JPH09229933A - ｐ５３蛋白質に対する自己抗体検出法 - Google Patents
ｐ５３蛋白質に対する自己抗体検出法Info
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- JPH09229933A JPH09229933A JP12412396A JP12412396A JPH09229933A JP H09229933 A JPH09229933 A JP H09229933A JP 12412396 A JP12412396 A JP 12412396A JP 12412396 A JP12412396 A JP 12412396A JP H09229933 A JPH09229933 A JP H09229933A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ｐ５３癌抑制遺伝子産物（ｐ５３蛋白
質）のＮ末端からのアミノ酸配列が１−１１２ペプチ
ド、１０８−３１０ペプチド、３０６−３９３ペプチ
ド、１−３９３ペプチドからなる群から選ばれる各ペプ
チド全体又はその一部、あるいはこれらの混合物を用い
て、ｐ５３蛋白質に対する自己抗体を検出する。 【効果】 再現性の高い正確な癌の診断が可能となる。
質）のＮ末端からのアミノ酸配列が１−１１２ペプチ
ド、１０８−３１０ペプチド、３０６−３９３ペプチ
ド、１−３９３ペプチドからなる群から選ばれる各ペプ
チド全体又はその一部、あるいはこれらの混合物を用い
て、ｐ５３蛋白質に対する自己抗体を検出する。 【効果】 再現性の高い正確な癌の診断が可能となる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ｐ５３蛋白質（ｐ
５３癌抑制遺伝子産物）に対する自己抗体を検出するた
めの免疫測定方法及び測定用キットに関するものであ
る。ｐ５３蛋白質に対する自己抗体は担癌患者の血中に
特異的に出現するものであり、したがって、本発明は、
自己抗体を単に測定する方法を提供するだけでなく、癌
の診断にも利用することができる。
５３癌抑制遺伝子産物）に対する自己抗体を検出するた
めの免疫測定方法及び測定用キットに関するものであ
る。ｐ５３蛋白質に対する自己抗体は担癌患者の血中に
特異的に出現するものであり、したがって、本発明は、
自己抗体を単に測定する方法を提供するだけでなく、癌
の診断にも利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】３９３アミノ酸からなる核内リン酸化蛋
白質をコードし、癌抑制遺伝子であるｐ５３癌抑制遺伝
子は、種々のヒト癌において高頻度に欠失と点突然変異
が認められ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２６２，ｐ．１
９８０，１９９３．１２．２４）、変異型ｐ５３蛋白質
は非常に長い半減期を有することから、癌細胞ではその
発現が増加し、蓄積することが知られている。一方、担
癌患者においては、血中にｐ５３蛋白質と反応する自己
抗体が出現することがウエスタンブロット法及び免疫沈
降法等で認められている。
白質をコードし、癌抑制遺伝子であるｐ５３癌抑制遺伝
子は、種々のヒト癌において高頻度に欠失と点突然変異
が認められ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２６２，ｐ．１
９８０，１９９３．１２．２４）、変異型ｐ５３蛋白質
は非常に長い半減期を有することから、癌細胞ではその
発現が増加し、蓄積することが知られている。一方、担
癌患者においては、血中にｐ５３蛋白質と反応する自己
抗体が出現することがウエスタンブロット法及び免疫沈
降法等で認められている。
【０００３】これらのことから、ｐ５３蛋白質の異常蓄
積は癌組織に特徴的であると考えられ、また、このｐ５
３蛋白質に対する自己抗体の検出は、特異性が高い癌診
断薬に応用可能である。
積は癌組織に特徴的であると考えられ、また、このｐ５
３蛋白質に対する自己抗体の検出は、特異性が高い癌診
断薬に応用可能である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、特異性が高く再現性も有する極めて信頼性の高
い癌診断システムに応用することのできる、ｐ５３蛋白
質に対する自己抗体の検出システムを提供することであ
る。
目的は、特異性が高く再現性も有する極めて信頼性の高
い癌診断システムに応用することのできる、ｐ５３蛋白
質に対する自己抗体の検出システムを提供することであ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に鋭意研究を行った結果、本発明者らは、ｐ５３蛋白質
