JPH09255587A

JPH09255587A - 水産用抗菌剤

Info

Publication number: JPH09255587A
Application number: JP8069931A
Authority: JP
Inventors: Giichi Sugimori; 義一杉森; Shigetoshi Katayama; 慈敏片山
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1996-03-26
Filing date: 1996-03-26
Publication date: 1997-09-30

Abstract

(57)【要約】【課題】魚介類の細菌感染症の予防及び治療手段を提
供する。【解決手段】式Ｉ：【化１】［式中、ＸはＬ−ＨyＰro又はＬ−Ｐro、Ｒは−ＣＨ₃又は
−ＣＨ(ＣＨ₃)₂、ｎは９〜１２の整数を表す］で示され
る化合物又はその塩を有効成分とする魚介類における細
菌性疾患の予防又は治療のための水産用抗菌剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、主に水産業の分野にお
いて魚介類の細菌性疾患の予防及び／又は治療に用いる
ための抗菌剤に関し、さらに詳しくはアシルオクタペプ
チド系化合物を有効成分とする抗菌剤に関する。

【０００２】

【従来技術と発明が解決しようとする課題】近年、水産
業の分野では、漁場の確保が困難であったり水産資源の
保全及び確保の必要性から、様々な魚介類の養殖が行わ
れている。しかるに、陸棲動物と同様、水棲動物も種々
の感染性疾病に侵されることから、養殖を効率良く行う
ためには、そのような感染症を適切に予防及び／又は治
療することが不可欠である。魚介類の感染症のうち、病
原菌がグラム陽性の菌である感染症、中でもエンテロコ
ッカスセリオリシダ（Enterococcus seriolicida）に
起因する溶血性連鎖球菌症は年間を通じて発生し、養殖
ブリ等の養殖業における被害の大多数が該疾患に関連し
ている［動生協会会報，26(3)：10〜17；1993］。従
来、このような感染症の予防及び治療には、エリスロマ
イシン、スピラマイシ、リンコマイシン、オキシテトラ
サイクリンなどの抗生物質が汎用されている［JVPA DIG
EST日本動物薬事協会会報，8：21；1995］が、これら既
存薬剤に対する感受性が低下した、所謂、耐性菌の出現
により、適切な予防及び治療が困難になってきた。従っ
て、既存の抗菌剤に対して交差耐性を示さず、優れた抗
菌活性を有する薬剤が必要とされている。しかも、その
ような薬剤はヒト等の動物においては活性を殆ど又は全
く示さないことが好ましい[JVPA DIGEST日本動物薬事協
会会報，８：１０；１９９５］。このように、水産用抗
菌剤には、魚介類に投与した場合には有効な血中濃度を
示し、優れた抗菌活性を示すと同時に、ヒト等の動物に
投与した場合には、血中濃度の上昇を殆ど又は全く示さ
ないことが要求される［ＪＶＰＡＤＩＧＥＳＴ日本動
物薬事協会会報，8：10；1995］。しかしながら、その
ような特殊な性質を有する新規な抗菌剤の開発は容易で
はなかった。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、魚介類の
細菌性疾患、特に、グラム陽性菌感染症の予防及び治療
に有効であり、しかもヒト等の動物における安全性が高
く、既存の抗菌剤に交叉耐性を示さない新規な抗菌剤を
提供することを目的として鋭意研究を重ねた結果、ある
種のアシル系抗生物質がこの目的の達成に適することを
見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、
式Ｉ：

【化３】［式中、ＸはＬ−ＨyＰro又はＬ−Ｐro、Ｒは−ＣＨ₃又
は−ＣＨ(ＣＨ₃)₂、ｎは９〜１２の整数を表す］で示さ
れる化合物又はその塩を有効成分とする魚介類における
細菌性疾患の予防又は治療のための水産用抗菌剤を提供
するものである。本発明はまた、当該技術分野で通常用
いられる適当な担体中に上記の化合物Ｉ及びその塩から
なる群から選択される２以上の化合物を、含有する水産
用抗菌剤を提供するものである。ここに、「担体」なる
語句は、水棲動物に特定の医薬を投与する場合に用いら
れる任意の形態の担体を意味し、例えば、後述する様々
な飼料及び製剤的に許容される担体が含まれる。本発明
において魚介類とは、淡水魚、海水魚を含む魚類、アサ
リ、ハマグリなどの貝類、海老、蟹などの甲殻類を意味
する。

【０００４】本発明の抗菌剤の有効成分である化合物Ｉ
はアシルオクタペプチドとして、その塩と共に、特開平
３−１８８０９８号公報に開示されている。該公報に
は、この物質のメシチリン耐性ブドウ球菌に対する抗菌
作用が開示されているが、魚介類における抗菌活性及び
ヒト等の陸棲動物での安全性については全く開示されて
いない。周知のごとく、魚介類では、環境への適応のた
め、様々な器官の機能や代謝機構が陸棲動物のそれとは
大きく異なっており、陸棲動物における活性測定の結果
をそのまま魚介類にあてはめることはできない。実際、
後述の試験例に示すように、式Ｉの化合物を経口投与し
た後の血中濃度は、哺乳動物や鳥類では殆ど上昇しない
が、魚介類では投与１時間後にピークを有する上昇が認
められた。この結果は、上記公報の開示内容からは到底
予測できないものであり、化合物Ｉが魚介類、特に魚類
の細菌感染症の予防及び／又は治療に適した、優れた特
性を有する新規な水産用抗生物質であることを示してい
る。

