JPH09173063A - 抗ヒトリポタンパク質（ａ）モノクローナル抗体可変領域のＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列 - Google Patents
抗ヒトリポタンパク質（ａ）モノクローナル抗体可変領域のＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列Info
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- JPH09173063A JPH09173063A JP7351455A JP35145595A JPH09173063A JP H09173063 A JPH09173063 A JP H09173063A JP 7351455 A JP7351455 A JP 7351455A JP 35145595 A JP35145595 A JP 35145595A JP H09173063 A JPH09173063 A JP H09173063A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトリポタンパク質（ａ）を認識するモノク
ローナル抗体であるＫＯＳ−Ａ抗体の可変領域を構成す
るＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域を再構成することを可能
とし、ヒトリポタンパク質（ａ）を特異的に認識する組
換え抗体を製造することを可能にする。 【解決手段】 抗ヒトリポタンパク質（ａ）モノクロ−
ナル抗体ＫＯＳ−ＡのＨ鎖Ｖ領域またはＬ鎖Ｖ領域の塩
基配列またはアミノ酸配列であって、ヒトリポタンパク
質（ａ）を認識する機能を担う、配列表の配列番号１−
４で示される配列。
ローナル抗体であるＫＯＳ−Ａ抗体の可変領域を構成す
るＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域を再構成することを可能
とし、ヒトリポタンパク質（ａ）を特異的に認識する組
換え抗体を製造することを可能にする。 【解決手段】 抗ヒトリポタンパク質（ａ）モノクロ−
ナル抗体ＫＯＳ−ＡのＨ鎖Ｖ領域またはＬ鎖Ｖ領域の塩
基配列またはアミノ酸配列であって、ヒトリポタンパク
質（ａ）を認識する機能を担う、配列表の配列番号１−
４で示される配列。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトリポタンパク
質（ａ）［以下「ヒトＬｐ（ａ）」という］を認識する
マウスモノクロ−ナル抗体の可変領域をコ−ドするＤＮ
Ａ塩基配列およびアミノ酸配列に関する。さらに詳しく
は、モノクロ−ナル抗体ＫＯＳ−Ａの可変領域であるＨ
鎖Ｖ領域（以下ＶH領域という）およびＬ鎖Ｖ領域（以
下ＶL領域という）の塩基配列またはアミノ酸配列であ
って、ヒトＬｐ（ａ）を特異的に認識する配列に関す
る。
質（ａ）［以下「ヒトＬｐ（ａ）」という］を認識する
マウスモノクロ−ナル抗体の可変領域をコ−ドするＤＮ
Ａ塩基配列およびアミノ酸配列に関する。さらに詳しく
は、モノクロ−ナル抗体ＫＯＳ−Ａの可変領域であるＨ
鎖Ｖ領域（以下ＶH領域という）およびＬ鎖Ｖ領域（以
下ＶL領域という）の塩基配列またはアミノ酸配列であ
って、ヒトＬｐ（ａ）を特異的に認識する配列に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ヒトＬｐ（ａ）は、Ｂｅｒｇ等によって
１９６３年に発見され（Ｂｅｒｇ Ｋ．Ａｃｔａ Ｐａ
ｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．５９，３
６９−３８２，１９６３）、リポタンパク質電気泳動に
おいてプレベ−タ位に現れる血清リポタンパク質であ
る。現在、Ｌｐ（ａ）は動脈硬化疾患の独立した危険因
子として考えられており、虚血性心疾患、心筋梗塞、脳
梗塞、閉鎖性末梢動脈硬化症等の動脈硬化関連疾患群で
は、対照群と比較して、有意にその血中濃度が高いこと
が知られている。
１９６３年に発見され（Ｂｅｒｇ Ｋ．Ａｃｔａ Ｐａ
ｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．５９，３
６９−３８２，１９６３）、リポタンパク質電気泳動に
おいてプレベ−タ位に現れる血清リポタンパク質であ
る。現在、Ｌｐ（ａ）は動脈硬化疾患の独立した危険因
子として考えられており、虚血性心疾患、心筋梗塞、脳
梗塞、閉鎖性末梢動脈硬化症等の動脈硬化関連疾患群で
は、対照群と比較して、有意にその血中濃度が高いこと
が知られている。
【０００３】従って、血中におけるヒトＬｐ（ａ）の濃
度を測定することは、動脈硬化疾患を予測する上で、臨
床上極めて重要である。血中ヒトＬｐ（ａ）を測定する
方法は、一般に免疫学的測定方法が利用されている。そ
の中でも、モノクロ−ナル抗体を用いた免疫比濁定量法
は特異性が高い点、検体の大量測定ができる点において
優れている。モノクロ−ナル抗体は、１９７５年に、Ｋ
ｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎが確立して以来（Ｋｏｈ
ｌｅｒ，Ｇ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ：Ｎａｔｕｒｅ
２５６，８４，１９７５）、今日までに、様々なモノ
クロ−ナル抗体が作られてきた。さらに、ハイブリド−
マ作製技術も改良が行われ、近年は電気細胞融合法も盛
んに行われるようになってきた。このような技術改良に
伴って作られたモノクロ−ナル抗体も、今日では各種の
診断をはじめとして広く生物医学研究に用いられてい
る。本発明者らは、ヒトＬｐ（ａ）におけるアポタンパ
ク質（ａ）に対して特異的に結合し、ヒトプラスミノ−
ゲンおよび低密度リポタンパク質のいずれをも認識（い
ずれにも結合）しないモノクロ−ナル抗体ＫＯＳ−Ａを
産生する、ヒトＬｐ（ａ）で免疫したマウス（ＢＡＬＢ
／ｃ）とマウスミエローマ細胞ＳＰ−２／Ｏ−Ａｇ１４
との細胞融合株ＫＯＳ−Ａ（工業技術院生命技術研究所
の寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１４５）を樹立した［特
開平７−３０９８９９、発明の名称：ヒトリポタンパク
質（ａ）に対するモノクローナル抗体およびこれらを用
いる免疫比濁測定方法、出願人：株式会社コスモ総合研
究所およびコスモ石油株式会社］。
度を測定することは、動脈硬化疾患を予測する上で、臨
床上極めて重要である。血中ヒトＬｐ（ａ）を測定する
方法は、一般に免疫学的測定方法が利用されている。そ
の中でも、モノクロ−ナル抗体を用いた免疫比濁定量法
は特異性が高い点、検体の大量測定ができる点において
優れている。モノクロ−ナル抗体は、１９７５年に、Ｋ
ｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎが確立して以来（Ｋｏｈ
ｌｅｒ，Ｇ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ：Ｎａｔｕｒｅ
２５６，８４，１９７５）、今日までに、様々なモノ
クロ−ナル抗体が作られてきた。さらに、ハイブリド−
マ作製技術も改良が行われ、近年は電気細胞融合法も盛
んに行われるようになってきた。このような技術改良に
伴って作られたモノクロ−ナル抗体も、今日では各種の
診断をはじめとして広く生物医学研究に用いられてい
る。本発明者らは、ヒトＬｐ（ａ）におけるアポタンパ
ク質（ａ）に対して特異的に結合し、ヒトプラスミノ−
ゲンおよび低密度リポタンパク質のいずれをも認識（い
ずれにも結合）しないモノクロ−ナル抗体ＫＯＳ−Ａを
産生する、ヒトＬｐ（ａ）で免疫したマウス（ＢＡＬＢ
／ｃ）とマウスミエローマ細胞ＳＰ−２／Ｏ−Ａｇ１４
との細胞融合株ＫＯＳ−Ａ（工業技術院生命技術研究所
の寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１４５）を樹立した［特
開平７−３０９８９９、発明の名称：ヒトリポタンパク
質（ａ）に対するモノクローナル抗体およびこれらを用
いる免疫比濁測定方法、出願人：株式会社コスモ総合研
究所およびコスモ石油株式会社］。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながらＫＯＳ−
Ａモノクロ−ナル抗体において、抗原と特異的に結合す
る機能を有する、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域の遺伝子配
列については全く知られていない。また、一般にモノク
ロ−ナル抗体産生細胞株の抗体産生能は継代とともに低
下することが知られている。これらの問題を解決するた
めに、抗体産生細胞の遺伝子をクロ−ニングした後、遺
伝子を適当な宿主（大腸菌等）に導入することによって
大量発現させることが行われているが、このような遺伝
子工学的手法によって抗体を産生させるためには、その
遺伝子を分離し構造を解明することが重要である。
Ａモノクロ−ナル抗体において、抗原と特異的に結合す
る機能を有する、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域の遺伝子配
列については全く知られていない。また、一般にモノク
ロ−ナル抗体産生細胞株の抗体産生能は継代とともに低
下することが知られている。これらの問題を解決するた
めに、抗体産生細胞の遺伝子をクロ−ニングした後、遺
伝子を適当な宿主（大腸菌等）に導入することによって
大量発現させることが行われているが、このような遺伝
子工学的手法によって抗体を産生させるためには、その
遺伝子を分離し構造を解明することが重要である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために検討を重ねた結果、ＫＯＳ−Ａモノク