のペプチド断片（つまりｐ５３蛋白質中の特定のアミノ
酸配列からなるペプチド）が自己抗体と特異的に結合す
ることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明
は、ｐ５３蛋白質全体ではなくそれを構成するペプチド
断片が自己抗体と特異的に結合するという新しい知見に
基づいてなされたものであって、担体に固定した該ペプ
チド断片、及び、標識した抗ヒトイムノグロブリン抗体
を用いることを基本的技術思想とするｐ５３蛋白質に対
する自己抗体の測定方法に関するものである。
に鋭意研究を行った結果、本発明者らは、ｐ５３蛋白質
のペプチド断片（つまりｐ５３蛋白質中の特定のアミノ
酸配列からなるペプチド）が自己抗体と特異的に結合す
ることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明
は、ｐ５３蛋白質全体ではなくそれを構成するペプチド
断片が自己抗体と特異的に結合するという新しい知見に
基づいてなされたものであって、担体に固定した該ペプ
チド断片、及び、標識した抗ヒトイムノグロブリン抗体
を用いることを基本的技術思想とするｐ５３蛋白質に対
する自己抗体の測定方法に関するものである。
【０００６】その測定原理は、該ペプチド断片をマイク
ロプレートその他の担体に固相化しておき、これに該自
己抗体を含有すると予想されるサンプルを適用して該ペ
プチド断片と反応結合させ、次いで酵素等で標識した抗
ヒトイムノグロブリン抗体を適用して該自己抗体に反応
結合せしめた後、基質発色剤等を反応させて吸光度の測
定を行うことよりなる。また、本発明の測定方法には、
上記した方法のほか、ウエスタンブロット法、免疫組織
染色法、及び免疫沈降法等も包含される。以下、本発明
について詳述する。
ロプレートその他の担体に固相化しておき、これに該自
己抗体を含有すると予想されるサンプルを適用して該ペ
プチド断片と反応結合させ、次いで酵素等で標識した抗
ヒトイムノグロブリン抗体を適用して該自己抗体に反応
結合せしめた後、基質発色剤等を反応させて吸光度の測
定を行うことよりなる。また、本発明の測定方法には、
上記した方法のほか、ウエスタンブロット法、免疫組織
染色法、及び免疫沈降法等も包含される。以下、本発明
について詳述する。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明を実施するには、ｐ５３蛋
白質（そのアミノ酸配列を図１に示す）を構成する特定
のペプチド断片を使用するが、これらのペプチド断片は
次のようにして作製する。
白質（そのアミノ酸配列を図１に示す）を構成する特定
のペプチド断片を使用するが、これらのペプチド断片は
次のようにして作製する。
【０００８】ヒト線維芽細胞等の細胞のＳＶ４０ウイル
ス、Ｅ１アデノウイルス、Ｅ６パピローマウイルス等に
よるトランスフォーマントから抽出したｍＲＮＡからｃ
ＤＮＡを作製し、これをＰＣＲ法によって増幅した後制
限酵素で切断し、断片をベクターに組み込み、得られた
発現ベクターで大腸菌等の宿主を形質転換し、必要あれ
ば誘導処理した後、宿主を培養し、菌体溶解物から目的
とする融合蛋白質を抽出し、精製する。このようにし
て、ｐ５３のＧＳＴ融合蛋白質を、例えばＮ末端ドメイ
ン（ｐ５３蛋白質のＮ末端からのアミノ酸配列が１−１
１２のペプチド）、コアドメイン（１０８−３１０ペプ
チド）、Ｃ末端ドメイン（３０６−３９３ペプチド）、
及び全長（１−３９３ペプチド）について作成する。
ス、Ｅ１アデノウイルス、Ｅ６パピローマウイルス等に
よるトランスフォーマントから抽出したｍＲＮＡからｃ
ＤＮＡを作製し、これをＰＣＲ法によって増幅した後制
限酵素で切断し、断片をベクターに組み込み、得られた
発現ベクターで大腸菌等の宿主を形質転換し、必要あれ
ば誘導処理した後、宿主を培養し、菌体溶解物から目的
とする融合蛋白質を抽出し、精製する。このようにし
て、ｐ５３のＧＳＴ融合蛋白質を、例えばＮ末端ドメイ
ン（ｐ５３蛋白質のＮ末端からのアミノ酸配列が１−１
１２のペプチド）、コアドメイン（１０８−３１０ペプ
チド）、Ｃ末端ドメイン（３０６−３９３ペプチド）、
及び全長（１−３９３ペプチド）について作成する。
【０００９】ｐ５３ペプチド断片（以下、ｐ５３ペプチ
ドということもある）は、上記のように遺伝子組換え技
術によるほか、ｐ５３蛋白質についてはその全アミノ酸
配列が既知であるので（例えば、Mol. Cell. Biol., Vo
l.15, No.7, 1985, p.1601-1610）、酵素分解等によっ
て各種のペプチド断片に切断して作成してもよいし、市
