／ｍｌである
ことを特徴とする抗原又は抗体測定用試薬の製造方法で
ある。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は不溶性担体に抗体又
は抗原を担持させ、抗原抗体反応による該担体の凝集の
程度を検出することにより該抗体又は抗原に対応する抗
原又は抗体を測定するための試薬の製造方法に関するも
のである。
は抗原を担持させ、抗原抗体反応による該担体の凝集の
程度を検出することにより該抗体又は抗原に対応する抗
原又は抗体を測定するための試薬の製造方法に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】従来、血液や尿などの体液中の蛋白質や
脂質等、例えば、Ｂ型肝炎ウィルス、癌胎児性抗原、ヒ
ト免疫不全ウィルス、Ｃ−反応性蛋白質、Ｂ型肝炎ウィ
ルス抗体、ヒト免疫不全ウィルス抗体、リウマチ因子、
抗ストレプトリジン−Ｏ、等免疫学的に抗原又は抗体に
属する物質の測定に、ラテックス担体のような不溶性担
体に該抗原又は抗体に対応する抗体又は抗原を担持さ
せ、抗原抗体反応による該担体の凝集の程度を検出する
ことにより該抗原又は抗体（以下、被測定物質という）
を測定する試薬が一般的に使用されている。
脂質等、例えば、Ｂ型肝炎ウィルス、癌胎児性抗原、ヒ
ト免疫不全ウィルス、Ｃ−反応性蛋白質、Ｂ型肝炎ウィ
ルス抗体、ヒト免疫不全ウィルス抗体、リウマチ因子、
抗ストレプトリジン−Ｏ、等免疫学的に抗原又は抗体に
属する物質の測定に、ラテックス担体のような不溶性担
体に該抗原又は抗体に対応する抗体又は抗原を担持さ
せ、抗原抗体反応による該担体の凝集の程度を検出する
ことにより該抗原又は抗体（以下、被測定物質という）
を測定する試薬が一般的に使用されている。
【０００３】従来、このような担体の凝集を検出して被
測定物質を測定する試薬においては、通常、反応液中の
不溶性担体の凝集による吸光度の増加を光学密度（以下
「Ｏ．Ｄ．」という）で測定し、Ｏ．Ｄ．と被測定物質
量との関係を表す検量線を予め作成し、この検量線を用
いて未知量の被測定物質を定量している。
測定物質を測定する試薬においては、通常、反応液中の
不溶性担体の凝集による吸光度の増加を光学密度（以下
「Ｏ．Ｄ．」という）で測定し、Ｏ．Ｄ．と被測定物質
量との関係を表す検量線を予め作成し、この検量線を用
いて未知量の被測定物質を定量している。
【０００４】このＯ．Ｄ．による測定において、短時間
で高感度かつ広範囲な測定を可能にするためにポリエチ
レングリコール、ポリビニルピロリドン等の合成高分子
物質、デキストラン［特開昭５９−２２０４６号公報参
照］、デキストラン硫酸［特開平２−６１５６１号公報
参照］等の多糖類、マルトトリオース重合体［特開平６
−１６７４９３号公報参照］といった凝集促進剤を添加
する試みがなされている。
で高感度かつ広範囲な測定を可能にするためにポリエチ
レングリコール、ポリビニルピロリドン等の合成高分子
物質、デキストラン［特開昭５９−２２０４６号公報参
照］、デキストラン硫酸［特開平２−６１５６１号公報
参照］等の多糖類、マルトトリオース重合体［特開平６
−１６７４９３号公報参照］といった凝集促進剤を添加
する試みがなされている。
【０００５】これらの凝集促進剤によりＯ．Ｄ．の増加
率は上昇するが抗原抗体凝集塊が反応溶液中で不均一に
成長すると、時に非特異的な凝集を起こし、誤った測定
値を与えることがある。また、吸光度の増加が被測定物
質の濃度に対して直線的に伸びていても、光学的測定機
器の測定上限付近（一般の光学的測定機器において吸光
度の測定上限はＯ．Ｄ．＝３付近である）になると、被
測定物質の濃度が高くなっても、それに伴った吸光度の
増加を光学的測定機器では検出できず、検量線が頭打ち
の状態となり、測定上限以上の吸光度では吸光度変化に
よって被測定物質の濃度を測定することは難しい。
率は上昇するが抗原抗体凝集塊が反応溶液中で不均一に
成長すると、時に非特異的な凝集を起こし、誤った測定
値を与えることがある。また、吸光度の増加が被測定物
質の濃度に対して直線的に伸びていても、光学的測定機
器の測定上限付近（一般の光学的測定機器において吸光
度の測定上限はＯ．Ｄ．＝３付近である）になると、被
測定物質の濃度が高くなっても、それに伴った吸光度の
増加を光学的測定機器では検出できず、検量線が頭打ち
の状態となり、測定上限以上の吸光度では吸光度変化に
よって被測定物質の濃度を測定することは難しい。