【０００５】本明細書中、式Ｉで示される化合物を、上
記公報の記載に従い、プラスバシン（Plusbacin）と呼
称する。代表的なプラスバシン類化合物として、下記の
８種類が知られている。式Ｉにおいて、ＸがＬ−ＨyＰr
o、ｎが１０、Ｒが−ＣＨ₃である化合物（プラスバシン
Ａ₁）；ＸがＬ−ＨyＰro、ｎが９、Ｒが−ＣＨ（ＣＨ₃)
₂である化合物（プラスバシンＡ₂）；ＸがＬ−ＨyＰr
o、ｎが１０、Ｒが−ＣＨ（ＣＨ₃)₂である化合物（プラ
スバシンＡ₃）；ＸがＬ−ＨyＰro、ｎが１２、Ｒが−Ｃ
Ｈ₃である化合物（プラスバシンＡ₄）；ＸがＬ−Ｐro、
ｎが１０、Ｒが−ＣＨ₃である化合物（プラスバシン
Ｂ₁）；ＸがＬ−Ｐro、ｎが９、Ｒが−ＣＨ（ＣＨ₃)₂で
ある化合物（プラスバシンＢ₂）；ＸがＬ−Ｐro、ｎが
１０、Ｒが−ＣＨ（ＣＨ₃)₂である化合物（プラスバシ
ンＢ₃）；及びＸがＬ−Ｐro、ｎが１２、Ｒが−ＣＨ₃で
ある化合物（プラスバシンＢ₄）。本明細書中、「Ｌ−
ＨyＰro」はＬ−トランス−３−ヒドロキシプロリン
を、「Ｄ−ＨyＡsp」はＤ−トレオ−β―ヒドロキシア
スパラギン酸を、「Ｌ−ＨyＡsp」はＬ−トレオ−β―
ヒドロキシアスパラギン酸を、「ａＴhr」はアロートレ
オニンを意味する。

【０００６】本発明の目的にとっては、上記の８種類の
プラスバシン及びその塩のみならず、式Ｉで示される抗
菌活性を有する他のプラスバシン類の化合物及びその塩
も有用である。本発明に有用なプラスバシンの塩には、
リチウム、カリウム、ナトリウム等のアルカリ金属、マ
グネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属、又は塩
酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素等の無機酸、及び酢
酸、シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、クエン酸、リン
ゴ酸、アジピン酸、コハク酸等の有機酸との塩が含まれ
る。なお、本明細書中、単にプラスバシンというとき
は、プラスバシンＡ₁〜Ａ₄及びＢ₁〜Ｂ₄をはじめとする
式Ｉの化合物及びその塩の各々、又はそれらの任意の組
み合わせからなる混合物、あるいは式Ｉで示される化合
物すべてを指すものとする。

【０００７】プラスバシンは、後述するインビトロ（in
vitro）及びインビボ（in vivo）の試験例の結果から
明らかなように、グラム陽性菌に対して抗菌活性を示
す。しかも、プラスバシンの経口投与における血中移行
性は、魚類等の水棲動物のみにおいて認められることか
ら、該物質を含有する魚介類を動物が摂取することによ
る影響はほとんど無く、安全性が高い。即ち、プラスバ
シンは、エンテロコッカスセリオリシダ（E．seriolic
ida）、ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、クロス
トリジウムパーフリンゲンス（Clostridium perfringe
ns）等のグラム陽性菌に対して抗菌活性を示し、さら
に、マクロライド系、リンコマイシン系及びテトラサイ
クリン系薬剤に低感受性のエンテロコッカスセリオリ
シダ（E．seriolicida）に対しても抗菌活性を示した。
また、エンテロコッカスセリオリシダ（E．seriolicid
a）を人工的に感染させたブリに対する治療有効性も確
認された。

【０００８】一方、急性毒性試験の結果は、本発明の抗
菌剤の安全性が高いことを示している。また、マウス、
ラットなどの哺乳動物、ニワトリなどの鳥類及びニジマ
ス、鯉、ブリなどの魚類に対する経口投与による血中へ
の移行性試験で、魚類でのみ血中への移行性を示す優れ
た特性を有する抗菌剤であることを意味している。これ
らの試験結果は、本発明のプラスバシンを有効成分とす
る抗菌剤が、魚介類、特に魚類における、プラスバシン
に感受性を有するグラム陽性菌による感染症の予防及び
治療に有用であり、魚の生存率を高める目的で日常的に
魚に投与し得ることを示すものである。本発明の抗菌剤
は、特に、魚類のエンテロコッカスセリオリシダ（E.
seriolicida）に起因する連鎖球菌症の治療及び予防に
有用である。この感染症はブリ養殖における被害の最大
原因の１つとされており、ブリ養殖業界で大きい問題と
なっているが、本発明は、その問題の解決に大きく貢献
するものである。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明のプラスバシン類は、プラ
スバシン産生能を有する菌を培地に培養し、培養物から
常法通り分離、精製することにより得られる。そのよう
な菌として、特開平３−１８８０９８に記載のシュード
モナス属の菌（例えばPseudomonas sp. ＰＢ−６２５０
（ＦＥＲＭＢＰ−２９３８））を挙げることができ
る。培養物からのプラスバシンの精製は、それが菌体内
に蓄積されるか、あるいは培地に分泌されるかにより異
なるが、いずれも溶媒抽出、晶析、カラムクロマトグラ
フィー等の当業者既知の方法を用いて行うことができ
る。下記の製造例では、シュードモナス属の菌を培地に
培養し、生産されたプラスバシンを菌体内から、又は菌
体外から精製する方法を示している。しかしながら、本
発明の目的は、抗菌活性を有する限り、任意の起源から
任意の製造方法で得られたプラスバシンを用いて達成す
ることができる。従って、本明細書に記載の方法以外の
方法で得られるプラスバシン類も本発明の範囲に包含さ
れる。