販の自動ペプチド合成装置を用いても容易に作成するこ
とができる。また、本発明においては、上記した各ペプ
チド断片の全体のほか、その一部も使用できるし、それ
らの混合物も使用でき、これらも上記ｐ５３ペプチドに
包含される。
ドということもある）は、上記のように遺伝子組換え技
術によるほか、ｐ５３蛋白質についてはその全アミノ酸
配列が既知であるので（例えば、Mol. Cell. Biol., Vo
l.15, No.7, 1985, p.1601-1610）、酵素分解等によっ
て各種のペプチド断片に切断して作成してもよいし、市
販の自動ペプチド合成装置を用いても容易に作成するこ
とができる。また、本発明においては、上記した各ペプ
チド断片の全体のほか、その一部も使用できるし、それ
らの混合物も使用でき、これらも上記ｐ５３ペプチドに
包含される。
【００１０】ｐ５３ペプチドの固相化担体の調製は、蛋
白質を固相面に結合する既知の方法を用いて容易に行う
ことができる。例えば、固相化担体としては、通常、ビ
ーズ、マイクロプレート、チューブ等が用いられる。こ
れらの固相面にｐ５３ペプチドを結合する方法として
は、物理吸着、化学結合等既知の固定化技術が適宜利用
できる。
白質を固相面に結合する既知の方法を用いて容易に行う
ことができる。例えば、固相化担体としては、通常、ビ
ーズ、マイクロプレート、チューブ等が用いられる。こ
れらの固相面にｐ５３ペプチドを結合する方法として
は、物理吸着、化学結合等既知の固定化技術が適宜利用
できる。
【００１１】このようにして固相化したｐ５３ペプチド
と自己抗体含有サンプルとを接触させると、ｐ５３蛋白
質に対する自己抗体のみが特異的にｐ５３ペプチドと結
合する。そこで、標識した抗ヒトイムノグロブリン抗体
を加えると、該抗体は自己抗体と結合するので、この標
識を利用して測定を行うことができる。
と自己抗体含有サンプルとを接触させると、ｐ５３蛋白
質に対する自己抗体のみが特異的にｐ５３ペプチドと結
合する。そこで、標識した抗ヒトイムノグロブリン抗体
を加えると、該抗体は自己抗体と結合するので、この標
識を利用して測定を行うことができる。
【００１２】標識としては、酵素、ラジオアイソトー
プ、ＦＩＴＣやローダミンといった蛍光物質等常用され
る標識が適宜使用される。
プ、ＦＩＴＣやローダミンといった蛍光物質等常用され
る標識が適宜使用される。
【００１３】標識酵素としては、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）、ウシ小腸アルカリフォスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオ
キシダーゼ等の酵素免疫分析法（ＥＩＡ）に常用される
酵素が適宜使用され、これらの酵素に適合しＥＩＡで常
用される発色基質が適宜使用される。発色基質として
は、例えばＨＲＰの場合は、３，３′，５，５′−テト
ラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、ＴＭＢＺ・ＨＣｌ、
ＴＭＢＺ・ＰＳ、ＡＢＴＳ、ｏ−フェニレンジアミン、
ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸等が使用され、アルカリフ
ォスファターゼの場合は、ｐ−ニトロフェニルフォスフ
ェート、４−メチルウンベリフェリルフォスフェート等
が使用され、β−ガラクトシダーゼの場合は、ｏ−ニト
ロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−メチル
ウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド等が使用
される。
ダーゼ（ＨＲＰ）、ウシ小腸アルカリフォスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオ
キシダーゼ等の酵素免疫分析法（ＥＩＡ）に常用される
酵素が適宜使用され、これらの酵素に適合しＥＩＡで常
用される発色基質が適宜使用される。発色基質として
は、例えばＨＲＰの場合は、３，３′，５，５′−テト
ラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、ＴＭＢＺ・ＨＣｌ、
ＴＭＢＺ・ＰＳ、ＡＢＴＳ、ｏ−フェニレンジアミン、
ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸等が使用され、アルカリフ
ォスファターゼの場合は、ｐ−ニトロフェニルフォスフ
ェート、４−メチルウンベリフェリルフォスフェート等
が使用され、β−ガラクトシダーゼの場合は、ｏ−ニト
ロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−メチル
ウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド等が使用
される。
【００１４】酵素と基質とを反応させ、各基質にそれぞ
れ特有の吸光度又は蛍光光度を測定し、もって自己抗体
の測定を行うものである。以下、本発明の実施例につい
て述べる。
れ特有の吸光度又は蛍光光度を測定し、もって自己抗体
の測定を行うものである。以下、本発明の実施例につい
て述べる。
【００１５】
【実施例１：ｐ５３のＧＳＴ融合蛋白質の作製】４種類
のｐ５３ペプチド、すなわちＮ末端からのアミノ酸配列
が１−１１２ペプチド、１０８−３１０ペプチド、３０
６−３９３ペプチド、１−３９３ペプチドとＧＳＴ（グ
ルタチオンＳトランスフェラーゼ）との融合蛋白質を以
下により作製した。
のｐ５３ペプチド、すなわちＮ末端からのアミノ酸配列
が１−１１２ペプチド、１０８−３１０ペプチド、３０
６−３９３ペプチド、１−３９３ペプチドとＧＳＴ（グ
ルタチオンＳトランスフェラーゼ）との融合蛋白質を以
下により作製した。
【００１６】ヒト線維芽細胞ＷＩ−３８のＳＶ４０トラ
ンスフォーマントであるＷＩ−３８ＶＡ１３よりＲＮＡ
を抽出した。抽出は、ＡＧＰＣ法を用いて、次のように
して行った。
ンスフォーマントであるＷＩ−３８ＶＡ１３よりＲＮＡ
を抽出した。抽出は、ＡＧＰＣ法を用いて、次のように
して行った。
【００１７】（ＡＧＰＣ法試薬の調製） （１）１Ｍ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０） クエン酸三ナトリウム ２９．４ｇ Ｈ2Ｏ ８０ｍｌ クエン酸を加え溶解して、ｐＨ７．０にあわせる。Ｈ2
Ｏで１００ｍｌとし、オートクレーブして使用する。 （２）Ｄ液 ＧＴＣ（グアニジウムチオシアネート） ２３６．３ｇ（４Ｍ） ザルコシル ２．５ｇ（０．８％） １Ｍ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７.０） １２.５ｍｌ(２５ｍＭ) Ｈ2Ｏ ２５０ｍｌ ８５℃で加温溶解する。室温に戻し、水で４９６ｍｌに
あわせる。径０．４５μＭボトルトップフィルターで濾
過して保存する。使用時に保存溶液５０ｍｌに対して２
−ＭＥ ３６０μｌ（０．１Ｍ）を加える。 （３）２Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０） 酢酸ナトリウム トリハイドレート ２７．２ｇ Ｈ2Ｏ １０ｍｌ 酢酸でｐＨ４．０にあわせる。Ｈ2Ｏを加えて１００ｍ
ｌとする。径０．４５μｍボトルトップフィルターで濾
過して使用する。
Ｏで１００ｍｌとし、オートクレーブして使用する。 （２）Ｄ液 ＧＴＣ（グアニジウムチオシアネート） ２３６．３ｇ（４Ｍ） ザルコシル ２．５ｇ（０．８％） １Ｍ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７.０） １２.５ｍｌ(２５ｍＭ) Ｈ2Ｏ ２５０ｍｌ ８５℃で加温溶解する。室温に戻し、水で４９６ｍｌに
あわせる。径０．４５μＭボトルトップフィルターで濾
過して保存する。使用時に保存溶液５０ｍｌに対して２
−ＭＥ ３６０μｌ（０．１Ｍ）を加える。 （３）２Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０） 酢酸ナトリウム トリハイドレート ２７．２ｇ Ｈ2Ｏ １０ｍｌ 酢酸でｐＨ４．０にあわせる。Ｈ2Ｏを加えて１００ｍ
ｌとする。径０．４５μｍボトルトップフィルターで濾
過して使用する。
【００１８】（ＡＧＰＣ法の操作） （１）Ｄ液０．５ｍｌを加え、細胞をとかす。 （２）Ｄ液０．５ｍｌに対し、 ２Ｍ 酢酸ナトリウム ５０μｌ フェノール ０．５ｍｌ クロロホルム／イソアミルアルコール(４９/ｌ) １００μｌ を順次加え、１種類いれるごとに、チューブを２〜３回
振り、混ぜる。 （３）全部いれたら、１０秒間激しく混ぜた後、１５分
間氷冷する。 （４）１０，０００ｘｇで２０分間遠心すると、ＤＮＡ
は中間層に行くので、水層を別のチューブに移す。ＤＮ
Ａを吸い取らないように注意する。 （５）イソプロパノール０．５ｍｌを加え、−２０℃で
１時間以上冷やす。次に、１０分間遠心し、ＲＮＡを沈
殿させる。 （６）沈殿を０．５ｍｌのＤ液に再び溶解する。イソプ
ロパノール０．５ｍｌを加え、−２０℃で１時間以上置
く。 （７）遠心してＲＮＡを沈殿させ、沈殿を８０％エタノ
ールで洗い、乾燥させた後、水に溶解する。
振り、混ぜる。 （３）全部いれたら、１０秒間激しく混ぜた後、１５分
間氷冷する。 （４）１０，０００ｘｇで２０分間遠心すると、ＤＮＡ