ロ−ナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖の可変領域をコ−ドする
ｃＤＮＡを分離し、その塩基配列を解明し本発明を完成
した。すなわち、本発明は抗Ｌｐ（ａ）モノクロ−ナル
抗体のＶH領域およびＶL領域のＤＮＡ塩基配列およびア
ミノ酸配列に関する。さらに詳しくは本発明は（１）
抗ヒトリポタンパク質（ａ）モノクロ−ナル抗体ＫＯＳ
−ＡのＨ鎖Ｖ領域の塩基配列であって、ヒトリポタンパ
ク質（ａ）を認識する機能を担う、配列表の配列番号１
で示される塩基配列、（２） 抗ヒトリポタンパク質
（ａ）モノクロ−ナル抗体ＫＯＳ−ＡのＨ鎖Ｖ領域のア
ミノ酸配列であって、ヒトリポタンパク質（ａ）を認識
する機能を担う、配列表の配列番号２で示されるアミノ
酸配列、（３） 抗ヒトリポタンパク質（ａ）モノクロ
−ナル抗体ＫＯＳ−ＡのＬ鎖Ｖ領域の塩基配列であっ
て、ヒトリポタンパク質（ａ）を認識する機能を担う、
配列表の配列番号３で示される塩基配列、および（４）
抗ヒトリポタンパク質（ａ）モノクロ−ナル抗体ＫＯ
Ｓ−ＡのＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列であって、ヒトリポ
タンパク質（ａ）を認識する機能を担う、配列表の配列
番号４で示されるアミノ酸配列に関する。
を達成するために検討を重ねた結果、ＫＯＳ−Ａモノク
ロ−ナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖の可変領域をコ−ドする
ｃＤＮＡを分離し、その塩基配列を解明し本発明を完成
した。すなわち、本発明は抗Ｌｐ（ａ）モノクロ−ナル
抗体のＶH領域およびＶL領域のＤＮＡ塩基配列およびア
ミノ酸配列に関する。さらに詳しくは本発明は（１）
抗ヒトリポタンパク質（ａ）モノクロ−ナル抗体ＫＯＳ
−ＡのＨ鎖Ｖ領域の塩基配列であって、ヒトリポタンパ
ク質（ａ）を認識する機能を担う、配列表の配列番号１
で示される塩基配列、（２） 抗ヒトリポタンパク質
（ａ）モノクロ−ナル抗体ＫＯＳ−ＡのＨ鎖Ｖ領域のア
ミノ酸配列であって、ヒトリポタンパク質（ａ）を認識
する機能を担う、配列表の配列番号２で示されるアミノ
酸配列、（３） 抗ヒトリポタンパク質（ａ）モノクロ
−ナル抗体ＫＯＳ−ＡのＬ鎖Ｖ領域の塩基配列であっ
て、ヒトリポタンパク質（ａ）を認識する機能を担う、
配列表の配列番号３で示される塩基配列、および（４）
抗ヒトリポタンパク質（ａ）モノクロ−ナル抗体ＫＯ
Ｓ−ＡのＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列であって、ヒトリポ
タンパク質（ａ）を認識する機能を担う、配列表の配列
番号４で示されるアミノ酸配列に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明によれば、抗Ｌｐ（ａ）モ
ノクロ−ナル抗体のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域の
ＤＮＡ塩基配列は、Ｌｐ（ａ）に対するモノクロ−ナル
抗体を産生するハイブリド−マのｍＲＮＡより、Ｌｐ
（ａ）に対するモノクロ−ナル抗体ＶH領域およびＶL領
域のｃＤＮＡを合成し、そのＤＮＡの塩基配列を解析す
ることによって決定した。以下、これらの工程について
詳述する。本発明において使用される細胞株は、マウス
リンパ球細胞とマウス骨髄腫細胞を融合させたハイブリ
ド−マ、具体的には、ＫＯＳ−Ａとして工業技術院生命
技術研究所に寄託されているハイブリド−マＦＥＲＭ
Ｐ−１４１４５である。このハイブリド−マはヒトＬｐ
（ａ）に特異的に反応するマウスモノクロ−ナル抗体を
産生するハイブリド−マである。
ノクロ−ナル抗体のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域の
ＤＮＡ塩基配列は、Ｌｐ（ａ）に対するモノクロ−ナル
抗体を産生するハイブリド−マのｍＲＮＡより、Ｌｐ
（ａ）に対するモノクロ−ナル抗体ＶH領域およびＶL領
域のｃＤＮＡを合成し、そのＤＮＡの塩基配列を解析す
ることによって決定した。以下、これらの工程について
詳述する。本発明において使用される細胞株は、マウス
リンパ球細胞とマウス骨髄腫細胞を融合させたハイブリ
ド−マ、具体的には、ＫＯＳ−Ａとして工業技術院生命
技術研究所に寄託されているハイブリド−マＦＥＲＭ
Ｐ−１４１４５である。このハイブリド−マはヒトＬｐ
（ａ）に特異的に反応するマウスモノクロ−ナル抗体を
産生するハイブリド−マである。
【０００７】これら所望の抗体を産生する細胞を適当な
条件下、たとえば、３７℃炭酸ガス濃度５％で培養増殖
させ、得られた細胞を遠心分離により集めた後、細胞を
破壊し、定法たとえば、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ等の方法（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８，５２９４，１９７７）
やＦａｖａｌｏｒｏ等の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ＩｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５，７１８，１９８０）により
全ＲＮＡを得る。次にこれを定法たとえば、バッチ法や
オリゴｄＴセルロ−スまたはポリＵセファロ−スなどを
用いる吸着カラムクロマトグラフィ−によりポリ（Ａ）
ｍＲＮＡ画分を分離することができる。上記の方法によ
り得られたポリ（Ａ）ｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴ
または抗体定常領域の塩基配列に対応すると考えられる
塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドをプライマ−
として、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰの存
在下で逆転写酵素により、ｍＲＮＡに相補的な一本鎖ｃ
ＤＮＡを合成する。
条件下、たとえば、３７℃炭酸ガス濃度５％で培養増殖
させ、得られた細胞を遠心分離により集めた後、細胞を
破壊し、定法たとえば、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ等の方法（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８，５２９４，１９７７）
やＦａｖａｌｏｒｏ等の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ＩｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５，７１８，１９８０）により
全ＲＮＡを得る。次にこれを定法たとえば、バッチ法や
オリゴｄＴセルロ−スまたはポリＵセファロ−スなどを
用いる吸着カラムクロマトグラフィ−によりポリ（Ａ）
ｍＲＮＡ画分を分離することができる。上記の方法によ
り得られたポリ（Ａ）ｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴ
または抗体定常領域の塩基配列に対応すると考えられる
塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドをプライマ−
として、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰの存
在下で逆転写酵素により、ｍＲＮＡに相補的な一本鎖ｃ
ＤＮＡを合成する。
【０００８】次に、ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法
を用いて前記一本鎖ｃＤＮＡの有意義な部分の特異的増
幅を行う。マウスモノクロ−ナル抗体のＶL領域に対応
すると考えられる塩基配列を有する合成オリゴヌクレオ
チドの５´側のセンスプライマ−と３´側のアンチセン
スプライマ−を用いて、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ、ｄＣＴＰの存在下で耐熱性ＤＮＡ合成酵素により、
マウスモノクロ−ナル抗体のＶL領域を増幅する。ま
た、マウスモノクロ−ナル抗体のＶH領域に対応すると
考えられる塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドの
５´側のセンスプライマ−と３´側のアンチセンスプラ
イマ−を用いて、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣ
ＴＰの存在下で耐熱性ＤＮＡ合成酵素により、マウスモ
ノクロ−ナル抗体のＶH領域を増幅する。次に増幅され
たＶH領域とＶL領域をリンカ−（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（８），９８９，１９９３）で
連結し、再度、ＶH領域に対応する５´側のセンスプラ
イマ−（５´末端に適当な制限酵素サイトを修飾したも
の）とＶL領域に対応する３´側のアンチセンスプライ
マ−（３´末端に適当な制限酵素サイトを修飾したも
の）を用いて、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴ
Ｐの存在下で耐熱性ＤＮＡ合成酵素により、ＶH＋リン
カ−＋ＶLフラグメントを増幅する。
を用いて前記一本鎖ｃＤＮＡの有意義な部分の特異的増
幅を行う。マウスモノクロ−ナル抗体のＶL領域に対応
すると考えられる塩基配列を有する合成オリゴヌクレオ
チドの５´側のセンスプライマ−と３´側のアンチセン
スプライマ−を用いて、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ、ｄＣＴＰの存在下で耐熱性ＤＮＡ合成酵素により、
