JPH09157160A - ウイルスベクターの不活化防止剤 - Google Patents
ウイルスベクターの不活化防止剤Info
- Publication number
- JPH09157160A JPH09157160A JP32311795A JP32311795A JPH09157160A JP H09157160 A JPH09157160 A JP H09157160A JP 32311795 A JP32311795 A JP 32311795A JP 32311795 A JP32311795 A JP 32311795A JP H09157160 A JPH09157160 A JP H09157160A
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- JP
- Japan
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- gene
- inactivation
- vector
- viral vector
- virus
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 血清によるウイルスベクター不活化の防止
【解決手段】 ｐ−グアニジノ安息香酸誘導体またはそ
の塩である蛋白分解酵素阻害剤の使用によりウイルスベ
クター不活化を防止する。 【効果】 メシル酸ナファモスタットの添加によりウイ
ルスベクターの活性を高く保つことができる。
の塩である蛋白分解酵素阻害剤の使用によりウイルスベ
クター不活化を防止する。 【効果】 メシル酸ナファモスタットの添加によりウイ
ルスベクターの活性を高く保つことができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子治療の目的
で、標的細胞にウイルスベクターを導入する際にウイル
スベクターの失活を防ぐためのウイルスベクター不活化
防止剤に関する。
で、標的細胞にウイルスベクターを導入する際にウイル
スベクターの失活を防ぐためのウイルスベクター不活化
防止剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子治療は致死性の遺伝性疾患あるい
は癌等の生命を脅かす疾患に対し、遺伝子導入法を応用
した治療方法である。近年、いわゆる遺伝子治療の可能
性に強い関心が寄せられている。１９９０年アデノシン
デアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症による重症複合免疫不全
症の患者のリンパ球に正常のＡＤＡ遺伝子を組み込んだ
レトロウイルスベクターを用いた、遺伝子治療が行われ
た。ウイルス粒子は細胞表面のウイルス外被糖蛋白に対
するレセプターに吸着し、細胞内に侵入する。次いで、
ウイルス粒子内にある逆転写酵素の働きによりゲノムの
一本鎖ＲＮＡの情報は二本鎖ＤＮＡに安定的に組み込ま
れる。組み込まれた状態のウイルスをプロウイルスと呼
ぶ。プロウイルスが形成されると、宿主細胞の転写、翻
訳メカニズムを利用してｍＲＮＡが発現し、ウイルス蛋
白が合成される。ウイルスに任意の遺伝子を組み込んだ
ベクターＤＮＡを宿主細胞に移入することにより、ウイ
ルスに組み込まれた任意の遺伝子が発現する。遺伝子治
療を成功させるためには、遺伝子が宿主細胞に効率良く
導入され、導入した遺伝子が長期にわたり安定的に発現
させる必要がある。遺伝子を標的細胞に導入するベクタ
ーとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボ
ウイルスベクターなどが知られている。この内、レトロ
ウイルスは、標的細胞に対する障害性が少ない、安定し
たウイルス粒子が得られる、かつまたヒトへの治療経験
がある、などで最も適したウイルスである。
は癌等の生命を脅かす疾患に対し、遺伝子導入法を応用
した治療方法である。近年、いわゆる遺伝子治療の可能
性に強い関心が寄せられている。１９９０年アデノシン
デアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症による重症複合免疫不全
症の患者のリンパ球に正常のＡＤＡ遺伝子を組み込んだ
レトロウイルスベクターを用いた、遺伝子治療が行われ
た。ウイルス粒子は細胞表面のウイルス外被糖蛋白に対
するレセプターに吸着し、細胞内に侵入する。次いで、
ウイルス粒子内にある逆転写酵素の働きによりゲノムの