【０００６】吸光度の増加率を一定に保ったまま、より
広い測定範囲を持った抗体又は抗原測定用試薬を得るた
めに、抗体又は抗原に不溶性担体を担持させた後、この
不溶性担体に非イオン性又は陰イオン性界面活性剤を接
触させる方法［特開平７−１２８１３号公報参照］が提
案されている。
広い測定範囲を持った抗体又は抗原測定用試薬を得るた
めに、抗体又は抗原に不溶性担体を担持させた後、この
不溶性担体に非イオン性又は陰イオン性界面活性剤を接
触させる方法［特開平７−１２８１３号公報参照］が提
案されている。
【０００７】しかしこの提案方法も、微量成分の測定に
際し抗原抗体反応を均一に進行させるにはまだ十分では
なかった。
際し抗原抗体反応を均一に進行させるにはまだ十分では
なかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記問題点に
鑑みてなされたものであり、その目的は、検体試料中の
微量成分の測定に際し抗原抗体反応の進行を安定化さ
せ、かつ、被測定物質の濃度に対する不溶性担体凝集に
よる吸光度もしくは散乱光強度の増加率を一定に保った
まま、より広い測定範囲を持った抗体又は抗原測定用試
薬を製造する方法を提供することである。
鑑みてなされたものであり、その目的は、検体試料中の
微量成分の測定に際し抗原抗体反応の進行を安定化さ
せ、かつ、被測定物質の濃度に対する不溶性担体凝集に
よる吸光度もしくは散乱光強度の増加率を一定に保った
まま、より広い測定範囲を持った抗体又は抗原測定用試
薬を製造する方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明による、抗原又は
抗体測定用試薬の製造方法は、不溶性担体が分散された
懸濁液中で、該不溶性担体に抗原又は抗体を担持する際
に、上記抗原又は抗体と非イオン性又は陰イオン性界面
活性剤とを該不溶性担体に同時に接触させること、及
び、上記界面活性剤の上記濃度が０．００１〜０．１ｍ
ｇ／ｍｌであることを特徴とする方法である。
抗体測定用試薬の製造方法は、不溶性担体が分散された
懸濁液中で、該不溶性担体に抗原又は抗体を担持する際
に、上記抗原又は抗体と非イオン性又は陰イオン性界面
活性剤とを該不溶性担体に同時に接触させること、及
び、上記界面活性剤の上記濃度が０．００１〜０．１ｍ
ｇ／ｍｌであることを特徴とする方法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明において使用される不溶性
担体としては、従来、抗体又は抗原が担持された不溶性
担体の凝集により抗原又は抗体測定を行うのに使用され
る物質がいずれも使用可能であり、例えば、無機物質粉
末、有機高分子物質粉末、微生物、血球、細胞片などが
挙げられる。無機物質としては、金、チタン、鉄、ニッ
ケル等の金属；アルミナ、チタニア等の金属酸化物；シ
リカ等が挙げられる。有機高分子としては、特に限定さ
れないが、例えば、スチレン重合体、スチレン−スチレ
ンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリ
ル酸重合体、アクリルニトリル−ブタジエン−スチレン
共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、
酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられ
る。特に、これらの重合体粉末を水に均一に懸濁させた
ラテックス粒子が好ましい。該ラテックス粒子の平均粒
径は、好ましくは０．０５〜１．０μｍ、より好ましく
は０．０５〜０．５μｍである。
担体としては、従来、抗体又は抗原が担持された不溶性
担体の凝集により抗原又は抗体測定を行うのに使用され
る物質がいずれも使用可能であり、例えば、無機物質粉
末、有機高分子物質粉末、微生物、血球、細胞片などが
挙げられる。無機物質としては、金、チタン、鉄、ニッ
ケル等の金属；アルミナ、チタニア等の金属酸化物；シ
リカ等が挙げられる。有機高分子としては、特に限定さ
れないが、例えば、スチレン重合体、スチレン−スチレ
ンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリ
ル酸重合体、アクリルニトリル−ブタジエン−スチレン
共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、
酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられ
る。特に、これらの重合体粉末を水に均一に懸濁させた
ラテックス粒子が好ましい。該ラテックス粒子の平均粒
径は、好ましくは０．０５〜１．０μｍ、より好ましく
は０．０５〜０．５μｍである。
【００１１】本発明で使用される非イオン性界面活性剤
としては、例えば、ポリオキシエチレン−ソルビタン−
モノラウレート（例えば、商品名Tween 20；Atlas Powd
erCo．社製）、ポリオキシエチレン−ソルビタン−モノ
オレエート（例えば、商品名Tween 80；Atlas Powder
Co．社製）、アルキルポリエーテル−アルコール混合物
（例えば、商品名Triton；Rohm and Haas Co．社製）、
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（例えば、商品名
Brij 35 ；Atlas Powder Co．社製）、ポリオキシエチ
レン−オクチルフェノールエーテル（例えば、商品名No
n −IdetP −40）、ポリエチレンオキシド−アルキルエ
ーテル付加物（例えば、商品名LubrolPX ；Ｉ．Ｃ．
Ｉ．社製）、オキシエチレン単位１０個を有するＣ−１
６，Ｃ−１８脂肪族アルコール（例えば、商品名Berol
EMU 043 ）等が挙げられ、陰イオン性界面活性剤として
は、例えば、ナトリウムドデシルサルフェートが挙げら
れる。
としては、例えば、ポリオキシエチレン−ソルビタン−
モノラウレート（例えば、商品名Tween 20；Atlas Powd
erCo．社製）、ポリオキシエチレン−ソルビタン−モノ
オレエート（例えば、商品名Tween 80；Atlas Powder
Co．社製）、アルキルポリエーテル−アルコール混合物
（例えば、商品名Triton；Rohm and Haas Co．社製）、
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（例えば、商品名
Brij 35 ；Atlas Powder Co．社製）、ポリオキシエチ
レン−オクチルフェノールエーテル（例えば、商品名No
n −IdetP −40）、ポリエチレンオキシド−アルキルエ
ーテル付加物（例えば、商品名LubrolPX ；Ｉ．Ｃ．
Ｉ．社製）、オキシエチレン単位１０個を有するＣ−１
６，Ｃ−１８脂肪族アルコール（例えば、商品名Berol
EMU 043 ）等が挙げられ、陰イオン性界面活性剤として
は、例えば、ナトリウムドデシルサルフェートが挙げら
れる。
【００１２】本発明において、不溶性担体に抗原又は抗
体と非イオン性又は陰イオン性界面活性剤とを同時に担
持する方法としては、例えば、下記の方法が挙げられ
る。
体と非イオン性又は陰イオン性界面活性剤とを同時に担
持する方法としては、例えば、下記の方法が挙げられ
る。
【００１３】不溶性担体が分散された懸濁液に、担持
しようとする抗体又は抗原を含む液と界面活性剤を含む
緩衝液とを同時に添加する方法。
しようとする抗体又は抗原を含む液と界面活性剤を含む
緩衝液とを同時に添加する方法。
【００１４】不溶性担体が分散された懸濁液に、予め
界面活性剤を含む緩衝液を添加しておいた抗体又は抗原
含有液を添加する方法。
界面活性剤を含む緩衝液を添加しておいた抗体又は抗原
含有液を添加する方法。
【００１５】なお、上記及びの方法において界面活
性剤を緩衝液に溶解する場合、緩衝液としては、通常、
ｐＨ５〜１０の緩衝液が好ましく、例えば、リン酸緩衝
液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられる。
性剤を緩衝液に溶解する場合、緩衝液としては、通常、
ｐＨ５〜１０の緩衝液が好ましく、例えば、リン酸緩衝
液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられる。
【００１６】この担持には、公知の物理的吸着法又は化
学的結合法が使用される。抗体を担持させる場合、抗体
としては、モノクロナール抗体又はポリクローナル抗体
が好適に使用される。これらの抗体は、通常、硫安沈
澱、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の
抗体精製手段を適宜組み合わせて精製される。抗体の種
類としては、例えば、ＩｇＧやＩｇＭ等の免疫グロブリ