マウスモノクロ−ナル抗体のＶL領域を増幅する。ま
た、マウスモノクロ−ナル抗体のＶH領域に対応すると
考えられる塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドの
５´側のセンスプライマ−と３´側のアンチセンスプラ
イマ−を用いて、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣ
ＴＰの存在下で耐熱性ＤＮＡ合成酵素により、マウスモ
ノクロ−ナル抗体のＶH領域を増幅する。次に増幅され
たＶH領域とＶL領域をリンカ−（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（８），９８９，１９９３）で
連結し、再度、ＶH領域に対応する５´側のセンスプラ
イマ−（５´末端に適当な制限酵素サイトを修飾したも
の）とＶL領域に対応する３´側のアンチセンスプライ
マ−（３´末端に適当な制限酵素サイトを修飾したも
の）を用いて、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴ
Ｐの存在下で耐熱性ＤＮＡ合成酵素により、ＶH＋リン
カ−＋ＶLフラグメントを増幅する。
【０００９】次にＶH＋リンカ−＋ＶLフラグメントの増
幅生成物を、該センスプライマ−および該アンチセンス
プライマ−中に設けた制限酵素部位で、該制限酵素によ
り切断して、モノクロ−ナル抗体の目的とする可変領域
をコ−ドするＤＮＡを得る。他方、適当な発現ベクタ−
を、ＶH＋リンカ−＋ＶLフラグメントの末端と同じ制限
酵素で切断し、このベクタ−に前記ＤＮＡを連結するこ
とにより、マウスモノクロ−ナル抗体の目的とする可変
領域をコ−ドするＤＮＡ断片を含むプラスミドを得る。
幅生成物を、該センスプライマ−および該アンチセンス
プライマ−中に設けた制限酵素部位で、該制限酵素によ
り切断して、モノクロ−ナル抗体の目的とする可変領域
をコ−ドするＤＮＡを得る。他方、適当な発現ベクタ−
を、ＶH＋リンカ−＋ＶLフラグメントの末端と同じ制限
酵素で切断し、このベクタ−に前記ＤＮＡを連結するこ
とにより、マウスモノクロ−ナル抗体の目的とする可変
領域をコ−ドするＤＮＡ断片を含むプラスミドを得る。
【００１０】クロ−ン化されたＤＮＡの塩基配列は、任
意の常法に従って解析することにより決定できる。ま
た、特殊なファージに上記遺伝子を組み込み、該遺伝子
の発現で産生されたタンパクをファージ表面に露出させ
ることもできる。この方法を用いれば、ターゲットとす
べき特定の抗原物質をリガンドに用い、この抗原物質に
対するアフィニティーに基づいて、目的とするモノクロ
ーナル抗体遺伝子を容易にスクリーニングし、クローニ
ングすることができる。即ち、特定の抗原物質を適当な
固相担体上に固相化し、上記遺伝子の発現タンパクが露
出したファージをこの固相担体に接触させて、リガンド
の抗原物質に対して親和性を有するタンパクを発現した
ファージを選択的に回収すればよい。このようなアフィ
ニティーを利用して遺伝子クローンのスクリーニングを
行う方法は、バイオパンニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎ
ｇ）と称され、当該技術分野において公知である（Ｓｔ
ｅｐｈｅｎ Ｆ．Ｐａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｇｅｏｒｇ
ｅ Ｐ．Ｓｍｉｔｈ； Ｇｅｎｅ，７３（１９８８），
Ｊｏｈｎ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．；Ｎａ
ｔｕｒｅ，３４８，６（１９９０））。
意の常法に従って解析することにより決定できる。ま
た、特殊なファージに上記遺伝子を組み込み、該遺伝子
の発現で産生されたタンパクをファージ表面に露出させ
ることもできる。この方法を用いれば、ターゲットとす
べき特定の抗原物質をリガンドに用い、この抗原物質に
対するアフィニティーに基づいて、目的とするモノクロ
ーナル抗体遺伝子を容易にスクリーニングし、クローニ
ングすることができる。即ち、特定の抗原物質を適当な
固相担体上に固相化し、上記遺伝子の発現タンパクが露
出したファージをこの固相担体に接触させて、リガンド
の抗原物質に対して親和性を有するタンパクを発現した
ファージを選択的に回収すればよい。このようなアフィ
ニティーを利用して遺伝子クローンのスクリーニングを
行う方法は、バイオパンニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎ
ｇ）と称され、当該技術分野において公知である（Ｓｔ
ｅｐｈｅｎ Ｆ．Ｐａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｇｅｏｒｇ
ｅ Ｐ．Ｓｍｉｔｈ； Ｇｅｎｅ，７３（１９８８），
Ｊｏｈｎ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．；Ｎａ
ｔｕｒｅ，３４８，６（１９９０））。
【００１１】
【実施例】以下、実施例に沿って本発明を更に詳細に説
明する。 実施例 （１） ハイブリド−マからｍＲＮＡの抽出 ＫＯＳ−Ａハイブリド−マを、２０％（ｖ／ｖ）牛胎児
血清（三菱油化社製）入りＤＭＥＭ培地（生化学工業社
製）中で、３７℃、５％二酸化炭素下で細胞数が１×１
０7 個となるまで増殖させる。培養細胞を遠心分離
（８００×ｇ、５分間、室温）後、上清を除去し沈殿し
た細胞にリン酸ナトリウム０．０１Ｍ、ＮａＣｌ０．１
５Ｍ、ｐＨ７．４緩衝液を適量加え洗浄した。１×１０
7個の細胞に冷却溶液１［トリス０．０１Ｍ、ＮａＣｌ
０．１５Ｍ、ＭｇＣｌ２１．５ｍＭ、０．６５％（ｖ／
ｖ）ＮＰ−４０、ｐＨ７．５］４００μｌを加え、１０
秒間激しく撹拌した。遠心分離（８００×ｇ、５分間、
４℃）後、上清を微量遠心管に移し、溶液２［尿素７
Ｍ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウ
ム）、ＮａＣｌ０．３Ｍ、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン
四酢酸）０．０１Ｍ、トリス０．０１Ｍ、ｐＨ７．５］
２００μｌと溶液３［９２％（ｖ／ｖ）フェノ−ル、４
％（ｖ／ｖ）クロロホルム、４％（ｖ／ｖ）イソアミル
アルコ−ル］４００μｌを添加した。１０秒間激しく撹
拌し、遠心分離（１５．０００×ｇ、１分間、４℃）
後、上清を別の遠心管に移し、−２０℃の９９．５％エ
タノ−ル１ｍｌを加えた。−８０℃で１５分間冷却し、
遠心分離（１５．０００×ｇ、１分間、４℃）後、上清
を捨てた。沈澱物（ＲＮＡ）を再度、冷７５％エタノ−
ルで洗い、遠心分離（１５．０００×ｇ、１分間、４
℃）後、上清を捨てた。真空乾燥させた後、滅菌蒸留水
（以下ＳＤＷという）１００μｌに溶解した。ＲＮＡか
らｍＲＮＡの分離精製は、プロメガ社製のＰｏｌｙＡＴ
ｔｒａｃｔＳｙｓｔｅｍ １０００の試薬を使用して行
い、１μｇのｍＲＮＡを得た。
明する。 実施例 （１） ハイブリド−マからｍＲＮＡの抽出 ＫＯＳ−Ａハイブリド−マを、２０％（ｖ／ｖ）牛胎児
血清（三菱油化社製）入りＤＭＥＭ培地（生化学工業社
製）中で、３７℃、５％二酸化炭素下で細胞数が１×１
０7 個となるまで増殖させる。培養細胞を遠心分離
（８００×ｇ、５分間、室温）後、上清を除去し沈殿し
た細胞にリン酸ナトリウム０．０１Ｍ、ＮａＣｌ０．１
５Ｍ、ｐＨ７．４緩衝液を適量加え洗浄した。１×１０
7個の細胞に冷却溶液１［トリス０．０１Ｍ、ＮａＣｌ
０．１５Ｍ、ＭｇＣｌ２１．５ｍＭ、０．６５％（ｖ／
ｖ）ＮＰ−４０、ｐＨ７．５］４００μｌを加え、１０
秒間激しく撹拌した。遠心分離（８００×ｇ、５分間、
４℃）後、上清を微量遠心管に移し、溶液２［尿素７
Ｍ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウ
ム）、ＮａＣｌ０．３Ｍ、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン
四酢酸）０．０１Ｍ、トリス０．０１Ｍ、ｐＨ７．５］
２００μｌと溶液３［９２％（ｖ／ｖ）フェノ−ル、４
％（ｖ／ｖ）クロロホルム、４％（ｖ／ｖ）イソアミル
アルコ−ル］４００μｌを添加した。１０秒間激しく撹
拌し、遠心分離（１５．０００×ｇ、１分間、４℃）
後、上清を別の遠心管に移し、−２０℃の９９．５％エ
タノ−ル１ｍｌを加えた。−８０℃で１５分間冷却し、
遠心分離（１５．０００×ｇ、１分間、４℃）後、上清
を捨てた。沈澱物（ＲＮＡ）を再度、冷７５％エタノ−
ルで洗い、遠心分離（１５．０００×ｇ、１分間、４
℃）後、上清を捨てた。真空乾燥させた後、滅菌蒸留水
（以下ＳＤＷという）１００μｌに溶解した。ＲＮＡか
らｍＲＮＡの分離精製は、プロメガ社製のＰｏｌｙＡＴ
ｔｒａｃｔＳｙｓｔｅｍ １０００の試薬を使用して行
い、１μｇのｍＲＮＡを得た。
【００１２】（２） ｍＲＮＡからｃＤＮＡの作製およ
び精製 上記で得たｍＲＮＡを６５℃で１０分間インキュベ−ト
し、その後、すぐに氷中にいれ急冷した。ｍＲＮＡ１μ
ｇを１．５ｍｌ滅菌チュ−ブに取り、０．２Ｍランダム
プライマ−［宝酒造社製、以下 Ｒｄ（Ｎ）6という］
５μｌ、逆転写酵素２．５単位／μｌ（宝酒造社製、以
下ＲＴという）１μｌ、１％牛血清アルブミン（生化学
工業社製、以下ＢＳＡという）５μｌ、５０ｍＭ デオ
キシリボヌクレオチド５´−三リン酸（宝酒造社製、以
下ｄＮＴＰという）５μｌ、２０ｐＭ ジチオスレイト
−ル（生化学社製、以下ＤＴＴという）５μｌ、および
ＲＮＡ分解酵素阻害剤１単位／μｌ（宝酒造社製）１μ
ｌを添加し、最終液量が５０μｌとなるようにＳＤＷで
調整した。３７℃ １時間 インキュベ−トし、次に９
５℃ ５分間 インキュベ−トして酵素を失活させ、直
ちに氷中にいれ急冷した。フェノ−ル５０μｌを加え、
１０秒間激しく撹拌し、遠心分離（１５．０００×ｇ、
