JPH09149796A - カルシウムの測定方法および測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】２−クロロ−４−ニトロフェニールマルトース
又はパラニトロフェニールマルトース等発色性基を導入
したマルトース誘導体を用いて、カルシウムを測定す
る。 【効果】試料に由来するアミラーゼの影響を受けること
なく正確にカルシウムの測定が可縮となり、血清や尿等
生体試料中の簡便且つ正確なカルシウムの定量ができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、カルシウムの測定方法
に関するものであり、更に詳細には、カルシウムが存在
しないと活性を発現しないアミラーゼに試料中のカルシ
ウムを接触せしめ、試料中のカルシウム量に依存して変
化するアミラーゼ活性を測定することによってカルシウ
ムを測定するエンザイムアッセイに関する。

【０００２】更に詳細には、本発明は、測定試薬として
還元性末端に発色性基を有するマルトース（以下、マル
トース誘導体ともいう）を用い、変化するアミラーゼ活
性を、マルトース誘導体の分解速度あるいは分解程度を
遊離してくる発色性物質に基づいて測定する方法に関す
る。

【０００３】本発明に係る酵素定量法は、ヒト血清や尿
中に存在するアミラーゼの影響を受けることが極めて少
なく、これに対してカルシウムに対する反応性は極めて
高いので、アミラーゼが存在する各種試料（例えば生体
試料）であっても∵これら混在するアミラーゼに係りな
く、つまり予じめ混在するアミラーゼを失活させたりす
ることなく、直接且つ正確にカルシウムを測定すること
ができる。また、本発明は、このようなすぐれた測定方
法を実施できる測定試薬にも関するものである。

【０００４】

【従来の技術】生体内カルシウムの９９％以上は骨・歯
に局在しているが、およそ７００ｍｇ／日は骨への吸収
と排泄を繰り返している。そのため骨に較べると量的に
は少ないが体液や細胞中にもカルシウムは存在する。体
液や細胞中のカルシウムは血液凝固のほか“セカンドメ
ッセンジャー”として神経伝達機能、筋収縮機能、ホル
モン作用など生体活動の重要な働きに関与しているた
め、体液中特に血液中のカルシウムレベルは厳密に一定
に保たれなければならない。血液中のカルシウムレベル
はビタミンＤ、副甲状腺ホルモン、カルシトニンなどに
よって一定に保たれていることは知られている通りであ
り、健常人だと血液中には９〜１１ｍｇ／ｄｌ存在し日
内変動も多くとも±３％と厳密に維持されている。これ
が一旦疾病になると、変動するようになる。粘液水腫、
悪性腫瘍、サイコィドーシス、高タンパク質血症、甲状
腺機能亢進症などの疾病では高カルシウム血症に、ま
た、上皮小体機能低下症、骨軟化症、腎性クル病、尿毒
症、低タンパク質血症、悪性州骨転移などの疾病では低
カルシウム血症へと変動する。健常人の血中カルシウム
レベルは非常に厳密に維持されているため、カルシウム
レベルが僅かにでも変動をきたしたならば、それは間違
いなく疾病に起因するものであると容易に判定が可能で
あるので血中カルシウムの定量は臨床検査上非常に重要
な検査項目となる。

【０００５】血中カルシウムの定量方法としては、原子
吸光法、イオン電極法、ＯＣＰＤ（ｏ−クレゾールフタ
レインコンプレクソン）のような試薬を用いるキレート
比色法が上げられる。原子吸光法やイオン電極法は操作
が煩雑なうえ、特殊で高価な機器を必要とし、キレート
比色法ではＯＣＰＣがマグネシウムに反応する特異性の
低さのためのマスキング剤として８−オキシキノリンを
添加しなければならないなど問題点は多い。８−オキシ
キノリンマグネシウムをマスキングし正誤差を回避させ
るが、カルシウムもトラップしてしまうので、発色感度
を低下させたり低濃度のカルシウムが測れないなどの問
題が生じる。また、僅かなｐＨの相違によって発色度合
いが大きくかわるため、試薬の厳密な調整を必要とする
などの問題もかかえている。