【００１０】本発明の抗菌剤を魚類に経口もしくは非経
口投与する場合には、プラスバシンをそのまま、あるい
は適当な剤形に製剤化して投与してもよいが、一般的に
は、通常使用される担体（例えば、脱脂米糠、脱脂大豆
粉、ふすま、カオリン、タルク、炭酸カルシウム、乳
糖、水、本発明の抗菌活性に影響を及ぼさない化学物質
等）と混合したものを投与するか、このような混合した
もの、もしくはプラスバシン単独を魚類用飼料もしくは
水と混合して投与する方法が好ましい。ここで使用するプラスバシンは、必ずしも精製品である
必要はなく、菌の培養物、粗製物（プラスバシン生産菌
を培地に培養して得られる培養物の部分的な製生物）、
さらにはプラスバシンを含有する菌体そのものであって
もよい。また、プラスバシンは上記の製薬上許容される
塩の形で用いることもできる。グラム陽性菌に起因する
疾病の予防、治療を目的としてプラスバシンを投与する
場合、魚種によって異なるが、１日当たりの投与量は、
体重kgあたり、通常、１mg／kg〜２００mg／kg、好まし
くは５mg／kg〜１５０mg／kg、より好ましくは１０mg／
kg〜１００mg／kgである。

【００１１】本発明のプラスバシンを餌料に混合して用
いる場合、餌料は魚類用の餌料として一般に使用される
ものであればいずれでもよい。そのような餌料は、通
常、いわし、さばなどの魚体のぶつ切り又はミンチにし
た生餌、魚類用配合飼料としてとうもろこし、ふすま、
米、麦、綿実粕、マイロ、大豆粕、魚粉、脱脂米糠、油
粕、アルファルファ、炭酸カルシウム、リン酸カルシウ
ム、塩化ナトリウム、塩化コリン、各種ビタミン剤（ビ
タミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＢ₁、ビ
タミンＢ₂、ビタミンＢ₆、ビタミンＢ₁₂、パントテン酸
カルシウム、ニコチン酸アミド、葉酸）、無機塩（硫酸
マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、ヨウ化カリ
ウム、硫酸コバルト）等の一部又は全部を混合して調製
される。餌料には、水産分野で許容されている他の添加
物、例えば、他の抗菌剤や殺菌剤等を添加してもよい。

【００１２】本発明に係るプラスバシン含有餌料中のプ
ラスバシン含有量は、それらを単独で使用する場合、そ
れらの任意の混合物を使用する場合、それらを含有する
菌体、それらを含む抽出粗製物を使用する場合のいずれ
であっても、使用するプラスバシンの濃度は、前記１日
当たりの投与量をもとにして、必要な量のプラスバシン
が餌料中に含有されるように計算して、個々の魚の餌料
にすることが好ましい。あるいは、本発明の抗菌剤は、
水産分野で用いられている通常の経口投与に適した剤
型、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、ペレッ
ト等の固形剤；水剤；油性懸濁剤；又はシロップ剤もし
くはエリキシル剤等の液剤のいずれかの剤型に製剤化す
ることができる。これらの製剤は、そのまま、あるいは
餌料に混合して与えることができる。その調製に際して
は、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、水性溶剤、油性溶
剤、乳化剤、懸濁化剤等のいずれも用いることができ、
また、他の添加剤、例えば保存剤、安定剤、ビタミン
剤、他の抗菌剤、殺菌剤等を含むものであってもよい。
本発明の抗菌剤は魚介類一般に投与できる。また、魚介
類の飼育法は、一般に行われている方法をそのまま用い
ればよい。

【００１３】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく
説明する。製造例１プラスバシンの製造実質上、特開平３−１８８０９８に記載の方法と同様に
して製造する。（ａ）発酵生産工程：グルコース１０ｇ、酵母エキス５
ｇ、水道水１０００ml（ｐＨ無調製）よりなる培地１Ｌ
を含む２Ｌ容エルレンマイヤーフラスコにシュードモナ
ス種（Pseudomonas sp. ）ＰＢ−６２５０（ＦＥＲＭ
ＢＰ−２９３８）の培養スラントの菌体を無菌的に懸濁
させる。これを毎分２５０回転で、２８℃、１８時間振
盪培養を行う。この培養物７Ｌを、コーンスターチ１０
ｇ、ポテトスターチ１０ｇ、ＣＡ−１（動物飼料）２０
ｇ、水道水１０００ml（ｐＨ無調製）からなる培地２０
０Ｌを含む５００Ｌタンクに接種し、通気量２００Ｌ／
分で、毎分２５０回転、２８℃、７２時間培養する。