１分間、４℃）後、上清（＝水相）を別の遠心管に移
し、−２０℃の９９．５％エタノ−ル１２５μｌ加え
た。−８０℃で１５分間冷却し、遠心分離（１５．００
０×ｇ、１分間、４℃）後、上清を捨てた。沈澱物（ｃ
ＤＮＡ）を再度、冷７５％エタノ−ルで洗い、遠心分離
（１５，０００×ｇ、１分間、４℃）後、上清を捨て
た。沈澱物（ｃＤＮＡ）を真空乾燥させた後、１ｍＭト
リス、０．１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（以下ＴＥ溶液
という）１００μｌに溶解した。
び精製 上記で得たｍＲＮＡを６５℃で１０分間インキュベ−ト
し、その後、すぐに氷中にいれ急冷した。ｍＲＮＡ１μ
ｇを１．５ｍｌ滅菌チュ−ブに取り、０．２Ｍランダム
プライマ−［宝酒造社製、以下 Ｒｄ（Ｎ）6という］
５μｌ、逆転写酵素２．５単位／μｌ（宝酒造社製、以
下ＲＴという）１μｌ、１％牛血清アルブミン（生化学
工業社製、以下ＢＳＡという）５μｌ、５０ｍＭ デオ
キシリボヌクレオチド５´−三リン酸（宝酒造社製、以
下ｄＮＴＰという）５μｌ、２０ｐＭ ジチオスレイト
−ル（生化学社製、以下ＤＴＴという）５μｌ、および
ＲＮＡ分解酵素阻害剤１単位／μｌ（宝酒造社製）１μ
ｌを添加し、最終液量が５０μｌとなるようにＳＤＷで
調整した。３７℃ １時間 インキュベ−トし、次に９
５℃ ５分間 インキュベ−トして酵素を失活させ、直
ちに氷中にいれ急冷した。フェノ−ル５０μｌを加え、
１０秒間激しく撹拌し、遠心分離（１５．０００×ｇ、
１分間、４℃）後、上清（＝水相）を別の遠心管に移
し、−２０℃の９９．５％エタノ−ル１２５μｌ加え
た。−８０℃で１５分間冷却し、遠心分離（１５．００
０×ｇ、１分間、４℃）後、上清を捨てた。沈澱物（ｃ
ＤＮＡ）を再度、冷７５％エタノ−ルで洗い、遠心分離
（１５，０００×ｇ、１分間、４℃）後、上清を捨て
た。沈澱物（ｃＤＮＡ）を真空乾燥させた後、１ｍＭト
リス、０．１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（以下ＴＥ溶液
という）１００μｌに溶解した。
【００１３】（３） ｃＤＮＡからＨ鎖，Ｌ鎖の可変領
域遺伝子の増幅および精製 ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃ
ｔｉｏｎ）によるｃＤＮＡの増幅は、以下の条件で行っ
た。尚、テンプレートとなるｃＤＮＡは、上記ＴＥ溶液
に溶解したものを用いた。抗体の可変領域（ＶH）をコ
ードしている遺伝子は、Ｈ鎖においては５´末端からＶ
ｈ遺伝子、Ｄ遺伝子、Ｊｈ 遺伝子の３つのセグメント
で構成されている。Ｌ鎖はκ鎖とλ鎖があるがＫＯＳ−
Ａはκ鎖である。κ鎖はＶκ遺伝子およびＪκ遺伝子の
２つのセグメントで構成されており、Ｖκ領域がすなわ
ちＶLとなる。Ｈ鎖、κ鎖共に、Ｖ遺伝子の５´末端領
域（可変領域のＮ末端領域に対応）およびＪ遺伝子領域
（可変領域のＣ末端領域に対応）は、抗体間でかなり高
く保存された配列になっていることが知られている
（Ｒ．Ｏｒｌａｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８６，３８３３（１
９８９））。従って、公知の配列を参考にして、ＶH領
域のＰＣＲ増幅用のプライマーとして、Ｖｈ遺伝子の５
´末端領域から、下記表１に示すＶＨＢＡＣＫプライマ
ー（配列番号５）を、Ｊｈ 遺伝子領域から下記表１に
示すＶＨＦＯＲプライマ−（配列番号６）の配列を設計
した。これらのプライマーは表１に示す制限酵素切断部
位を有する。またＶL領域（すなわちＶκ領域）のＰＣ
Ｒ増幅用のプライマーとして、Ｖκ遺伝子の５´末端領
域から表１に示すＶLＢＡＣＫプライマー（配列番号
７）を、Ｊκ遺伝子領域から表１に示すＶLＦＯＲプラ
イマー（配列番号８）の配列を設計した。これらのプラ
イマーは表１に示す制限酵素切断部位を有する。各プラ
イマーは、表１に示すように、コドンの縮重を考慮して
ミックス・プライマーとした。また各プライマーの制限
酵素切断部位を点線で囲み、その下に制限酵素名を記し
た。
域遺伝子の増幅および精製 ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃ
ｔｉｏｎ）によるｃＤＮＡの増幅は、以下の条件で行っ
た。尚、テンプレートとなるｃＤＮＡは、上記ＴＥ溶液
に溶解したものを用いた。抗体の可変領域（ＶH）をコ
ードしている遺伝子は、Ｈ鎖においては５´末端からＶ
ｈ遺伝子、Ｄ遺伝子、Ｊｈ 遺伝子の３つのセグメント
で構成されている。Ｌ鎖はκ鎖とλ鎖があるがＫＯＳ−
Ａはκ鎖である。κ鎖はＶκ遺伝子およびＪκ遺伝子の
２つのセグメントで構成されており、Ｖκ領域がすなわ
ちＶLとなる。Ｈ鎖、κ鎖共に、Ｖ遺伝子の５´末端領
域（可変領域のＮ末端領域に対応）およびＪ遺伝子領域
（可変領域のＣ末端領域に対応）は、抗体間でかなり高
く保存された配列になっていることが知られている
（Ｒ．Ｏｒｌａｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８６，３８３３（１
９８９））。従って、公知の配列を参考にして、ＶH領
域のＰＣＲ増幅用のプライマーとして、Ｖｈ遺伝子の５
´末端領域から、下記表１に示すＶＨＢＡＣＫプライマ
ー（配列番号５）を、Ｊｈ 遺伝子領域から下記表１に
示すＶＨＦＯＲプライマ−（配列番号６）の配列を設計
した。これらのプライマーは表１に示す制限酵素切断部
位を有する。またＶL領域（すなわちＶκ領域）のＰＣ
Ｒ増幅用のプライマーとして、Ｖκ遺伝子の５´末端領
域から表１に示すＶLＢＡＣＫプライマー（配列番号
７）を、Ｊκ遺伝子領域から表１に示すＶLＦＯＲプラ
イマー（配列番号８）の配列を設計した。これらのプラ
イマーは表１に示す制限酵素切断部位を有する。各プラ
イマーは、表１に示すように、コドンの縮重を考慮して
ミックス・プライマーとした。また各プライマーの制限
酵素切断部位を点線で囲み、その下に制限酵素名を記し
た。
【００１４】
【表１】 各プライマーは、外注（フナコシ社）して作製した。
【００１５】（３−１） Ｖ H領域のＰＣＲ増幅 ｃＤＮＡ２μＬに、ＶHＢＡＣＫプライマー（５０ｐｍ
ｏｌｅ／μＬ）２μＬ、ＶHＦＯＲプライマー（５０ｐ
ｍｏｌｅ／μＬ）２μＬ、ＰＣＲバッファー［１００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８），１５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2，５００ｍＭ ＫＣｌ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００］５μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ８μＬ、ＳＤＷ
３０μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２．５ ｕｎｉ
ｔｓ／μＬ、宝酒造社製）１μＬを加えて計５０μＬと
し、変性を９４℃で１分、アニーリングを５５℃で１
分、伸長反応を７２℃で２分という条件で３０サイクル
のＰＣＲを行った。
ｏｌｅ／μＬ）２μＬ、ＶHＦＯＲプライマー（５０ｐ
ｍｏｌｅ／μＬ）２μＬ、ＰＣＲバッファー［１００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８），１５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2，５００ｍＭ ＫＣｌ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００］５μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ８μＬ、ＳＤＷ
３０μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２．５ ｕｎｉ
ｔｓ／μＬ、宝酒造社製）１μＬを加えて計５０μＬと
し、変性を９４℃で１分、アニーリングを５５℃で１
分、伸長反応を７２℃で２分という条件で３０サイクル
のＰＣＲを行った。
【００１６】（３−２） Ｖ L領域のＰＣＲ増幅 ｃＤＮＡ２μＬに、ＶLＢＡＣＫプライマー（５０ｐｍ
ｏｌｅ／μＬ）２μＬ、ＶLＦＯＲプライマー（５０ｐ
ｍｏｌｅ／μＬ）２μＬ、ＰＣＲバッファー［１００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８），１５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2， ５００ｍＭ ＫＣｌ，１％ ＴｒｉｔｏｎＸ
−１００］５μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ８μＬ、Ｓ
ＤＷ３０μＬおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２．５
ｕｎｉｔｓ／μＬ）１μＬを加えて計５０μＬとし、
変性を９４℃で１分、アニーリングを４５℃で１分、伸
長反応を７２℃で２分という条件で３０サイクルのＰＣ
Ｒを行った。
ｏｌｅ／μＬ）２μＬ、ＶLＦＯＲプライマー（５０ｐ
ｍｏｌｅ／μＬ）２μＬ、ＰＣＲバッファー［１００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８），１５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2， ５００ｍＭ ＫＣｌ，１％ ＴｒｉｔｏｎＸ
−１００］５μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ８μＬ、Ｓ
ＤＷ３０μＬおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２．５