一本鎖ＲＮＡの情報は二本鎖ＤＮＡに安定的に組み込ま
れる。組み込まれた状態のウイルスをプロウイルスと呼
ぶ。プロウイルスが形成されると、宿主細胞の転写、翻
訳メカニズムを利用してｍＲＮＡが発現し、ウイルス蛋
白が合成される。ウイルスに任意の遺伝子を組み込んだ
ベクターＤＮＡを宿主細胞に移入することにより、ウイ
ルスに組み込まれた任意の遺伝子が発現する。遺伝子治
療を成功させるためには、遺伝子が宿主細胞に効率良く
導入され、導入した遺伝子が長期にわたり安定的に発現
させる必要がある。遺伝子を標的細胞に導入するベクタ
ーとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボ
ウイルスベクターなどが知られている。この内、レトロ
ウイルスは、標的細胞に対する障害性が少ない、安定し
たウイルス粒子が得られる、かつまたヒトへの治療経験
がある、などで最も適したウイルスである。
【０００３】レトロウイルスベクターは標的細胞ゲノム
に組込まれ細胞分裂とともに娘細胞に受け継がれるの
で、導入した遺伝子の長期にわたる安定的発現という目
的にかなっている。遺伝子導入の効率は用いるベクター
の種類、培養条件などにより左右される。従来から、ウ
イルスベクターを標的宿主細胞に導入するためには試験
管内でウイルスベクターと標的宿主細胞をインキュベー
トすることが必要であった。しかし、試験管内でインキ
ュベートすることにより、ウイルスベクターの不活化や
細胞の死滅や疲幣などが避けられず、遺伝子導入の効率
が悪くなる。さらに、肝臓癌のような固形癌について
は、試験管内で遺伝子を標的細胞に導入するよりは、直
接局所にウイルスベクターを導入する方が効率的であ
る。
に組込まれ細胞分裂とともに娘細胞に受け継がれるの
で、導入した遺伝子の長期にわたる安定的発現という目
的にかなっている。遺伝子導入の効率は用いるベクター
の種類、培養条件などにより左右される。従来から、ウ
イルスベクターを標的宿主細胞に導入するためには試験
管内でウイルスベクターと標的宿主細胞をインキュベー
トすることが必要であった。しかし、試験管内でインキ
ュベートすることにより、ウイルスベクターの不活化や
細胞の死滅や疲幣などが避けられず、遺伝子導入の効率
が悪くなる。さらに、肝臓癌のような固形癌について
は、試験管内で遺伝子を標的細胞に導入するよりは、直
接局所にウイルスベクターを導入する方が効率的であ
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、ウイルスベク
ターを直接生体内に投与すると、血清によるウイルスベ
クターの不活化がおこり、期待したほどの効果は認めら
れない。そこで、ウイルスベクターを直接生体内に投与
し、生体内で標的細胞に直接遺伝子を導入し、効率を上
げる必要がある。
ターを直接生体内に投与すると、血清によるウイルスベ
クターの不活化がおこり、期待したほどの効果は認めら
れない。そこで、ウイルスベクターを直接生体内に投与
し、生体内で標的細胞に直接遺伝子を導入し、効率を上
げる必要がある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】そこで、直接ウイルスベ
クターを生体内に投与した時に起こる、血清によりウイ
ルスベクターの不活化を防ぐことを目的に鋭意研究し
た。その結果、一般式Ｉで示す蛋白分解酵素阻害剤が有
効であることが判明した。
クターを生体内に投与した時に起こる、血清によりウイ
ルスベクターの不活化を防ぐことを目的に鋭意研究し
た。その結果、一般式Ｉで示す蛋白分解酵素阻害剤が有
効であることが判明した。
【化３】
【０００６】一般式〔Ｉ〕で示される化合物は特許出願
公開平２−２４３６２４によると、抗ウイルス作用すな
わちウイルスを殺す作用があることが既に知られている
公知化合物である。しかし、本発明の効果は抗ウイルス
作用とは相反する作用であり、従来の作用からは全く予
想されない作用である。さらに、ウイルスベクターの不
活化剤として用いられる一般式〔Ｉ〕で示される化合物
のメシル酸塩は、一般名メシル酸ナファモスタット（上
記式〔Ｉ〕においてＲが６−アミジノ−２−ナフチル基
の場合）あるいはメシル酸カモスッタト（上記式〔Ｉ〕
においてＲが４−（ジメチルカルバモイルメトキシカル
ボニルメチル）フェニル基の場合）としてすでに膵炎の
治療等に用いられ、哺乳類に対する安全性が確認されて
いる。
公開平２−２４３６２４によると、抗ウイルス作用すな
わちウイルスを殺す作用があることが既に知られている
公知化合物である。しかし、本発明の効果は抗ウイルス
作用とは相反する作用であり、従来の作用からは全く予
想されない作用である。さらに、ウイルスベクターの不
活化剤として用いられる一般式〔Ｉ〕で示される化合物
のメシル酸塩は、一般名メシル酸ナファモスタット（上
記式〔Ｉ〕においてＲが６−アミジノ−２−ナフチル基
の場合）あるいはメシル酸カモスッタト（上記式〔Ｉ〕
においてＲが４−（ジメチルカルバモイルメトキシカル
ボニルメチル）フェニル基の場合）としてすでに膵炎の
治療等に用いられ、哺乳類に対する安全性が確認されて
いる。
【０００７】
【発明の効果】以下の実験例に示すように、メシル酸ナ
ファモスタット存在下、ウイルスベクターとして利用さ
れるウイルスの一つであるレトロウイルスにβ−ガラク
トシダーゼ発現遺伝子を導入したＢＡＧレトロウイルス
を血清と接触させ、経時的に採取し、さらにフィブロブ
ラスト細胞と３７℃でインキュベートし、フィブロブラ
スト細胞にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入させ、フ
ィブロブラスト細胞の産生するβ−ガラクトシダーゼ量
を測定しウイルスベクターに対する血清の影響を調べ
た。その結果、対照と比較して明らかにメシル酸ナファ
モスタットが存在した方がウイルスベクターが血清に対
して、安定であった。さらに、メシル酸カモスタットも
同様に血清によるウイルスベクターの不活化を阻害する
作用がある。投与方法としては、メシル酸ナファモスタ
ットあるいはメシル酸カモスタットを適当な溶媒に溶解
し、ウイルスベクターと混和し、静脈あるいは動脈内に
投与する。
ファモスタット存在下、ウイルスベクターとして利用さ
れるウイルスの一つであるレトロウイルスにβ−ガラク
トシダーゼ発現遺伝子を導入したＢＡＧレトロウイルス
を血清と接触させ、経時的に採取し、さらにフィブロブ
ラスト細胞と３７℃でインキュベートし、フィブロブラ
スト細胞にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入させ、フ
ィブロブラスト細胞の産生するβ−ガラクトシダーゼ量
を測定しウイルスベクターに対する血清の影響を調べ
た。その結果、対照と比較して明らかにメシル酸ナファ
モスタットが存在した方がウイルスベクターが血清に対
して、安定であった。さらに、メシル酸カモスタットも
同様に血清によるウイルスベクターの不活化を阻害する
作用がある。投与方法としては、メシル酸ナファモスタ
ットあるいはメシル酸カモスタットを適当な溶媒に溶解
し、ウイルスベクターと混和し、静脈あるいは動脈内に
投与する。
【０００８】
【実施例】次に実施例によって本発明を詳細に説明す
る。
る。
【０００９】
【実施例】β−ガラクトシダーゼ発現遺伝子を組込んだ
ＢＡＧレトロウイルス５×１０5ＣＦＵ／ｍｌを５０μ
ｌとメシル酸ナファモスタットの０．１，１，１０μｇ
をそれぞれ含むヒト血清５０μｌを３７℃でインキュベ
ートし、０，１５，３０，４５，６０分毎に血清を採取
し、その５０μｌをＮＩＨ−フィブロブラスト（１×１
０4 細胞／ウエル）に添加し、さらにポリブレン４μｇ
／ｍｌを加え、４８時間培養し、β−ガラクトシダーゼ
を発現させ、ついで、β−ガラクトシダーゼの発色基質
である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−１−
β−ガラクトシドと反応させ青色に染色された細胞を計
測した。ＢＡＧレトロウイルスのβ−ガラクトシダーゼ
発現遺伝子が組込まれたフィブロブラスト細胞はβ−ガ
ラクトシダーゼを発現し、β−ガラクトシダーゼの発色
基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
１−β−ガラクトシドを分解し、青色に染まる。
ＢＡＧレトロウイルス５×１０5ＣＦＵ／ｍｌを５０μ
ｌとメシル酸ナファモスタットの０．１，１，１０μｇ
をそれぞれ含むヒト血清５０μｌを３７℃でインキュベ
ートし、０，１５，３０，４５，６０分毎に血清を採取
し、その５０μｌをＮＩＨ−フィブロブラスト（１×１
０4 細胞／ウエル）に添加し、さらにポリブレン４μｇ
／ｍｌを加え、４８時間培養し、β−ガラクトシダーゼ
を発現させ、ついで、β−ガラクトシダーゼの発色基質
である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−１−
β−ガラクトシドと反応させ青色に染色された細胞を計
測した。ＢＡＧレトロウイルスのβ−ガラクトシダーゼ
発現遺伝子が組込まれたフィブロブラスト細胞はβ−ガ
ラクトシダーゼを発現し、β−ガラクトシダーゼの発色
基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
１−β−ガラクトシドを分解し、青色に染まる。
【００１０】図１に示す結果から明らかな様に、メシル
酸ナファモスタットを添加した方がウイルスタイターが
高い、すなわち、β−ガラクトシダーゼ発現遺伝子を持
ったＢＡＧレトロウイルスが血清による不活化を受け
ず、β−ガラクトシダーゼ発現遺伝子が効率良くフィブ
ロブラスト細胞に導入されたことを示している。
酸ナファモスタットを添加した方がウイルスタイターが
高い、すなわち、β−ガラクトシダーゼ発現遺伝子を持
ったＢＡＧレトロウイルスが血清による不活化を受け
ず、β−ガラクトシダーゼ発現遺伝子が効率良くフィブ
ロブラスト細胞に導入されたことを示している。
【図１】メシル酸ナファモスタット存在下における血清
のウイルスベクターへの影響を示すグラフ。
のウイルスベクターへの影響を示すグラフ。
Claims (3)
- 【請求項１】 一般式Ｉで示されるｐ−グアニジノ安息
香酸誘導体またはその無毒性塩を有効成分として含有す
ることを特徴とするウイルスベクター不活化防止剤。 【化１】 - 【請求項２】 【化２】 その無毒性塩を有効成分とすることを特徴とする請求項
１に記載のウイルスベクター不活化防止剤 - 【請求項３】 動物細胞にウイルスベクターを用いて遺
伝子を導入する際に、ウイルスベクター不活化防止剤と
してナファモスタットあるいはその塩を添加することに
よりウイルスベクターの不活化を防止する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32311795A JPH09157160A (ja) | 1995-12-12 | 1995-12-12 | ウイルスベクターの不活化防止剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32311795A JPH09157160A (ja) | 1995-12-12 | 1995-12-12 | ウイルスベクターの不活化防止剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09157160A true JPH09157160A (ja) | 1997-06-17 |
Family
ID=18151278
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32311795A Pending JPH09157160A (ja) | 1995-12-12 | 1995-12-12 | ウイルスベクターの不活化防止剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09157160A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103012214A (zh) * | 2011-09-28 | 2013-04-03 | 南京长澳医药科技有限公司 | 一种萘莫司他盐酸盐及萘莫司他甲磺酸盐的制备方法 |
| WO2021215798A1 (ko) * | 2020-04-20 | 2021-10-28 | 재단법인 한국파스퇴르연구소 | 사스 코로나바이러스 감염증 치료용 약학 조성물 및 이의 의약 용도 |
-
1995
- 1995-12-12 JP JP32311795A patent/JPH09157160A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103012214A (zh) * | 2011-09-28 | 2013-04-03 | 南京长澳医药科技有限公司 | 一种萘莫司他盐酸盐及萘莫司他甲磺酸盐的制备方法 |
| WO2021215798A1 (ko) * | 2020-04-20 | 2021-10-28 | 재단법인 한국파스퇴르연구소 | 사스 코로나바이러스 감염증 치료용 약학 조성물 및 이의 의약 용도 |
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