【００１４】（ｂ）抽出，精製工程：（１）上記の培養液約２００Ｌに食塩２５kgを加え、希
塩酸でｐＨ３．０に調製し、シャープレス遠心機で遠心
分離する。菌体部分を７０％アセトン５４Ｌで２回抽出
し、抽出液を減圧下で濃縮し、大部分のアセトンを留去
する。残った水性溶液（１５Ｌ）に水１０Ｌを加え、希
水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調製し、ダイヤイオン
ＨＰ−２０（三菱化成社製）のカラム（１０Ｌ）に通過
せしめ、プラスバシンを吸着させる。カラムを水洗後、
３０％アセトンから１００％アセトンまでの濃度勾配溶
出法により溶出する。活性のある溶出分画を集め（１０
Ｌ）、減圧下、大部分のアセトンを留去した後、ｐＨ
２．５（希塩酸により調製）でブタノール５Ｌで抽出す
る。ブタノール抽出液を減圧下で濃縮し、アセトンを加
えることによりプラスバシンを含む粗粉末（以下、プラ
スバシン群と記す）２３.９ｇを得た。

【００１５】（２）クロロホルム−エタノール−１０％
酢酸（４：７：２）溶媒で充填したシリカゲルカラム
（メルク社製，７０−２３０メッシュ，１０００ｇ）
に、上記の粗粉末（２３ｇ）を上記溶媒で溶解した溶液
を載せ、同溶媒で展開溶出する。活性のある溶出分画を
集め、減圧下、水及びブタノールを加えながら濃縮す
る。濃縮液より抗菌剤をｐＨ２．０でブタノールで抽出
し、アセトンを加えることにより、抗菌剤の粗粉末６．
３４ｇ得た。

【００１６】（３）上記粗粉末を、下記の条件による高
速液体クロマトグラフィーに付し、精製分画を得た。カラム：ＹＭＣＡＰ−３２４Ｓ１５／３０３００
ＡＯＤＳ（山村化学社製）移動層：アセトニトリル−５０mM硫酸ナトリウムを含む
５０mMリン酸緩衝液、ｐＨ７.５（３６：６４）流速：１００ml／分紫外線吸収検出機により２２０nmで検出。試料はｐＨ
８．０の水に溶解し、１回につき５００mgを注入した。

【００１７】上記のクロマトグラフィーにより，最初に
成分Ａ₁及びＢ₁を含む分画が、次に、成分Ａ₂及びＢ₂を
含む分画が、最後にＡ₃，Ａ₄，Ｂ₃及びＢ₄を含む分画が
溶出される。各々の分画を分取して集め、減圧下で濃縮
後、ｐＨ２.５でブタノールで抽出する。この抽出液を
０．１Ｎ塩酸、次いで水で洗浄する。更に、減圧下濃縮
し、アセトンを加えることにより、Ａ₁及びＢ₁塩酸塩混
合物１５０mg、Ａ₂及びＢ₂塩酸塩混合物２．１４ｇ及び
Ａ₃，Ａ₄，Ｂ₃及びＢ₄塩酸塩混合物１.０ｇが得られ
た。

【００１８】（４）プラスバシンＡ₁〜Ａ₄及びＢ₁から
Ｂ₄各成分は、上記の各々の混合物から、下記の条件に
よる高速液体クロマトグラフィーを再び行って分離し
た。カラム：ウルトロン７ＣＮ２０×２５０mm（信和化工
社製）移動層：アセトニトリル−５０mM硫酸ナトリウムを含む
５０mMリン酸緩衝液、ｐＨ２.２（Ａ₁及びＢ₁の分離の
場合，２６：７４，Ａ₂及びＢ₂，Ａ₃，Ｂ₃，Ａ₄及びＢ₄
の場合，２８：７２）流速：１１．２５ml／分紫外線吸収検出機により２２０nmで検出。試料は５０％メタノールに溶解し、１回につき５mgを注
入した。各成分の分画を分取し、減圧下、濃縮し、ｐＨ
２.５でブタノールで抽出し、その抽出液を０．１Ｎ塩
酸、次いで、水で洗浄後、更に減圧下濃縮し、アセトン
を加えることにより、各成分の塩酸塩を得た。Ａ₁及び
Ｂ₁の混合物７７mgからＡ₁塩酸塩２３mg及びＢ₁塩酸塩
６mgが得られた。Ａ₂及びＢ₂の混合物１００mgからＡ₂
塩酸塩６８mg及びＢ₂塩酸塩４mgが得られた。Ａ₃、
Ａ₄、Ｂ₃及びＢ₄の混合物１５０mgからＡ₃塩酸塩５２m
g、Ａ₄塩酸塩１０mg、Ｂ₃塩酸塩５mg及びＢ₄塩酸塩２mg
が得られた。