ｕｎｉｔｓ／μＬ）１μＬを加えて計５０μＬとし、
変性を９４℃で１分、アニーリングを４５℃で１分、伸
長反応を７２℃で２分という条件で３０サイクルのＰＣ
Ｒを行った。
【００１７】（３−３） ＰＣＲ産物の精製 目的のＰＣＲ産物は、２％アガロースゲル（宝酒造社
製）により分離精製した。すなわち、上記のＰＣＲ反応
液５０μＬに３５μＬのローディング溶液（２０％サッ
カロース、０．１％ブロムフェノールブルー）を加え、
均一にして電気泳動装置にアプライした。電気泳動用緩
衝液としては、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（ｐＨ
８．３）、５ｍＭ ＡｃＯＮａ、１ｍＭ ＥＤＴＡを用
いた。電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムにより染色し
目的のバンド（ＶH：約３６０ｂｐ、ＶL：約３２０ｂ
ｐ）をゲルより回収した。このゲル断片を１．５ｍＬ用
滅菌チューブの中に入れ、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ Ｂａｎ
ｄＰｒｅｐ ＫＩＴ（ファルマシア社製）を用いて精製
し、最終的に５０μＬのＴＥ溶液としてＤＮＡを回収し
た。
製）により分離精製した。すなわち、上記のＰＣＲ反応
液５０μＬに３５μＬのローディング溶液（２０％サッ
カロース、０．１％ブロムフェノールブルー）を加え、
均一にして電気泳動装置にアプライした。電気泳動用緩
衝液としては、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯＨ（ｐＨ
８．３）、５ｍＭ ＡｃＯＮａ、１ｍＭ ＥＤＴＡを用
いた。電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムにより染色し
目的のバンド（ＶH：約３６０ｂｐ、ＶL：約３２０ｂ
ｐ）をゲルより回収した。このゲル断片を１．５ｍＬ用
滅菌チューブの中に入れ、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ Ｂａｎ
ｄＰｒｅｐ ＫＩＴ（ファルマシア社製）を用いて精製
し、最終的に５０μＬのＴＥ溶液としてＤＮＡを回収し
た。
【００１８】（４）ＶHとＶLのＤＮＡフラグメントの制
限酵素処理 上記（３）で得られたＶHのＤＮＡフラグメント２０μ
Ｌ（約０．５μｇ）に、Ｍ−バッファー［１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）， １００ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2，１０ｍＭ ＤＴＴ，５００ｍＭ ＮａＣｌ、宝
酒造社製］５μＬ、ＳＤＷ２３μＬおよびＳｐｅＩ（１
２ｕｎｉｔｓ／μｌ、宝酒造社製）２μＬを加え、均一
にして３７℃で１０時間インキュベートした。酵素反応
終了後、４Ｍ ＮａＣｌ５μＬ、ＳＤＷ４５μＬおよび
エタノール２５０μＬを加え、撹拌後−８０℃で２時間
放置し、遠心（１２０００ｒｐｍ、０℃、２０分）し
て、ＤＮＡを沈澱として回収した。これを２０μＬのＳ
ＤＷに溶解し、ついで１０×ＮｏｔＩバッファ−［１０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１００ｍＭ
ＭｇＣｌ2，０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０
ｍＭ ＤＴＴ，５００ｍＭ ＮａＣｌ］５μＬ、ＳＤＷ
２３μＬおよびＮｏｔＩ （１２ｕｎｉｔｓ／μｌ、フ
ァルマシア社製）２μＬを加え、均一にして３７℃で１
０時間インキュベートした。酵素反応終了後、ＳＤＷ５
０μＬおよびエタノール２５０μＬを加え、撹拌後−８
０℃で２時間放置し、遠心（１２０００ ｒｐｍ、０
℃、２０分）して、ＤＮＡを沈澱として回収した。これ
を２０μＬのＳＤＷに溶解した。以後このＤＮＡフラグ
メントをＶH（Ｎ−Ｓ）と称する。
限酵素処理 上記（３）で得られたＶHのＤＮＡフラグメント２０μ
Ｌ（約０．５μｇ）に、Ｍ−バッファー［１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）， １００ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2，１０ｍＭ ＤＴＴ，５００ｍＭ ＮａＣｌ、宝
酒造社製］５μＬ、ＳＤＷ２３μＬおよびＳｐｅＩ（１
２ｕｎｉｔｓ／μｌ、宝酒造社製）２μＬを加え、均一
にして３７℃で１０時間インキュベートした。酵素反応
終了後、４Ｍ ＮａＣｌ５μＬ、ＳＤＷ４５μＬおよび
エタノール２５０μＬを加え、撹拌後−８０℃で２時間
放置し、遠心（１２０００ｒｐｍ、０℃、２０分）し
て、ＤＮＡを沈澱として回収した。これを２０μＬのＳ
ＤＷに溶解し、ついで１０×ＮｏｔＩバッファ−［１０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１００ｍＭ
ＭｇＣｌ2，０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０
ｍＭ ＤＴＴ，５００ｍＭ ＮａＣｌ］５μＬ、ＳＤＷ
２３μＬおよびＮｏｔＩ （１２ｕｎｉｔｓ／μｌ、フ
ァルマシア社製）２μＬを加え、均一にして３７℃で１
０時間インキュベートした。酵素反応終了後、ＳＤＷ５
０μＬおよびエタノール２５０μＬを加え、撹拌後−８
０℃で２時間放置し、遠心（１２０００ ｒｐｍ、０
℃、２０分）して、ＤＮＡを沈澱として回収した。これ
を２０μＬのＳＤＷに溶解した。以後このＤＮＡフラグ
メントをＶH（Ｎ−Ｓ）と称する。
【００１９】ＶLのＤＮＡフラグメント２０μＬ（約
０．５μｇ）に、Ｌ−バッファー［１００ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ ＭｇＣｌ2，
１０ｍＭ ＤＴＴ、宝酒造社製］５μＬ、ＳＤＷ２
２．５μＬおよびＳａｃＩ（１２ｕｎｉｔｓ／μＬ、宝
酒造社製）１．０μＬを加え、均一にして３７℃で６時
間インキュベートした。これに４Ｍ ＮａＣｌ ０．５
μＬを加え、ついでＸｈｏＩ（８ｕｎｉｔｓ／μＬ、宝
酒造社製）１μＬを加え、均一にして３７℃で６時間イ
ンキュベートした。酵素反応終了後、４Ｍ ＮａＣｌ
５μＬ、ＳＤＷ４５μＬおよびエタノール２５０μＬを
加え、撹拌後−８０℃で２時間放置し、遠心（１２００
０ｒｐｍ、０℃、２０分）して、ＤＮＡを沈澱として回
収した。これを２０μＬのＳＤＷに溶解した。以後この
ＤＮＡフラグメントをＶL（Ｓ−Ｘ）と称する。
０．５μｇ）に、Ｌ−バッファー［１００ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ ＭｇＣｌ2，
１０ｍＭ ＤＴＴ、宝酒造社製］５μＬ、ＳＤＷ２
２．５μＬおよびＳａｃＩ（１２ｕｎｉｔｓ／μＬ、宝
酒造社製）１．０μＬを加え、均一にして３７℃で６時
間インキュベートした。これに４Ｍ ＮａＣｌ ０．５
μＬを加え、ついでＸｈｏＩ（８ｕｎｉｔｓ／μＬ、宝
酒造社製）１μＬを加え、均一にして３７℃で６時間イ
ンキュベートした。酵素反応終了後、４Ｍ ＮａＣｌ
５μＬ、ＳＤＷ４５μＬおよびエタノール２５０μＬを
加え、撹拌後−８０℃で２時間放置し、遠心（１２００
０ｒｐｍ、０℃、２０分）して、ＤＮＡを沈澱として回
収した。これを２０μＬのＳＤＷに溶解した。以後この
ＤＮＡフラグメントをＶL（Ｓ−Ｘ）と称する。
【００２０】（５）クローニング用ベクターの制限酵素
処理 クローニング用プラスミドベクターとして、Ｂｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）（ＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥ社
製）を用いた。ＶH（Ｎ−Ｓ）用ベクターフラグメント
作製のため、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）１
０μＬ（約５．０μｇ）に、Ｍ−バッファー［１００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2，１０ｍＭ ＤＴＴ，５００ｍＭ ＮａＣｌ］
５μＬ、ＳＤＷ３３μＬおよびＳｐｅＩ（１２ｕｎｉｔ
ｓ／μＬ）２μＬを加え、均一にして３７℃で１０時間
インキュベートした。酵素反応終了後、４Ｍ ＮａＣｌ
５μＬ、ＳＤＷ４５μＬおよびエタノール２５０μＬを
加え、撹拌後−８０℃で２時間放置した後、遠心（１２
０００ｒｐｍ、０℃、２０分）し、ＤＮＡを沈澱として
回収した。これを２０μＬのＳＤＷに溶かした。ついで
１０×ＮｏｔＩバッファ−［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０），１００ｍＭ ＭｇＣｌ2， ０．
２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０ｍＭ ＤＴＴ，５０
０ｍＭ ＮａＣｌ］５μＬ、ＳＤＷ２３μＬおよびＮｏ
ｔＩ（１２ｕｎｉｔｓ／μｌ）２μＬを加え、均一にし
て３７℃で１０時間インキュベートした。酵素反応終了
後、ＳＤＷ５０μＬおよびエタノール２５０μＬを加
え、撹拌後−８０℃で２時間放置し、遠心（１２０００
ｒｐｍ、０℃、２０分）して、ＤＮＡを沈澱として回収
した。これを２０μＬのＳＤＷに溶解した。以後これを
ＫＳ（Ｎ−Ｓ）と称する。
処理 クローニング用プラスミドベクターとして、Ｂｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）（ＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥ社
製）を用いた。ＶH（Ｎ−Ｓ）用ベクターフラグメント