は中間層に行くので、水層を別のチューブに移す。ＤＮ
Ａを吸い取らないように注意する。 （５）イソプロパノール０．５ｍｌを加え、−２０℃で
１時間以上冷やす。次に、１０分間遠心し、ＲＮＡを沈
殿させる。 （６）沈殿を０．５ｍｌのＤ液に再び溶解する。イソプ
ロパノール０．５ｍｌを加え、−２０℃で１時間以上置
く。 （７）遠心してＲＮＡを沈殿させ、沈殿を８０％エタノ
ールで洗い、乾燥させた後、水に溶解する。
【００１９】このようにして抽出したｍＲＮＡから、次
の反応条件にて、ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ａｓｅ（ＲＴ）反応によりｃＤＮＡを作成した。ＲＴ反
応は、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔａｓｅ（商品名 Superscript）を使用し
た。反応組成は次のとおりである。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ
ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ｄＮＴＰ、７．５μｇ／ｍｌの
ランダム ヘキサマー、ＲＮａｓｉｎ（プロメガ社、Ｒ
Ｎａｓｅインヒビター）を１０００Ｕ／ｍｌ、ＲＮａｓ
ｅＨ-（リバース トランスクリプターゼ）を２００，
０００Ｕ／ｍｌ。
の反応条件にて、ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ａｓｅ（ＲＴ）反応によりｃＤＮＡを作成した。ＲＴ反
応は、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔａｓｅ（商品名 Superscript）を使用し
た。反応組成は次のとおりである。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ
ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ｄＮＴＰ、７．５μｇ／ｍｌの
ランダム ヘキサマー、ＲＮａｓｉｎ（プロメガ社、Ｒ
Ｎａｓｅインヒビター）を１０００Ｕ／ｍｌ、ＲＮａｓ
ｅＨ-（リバース トランスクリプターゼ）を２００，
０００Ｕ／ｍｌ。
【００２０】次に、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を５
´末端に有するＰＣＲｐｒｉｍｅｒにて増幅後、Ｂａｍ
ＨＩにて消化し、ｐＧＥＸ−５Ｘ−２ベクターのＢａｍ
ＨＩ部位に組み込んだ。シークエンス法にてインサート
が正しく組み込まれていることを確認した後、大腸菌Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３），ＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にト
ランスフォーム後、０．１ｍＭのイソプロピルチオベー
タガラクトシド（ＩＰＴＧ）にて３７℃、２時間あるい
は２５℃、６時間誘導をかけた。大腸菌の細胞ライゼイ
トより目的の融合蛋白質をグルタチオンセファロースを
用いたアフィニティークロマトグラフィー法にて抽出、
精製した。各発現蛋白質は、ｐ５３を認識している抗体
を用いたウエスタンブロッティング法で確認した。
´末端に有するＰＣＲｐｒｉｍｅｒにて増幅後、Ｂａｍ
ＨＩにて消化し、ｐＧＥＸ−５Ｘ−２ベクターのＢａｍ
ＨＩ部位に組み込んだ。シークエンス法にてインサート
が正しく組み込まれていることを確認した後、大腸菌Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３），ＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にト
ランスフォーム後、０．１ｍＭのイソプロピルチオベー
タガラクトシド（ＩＰＴＧ）にて３７℃、２時間あるい
は２５℃、６時間誘導をかけた。大腸菌の細胞ライゼイ
トより目的の融合蛋白質をグルタチオンセファロースを
用いたアフィニティークロマトグラフィー法にて抽出、
精製した。各発現蛋白質は、ｐ５３を認識している抗体
を用いたウエスタンブロッティング法で確認した。
【００２１】すなわち、各発現蛋白質（ｐ５３（１−１
１２）、ｐ５３（１０８−３１０）、ｐ５３（３０６−
３９３）、ｐ５３（１−３９３））について、Ｎ−末端
からのアミノ酸配列が４６−５５ペプチドを特異的に認
識するモノクローナル抗体（ｐＡｂ １８０１）、同２
１２−２１７ペプチド認識モノクローナル抗体（ｐＡｂ
２４０）、同３７１−３８０ペプチド認識モノクローナ
ル抗体（ｐＡｂ４２１）（これらのモノクローナル抗体