【００１９】製造例２プラスバシンの製造（ａ）発酵生産工程：菌体外に生産物を分泌するシュー
ドモナス属の菌株を選択し、製造例１と同様にして培養
する。（ｂ）抽出、精製工程上記の発酵液約２６０Ｌ（含有量３４７ｇ）にクロロホ
ルム２．７Ｌを添加して３時間撹拌殺菌を行う。次い
で、６Ｎ塩酸にて発酵液をｐＨ２に調節した後、ｎ−ブ
タノール／メタノール（１：１）２８８Ｌを加え、１時
間撹拌抽出した。シャープレス遠心分離機（関西遠心分
離株式会社製）にて菌体を分離することによって清澄な
抽出液を得た。抽出液は減圧濃縮し、アセトンを留去し
た後、濃縮液に塩化ナトリウム２０ｋｇを加えて塩析
し、ｎ−ブタノール抽出液１４２Ｌを得た。ブタノール
抽出液は水を加えながら減圧濃縮、留去後アセトン１８
Ｌを加えることにより、粗プラスバシン９１７ｇ（含有
量２２６ｇ）が黄褐色粉末として得られた。粗プラスバ
シン３６９ｇを水３０Ｌに懸濁した。撹拌しながら２Ｎ
水酸化ナトリウムを添加してプラスバシンを溶解し、最
終ｐＨを８.２とした後、Dowex １×２（酢酸タイプ）
１８×４０cmカラムに通過させた。カラムを水洗、０.
５Ｍ酢酸アンモニウム溶液で洗浄後、５０％メタノール
／０.５Ｍ酢酸アンモニウム溶液からプラスバシンを溶
出させた。溶出液を４℃で一晩冷却して析出した結晶性
のプラスバシンをろ別後、アセトンで洗浄した。真空乾
燥して精製プラスバシン３６ｇ（ＴＬＣ１スポット）
が黄色粉末として得られた。プラスバシンとしてはＡ₁、
Ｂ₁、Ａ₂、Ｂ₂、Ａ₃、Ａ₄（Ｂ₃）等、６〜７種以上の成
分が含まれている。

【００２０】（ｃ）プラスバシンＡ₃の分離精製上記（ｂ）で得た混合物からインビトロの抗菌活性が高
いプラスバシンＡ₃を分離精製した。（１）プラスバシンの粗分画上記の精製プラスバシン（ＴＬＣ１スポット）黄色粉
末１６ｇを脱イオン水１５０mlに溶解させる。予め２９
％アセトニトリル／５０mＭリン酸塩バッファー（ｐＨ
７.５）溶液で平衡化したBakerbond ＷｐＣ４（平均粒
径４０ミクロン）ガラスカラム８０mm × ４００mm（カ
ラム容積：約２Ｌ）に載せ、同バッファーを用い、流速
８５ml／ml（カラム内圧：２.５−３.６kg／cm２）で溶
出（１２Ｌ）を行い、プラスバシンＡ₁、Ｂ₁成分を分画
した。次いで、アセトニトリル濃度を３０％に上昇させ
て溶出（約９Ｌ）し、プラスバシンＡ₂、Ｂ₂成分を分画
した。最後にアセトニトリル濃度を３１％に上昇させて
溶出（約６Ｌ）し、プラスバシンＡ₃、Ａ₄成分を分画し
た。各分画物はアセトニトリルを留去した後、塩酸酸性
（ｐＨ２）としてｎ−ブタノール抽出、濃縮液にアセト
ンを加えて無色粉末とした。かくしてプラスバシン
Ａ₃、Ａ₄混合物４．５ｇが得られた。

【００２１】（２）プラスバシンＡ₃の単離逆相ＣＮＨＰＬＣによるプラスバシンＡ₃成分とＡ₄成
分の分離プラスバシンＡ₃、Ａ₄混合物０．５ｇを５０％メタノー
ル水６mlに溶解した後、ＨＰＬＣ分取を行った。ＨＰＬ
Ｃ分取条件は下記のとおりである。カラム：R-555-15，S-15，120A，CN 50 ×500mm (YMC) 移動層：２８％アセトニトリル／５０mＭリン酸（ｐＨ
２．２）流量：１００ml／分（内圧１７−２４kg／cm２Ｇ）検出：２２０nm 分析用ＨＰＬＣで単一ピークを示すプラスバシンＡ₃画
分を集めて減圧濃縮して溶媒を留去し、産生溶液からｎ
−ブタノール抽出を行った。ｎ−ブタノール抽出物は十
分水洗した後、減圧濃縮し、アセトンを加えて無色粉末
とした。精製プラスバシンＡ₃（カルボン酸）１９５mg
が得られた。

【００２２】（３）プラスバシンＡ₃ナトリウム塩の製
造精製プラスバシンＡ₃（カルボン酸）を精製水に溶解
し、撹拌しながら１Ｎ水酸化ナトリウムをゆっくりと加
えてｐＨを７．０に調節後、溶液を凍結乾燥すると無色
粉末としてプラスバシンＡ₃ナトリウム塩１９７mgが得
られた。

【００２３】プラスバシンは、特開平３−１８８０９８
に記載のごとく、グラム陽性菌に対して優れた抗菌活性
を有することが分かっているが、その水産用抗菌剤とし
ての有用性を以下の方法で試験した。試験例１急性毒性製造例で得たプラスバシンの急性毒性をラット及びマウ
スでの経口あるいは腹腔内投与で試験した。その結果、
試験を行った最大投与量（経口投与：300mg/kg，腹腔内
投与：100mg/kg）において両動物の雌雄共死亡例が出現
しなかった。以下に、ラット及びマウスにおけるプラス
バシンＡ₃の経口あるいは腹腔内投与での無毒性量を示
す。

【表１】本発明に係る化合物の魚毒性を農林省の定めた「魚類に
対する毒性試験」（40農政Ｂ第2,735号）に準じてヒメ
ダカを10mg／Ｌ試験液に96時間放飼したが、試験期間中
に異常は認められず，動物及び魚類に対して低毒性物質
としての特徴を有していることがわかった。