作製のため、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）１
０μＬ（約５．０μｇ）に、Ｍ−バッファー［１００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2，１０ｍＭ ＤＴＴ，５００ｍＭ ＮａＣｌ］
５μＬ、ＳＤＷ３３μＬおよびＳｐｅＩ（１２ｕｎｉｔ
ｓ／μＬ）２μＬを加え、均一にして３７℃で１０時間
インキュベートした。酵素反応終了後、４Ｍ ＮａＣｌ
５μＬ、ＳＤＷ４５μＬおよびエタノール２５０μＬを
加え、撹拌後−８０℃で２時間放置した後、遠心（１２
０００ｒｐｍ、０℃、２０分）し、ＤＮＡを沈澱として
回収した。これを２０μＬのＳＤＷに溶かした。ついで
１０×ＮｏｔＩバッファ−［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０），１００ｍＭ ＭｇＣｌ2， ０．
２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０ｍＭ ＤＴＴ，５０
０ｍＭ ＮａＣｌ］５μＬ、ＳＤＷ２３μＬおよびＮｏ
ｔＩ（１２ｕｎｉｔｓ／μｌ）２μＬを加え、均一にし
て３７℃で１０時間インキュベートした。酵素反応終了
後、ＳＤＷ５０μＬおよびエタノール２５０μＬを加
え、撹拌後−８０℃で２時間放置し、遠心（１２０００
ｒｐｍ、０℃、２０分）して、ＤＮＡを沈澱として回収
した。これを２０μＬのＳＤＷに溶解した。以後これを
ＫＳ（Ｎ−Ｓ）と称する。
【００２１】ＶL（Ｓ−Ｘ）用ベクターフラグメント作
製のため、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）１０
μＬ（約５．０ μｇ）に、Ｌ−バッファー［１００ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2，１０ｍＭ ＤＴＴ］５μＬ 、ＳＤＷ３１．５
μＬおよびＳａｃＩ（１２ｕｎｉｔｓ／μＬ ）１．５
μＬを加え、均一にして３７℃で６時間インキュベート
した。これに４ＭＮａＣｌ ０．５μＬを加え、ついで
ＸｈｏＩ（８ｕｎｉｔｓ／μＬ）１．５μＬを加え、均
一にして３７℃で６時間インキュベートした。酵素反応
終了後、４Ｍ ＮａＣｌ ５μＬ、ＳＤＷ４５μＬおよ
びエタノール２５０μＬを加え、撹拌後−８０℃で２時
間放置し、遠心（１２０００ｒｐｍ、０℃、２０分）し
て、ＤＮＡを沈澱として回収した。これを２０μＬのＳ
ＤＷに溶解した。以後これをＫＳ（Ｓ−Ｘ）と称する。
製のため、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）１０
μＬ（約５．０ μｇ）に、Ｌ−バッファー［１００ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2，１０ｍＭ ＤＴＴ］５μＬ 、ＳＤＷ３１．５
μＬおよびＳａｃＩ（１２ｕｎｉｔｓ／μＬ ）１．５
μＬを加え、均一にして３７℃で６時間インキュベート
した。これに４ＭＮａＣｌ ０．５μＬを加え、ついで
ＸｈｏＩ（８ｕｎｉｔｓ／μＬ）１．５μＬを加え、均
一にして３７℃で６時間インキュベートした。酵素反応
終了後、４Ｍ ＮａＣｌ ５μＬ、ＳＤＷ４５μＬおよ
びエタノール２５０μＬを加え、撹拌後−８０℃で２時
間放置し、遠心（１２０００ｒｐｍ、０℃、２０分）し
て、ＤＮＡを沈澱として回収した。これを２０μＬのＳ
ＤＷに溶解した。以後これをＫＳ（Ｓ−Ｘ）と称する。
【００２２】（６）ＶHとＶLのＤＮＡフラグメントとベ
クターフラグメントとのライゲ−ション 上記（５）で得られたＫＳ（Ｎ−Ｓ）１．５μＬ（０．
１μｇ）に、上記（４）で得られたＶH（Ｎ−Ｓ）９．
０μＬ（０．０５μｇ）、ライゲーション緩衝液（０．
２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），５０ｍＭ
ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＡＴＰ，５ｍＭ ＤＴＴ，２５％
ポリエチレングリコール−８０００］４．０μＬ、０．
２Ｍβ−メルカプトエタノール１．０μＬ、ＳＤＷ１
３．５μＬおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（３５０ｕｎｉ
ｔｓ／μＬ）１．０μＬを加え均一にし、１６℃で２０
時間インキュベートした。反応終了後、４Ｍ ＮａＣｌ
１．２５μＬ、ＳＤＷ３．７５μＬおよびエタノール
８７．５μＬを加え、撹拌後−８０℃で２時間放置後、
遠心（１２０００ ｒｐｍ、０℃、２０分）してＤＮＡ
を沈澱として回収し、２０μＬのＳＤＷに溶かし、ＫＳ
ＶHを得た。上記（５）で得られたＫＳ（Ｓ−Ｘ）と、
上記（４）で得られたＶL（Ｓ−Ｘ）のライゲーション
もＫＳＶHの場合と同様に行って、ＫＳＶLを得た。
クターフラグメントとのライゲ−ション 上記（５）で得られたＫＳ（Ｎ−Ｓ）１．５μＬ（０．
１μｇ）に、上記（４）で得られたＶH（Ｎ−Ｓ）９．
０μＬ（０．０５μｇ）、ライゲーション緩衝液（０．
２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），５０ｍＭ
ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＡＴＰ，５ｍＭ ＤＴＴ，２５％
ポリエチレングリコール−８０００］４．０μＬ、０．
２Ｍβ−メルカプトエタノール１．０μＬ、ＳＤＷ１
３．５μＬおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（３５０ｕｎｉ
ｔｓ／μＬ）１．０μＬを加え均一にし、１６℃で２０
時間インキュベートした。反応終了後、４Ｍ ＮａＣｌ
１．２５μＬ、ＳＤＷ３．７５μＬおよびエタノール
８７．５μＬを加え、撹拌後−８０℃で２時間放置後、
遠心（１２０００ ｒｐｍ、０℃、２０分）してＤＮＡ
を沈澱として回収し、２０μＬのＳＤＷに溶かし、ＫＳ
ＶHを得た。上記（５）で得られたＫＳ（Ｓ−Ｘ）と、
上記（４）で得られたＶL（Ｓ−Ｘ）のライゲーション
もＫＳＶHの場合と同様に行って、ＫＳＶLを得た。
【００２３】（７）ＫＳＶHおよびＫＳＶLの大腸菌への
導入 上記（６）で得られたＫＳＶH、ＫＳＶLのそれぞれ１０
μＬを１．５ｍｌの滅菌チュ−ブに取り、つぎに大腸菌
ＮＭ５２２のコンピ−テントセル（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮ
Ｅ社製）１００μＬを添加し、氷中で１時間静置した。
つぎに、このチュ−ブを４２℃で９０秒静置し、また氷
中に２分間戻した。つぎに、ＳＯＣ溶液（Ｙｅａｓｔ
Ｅｘｔｒａｃｔ ０．５ｇ、Ｐｅｐｔｏｎ ２ｇおよび
ＮａＣｌ０．０５ｇを坪量し、蒸留水１００ｍｌを加え
オ−トクレイブする。培地が５０〜６０℃に冷えた後、
１Ｍ ＭｇＣｌ2 １ｍｌ、２５０ ｍＭ ＫＣｌ １
ｍｌおよび２Ｍ Ｇｌｕｃｏｓｅ ２．７８ｍｌを加え
る）１ｍｌを加え、３７℃で１時間静置した。
導入 上記（６）で得られたＫＳＶH、ＫＳＶLのそれぞれ１０
μＬを１．５ｍｌの滅菌チュ−ブに取り、つぎに大腸菌
ＮＭ５２２のコンピ−テントセル（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮ
Ｅ社製）１００μＬを添加し、氷中で１時間静置した。
つぎに、このチュ−ブを４２℃で９０秒静置し、また氷
中に２分間戻した。つぎに、ＳＯＣ溶液（Ｙｅａｓｔ
Ｅｘｔｒａｃｔ ０．５ｇ、Ｐｅｐｔｏｎ ２ｇおよび
ＮａＣｌ０．０５ｇを坪量し、蒸留水１００ｍｌを加え
オ−トクレイブする。培地が５０〜６０℃に冷えた後、
１Ｍ ＭｇＣｌ2 １ｍｌ、２５０ ｍＭ ＫＣｌ １
ｍｌおよび２Ｍ Ｇｌｕｃｏｓｅ ２．７８ｍｌを加え
る）１ｍｌを加え、３７℃で１時間静置した。
【００２４】このうち２００μＬをＬＢ−Ａｍｐ−Ｘ・
ｇａｌ寒天培地［１．０％バクト・トリプトン、０．５
％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％Ａｇａｒ
Ｎｏｂｌｅ（ｐＨ７．３），１００μｇ／ｍＬアンピシ
リン，６０μｇ／ｍＬ ５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏ
ｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐ
ｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｘ−ｇａｌ）］に植菌し３７℃で
１２時間培養して、β−ガラクシドダーゼのα相補性に
よる、コロニーのブルー・ホワイト・セレクションを行
った。寒天培地より目的のプラスミドを含むと予想され
る白いコロニーを選び、ＬＢ−Ａｍｐ培地［１．０％バ
クト・トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎａ
Ｃｌ（ｐＨ７．３）、１００μｇ／ｍＬアンピシリン］
５ｍＬに植え継ぎ、３７℃で６時間インキュベートし
た。これを遠心し集菌した後、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ Ｋ
ｉｔ（ファルマシア社製）を用いてプラスミドを調製
し、組換えプラスミド作製時に使用したのと同じ制限酵
素を用いて制限酵素処理を行って、目的のプラスミドで
あるか否かを、すなわち、目的鎖長のＤＮＡフラグメン
ト［ＶH（Ｎ−Ｓ）とＶL（Ｓ−Ｘ）］が該プラスミドに
組み込まれているかどうかを、２％アガロースゲル（宝
酒造社製）電気泳動、臭化エチジウム染色により確認し
た。
ｇａｌ寒天培地［１．０％バクト・トリプトン、０．５
％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％Ａｇａｒ
Ｎｏｂｌｅ（ｐＨ７．３），１００μｇ／ｍＬアンピシ