ンが挙げられ、必要に応じてＦ（ａｂ')2 部分、Ｆａｂ
部分となされてもよい。抗原を担持させる場合、抗原の
種類としては、特に限定されず、例えば、蛋白質、ポリ
ペプチド、ステロイド、多糖類、脂質等が測定目的に応
じて使用される。
学的結合法が使用される。抗体を担持させる場合、抗体
としては、モノクロナール抗体又はポリクローナル抗体
が好適に使用される。これらの抗体は、通常、硫安沈
澱、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の
抗体精製手段を適宜組み合わせて精製される。抗体の種
類としては、例えば、ＩｇＧやＩｇＭ等の免疫グロブリ
ンが挙げられ、必要に応じてＦ（ａｂ')2 部分、Ｆａｂ
部分となされてもよい。抗原を担持させる場合、抗原の
種類としては、特に限定されず、例えば、蛋白質、ポリ
ペプチド、ステロイド、多糖類、脂質等が測定目的に応
じて使用される。
【００１７】抗体又は抗原の担持工程終了後、不溶性担
体の表面の抗体又は抗原付着可能部位がまだ残っている
場合、該担体使用時に非特異吸着反応が起こらないよう
に、通常、牛血清アルブミンのような蛋白質でその不溶
性担体上の活性点を飽和させる操作（通常、この操作は
ブロッキングと呼ばれている）を行う。
体の表面の抗体又は抗原付着可能部位がまだ残っている
場合、該担体使用時に非特異吸着反応が起こらないよう
に、通常、牛血清アルブミンのような蛋白質でその不溶
性担体上の活性点を飽和させる操作（通常、この操作は
ブロッキングと呼ばれている）を行う。
【００１８】本発明において、最終的に得られる抗原又
は抗体測定用試薬は、前記非イオン性又は陰イオン性界
面活性剤を含有した前記不溶性担体の懸濁液である。本
発明方法においては、上記界面活性剤の濃度は、上記懸
濁液中０．０００５〜０．１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは
０．００１〜０．０５ｍｇ／ｍｌとされる。該界面活性
剤の濃度が低くなると測定範囲の拡大効果が小さくな
り、高くなると該界面活性剤が上記試薬の使用時に抗原
抗体反応を阻害する場合がある。
は抗体測定用試薬は、前記非イオン性又は陰イオン性界
面活性剤を含有した前記不溶性担体の懸濁液である。本
発明方法においては、上記界面活性剤の濃度は、上記懸
濁液中０．０００５〜０．１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは
０．００１〜０．０５ｍｇ／ｍｌとされる。該界面活性
剤の濃度が低くなると測定範囲の拡大効果が小さくな
り、高くなると該界面活性剤が上記試薬の使用時に抗原
抗体反応を阻害する場合がある。
【００１９】なお、上記の界面活性剤は、該担体が抗原
抗体反応に供される際に、該担体と共存していてもよい
し、又は、抗原抗体反応に供される以前に該担体から分
離されていてもよい。
抗体反応に供される際に、該担体と共存していてもよい
し、又は、抗原抗体反応に供される以前に該担体から分
離されていてもよい。
【００２０】また、最終的に得られる試薬中に存在す
る、抗体又は抗原が担持された不溶性担体の濃度は、上
記懸濁液中好ましくは０．２〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好
ましくは１〜５ｍｇ／ｍｌである。該不溶性担体の濃度
が低くなると、測定範囲の拡大効果がより小さくなり、
高くなると該不溶性担体が凝集して抗原抗体反応を阻害
する。
る、抗体又は抗原が担持された不溶性担体の濃度は、上
記懸濁液中好ましくは０．２〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好
ましくは１〜５ｍｇ／ｍｌである。該不溶性担体の濃度
が低くなると、測定範囲の拡大効果がより小さくなり、
高くなると該不溶性担体が凝集して抗原抗体反応を阻害
する。
【００２１】本発明により製造された抗原又は抗体測定
試薬によって検体中の被測定試薬を測定するには、光学
的に測定する方法又は肉眼で測定する方法のいずれでも
よい。光学的に測定するには、例えば、まず、検体を反
応容器に分注し、これに該抗原又は抗体測定用試薬を分
注混合し反応させる。この工程において検体及び試薬の
分注順序は、上記方法の逆でも同時でも良い。反応にお
けるｐＨは好ましくは５〜１０、より好ましくは６〜８
である。使用される緩衝液としては、例えば、リン酸緩
衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられ
る。反応温度は好ましくは０〜５０℃、より好ましくは
２０〜４０℃である。凝集反応時間は、好ましくは２０
秒〜３０分、より好ましくは１〜１５分である。
試薬によって検体中の被測定試薬を測定するには、光学
的に測定する方法又は肉眼で測定する方法のいずれでも
よい。光学的に測定するには、例えば、まず、検体を反
応容器に分注し、これに該抗原又は抗体測定用試薬を分
注混合し反応させる。この工程において検体及び試薬の
分注順序は、上記方法の逆でも同時でも良い。反応にお
けるｐＨは好ましくは５〜１０、より好ましくは６〜８
である。使用される緩衝液としては、例えば、リン酸緩
衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられ
る。反応温度は好ましくは０〜５０℃、より好ましくは
２０〜４０℃である。凝集反応時間は、好ましくは２０
秒〜３０分、より好ましくは１〜１５分である。
【００２２】このようにして得られる凝集物の生成量又
は生成速度を吸光度等を測定することによって、検体中
の被測定物質の濃度を算出する。これには、例えば、吸
光度を１回測定する方法、吸光度を２回測定する方法な
どがある。吸光度を測定する代わりに散乱光を測定する
方法も用い得る。測定は３００〜１０００ｎｍの範囲内
の適当な波長で行うことができるが、ラテックスの粒径
に対して充分長い波長を用いることが好ましい。このよ
うな光学的測定の装置は既知のものであってよい。例え
ば、吸光度を測定する通常の分光光度計、光の散乱強度
を測定する装置、粒子数及び／又は粒子径を測定するた
めの装置などが用いられる。上記凝集反応を測定するた
めの専用装置としては、分光光度計を組み込んだ生化学
自動分析装置、免疫比濁法による凝集反応を測定するた
めの専用装置、フローインジェクションを利用して凝集
反応を測定するための装置、ラテックス凝集反応を測定
するための専用装置などがある。
は生成速度を吸光度等を測定することによって、検体中
の被測定物質の濃度を算出する。これには、例えば、吸
光度を１回測定する方法、吸光度を２回測定する方法な
どがある。吸光度を測定する代わりに散乱光を測定する
方法も用い得る。測定は３００〜１０００ｎｍの範囲内
の適当な波長で行うことができるが、ラテックスの粒径
に対して充分長い波長を用いることが好ましい。このよ
うな光学的測定の装置は既知のものであってよい。例え
ば、吸光度を測定する通常の分光光度計、光の散乱強度
を測定する装置、粒子数及び／又は粒子径を測定するた
めの装置などが用いられる。上記凝集反応を測定するた
めの専用装置としては、分光光度計を組み込んだ生化学
自動分析装置、免疫比濁法による凝集反応を測定するた
めの専用装置、フローインジェクションを利用して凝集
反応を測定するための装置、ラテックス凝集反応を測定
するための専用装置などがある。
【００２３】本発明により得られた試薬によって測定す
ることのできる検体は、抗原や抗体などの免疫学的に活
性な物質を含有する試料、特に生体試料（例えば、血
液、胸水、腹水、リンパ液などの体液、尿、便、汗など
の排泄物、又は組織の抽出物等）である。本発明で得ら
れた試薬によって測定できる抗原又は抗体は、通常、免
疫学的に抗原又は抗体に属するあらゆる物質を含有む。
例えば、アンチトロンビンIII(AT III) 、アルファフェ
トプロテイン（ＡＦＰ）、リウマチ因子（ＲＦ）、抗ス
トレプトリジン−Ｏ（ＡＳＯ）、Ｃ−反応性蛋白質（Ｃ
ＲＰ）、フィブリノーゲン−フイブリン分解物（ＦＤ
Ｐ）、ヒト絨毛膜ゴナドトロンピン（ＨＣＧ）、癌胎児
性抗原（ＣＥＡ）などの蛋白質又はポリペプチド、ステ
ロイド、多糖類、脂質等が挙げられる。
ることのできる検体は、抗原や抗体などの免疫学的に活
性な物質を含有する試料、特に生体試料（例えば、血
液、胸水、腹水、リンパ液などの体液、尿、便、汗など
の排泄物、又は組織の抽出物等）である。本発明で得ら
れた試薬によって測定できる抗原又は抗体は、通常、免
疫学的に抗原又は抗体に属するあらゆる物質を含有む。
例えば、アンチトロンビンIII(AT III) 、アルファフェ
トプロテイン（ＡＦＰ）、リウマチ因子（ＲＦ）、抗ス
トレプトリジン−Ｏ（ＡＳＯ）、Ｃ−反応性蛋白質（Ｃ
ＲＰ）、フィブリノーゲン−フイブリン分解物（ＦＤ
Ｐ）、ヒト絨毛膜ゴナドトロンピン（ＨＣＧ）、癌胎児
性抗原（ＣＥＡ）などの蛋白質又はポリペプチド、ステ
ロイド、多糖類、脂質等が挙げられる。
【００２４】
【実施例】以下、本発明を具体的に説明するために、そ
の実施例を示す。なお、以下の実施例及び比較例におい
ては、アンチトロンビンIII （以下、「AT III」とい
う）を測定するための試薬を製造し、得られた試薬を用
いて検量線を作成した。
の実施例を示す。なお、以下の実施例及び比較例におい
ては、アンチトロンビンIII （以下、「AT III」とい
う）を測定するための試薬を製造し、得られた試薬を用
いて検量線を作成した。
【００２５】実施例１ (1) 抗AT III抗体担持ラテックス試薬の調製抗体及び界面活性剤の不溶性担体への担持工程 予め界面活性剤としてTween 20を０．００２ｍｇ／ｍｌ
の濃度で溶解した０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
５）に、抗ヒトATIII 山羊産生抗体（ＡＴＡＢ社製）を
２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、得られた液５ｍｌに、平
均粒径が０．１μｍのポリスチレン系ラテックス（固形
分１０重量％、積水化学工業社製）５００μｌを添加
し、１８℃にて２．５時間攪拌した。
の濃度で溶解した０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
５）に、抗ヒトATIII 山羊産生抗体（ＡＴＡＢ社製）を
２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、得られた液５ｍｌに、平
均粒径が０．１μｍのポリスチレン系ラテックス（固形
分１０重量％、積水化学工業社製）５００μｌを添加
し、１８℃にて２．５時間攪拌した。
【００２６】こうして、抗ヒトATIII 山羊産生抗体担持
ラテックス懸濁液を調製した。
ラテックス懸濁液を調製した。
【００２７】担持抗体のブロッキング工程 次に、牛血清アルブミンを２重量％濃度で含有した０．
３５Ｍリン緩衝液（ｐＨ６．５）５ｍｌを、上記抗ヒト
ATIII 山羊産生抗体担持ラテックス懸濁液に加え（混合
後、Tween ２０の最終濃度は０．００１ｍｇ／ｍｌとな
る）、室温で一晩混合、攪拌を続けATIII 測定用試薬を
製造した。その後、これを４℃で保存した。
３５Ｍリン緩衝液（ｐＨ６．５）５ｍｌを、上記抗ヒト
ATIII 山羊産生抗体担持ラテックス懸濁液に加え（混合
後、Tween ２０の最終濃度は０．００１ｍｇ／ｍｌとな
る）、室温で一晩混合、攪拌を続けATIII 測定用試薬を
製造した。その後、これを４℃で保存した。
【００２８】(2) ATIII の光学的測定 上記ラテッス試薬２００μｌを、牛血清アルブミンを１
重量％、ポリエチレングリコール（ポリエチレングリコ
ール６０００、平均分子量７５００、和光純薬社製）を
４重量％の濃度で溶解した０．３５Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．５）３５０μｌにて希釈し、検体（スタンダード
ヒューマンプラズマ（ベーリンガーマンハイム社製、凍
結乾燥品）を純水で復元したものを、５重量％牛血清ア
ルブミン水溶液で希釈し、又は復元時純水の添加量を減
じることにより濃縮して０、２５、５０、７５、１０
０、１５０及び２００％の濃度系列を調製したもの（こ
こで１００％とは正常人血漿中のATIII 標準含有濃度で
ある。）を３μｌ添加し、攪拌し４分後の波長５７０ｎ
ｍの吸光度を１回測定した。得られた吸光度と濃度との
関係を図１に示す。また、１０％の濃度検体を１０回測
定し変動係数を求めた結果を表１に示す。
重量％、ポリエチレングリコール（ポリエチレングリコ
ール６０００、平均分子量７５００、和光純薬社製）を
４重量％の濃度で溶解した０．３５Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．５）３５０μｌにて希釈し、検体（スタンダード
ヒューマンプラズマ（ベーリンガーマンハイム社製、凍
結乾燥品）を純水で復元したものを、５重量％牛血清ア
ルブミン水溶液で希釈し、又は復元時純水の添加量を減
じることにより濃縮して０、２５、５０、７５、１０
０、１５０及び２００％の濃度系列を調製したもの（こ
こで１００％とは正常人血漿中のATIII 標準含有濃度で
ある。）を３μｌ添加し、攪拌し４分後の波長５７０ｎ