【００２４】試験例２畜産及び水産分野における主要
細菌性疾病起因菌に対する抗菌活性プラスバシンＡ₃の畜産及び水産分野における主要細菌
性疾病起因菌に対する抗菌活性をin vitroで試験し
た。即ち、表２に示す１４菌種１４菌株に対する抗菌
活性を、日本化学療法学会標準法に準じて寒天平板希釈
法あるいは液体希釈法で最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を
求めた。試験成績を表２に示す。

【表２】ＭＩＣ（μg/ml）菌種菌株名プラスバシンＡ₃ Escherichia coli NIHJ JC-2 >12.5Klebsiella pneumoniae ATCC 27736 >12.5Bordetella bronchiseptica H16 >12.5Treponema hyodysenteriae ATCC 27164 >12.5Actinobacillus pleuropneumoniae NB-001 >12.5Salmonella Enteritidis 8966（PT34） >12.5Pasteurella multocida D-6 >12.5Pasteurella piscicida No.2 >12.5Staphylococcus aureus FDA 209P 0.39Streptococcus agalactiae ATCC 9925 3.13Clostridium perfringens ATCC 13124 0.78Enterococcus seriolicida S-3452 0.2Mycoplasma gallisepticum S6 >12.5Mycoplasma hyodysenteriae ST-11 >12.5 表２から明らかに、プラスバシンはスタフィロコッカス
アウレウス(S．aureus)、ストレプトコッカスアガラ
クチィエ（S．agalactiae）、クロストリジウムパーフ
リゲンス（C．perfringens）及びエンテロコッカスセ
リオリシダ(E．seriolicida)等のグラム陽性菌に抗菌活
性を有する。

【００２５】以下の試験例３〜７に用いたプラスバシン
は、プラスバシンＡ₂、Ａ₃、Ａ₄、Ｂ₂、Ｂ₃の混合物で
ある。試験例３エンテロコッカスセリオリシダ(E．serioli
cida)に対する抗菌活性プラスバシンの野外より分離したマクロライド系薬剤、
リンコマイシン、オキシテトラサイクリンなどの薬剤に
耐性を示すエンテロコッカスセリオリシダ(E．serioli
cida)に対する感受性（ＭＩＣ）と四国及び九州地区よ
り分離した野外分離エンテロコッカスセリオリシダ
(E．seriolicida)66株に対する感受性分布をインビトロ
で試験した。これらの試験成績を表３と表４に示す。

【表３】ＭＩＣ（μg/ml）菌株名フ゜ラスハ゛シンエリスロマイシンリンコマイシンオキシテトラサイクリン S-3452 0.2 0.2 0.2 0.2 KS-9506 0.2 0.2 >25.0 0.39 KS-9508 0.2 0.2 >25.0 0.39 KS-9525 0.2 >25.0 >25.0 25.0 KS-9537 0.1 >25.0 >25.0 >25.0 SE94-071 0.2 >25.0 >25.0 >25.0 SE94-075 0.05 >25.0 >25.0 25.0 表３から明らかに、プラスバシンはリンコマイシン耐性
株、エリスロマイシン、リンコマイシン及びオキシテト
ラサイクリンの３薬剤に耐性を示す多剤耐性株に対して
も感受性株（S-3452）と同等の感受性を示した。

【００２６】

【表４】ＭＩＣ（μg/ml）分布由来調査株数 0.78 0.39 0.2 0.1 0.05 0.025 0.0125 九州 49 0 0 19 26 4 0 0 四国 17 0 0 7 6 2 2 0 合計 66 0 0 26(39.4) 32(48.5) 6(9.1) 2(3.0) 0 プラスバシンの野外分離エンテロコッカスセリオリシ
ダ(E．seriolicida)66株に対するＭＩＣは0.1μg/mlを
中心とする一峰性の分布を示し、プラスバシン低感受性
株が見られなかった。

【００２７】試験例４エンテロコッカスセリオリシ
ダ(E．seriolicida)実験感染ブリに対するプラスバシン
の治療効果エンテロコッカスセリオリシダ(E．seriolicida)を人
工的に感染させたブリに対するプラスバシンの治療効果
を次の方法で試験した。野外より分離したエンテロコッ
カスセリオリシダ(E．seriolicida) S-3452株をBrain
Heart infusion（ＢＨＩ、Difco製）液体培地で25℃、
一夜培養した新鮮培養菌液２mlを800ｇのブリの腹腔内
に接種感染させた（２×10⁹CFU／尾）。プラスバシンは
滅菌蒸留水に溶かしたプラスバシン水溶液としてゾンデ
で強制経口投与した。投与量と投与期間は野外において
Ｅ．seriolicida感染症の治療に通常実施されている方
法に準じて、投与量を体重kgあたり25、50あるいは100m
gを、それぞれ感染直後と以降24時間間隔２回、合計３
回与えた。陽性対照としてエリスロマイシンを体重kgあ
たり50mgとなるように給餌配合飼料に混和して、プラス
バシンと同様３回与えた。感染対照には薬剤を一切与え
なかった。これらの群には一群25尾を割り当てたが、感
染対照群で１尾の事故死があったため、この群のみ24尾
として試験を継続した。試験期間中の飼育条件は水温15
〜20℃の自然の成り行きにまかせ、給餌は一日一回冷凍
イカナゴを規定量与えた。感染後20日間生死を観察し、
生存率を指標に有効性を評価した。結果を表５に示し
た。