リン，６０μｇ／ｍＬ ５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏ
ｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐ
ｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｘ−ｇａｌ）］に植菌し３７℃で
１２時間培養して、β−ガラクシドダーゼのα相補性に
よる、コロニーのブルー・ホワイト・セレクションを行
った。寒天培地より目的のプラスミドを含むと予想され
る白いコロニーを選び、ＬＢ−Ａｍｐ培地［１．０％バ
クト・トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎａ
Ｃｌ（ｐＨ７．３）、１００μｇ／ｍＬアンピシリン］
５ｍＬに植え継ぎ、３７℃で６時間インキュベートし
た。これを遠心し集菌した後、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ Ｋ
ｉｔ（ファルマシア社製）を用いてプラスミドを調製
し、組換えプラスミド作製時に使用したのと同じ制限酵
素を用いて制限酵素処理を行って、目的のプラスミドで
あるか否かを、すなわち、目的鎖長のＤＮＡフラグメン
ト［ＶH（Ｎ−Ｓ）とＶL（Ｓ−Ｘ）］が該プラスミドに
組み込まれているかどうかを、２％アガロースゲル（宝
酒造社製）電気泳動、臭化エチジウム染色により確認し
た。
【００２５】（８）ＫＳＶHおよびＫＳＶLのサブクロー
ニング 上記（７）で得られた、目的プラスミドを有する大腸菌
は、それぞれＬＢ−Ａｍｐ培地１．５ｍｌに植え、３７
℃で１６時間インキュベートした後、ＬＢ−Ａｍｐ５０
ｍｌに植え継ぎ、３７℃で５時間、大量培養した。これ
を集菌した後、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ Ｋｉｔ（ファルマ
シア社製）を用いて、目的プラスミドＫＳＶHおよびＫ
ＳＶLを調製した。プラスミドは沈澱として回収し、こ
れを５０ｆｍｏｌになるようＴＥ溶液に溶かした。
ニング 上記（７）で得られた、目的プラスミドを有する大腸菌
は、それぞれＬＢ−Ａｍｐ培地１．５ｍｌに植え、３７
℃で１６時間インキュベートした後、ＬＢ−Ａｍｐ５０
ｍｌに植え継ぎ、３７℃で５時間、大量培養した。これ
を集菌した後、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ Ｋｉｔ（ファルマ
シア社製）を用いて、目的プラスミドＫＳＶHおよびＫ
ＳＶLを調製した。プラスミドは沈澱として回収し、こ
れを５０ｆｍｏｌになるようＴＥ溶液に溶かした。
【００２６】（９）サイクルシ−クエンス 上記（８）でサブクロ−ニングしたプラスミドのＨ鎖と
Ｌ鎖の可変領域の塩基配列を、サイクルシ−クエンス法
で決定した。１ｐｍｏｌのＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ３
（宝酒造社製）とＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（宝酒造
社製）をそれぞれ別々のチュ−ブに１０μｌ取り、５×
キナ−ゼ緩衝液（宝酒造社製）１０μｌ、［γ32Ｐ］Ａ
ＴＰ（アマシャム社製）１０μｌ、ＳＤＷ１８．３μｌ
およびＴ４ポリヌクレオチドキナ−ゼ（６単位／μｌ）
（宝酒造社製）１．７μｌをそれぞれのチュ−ブに加
え、全量を５０μｌとした。上記で標識した32Ｐ標識Ｍ
１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ３と32Ｐ標識Ｍ１３ Ｐｒｉｍ
ｅｒ ＲＶをそれぞれ別々のチュ−ブに１０μｌ取り、
５０ｆｍｏｌに調製したＫＳＶH ０．１５μｌ、１０
×Ｔａｑポリメラ−ゼ緩衝液９μｌ、ＳＤＷ７１．８５
μｌおよびＴａｑポリメラ−ゼ（５単位／μｌ）１μｌ
をそれぞれのチュ−ブに加え、全量を７２μｌとした
（それぞれ溶液および溶液と称する）。
Ｌ鎖の可変領域の塩基配列を、サイクルシ−クエンス法
で決定した。１ｐｍｏｌのＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ３
（宝酒造社製）とＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（宝酒造
社製）をそれぞれ別々のチュ−ブに１０μｌ取り、５×
キナ−ゼ緩衝液（宝酒造社製）１０μｌ、［γ32Ｐ］Ａ
ＴＰ（アマシャム社製）１０μｌ、ＳＤＷ１８．３μｌ
およびＴ４ポリヌクレオチドキナ−ゼ（６単位／μｌ）
（宝酒造社製）１．７μｌをそれぞれのチュ−ブに加
え、全量を５０μｌとした。上記で標識した32Ｐ標識Ｍ
１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ３と32Ｐ標識Ｍ１３ Ｐｒｉｍ
ｅｒ ＲＶをそれぞれ別々のチュ−ブに１０μｌ取り、
５０ｆｍｏｌに調製したＫＳＶH ０．１５μｌ、１０
×Ｔａｑポリメラ−ゼ緩衝液９μｌ、ＳＤＷ７１．８５
μｌおよびＴａｑポリメラ−ゼ（５単位／μｌ）１μｌ
をそれぞれのチュ−ブに加え、全量を７２μｌとした
（それぞれ溶液および溶液と称する）。
【００２７】Ａｍｉｘ溶液（５ｍＭ ｄｄＡＴＰ ４０
μｌ、１ｍＭ ｄＡＴＰ ５μｌ、１ｍＭ ｄＣＴＰ
５μｌ、１ｍＭ ｄｅａｚａ ｄＧＴＰ ５μｌおよび
１ｍＭ ｄＴＴＰ ５μｌにＳＤＷ４０μｌを加えて１
００μｌとする）、Ｇｍｉｘ溶液（５ｍＭ ｄｄＧＴＰ
４μｌ、１ｍＭ ｄＡＴＰ ５μｌ、１ｍＭ ｄＣＴ
Ｐ ５μｌ、１ｍＭ ｄｅａｚａ ｄＧＴＰ ５μｌお
よび１ｍＭ ｄＴＴＰ５μｌにＳＤＷ７６μｌを加えて
１００μｌとする）、Ｃｍｉｘ溶液（５ｍＭｄｄＣＴＰ
２０μｌ、１ｍＭ ｄＡＴＰ ５μｌ、１ｍＭ ｄＣ
ＴＰ ５μｌ、１ｍＭ ｄｅａｚａ ｄＧＴＰ ５μｌ
および１ｍＭ ｄＴＴＰ ５μｌにＳＤＷ６０μｌを加
えて１００μｌとする）、およびＴｍｉｘ溶液（５ｍＭ
ｄｄＴＴＰ ４０μｌ、１ｍＭ ｄＡＴＰ ５μｌ、
１ｍＭ ｄＣＴＰ ５μｌ、１ｍＭ ｄｅａｚａ ｄＧ
ＴＰ ５μｌおよび１ｍＭ ｄＴＴＰ ５μｌにＳＤＷ
４０μｌを加えて１００μｌとする）をそれぞれ別々の
０．５ｍｌマイクロチュ−ブに４μｌずつ取り、上記で
調製した溶液または溶液を１６μｌずつ加え、全量
を２０μｌとした。さらに、各チュ−ブに２０μｌのパ
ラフィンを添加した。この操作でチュ−ブの本数は８本
になる。
μｌ、１ｍＭ ｄＡＴＰ ５μｌ、１ｍＭ ｄＣＴＰ
５μｌ、１ｍＭ ｄｅａｚａ ｄＧＴＰ ５μｌおよび
１ｍＭ ｄＴＴＰ ５μｌにＳＤＷ４０μｌを加えて１
００μｌとする）、Ｇｍｉｘ溶液（５ｍＭ ｄｄＧＴＰ
４μｌ、１ｍＭ ｄＡＴＰ ５μｌ、１ｍＭ ｄＣＴ
Ｐ ５μｌ、１ｍＭ ｄｅａｚａ ｄＧＴＰ ５μｌお
よび１ｍＭ ｄＴＴＰ５μｌにＳＤＷ７６μｌを加えて
１００μｌとする）、Ｃｍｉｘ溶液（５ｍＭｄｄＣＴＰ
２０μｌ、１ｍＭ ｄＡＴＰ ５μｌ、１ｍＭ ｄＣ
ＴＰ ５μｌ、１ｍＭ ｄｅａｚａ ｄＧＴＰ ５μｌ
および１ｍＭ ｄＴＴＰ ５μｌにＳＤＷ６０μｌを加
えて１００μｌとする）、およびＴｍｉｘ溶液（５ｍＭ
ｄｄＴＴＰ ４０μｌ、１ｍＭ ｄＡＴＰ ５μｌ、
１ｍＭ ｄＣＴＰ ５μｌ、１ｍＭ ｄｅａｚａ ｄＧ
ＴＰ ５μｌおよび１ｍＭ ｄＴＴＰ ５μｌにＳＤＷ
４０μｌを加えて１００μｌとする）をそれぞれ別々の
０．５ｍｌマイクロチュ−ブに４μｌずつ取り、上記で
調製した溶液または溶液を１６μｌずつ加え、全量
を２０μｌとした。さらに、各チュ−ブに２０μｌのパ
ラフィンを添加した。この操作でチュ−ブの本数は８本
になる。
【００２８】上記で調製した０．５ｍｌマイクロチュ−
ブをサ−マルサイクラ−（シ−タス社製）のブロックに
のせ、９４℃で５分間反応後、９４℃で３０秒、５５℃
で３０秒および７２℃で６０秒の連続反応を２０回行っ
た。反応終了後、パラフィンを取らないように反応液を
取り、シ−クエンス用アクリルアミドゲル電気泳動にか
けた。電気泳動終了後、アクリルアミドゲルを３Ｍペ−
パ−に張り、真空乾燥を行った。Ｘ線フィルムに感光さ
せ、室温で６時間以上放置した。Ｘ線フィルムを現像
し、ＤＮＡ配列を読み取った。
ブをサ−マルサイクラ−（シ−タス社製）のブロックに
のせ、９４℃で５分間反応後、９４℃で３０秒、５５℃
で３０秒および７２℃で６０秒の連続反応を２０回行っ
た。反応終了後、パラフィンを取らないように反応液を
取り、シ−クエンス用アクリルアミドゲル電気泳動にか
けた。電気泳動終了後、アクリルアミドゲルを３Ｍペ−
パ−に張り、真空乾燥を行った。Ｘ線フィルムに感光さ
せ、室温で６時間以上放置した。Ｘ線フィルムを現像
し、ＤＮＡ配列を読み取った。
【００２９】
【発明の効果】以上のように、ヒトＬｐ（ａ）を認識す
るモノクロ−ナル抗体であるＫＯＳ−Ａの可変領域のＤ
ＮＡ配列が明らかになった。得られたＤＮＡ配列によ
り、ＫＯＳ−Ａ抗体の可変領域を構成するＶH鎖領域お
よびＶL鎖領域を再構成することが可能となり、ヒトＬ
ｐ（ａ）を特異的に認識する組換え抗体を製造すること
ができる。本発明のＶH鎖領域塩基配列およびＶL鎖領域
塩基配列を組み込んでなる組換え抗体は、エピトープ認
識の必要最小限部位（可変領域）のみで構成することが
できるので、ヒトＬｐ（ａ）を検出する特異抗体として
安定した再現性のよい組換え抗体であることができると
考えられる。
るモノクロ−ナル抗体であるＫＯＳ−Ａの可変領域のＤ
ＮＡ配列が明らかになった。得られたＤＮＡ配列によ
り、ＫＯＳ−Ａ抗体の可変領域を構成するＶH鎖領域お
よびＶL鎖領域を再構成することが可能となり、ヒトＬ
ｐ（ａ）を特異的に認識する組換え抗体を製造すること
ができる。本発明のＶH鎖領域塩基配列およびＶL鎖領域
塩基配列を組み込んでなる組換え抗体は、エピトープ認
識の必要最小限部位（可変領域）のみで構成することが
できるので、ヒトＬｐ（ａ）を検出する特異抗体として
安定した再現性のよい組換え抗体であることができると