ｍの吸光度を１回測定した。得られた吸光度と濃度との
関係を図１に示す。また、１０％の濃度検体を１０回測
定し変動係数を求めた結果を表１に示す。
【００２９】実施例２〜３ 実施例１における、抗体及び界面活性剤の不溶性担体へ
の担持工程において、Tween ２０を０．００２ｍｇ／ｍ
ｌ溶解するリン酸緩衝液を使用する代わりに、Tween ２
０をそれぞれ０．０２１ｍｇ／ｍｌ（実施例２）、０．
１０５ｍｇ／ｍｌ（実施例３）溶解するリン酸緩衝液を
使用したこと（Tween ２０の最終濃度は、実施例２が
０．０１ｍｇ／ｍｌ、実施例３が０．０５ｍｇ／ｍｌと
なる）の他は、実施例１と同様にしてATIII 測定用試薬
を製造し、実施例１と同様にして、吸光度とATIII 濃度
との関係を求めた。この結果を図１及び表１に示す。
の担持工程において、Tween ２０を０．００２ｍｇ／ｍ
ｌ溶解するリン酸緩衝液を使用する代わりに、Tween ２
０をそれぞれ０．０２１ｍｇ／ｍｌ（実施例２）、０．
１０５ｍｇ／ｍｌ（実施例３）溶解するリン酸緩衝液を
使用したこと（Tween ２０の最終濃度は、実施例２が
０．０１ｍｇ／ｍｌ、実施例３が０．０５ｍｇ／ｍｌと
なる）の他は、実施例１と同様にしてATIII 測定用試薬
を製造し、実施例１と同様にして、吸光度とATIII 濃度
との関係を求めた。この結果を図１及び表１に示す。
【００３０】比較例１ 実施例１における、抗体及び界面活性剤の不溶性担体へ
の担持工程において、Tween ２０を含まないリン酸緩衝
液を使用することの他は、実施例１と同様にしてATIII
測定用試薬を製造し、実施例１と同様にして、吸光度と
ATIII 濃度との関係を求めた。この結果を図１及び表１
に示す。
の担持工程において、Tween ２０を含まないリン酸緩衝
液を使用することの他は、実施例１と同様にしてATIII
測定用試薬を製造し、実施例１と同様にして、吸光度と
ATIII 濃度との関係を求めた。この結果を図１及び表１
に示す。
【００３１】比較例２ 実施例１における、抗体及び界面活性剤の不溶性担体へ
の担持工程において、Tween ２０を０．００２ｍｇ／ｍ
ｌ溶解するリン酸緩衝液を使用する代わりに、Tween ２
０を１．０５ｍｇ／ｍｌ溶解するリン酸緩衝液を使用し
たこと（Tween２０の最終濃度は、０．５ｍｇ／ｍｌと
なる）の他は、実施例１と同様にしてATIII 測定用試薬
を製造し、実施例１と同様にして、吸光度とATIII 濃度
との関係を求めた。この結果を図１及び表１に示す。
の担持工程において、Tween ２０を０．００２ｍｇ／ｍ
ｌ溶解するリン酸緩衝液を使用する代わりに、Tween ２
０を１．０５ｍｇ／ｍｌ溶解するリン酸緩衝液を使用し
たこと（Tween２０の最終濃度は、０．５ｍｇ／ｍｌと
なる）の他は、実施例１と同様にしてATIII 測定用試薬
を製造し、実施例１と同様にして、吸光度とATIII 濃度
との関係を求めた。この結果を図１及び表１に示す。
【００３２】比較例３ 実施例１における、抗体及び界面活性剤の不溶性担体へ
の担持工程において、Tween ２０を含まないリン酸緩衝
液を使用し、その代わりに担持抗体のブロッキング工程
においてTween ２０を０．０２１ｍｇ／ｍｌ溶解するリ
ン酸緩衝液を使用すること（Tween ２０の最終濃度は、
０．０１ｍｇ／ｍｌとなる）の他は、実施例１と同様に
してATIII 測定用試薬を製造し、実施例１と同様にし
て、吸光度とATIII 濃度との関係を求めた。この結果を
図１及び表１に示す。
の担持工程において、Tween ２０を含まないリン酸緩衝
液を使用し、その代わりに担持抗体のブロッキング工程
においてTween ２０を０．０２１ｍｇ／ｍｌ溶解するリ
ン酸緩衝液を使用すること（Tween ２０の最終濃度は、
０．０１ｍｇ／ｍｌとなる）の他は、実施例１と同様に
してATIII 測定用試薬を製造し、実施例１と同様にし
て、吸光度とATIII 濃度との関係を求めた。この結果を
図１及び表１に示す。
【００３３】評価 図１から分かるように、実施例１〜３で得られた試薬を
用いた光学的測定では、従来の方法によって得られた比
較例１の試薬を用いた場合に比べて、試薬ブランク（図
１におけるATIII 濃度０％におけるＯ．Ｄ．値）が低
く、検量線の直線部分もATIII の高濃度域まで伸びてい
る。また、実施例１〜３で得られた試薬は、不溶性担体
に抗体又は抗原を担持した後に界面活性剤を接触させた
比較例３の試薬とほぼ同等の試薬ブランクを持ち、検量