【００２８】

【表５】群供試尾数生存尾数生存率（％）感染対照 24 4 16.7 プラスバシン 25mg/kg 25 25 100＊＊ 50mg/kg 25 25 100＊＊ 100mg/kg 25 25 100＊＊エリスロマイシン 50mg/kg 25 25 100＊＊＊＊：感染対照を基準にP<0.01 感染対照群の生存率が16.7％であったのに対して、プラ
スバシン投与群の生存率はすべて100％であった。この
結果からプラスバシンはエンテロコッカスセリオリシ
ダ(E．seriolicida)感染ブリに対して低投与濃度で有効
な治療効果を示すと判定された。

【００２９】試験例５哺乳動物および鳥類におけるプ
ラスバシンの経口投与による吸収性哺乳動物（ラット、マウス）および鳥類（ニワトリ）に
おけるプラスバシンの経口投与による吸収性を次の方法
で調べた。投与量を体重ｋｇあたり300ｍｇになるよう
に調製したプラスバシン水溶液を経口用ゾンデで強制経
口投与し、ラットでは投与１、３時間目に、マウスとニ
ワトリでは投与１、３および６時間目に常法により採血
し、血漿中のプラスバシン濃度を測定した。血中濃度を
エンテロコッカスセリオリシダ（E．seriolicida）を
指標菌とするバイオアッセイ法で調べたが、本測定法に
よる検出限界は0.1μｇ／mlである。結果を表６に示す。

【表６】動物投与量投与後の時間出現率平均血中濃度（mg／kg）（時間）（％）（μg／ml）ラット（雄） 300 1 1／3（33.3） 0.062±0.107 3 0／3（ 0 ） <0.1 マウス（雌） 300 1 0／3（ 0 ） <0.1 3 0／3（ 0 ） <0.1 6 0／3（ 0 ） <0.1 ニワトリ 300 1 0／3（ 0 ） <0.1 3 0／3（ 0 ） <0.1 6 0／3（ 0 ） <0.1 ラットで、投与１時間目に３匹中１匹から0.186μg／ml
の血中濃度が観察されたが、それ以外の動物における血
中濃度は検出限界以下であった。この結果は、プラスバ
シンが哺乳動物および鳥類においては、経口投与で吸収
されにくい性質の物質であることを示している。

【００３０】試験例６魚類におけるプラスバシン
の経口投与による吸収性（１）魚類（ブリ）におけるプラスバシンの経口投与による吸
収性を次の方法で調べた。魚体重40〜50gのブリにプラ
スバシン水溶液を体重ｋｇあたり50ｍｇになるように強
制経口投与し、投与１、３、６、12および24時間目に常
法により採血し、上記試験例５と同様の方法で血漿中の
プラスバシン濃度を測定した。結果を表７に示す。

【表７】投与後の時間（時間）魚種条件 No. ０１３６ 12 24 ブリ水溶液１ − 1.16 0.65 0.95 − − ２ − 1.95 0.88 0.75 − − ３ − 1.60 1.04 0.70 0.48 − ４ − 1.22 1.35 0.70 0.74 − ５ − 1.22 0.51 0.88 0.86 − ６ − 1.50 0.70 1.30 1.04 − −：検出限界（0.1μg/ml）以下，数値：血中濃度（単位；μg/ml）プラスバシン水溶液経口投与後のプラスバシンの血中濃
度は投与１時間目をピークに、それ以後漸次低下し、12
時間目には６尾中２尾で、24時間目には全例で検出限界
以下に低下した。

【００３１】試験例７魚類におけるプラスバシンの
経口投与による吸収性（２）魚類（ブリ）におけるプラスバシンの経口投与による吸
収性を次の方法で調べた。体重150〜200gのブリにプラ
スバシン水溶液あるいはブリ用配合飼料にプラスバシン
を混和したプラスバシン混餌で，体重kgあたり50mgにな
るように経口投与した。投与後、水溶液では１，３，24
時間目に、混餌では１，３，６，12，24時間目に常法に
よって採血し、血漿中のプラスバシン濃度を調べた。結
果を表８に示す。

【表８】投与後の時間（時間）魚種条件 No. ０１３６ 12 24 ブリ水溶液１ − − 1.95 NT NT 0.72 ２ − 0.28 0.94 NT NT 0.76 ３ − 0.70 2.00 NT NT 1.18 ４ − 0.37 1.15 NT NT 0.72 ５ − − 0.46 NT NT 0.79 混餌１ − 1.30 0.73 1.20 0.51 ２ − 1.48 0.90 0.95 0.41 ３ 0.71 0.92 1.35 0.71 1.00 ４ 0.34 0.92 0.85 0.86 1.30 ５ NT NT NT NT 0.54 −：検出限界（0.1μg/ml）以下，数値：血中濃度（単位；μg/ml） NT：調査せずプラスバシン水溶液、混餌のいずれの場合でも、血中濃
度の推移は類似している。これら試験例６及び７の結果
は、プラスバシンが魚類で吸収されやすい性質を持つ物
質であることを示している。