考えられる。
【００３０】
配列番号：１ 配列の長さ：３６３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 起源 生物名：マウス 株名：ＢＡＬＢ／ｃ 配列： CAGGAGTCAG GGCAGGAGTC TGGACCTGAC CTGGTGAAAC CTTCTCAGTC ACTTTCACTC 60 ACCTGCACTG TCACTGGCTA CTCCATCACC AGTGGTTATA GCTGGCACTG GATCCGGCAG 120 CTCAGGAACA ACTCATTGGA GTGGGTGGCA TCGAGACACA TCCAAGAAAA CCAGAAGTTC 180 AAGGGCAAGG CCAAACTGAC TGCAGTCACA TTCACATATT ACCGTGATAG AGAGGATTAC 240 TACGGTGGTC TGCAAATGTT TGACTCGTGG GCAGAGGACA CACCTCAACT TAACTGCGTG 300 ACGACGGAGG ACACGTCACA ATCACTTTCA GACACATGGG GCCAAGGGAC CACTGTTACT 360 AGT
【００３１】 配列番号：２ 配列の長さ：１２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Gln Glu Ser Gly Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Leu Arg Asn Asn Ser Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ser Arg His Ile Gln Glu Pro Ile Leu Pro Gln Leu Asn Ser 50 55 60 Val Thr Thr Glu Asp Arg Phe Thr Tyr Tyr Arg Asp Arg Glu Asp Tyr 65 70 75 80 Tyr Gly Gly Leu Gln Met Phe Asp Ser Trp Ala Glu Asp Thr Pro Gln 85 90 95 Leu Asn Cys Val Thr Thr Glu Asp Thr Ser Gln Ser Leu Ser Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Ser 115 120
【００３２】 配列番号：３ 配列の長さ：３２１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 起源 生物名：マウス 株名：ＢＡＬＢ／ｃ 配列： GACCTCGTGA TGACCCAGTC TCCATCCAGC ACTCATGTCA GCATCTCCAG GGGAGTCACC 60 ATGACCTGCA GTGCCAGCTC AAGTGTAAGT GTACATGTAC TGTGGTACCA GCAGAAGCCA 120 AGATCGTCCC CAAACCCTGG TTTATCTCAC ATCACTGCTC TCAGTGGTGT CCCTGCTCGC 180 TCAGTGTCAG GTTCAGGTTC AGGTACTGAT CTCTCTCTCA CAATCAGCAG CCAGAGCGCT 240 GAAGATGCTG CCACTTATTA CTGCCAGCAG TGGAGTAGTA ACCCGCTCAC GTTCGGTGGG 300 GGGACCAAGC TGGGACTCGA G
【００３３】 配列番号：４ 配列の長さ：１０７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Glu Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Thr His Val Ser Ile Ser 1 5 10 15 Arg Gly Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Val His 20 25 30 Val Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Asn Pro Gly Leu 35 40 45 Ser His Ile Thr Ala Leu Ser Gly Val Pro Ala Arg Ser Val Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Leu Ser Leu Thr Ile Ser Ser Gln Ser Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gly Leu Glu 100 105
【００３４】 配列番号：５ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列: GTSMARGCGG CCGCACAGSA GTCAGG
【００３５】 配列番号：６ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： TGAGGAGACT AGTAACAGTG GTCCCTTGGC CCCA
【００３６】 配列番号：７ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GTGCCAGATG TGAGCTCGTG ATGACCCAGT CTCCA
【００３７】 配列番号：８ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GCTCGAGTCC CAGCTTGGTC CC
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｗ 33/577 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】 抗ヒトリポタンパク質（ａ）モノクロ−
ナル抗体ＫＯＳ−ＡのＨ鎖Ｖ領域の塩基配列であって、
ヒトリポタンパク質（ａ）を認識する機能を担う、配列
表の配列番号１で示される塩基配列。 - 【請求項２】 抗ヒトリポタンパク質（ａ）モノクロ−
ナル抗体ＫＯＳ−ＡのＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列であっ
て、ヒトリポタンパク質（ａ）を認識する機能を担う、
配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列。 - 【請求項３】 抗ヒトリポタンパク質（ａ）モノクロ−
ナル抗体ＫＯＳ−ＡのＬ鎖Ｖ領域の塩基配列であって、
ヒトリポタンパク質（ａ）を認識する機能を担う、配列
表の配列番号３で示される塩基配列。 - 【請求項４】 抗ヒトリポタンパク質（ａ）モノクロ−
ナル抗体ＫＯＳ−ＡのＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列であっ
て、ヒトリポタンパク質（ａ）を認識する機能を担う、
配列表の配列番号４で示されるアミノ酸配列。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7351455A JPH09173063A (ja) | 1995-12-26 | 1995-12-26 | 抗ヒトリポタンパク質（ａ）モノクローナル抗体可変領域のＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7351455A JPH09173063A (ja) | 1995-12-26 | 1995-12-26 | 抗ヒトリポタンパク質（ａ）モノクローナル抗体可変領域のＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09173063A true JPH09173063A (ja) | 1997-07-08 |
Family
ID=18417406
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7351455A Pending JPH09173063A (ja) | 1995-12-26 | 1995-12-26 | 抗ヒトリポタンパク質（ａ）モノクローナル抗体可変領域のＤＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09173063A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7915387B2 (en) | 2004-05-12 | 2011-03-29 | Cephalon Australia Pty Ltd | Monoclonal antibody Sc104 and derivative thereof specifically binding to a sialyltetraosyl carbohydrate as a potential anti-tumor therapeutic agent |
-
1995
- 1995-12-26 JP JP7351455A patent/JPH09173063A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7915387B2 (en) | 2004-05-12 | 2011-03-29 | Cephalon Australia Pty Ltd | Monoclonal antibody Sc104 and derivative thereof specifically binding to a sialyltetraosyl carbohydrate as a potential anti-tumor therapeutic agent |
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