線の直線部分も同程度であった。次に、表１から分かる
ように、より高濃度（Tween ２０の最終濃度０．５ｍｇ
／ｍｌ）の界面活性剤溶液に懸濁させた試薬（比較例
２）、及び不溶性担体に抗体又は抗原を担持した後に界
面活性剤を接触させた比較例３の試薬では、検体濃度１
０％における変動係数が明らかに大きくなり、測定を精
度よく行うことが難しい。
用いた光学的測定では、従来の方法によって得られた比
較例１の試薬を用いた場合に比べて、試薬ブランク（図
１におけるATIII 濃度０％におけるＯ．Ｄ．値）が低
く、検量線の直線部分もATIII の高濃度域まで伸びてい
る。また、実施例１〜３で得られた試薬は、不溶性担体
に抗体又は抗原を担持した後に界面活性剤を接触させた
比較例３の試薬とほぼ同等の試薬ブランクを持ち、検量
線の直線部分も同程度であった。次に、表１から分かる
ように、より高濃度（Tween ２０の最終濃度０．５ｍｇ
／ｍｌ）の界面活性剤溶液に懸濁させた試薬（比較例
２）、及び不溶性担体に抗体又は抗原を担持した後に界
面活性剤を接触させた比較例３の試薬では、検体濃度１
０％における変動係数が明らかに大きくなり、測定を精
度よく行うことが難しい。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【発明の効果】本発明の抗原又は抗体測定用試薬の製造
方法によれば、検体試料中の微量成分の測定に際し抗原
抗体反応の進行を安定化させ、かつ、被測定物質の濃度
に対する不溶性担体凝集による吸光度もしくは散乱光強
度の増加率を一定に保ったまま、より広い測定範囲を持
った抗原抗体測定用試薬が製造できる。このように、吸
光度又は散乱光強度の増加率が一定であるので、検量線
作成のための測定も２回で済み、本発明の製造方法で得
られる試薬は操作が簡便であると共にコスト的にも有利
である。
方法によれば、検体試料中の微量成分の測定に際し抗原
抗体反応の進行を安定化させ、かつ、被測定物質の濃度
に対する不溶性担体凝集による吸光度もしくは散乱光強
度の増加率を一定に保ったまま、より広い測定範囲を持
った抗原抗体測定用試薬が製造できる。このように、吸
光度又は散乱光強度の増加率が一定であるので、検量線
作成のための測定も２回で済み、本発明の製造方法で得
られる試薬は操作が簡便であると共にコスト的にも有利
である。
【図１】図１は、実施例１〜３及び比較例１〜２で得ら
れたATIII 測定用試薬の検量線である。
れたATIII 測定用試薬の検量線である。
Claims (1)
- 【請求項１】 不溶性担体が分散された懸濁液中で、該
不溶性担体に抗原又は抗体を担持する際に、上記抗原又
は抗体と非イオン性又は陰イオン性界面活性剤とを該不
溶性担体に同時に接触させること、及び、上記界面活性
剤の上記濃度が０．０００５〜０．１ｍｇ／ｍｌである
ことを特徴とする抗原又は抗体測定用試薬の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8836796A JPH09281107A (ja) | 1996-04-10 | 1996-04-10 | 抗原又は抗体測定用試薬の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8836796A JPH09281107A (ja) | 1996-04-10 | 1996-04-10 | 抗原又は抗体測定用試薬の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09281107A true JPH09281107A (ja) | 1997-10-31 |
Family
ID=13940835
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8836796A Pending JPH09281107A (ja) | 1996-04-10 | 1996-04-10 | 抗原又は抗体測定用試薬の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09281107A (ja) |
-
1996
- 1996-04-10 JP JP8836796A patent/JPH09281107A/ja active Pending
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