は、既知であり、市販されている）を用いて、その反応
性を調べ、下記表１の結果を得た。
１２）、ｐ５３（１０８−３１０）、ｐ５３（３０６−
３９３）、ｐ５３（１−３９３））について、Ｎ−末端
からのアミノ酸配列が４６−５５ペプチドを特異的に認
識するモノクローナル抗体（ｐＡｂ １８０１）、同２
１２−２１７ペプチド認識モノクローナル抗体（ｐＡｂ
２４０）、同３７１−３８０ペプチド認識モノクローナ
ル抗体（ｐＡｂ４２１）（これらのモノクローナル抗体
は、既知であり、市販されている）を用いて、その反応
性を調べ、下記表１の結果を得た。
【００２２】
【表１】
【００２３】上記結果から明らかなように、各ｐ５３ペ
プチドのＧＳＴ融合蛋白質は、それぞれ対応する各抗体
と正確に反応しており、上記によって得られた各発現蛋
白質が目的とする各ｐ５３ペプチドであることが確認さ
れた。
プチドのＧＳＴ融合蛋白質は、それぞれ対応する各抗体
と正確に反応しており、上記によって得られた各発現蛋
白質が目的とする各ｐ５３ペプチドであることが確認さ
れた。
【００２４】
【実施例２：血中ｐ５３自己抗体の検出】ヒト線維芽細
胞ＷＩ−３８のＳＶ４０トランスフォーマントであるＷ
Ｉ−３８ＶＡ１３を抗原として、常法にしたがってウエ
スタンブロット法により各種癌患者血清についてスクリ
ーニングを行った。得られた結果を下記表２に示すが、
この結果から明らかなように、健常成人０．０％に対し
て胃癌、肺癌、大腸癌の各患者血清中に野生型ｐ５３癌
抑制遺伝子産物に対する自己抗体を検出した。
胞ＷＩ−３８のＳＶ４０トランスフォーマントであるＷ
Ｉ−３８ＶＡ１３を抗原として、常法にしたがってウエ
スタンブロット法により各種癌患者血清についてスクリ
ーニングを行った。得られた結果を下記表２に示すが、
この結果から明らかなように、健常成人０．０％に対し
て胃癌、肺癌、大腸癌の各患者血清中に野生型ｐ５３癌
抑制遺伝子産物に対する自己抗体を検出した。
【００２５】
【表２】
【００２６】
【実施例３：ｐ５３のＧＳＴ融合蛋白質を用いた血中ｐ
５３自己抗体の検出（ウエスタンブロット法）】ｐ５３
（１−１１２）、ｐ５３（１０８−３１０）、ｐ５３
（３０６−３９３）、ｐ５３（１−３９３）の各ペプチ
ドのＧＳＴ融合蛋白質について、それぞれ、Ｌａｅｍｍ
ｌｉの方法にしたがって１２．５％ＳＤＳポリアクリル
アミドゲルにて電気泳動した後、バイオラッド社製のウ
エスタンブロット装置で全融合蛋白質をニトロセルロー
スメンブレン（ミリポア社）に電気的に転写した。
５３自己抗体の検出（ウエスタンブロット法）】ｐ５３
（１−１１２）、ｐ５３（１０８−３１０）、ｐ５３
（３０６−３９３）、ｐ５３（１−３９３）の各ペプチ
ドのＧＳＴ融合蛋白質について、それぞれ、Ｌａｅｍｍ
ｌｉの方法にしたがって１２．５％ＳＤＳポリアクリル
アミドゲルにて電気泳動した後、バイオラッド社製のウ
エスタンブロット装置で全融合蛋白質をニトロセルロー
スメンブレン（ミリポア社）に電気的に転写した。
【００２７】このメンブレンを５％ 脱脂粉乳含有リン
酸緩衝液に室温で一晩浸した後、この希釈用緩衝液で４
００倍希釈した血清を室温にて反応させた。次いで０．
１％Ｔｗｅｅｎ ２０含有リン酸緩衝液（ＴＰＢＳ）で
洗浄した後、希釈用緩衝液で８０００倍に希釈したヤギ
抗ヒトＩｇＧ抗体（シグマ社）のペルオキシダーゼ標識
物と反応させ、ルミノール酸化反応を利用したＥＣＬ法
（アマシャム社）にて検出した。その結果、各ｐ５３ペ
プチドのＧＳＴ融合蛋白質との反応が確認された。
酸緩衝液に室温で一晩浸した後、この希釈用緩衝液で４
００倍希釈した血清を室温にて反応させた。次いで０．
１％Ｔｗｅｅｎ ２０含有リン酸緩衝液（ＴＰＢＳ）で
洗浄した後、希釈用緩衝液で８０００倍に希釈したヤギ
抗ヒトＩｇＧ抗体（シグマ社）のペルオキシダーゼ標識
物と反応させ、ルミノール酸化反応を利用したＥＣＬ法
（アマシャム社）にて検出した。その結果、各ｐ５３ペ
プチドのＧＳＴ融合蛋白質との反応が確認された。
【００２８】
【実施例４：ＥＩＡによる血中ｐ５３自己抗体の測定】
各ｐ５３合成ペプチドのＧＳＴ融合蛋白質をそれぞれ用
いて、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）による血中ｐ５３自己
抗体の測定を次のようにして行った。
各ｐ５３合成ペプチドのＧＳＴ融合蛋白質をそれぞれ用
いて、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）による血中ｐ５３自己
抗体の測定を次のようにして行った。
【００２９】各ｐ５３合成ペプチドのＧＳＴ融合蛋白質