【００３２】上記の試験例１〜７の結果から、プラスバ
シンは、グラム陽性菌に抗菌活性を有し、水産分野で最
大の養殖規模を誇っている養殖ブリにおける主要疾病で
ある連鎖球菌症の起因菌であるエンテロコッカスセリ
オリシダ（E．seriolicida）に対して有効な抗菌活性と
治療効果を示し、かつ哺乳動物や鳥類では吸収され難
く、魚類では吸収され易い安全性の高い化合物であるこ
とが分かる。これは、プラスバシンは水産分野における
グラム陽性菌に起因する疾病の予防と治療を介して効率
的な魚介類の飼育に貢献し得ることを示唆している。本
発明の水産性抗菌剤は、配合飼料あるいは生餌に有効量
のプラスバシンを添加することにより調製することがで
きる。その例を以下に示すが、本発明はこれらに限定さ
れるものではない。

【００３３】実施例１配合飼料魚粉６１％コーングルテンミール（大豆油粕）１２％デンプン１０％その他＊１６％＊その他：グルテン、グァーガム、リン酸カルシウム、
アルファルファモールからなる混合物。

【００３４】実施例２配合飼料魚粉８０％コーングルテンミール（大豆油粕）１０％小麦６％その他＊４％＊その他：グァーガム、炭酸カルシウム、豆乳粕、リ
ン酸カルシウム、飼料用酵母からなる混合物。

【００３５】実施例３生餌養殖水産動物用の生餌（主にまいわし）賦形物質＊＊賦形物質：グァーガム、ビール酵母、米糠油粕、小
麦粉、軽質流動パラフィン、無水ケイ酸、カルボキシメ
チルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウ
ム、乳糖、コーンスターチ、ポリオキシエチレンソルビ
タン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ
糖脂肪酸エステル等の単物質あるいは２物質以上含む混
合物。これら配合飼料あるいは生餌にプラスバシンを１日当た
り魚体重１kgにつき、プラスバシン10〜100mgを混合し
て摂取させる。プラスバシンを飼料に混合して投与する
以外に魚に経口、筋肉内、皮下等に投与することも可能
である。更には、水溶液として魚を水溶液中につける、
所謂、薬浴として投与することも可能である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成９年４月２３日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１０】本発明の抗菌剤を魚類に経口もしくは非経
口投与する場合には、プラスバシンをそのまま、あるい
は適当な剤形に製剤化して投与してもよいが、一般的に
は、通常使用される担体（例えば、脱脂米糠、脱脂大豆
粉、ふすま、カオリン、タルク、炭酸カルシウム、乳
糖、水、本発明の抗菌活性に影響を及ぼさない化学物質
等）と混合したものを投与するか、このような混合した
もの、もしくはプラスバシン単独を魚類用飼料もしくは
水と混合して投与する方法が好ましい。ここで使用するプラスバシンは、必ずしも精製品である
必要はなく、菌の培養物、粗製物（プラスバシン生産菌
を培地に培養して得られる培養物の部分的な製生物）、
さらにはプラスバシンを含有する菌体そのものであって
もよい。また、プラスバシンは上記の製薬上許容される
塩の形で用いることもできる。グラム陽性菌に起因する
疾病の予防、治療を目的としてプラスバシンを投与する
場合、魚種によって異なるが、１日当たりの投与量は、
体重kgあたり、通常、１mg〜２００mg、好ましくは５mg
〜１５０mg、より好ましくは１０mg〜１００mgである。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２３

【補正方法】変更

【補正内容】

【表１】本発明に係る化合物の魚毒性を農林水産省の定めた「魚
類に対する毒性試験」（40農政Ｂ第2,735号）に準じて
ヒメダカを10mg／Ｌ試験液に96時間放飼したが、試験期
間中に異常は認められず，動物及び魚類に対して低毒性
物質としての特徴を有していることがわかった。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２８】

【表５】群投与量(mg/kg) 供試尾数生存尾数生存率（％）感染対照 24 4 16.7 プラスバシン 25 25 25 100＊＊ 50 25 25 100＊＊ 100 25 25 100＊＊エリスロマイシン 50 25 25 100＊＊＊＊：感染対照群を基準にP<0.01 感染対照群の生存率が16.7％であったのに対して、プラ
スバシン投与群の生存率はすべて100％であった。この
結果からプラスバシンはエンテロコッカスセリオリシ
ダ(E．seriolicida)感染ブリに対して低投与量で有効な
治療効果を示すと判定された。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式Ｉ：【化１】［式中、ＸはＬ−ＨyＰro又はＬ−Ｐro、Ｒは−ＣＨ₃又は
−ＣＨ(ＣＨ₃)₂、ｎは９〜１２の整数を表す］で示され
る化合物又はその塩を有効成分とする魚介類における細
菌性疾患の予防又は治療のための水産用抗菌剤。
【請求項２】式Ｉ：【化２】［式中、ＸはＬ−ＨyＰro又はＬ−Ｐro、Ｒは−ＣＨ₃又は
−ＣＨ(ＣＨ₃)₂、ｎは９〜１２の整数を表す］で示され
る化合物及びその塩からなる群から選択される２種以上
の化合物を含有する水産用抗菌剤。
【請求項３】グラム陽性菌に起因する疾患の予防又は
治療に用いられる請求項１又は２に記載の水産用抗菌
剤。
【請求項４】式Ｉにおけるｎが９、１０又は１２であ
る請求項１又は２に記載の水産用抗菌剤。
【請求項５】式ＩにおけるＸがＬ−ＨyＰro、ｎが１
０、そしてＲが−ＣＨ(ＣＨ₃)₂である請求項１又は２に
記載の水産用抗菌剤。