【０００６】血中カルシウムの定量方法として、本方法
同様に酵素を用いた酵素的定量法もいくつか報告されて
きている。特開昭６２−３６１９９では、試料中のカル
シウムをカルモジュリンと反応させてカルシウム・カル
モジュリン複合体を形成させる。この複合体にてカルモ
ジュリン依存性酵素を活性化させその酵素活性を測定す
ることによって試料中のカルシウムを定量するというも
のであるが、測定レンジか狭く感度が高すぎるためあら
かじめ検体希釈が必要なことや、カルモジュリンやカル
モジュリン依存性酵素の基質が高価なうえに不安定であ
るので、なかなか広範に応用しがたい。特開昭６４−２
５９８では、過剰のシュウ酸塩中にカルシウムを加え、
沈澱、残存するシュウなをシュウ酸オキシダーゼにて測
定することによりカルシウムを定量しようとするもので
あるが、カルシウムをシュウ酸カルシウムとして沈澱さ
せる換作が用手法であること、検出にシュウ酸オキシダ
ーゼを用いているので試料中のアスコルビン酸やビリル
ビン酸の影響をうけやすいこと、スタンダードカーブが
右さがりになること、レートアッセイができないなど改
良の余地がある．特開平１−２３１８９６では、ホスホ
リルコリンチオエステルを基質としカルシウム濃度によ
って活性の変化するホスホリパーゼＡ２の酵素活性を測
定することによってカルシウムを定量しようとするもの
であるが、酵素活性の検出にＤＴＮＢ（５，５’−ジチ
オビス一２−ニトロ安息香酸）のようなＳＨ定量試薬を
用いているので、血液中のシステインのような含イオウ
化合物や蛋白質の影響をまともに受けることになる。ア
ミラーゼを用いた定量法も報告されてきている（日本臨
床検査自動化学会、第２３回大会講集、演題２２２〜２
２３）。アミラーゼは、承知の通り、血液中にも存在
し、病態、個々および日・時などによって大きく変動す
る。そうなると、カルシウム濃度をアミラーゼ活性で定
量しようとする場合には、この血中アミラーゼ活性の変
動がカルシウム測定に正負誤差を与えることになる。

【０００７】

【発明の解決しようとする課題】アミラーゼは、特にカ
ルシウムが結合した状態で活性を発現し、カルシウム非
存在下では活性が発現できないことは既知のことであっ
て、例えば、「アミラーゼ」（中村道徳／監修、大西正
健、坂野好幸、谷口肇編集、１９８６、１、１学会出版
センター発行、ｐ１４１〜１４４）に詳しく述べられて
いる。

【０００８】上記原理に基づき、片山らは下記化１で示
される２−クロロ−４−ニトロフェニール一α一マルト
トリオシド（Ｇ３ＣＮＰ）とブタ由来のアミラーゼを用
いて、血清や尿中のカルシウムを測定する方法を報告し
ている（Ｙｕｚｏ Ｋａｙａｍｏｒｉ，Ｙｏｓｈｉａｋ
ｉ Ｋａｔａｈａｍａ（１９９４），Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅ
ｍ，４０，７８４−７８４）。

【０００９】

【化１】

【００１０】しかしながら、片山らの上記報告でも、血
清等から持ち込まれたアミラーゼによってカルシウムの
測定に正の誤差を生ずることが報告されており、更に具
体的には、その“Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ”の項におい
て、急性脾臓炎やｈｙｐｅｒａｍｙｌａｓｅｍｉａの患
者では血清や尿中のアミラーゼ濃度が高く、正誤差が発
生することが示されている。

【００１１】・本発明は、このような技術の現状におい
て、カルシウムを正確且つ効率的に測定するシステムを
開発する目的でなされたものであり、更に詳細には、本
発明の目的は、血清等から持ち込まれたアミラーゼの影
響を受けることなく正確に生体試料等各試料中のカルシ
ウムを効率的に測定する新規システムを開発することで
ある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するためになされたものであって、血済や尿中の
アミラーゼの影響を受けることのないカルシウムの測定
方法及びそのための試薬を開発するために各方面から検
討した結果、カルシウムに対する反応性は保持したま
ま、血中や尿中のアミラーゼの影響は受けにくい新規シ
ステムを見出し、本発明を完成した，

【００１３】すなわち、本発明者らは、２−クロロ−４
一ニトロフェニールマルトースを用いることにより、ア
ミラーゼに対する感受性を大幅に低下させること（つま
り、アミラーゼに対する反応性はわずかに１／３３にす
ぎないこと）をはじめて見出し、この新知見を基礎とし
て本発明を完成するに至った。

【００１４】本発明は、還元性末端に発色性基が導入さ
れたマルトース誘導体を用いることを特徴とするカルシ
ウムのエンザイムアッセイを基本的技術思想とするもの
であって、血清等から持ち込まれたアミラーゼの影響を
受けることなくカルシウムを測定することができ、各種
試料、特にアミラーゼを持ち込んでくる試料、例えば尿
や血清試料中のカルシウムをも簡便且つ正確に測定でき
るシステムを提供するものである。

【００１５】本発明においては、還元性末端に発色性基
が導入されたマルトース誘導体を使用するが、発色性基
としては、マルトースと接合した状態では可視光領域で
の吸収は認められない。しかし一旦マルトースから遊離
して遊離の状態になると、可視光領域に吸収を示す発色
団がすべて包含される。このような発色団としては、具
体的には、２一クロロ−４一ニトロフェニール基、パラ
ニトロフェニ一ル基、６−ジクロロ−４−ニトロフェニ
ール基等が例示される。

【００１６】このような発色性基が導入されたマルトー
ス誘導体としては、例えば２一クロロ−４一ニトロフェ
ニールマルトース（以下、Ｇ２ＣＮＰということもあ
る）を挙げることができる。その構造式は、下記化２で
示される。

【００１７】

【化２】

【００１８】以下、実施例により本発明を更に具体的に
説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものでは
ない。

【００１９】

【実施例１】試料液、Ｒ−１液、Ｒ−２液をそれぞれ、
以下のように調製した。

【００２０】（試料液）：１００ｍＭ ＮａＣｌの共存
下、５ｍＭ、２．５ｍＭ、１．２５ｍＭ、０．６２５ｍ
Ｍ、０．３１２５ｍＭ、０．１５ｍＭ、０．００７５ｍ
Ｍ、０ｍＭの酢酸カルシウムをそれぞれ含む試料液を用
意した。

【００２１】（Ｒ−１液）：ブタ脾臓アミラーゼと０．
１％ＢＳＡ、０，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一４０５、０．
１％ＮａＮ₃を含む０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．
５）。市販のブタ膵臓アミラーゼの硫安溶液１ｍｌを遠
心分離にかけ（１０，０００ｒｐｍ×５分）、沈澱する
ブタ脾臓アミラーゼを集め、３ｍｌの１０ｍＭのＥＤＴ
Ａを含む０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解
し、４℃に３０分間放置した。その後、６０ｍｌのセフ
ァデックスＧ−２５カラムにて、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝
液（０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４０
５、０．１％ＮａＮ₃を含む、ｐＨ６．０）に交換し
て、カルシウムフリーのブタ脾臓アミラーゼ液を調製し
た。本溶液をＲ−１液とした。 （Ｒ−２液）：５ｍＭの２−クロロ−４−ニトロフェニ
一ルマルトース溶液。

【００２２】試料液１０μｌにＲ−１液を３００μｌ加
え、３７℃で５分間インキュべ一卜し、しかる後、１０
０μｌのＲ一２液を加え、よく混合した後３７℃に加温
し、Ｒ−２液添加後１分目から３分目までの４０５ｎｍ
での吸光度変化量を測定し、１分間当りの吸光度変化量
を算出した。測定は、日立社製７１５０自動分析機を用
いて行った。

【００２３】０ｍＭ酢酸カルシウムを含む試料液を用い
たときの吸光度変化量を他の試料液を用いたときの吸光
度変化量を差し引き、測定値を得た。結果を図１に示
す。

【００２４】その結果から明らかなように、本発明の方
法によれば、直線的な定量曲線にて試料中のカルシウム
を定量できることが確認された。

【００２５】

【実施例２】実際にヒト血清中のカルシウム量を、上記
実施例にて調整したＲ−１液、Ｒ−２液を用いて同様の
方法で測定した。結果を図１に示した。

【００２６】

【発明の効果】本発明の方法によれば、試料に由来する
アミラーゼの影響を受けることなく簡便で迅速なカルシ
ウムの正確な定量が可能となった。したがって、本発明
によれば、通常の試料はもちろんのこと、血清や尿素各
種の生体試料中のカルシウムを熟棟を要することなく迅
速且つ正確に測定することが可能となり、本発明は例え
ば臨床診断に多大の貢献をなすものである。

【００２７】また本発明は、Ｇ２ＣＮＰ、及び必要あれ
ばアミラーゼ、緩衝液、標準曲線作製用のカルシウム化
合物（溶液）を含有してなる、カルシウム測定試薬ない
し測定キットも提供するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明方法によるＧ２ＣＮＰを用いるカルシウ
ムの定量曲線を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】還元性末端に発色性基が導入されたマルト
   ース誘導体を用いてなることを特徴とするカルシウムの
   測定試薬。
2. 【請求項２】発色性基が２一クロロ−４一ニトロフェニ
   ール基又はパラニ卜ロフェニール基又は６−ジクロロ−
   ４−ニトロフェニール基であることを特徴とする請求項
   １に記載の測定試薬。
3. 【請求項３】２一クロロ−４−ニトロフェニ一ルマルト
   ースを用いてなることを特徴とするカルシウムの測定試
   薬
4. 【請求項４】請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載
   の試薬を使用することを特徴とするカルシウムの測定方
   法。