をリン酸緩衝液で０．６μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、５
０μｌずつ９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）に加
えた後、２時間室温に放置して、ｐ５３合成ペプチド固
相化マイクロプレートを作製した。ＴＰＢＳで洗浄後、
５％ 脱脂粉乳含有ＴＰＢＳを１ウエル当り２００μｌ
加え、２４時間４℃に放置してブロッキングを行なっ
た。
をリン酸緩衝液で０．６μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、５
０μｌずつ９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）に加
えた後、２時間室温に放置して、ｐ５３合成ペプチド固
相化マイクロプレートを作製した。ＴＰＢＳで洗浄後、
５％ 脱脂粉乳含有ＴＰＢＳを１ウエル当り２００μｌ
加え、２４時間４℃に放置してブロッキングを行なっ
た。
【００３０】５％ 脱脂粉乳含有ＴＰＢＳにて５０倍に
希釈した血清検体を５０μｌずつ添加後２時間反応させ
た。ＴＰＢＳで洗浄後、５％ 脱脂粉乳含有ＴＰＢＳに
て５００００倍に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体のペル
オキシダーゼ標識物を５０μｌずつ添加後、室温で２時
間反応させた。ＴＰＢＳで洗浄後、過酸化水素とＯ−フ
ェニレンジアミンの混合溶液を添加後３０分反応させ、
硫酸を添加後４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。ｐ
５３蛋白に対する自己抗体の存在がウエスタンブロット
法で認められなかった正常人血清の吸光度の平均＋３＊
標準偏差をカットオフ値として、それ以上の吸光度を示
すものを陽性として、ウエスタンブロット法の結果と比
較した。結果を下記表３に示す。
希釈した血清検体を５０μｌずつ添加後２時間反応させ
た。ＴＰＢＳで洗浄後、５％ 脱脂粉乳含有ＴＰＢＳに
て５００００倍に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体のペル
オキシダーゼ標識物を５０μｌずつ添加後、室温で２時
間反応させた。ＴＰＢＳで洗浄後、過酸化水素とＯ−フ
ェニレンジアミンの混合溶液を添加後３０分反応させ、
硫酸を添加後４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。ｐ
５３蛋白に対する自己抗体の存在がウエスタンブロット
法で認められなかった正常人血清の吸光度の平均＋３＊
標準偏差をカットオフ値として、それ以上の吸光度を示
すものを陽性として、ウエスタンブロット法の結果と比
較した。結果を下記表３に示す。
【００３１】
【表３】
【００３２】
【発明の効果】本発明により、ｐ５３蛋白質のペプチド
断片がｐ５３蛋白質に対する自己抗体に特異的に結合す
るという新知見に基づく、該自己抗体の測定システムが
はじめて開発された。ｐ５３ペプチドは特異性が高いた
め、本測定法は再現性のある結果が得られ、癌の診断に
非常に有効である。また、ｐ５３ペプチドを用いる本測
定法ないし検出法としては、ＥＩＡ、ＲＩＡ、免疫組織
染色法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法等が挙げら
れ、これらの方法を総合的に利用することにより、更に
正確な癌の診断が可能となる。
断片がｐ５３蛋白質に対する自己抗体に特異的に結合す
るという新知見に基づく、該自己抗体の測定システムが
はじめて開発された。ｐ５３ペプチドは特異性が高いた
め、本測定法は再現性のある結果が得られ、癌の診断に
非常に有効である。また、ｐ５３ペプチドを用いる本測
定法ないし検出法としては、ＥＩＡ、ＲＩＡ、免疫組織
染色法、免疫沈降法、ウエスタンブロット法等が挙げら
れ、これらの方法を総合的に利用することにより、更に
正確な癌の診断が可能となる。
【００３３】本発明によれば、自己抗体の測定方法が提
供されるだけでなく、ｐ５３ペプチド及び必要あればマ
イクロプレート、緩衝液、酵素標識抗体、発色基質等を
セットにした測定用キットも提供され、自己抗体の全測
定システムが有利に提供される。また、ｐ５３ペプチド
は特異性の高い腫瘍マーカーとして各種用途に利用する
ことができる。
供されるだけでなく、ｐ５３ペプチド及び必要あればマ
イクロプレート、緩衝液、酵素標識抗体、発色基質等を
セットにした測定用キットも提供され、自己抗体の全測
定システムが有利に提供される。また、ｐ５３ペプチド
は特異性の高い腫瘍マーカーとして各種用途に利用する
ことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐ５３蛋白質のアミノ酸配列を示す。
Claims (4)
- 【請求項１】 ｐ５３蛋白質を構成するペプチド断片を
固相化した担体、及び、標識した抗ヒトイムノグロブリ
ン抗体を使用すること、を特徴とするｐ５３蛋白質に対
する自己抗体を検出する免疫測定方法。 - 【請求項２】 ペプチド断片が、野生型ｐ５３蛋白質の
Ｎ末端からのアミノ酸配列が１−１１２ペプチド、１０
８−３１０ペプチド、３０６−３９３ペプチド、及び１
−３９３ペプチドからなる群から選ばれる各ペプチド全
体又はその一部、あるいはこれら２種以上の混合物であ
ること、を特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 免疫測定方法が、放射免疫測定方法、酵
素免疫測定方法、蛍光免疫測定方法、及び／又は、化学
発光免疫測定方法であること、を特徴とする請求項１又
は請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 野生型ｐ５３蛋白質のＮ末端からのアミ
ノ酸配列が１−１１２ペプチド、１０８−３１０ペプチ
ド、３０６−３９３ペプチド、及び１−３９３ペプチド
からなる群から選ばれる各ペプチド全体又はその一部、
あるいはこれら２種以上の混合物を含有すること、を特
徴とするｐ５３蛋白質に対する自己抗体の測定用キッ
ト。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12412396A JPH09229933A (ja) | 1996-02-27 | 1996-02-27 | ｐ５３蛋白質に対する自己抗体検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12412396A JPH09229933A (ja) | 1996-02-27 | 1996-02-27 | ｐ５３蛋白質に対する自己抗体検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09229933A true JPH09229933A (ja) | 1997-09-05 |
Family
ID=14877501
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12412396A Pending JPH09229933A (ja) | 1996-02-27 | 1996-02-27 | ｐ５３蛋白質に対する自己抗体検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09229933A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006084224A (ja) * | 2004-09-14 | 2006-03-30 | Yamaguchi Univ | 肝細胞癌の新規腫瘍マーカーとしての機能を有する抗ＨＨＭＩｇＧ抗体、肝癌のスクリーニング法および肝癌進行度のマーカーとしての利用 |
| JP2015172512A (ja) * | 2014-03-11 | 2015-10-01 | 学校法人北里研究所 | 生体試料中の疾患関連自己抗体の検出方法、キット及び検出装置 |
| US9696319B2 (en) | 1998-05-11 | 2017-07-04 | Oncimmune Ltd. | Tumour markers |
-
1996
- 1996-02-27 JP JP12412396A patent/JPH09229933A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9696319B2 (en) | 1998-05-11 | 2017-07-04 | Oncimmune Ltd. | Tumour markers |
| JP2006084224A (ja) * | 2004-09-14 | 2006-03-30 | Yamaguchi Univ | 肝細胞癌の新規腫瘍マーカーとしての機能を有する抗ＨＨＭＩｇＧ抗体、肝癌のスクリーニング法および肝癌進行度のマーカーとしての利用 |
| JP2015172512A (ja) * | 2014-03-11 | 2015-10-01 | 学校法人北里研究所 | 生体試料中の疾患関連自己抗体の検出方法、キット及び検出装置 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20040601 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |