JPH0870895A - フィブリノゲン測定方法およびその測定試薬 - Google Patents
フィブリノゲン測定方法およびその測定試薬Info
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- JPH0870895A JPH0870895A JP6209940A JP20994094A JPH0870895A JP H0870895 A JPH0870895 A JP H0870895A JP 6209940 A JP6209940 A JP 6209940A JP 20994094 A JP20994094 A JP 20994094A JP H0870895 A JPH0870895 A JP H0870895A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 血漿検体を希釈することなくフィブリノゲン
測定を行う方法およびそのための試薬の提供。 【構成】 検体にトロンビンまたは同様な活性を有する
プロテアーゼを添加して検体中のフィブリノゲンをフィ
ブリンに変換し、凝固時間を測定することからなる検体
中のフィブリノゲン測定方法であって、未希釈の検体を
用い、高濃度の塩を含有する反応液中で、フィブリノゲ
ンの変換を行うことを特徴とする方法、およびそのため
の試薬。 【効果】 高濃度の塩の存在下で反応を行うことによ
り、検体を希釈することなく測定でき、従来の希釈法に
比べ操作が簡便となる。
測定を行う方法およびそのための試薬の提供。 【構成】 検体にトロンビンまたは同様な活性を有する
プロテアーゼを添加して検体中のフィブリノゲンをフィ
ブリンに変換し、凝固時間を測定することからなる検体
中のフィブリノゲン測定方法であって、未希釈の検体を
用い、高濃度の塩を含有する反応液中で、フィブリノゲ
ンの変換を行うことを特徴とする方法、およびそのため
の試薬。 【効果】 高濃度の塩の存在下で反応を行うことによ
り、検体を希釈することなく測定でき、従来の希釈法に
比べ操作が簡便となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は血漿検体を希釈すること
なくフィブリノゲン測定を行う方法および試薬に関す
る。
なくフィブリノゲン測定を行う方法および試薬に関す
る。
【０００２】
【従来技術】フィブリノゲンは分子量３４００００の糖
蛋白であり、血液凝固の最後の反応に係わる重要な血液
凝固因子である。フィブリノゲンはトロンビンの作用に
より限定分解を受けフィブリンとなり、凝集塊を形成
し、凝固反応を完結に導くゆえに、凝固反応にとって不
可欠である。血中フィブリノゲンの量の増減は各種疾患
と密接な関係を有する。各種の感染症、悪性腫瘍、脳卒
中、心筋梗塞、膠原病、糖尿病、妊娠中毒症、ネフロー
ゼ等においては、フィブリノゲン量は上昇し、これに対
し、先天性の減少症や肝障害、大量出血、播種性血管内
凝固症候群（ＤＩＣ）、線溶の亢進状態ではフィブリノ
ゲン量は減少する。このように種々の疾患や血液学的診
断のために、フィブリノゲン量の測定は重要な血液凝固
検査の一つである。
蛋白であり、血液凝固の最後の反応に係わる重要な血液
凝固因子である。フィブリノゲンはトロンビンの作用に
より限定分解を受けフィブリンとなり、凝集塊を形成
し、凝固反応を完結に導くゆえに、凝固反応にとって不
可欠である。血中フィブリノゲンの量の増減は各種疾患
と密接な関係を有する。各種の感染症、悪性腫瘍、脳卒
中、心筋梗塞、膠原病、糖尿病、妊娠中毒症、ネフロー
ゼ等においては、フィブリノゲン量は上昇し、これに対
し、先天性の減少症や肝障害、大量出血、播種性血管内
凝固症候群（ＤＩＣ）、線溶の亢進状態ではフィブリノ
ゲン量は減少する。このように種々の疾患や血液学的診
断のために、フィブリノゲン量の測定は重要な血液凝固
検査の一つである。
【０００３】フィブリノゲン測定のための多くの方法が
知られている。大別して、フィブリノゲンがトロンビン
によってフィブリンになる過程ないしは生成物を測定す
る凝血学的測定法、フィブリノゲンそのものを免疫学的
に測定する方法、塩析法を用いた比濁法（特開昭６０−
５３８４８号公報）等がある。
知られている。大別して、フィブリノゲンがトロンビン
によってフィブリンになる過程ないしは生成物を測定す
る凝血学的測定法、フィブリノゲンそのものを免疫学的
に測定する方法、塩析法を用いた比濁法（特開昭６０−
５３８４８号公報）等がある。
【０００４】免疫学的方法や比濁法では、異常フィブリ
ノゲンや、フィブリノゲンとフィブリンおよびその分解
産物を十分に識別することができず、又、非特異的反応
を排除することができないので、フィブリノゲン測定値
が不正確であったり、測定操作が煩雑で、長時間を要す
るという問題がある（例えば、特開昭６０−５３８４８
号公報の方法では、測定時間が３０分以上である）。
ノゲンや、フィブリノゲンとフィブリンおよびその分解
産物を十分に識別することができず、又、非特異的反応
を排除することができないので、フィブリノゲン測定値
が不正確であったり、測定操作が煩雑で、長時間を要す
るという問題がある（例えば、特開昭６０−５３８４８
号公報の方法では、測定時間が３０分以上である）。
【０００５】凝血学的測定法の一つとして、プロトロン
ビン時間、部分トロンボプラスチン時間、又は活性化部
分トロンボプラスチン時間を測定する過程で、光学的お
よび時間的な演算処理を行うことによりフィブリノゲン
の量を求める方法がある（特開昭６０−５８５５５号公
報、特開昭６３−３０５２５５号公報、特開平５−６０
７６４号公報）。これらの方法は光学的手段で測定を行
うが、単に光学密度や光分散性の変化を測定するのみな
らず、時間的尺度を加味し、補正を加えた演算処理を行
い、フィブリノゲン量を求めるというもので、演算装置
を含む光学的システムを必要とし経済的負担が大きい。
又、その測定値は正確性に欠ける。
ビン時間、部分トロンボプラスチン時間、又は活性化部
分トロンボプラスチン時間を測定する過程で、光学的お
よび時間的な演算処理を行うことによりフィブリノゲン
の量を求める方法がある（特開昭６０−５８５５５号公
報、特開昭６３−３０５２５５号公報、特開平５−６０
７６４号公報）。これらの方法は光学的手段で測定を行
うが、単に光学密度や光分散性の変化を測定するのみな
らず、時間的尺度を加味し、補正を加えた演算処理を行
い、フィブリノゲン量を求めるというもので、演算装置
を含む光学的システムを必要とし経済的負担が大きい。
又、その測定値は正確性に欠ける。
【０００６】凝血学的測定方法として最も一般的に日常
検査で用いられている方法はトロンビン時間法である。
この方法は希釈血漿に十分量のトロンビンを添加し、ト
ロンビンの作用によってフィブリノゲンをフィブリンに
変換し、フィブリン凝集が生成するまでの凝固時間を測
定することによって、フィブリノゲン量を求める方法で
ある。凝固時間は検体中のフィブリノゲンの濃度に依存
し、フィブリノゲン量が増加すると凝固時間は短縮す
る。トロンビン時間法では正常量（約２００〜４００ｍ
ｇ／ｄｌ）のフィブリノゲンを含む血漿では瞬時（４秒
以内）に凝固を生じるため、測定可能な濃度まで血漿を
希釈する必要がある。普通、１０倍に希釈する。血漿中
フィブリノゲン濃度が非常に高い場合や低い場合は再希
釈を行い測定する。
検査で用いられている方法はトロンビン時間法である。
この方法は希釈血漿に十分量のトロンビンを添加し、ト
ロンビンの作用によってフィブリノゲンをフィブリンに
変換し、フィブリン凝集が生成するまでの凝固時間を測
定することによって、フィブリノゲン量を求める方法で
ある。凝固時間は検体中のフィブリノゲンの濃度に依存
し、フィブリノゲン量が増加すると凝固時間は短縮す
る。トロンビン時間法では正常量（約２００〜４００ｍ
ｇ／ｄｌ）のフィブリノゲンを含む血漿では瞬時（４秒
以内）に凝固を生じるため、測定可能な濃度まで血漿を
希釈する必要がある。普通、１０倍に希釈する。血漿中
フィブリノゲン濃度が非常に高い場合や低い場合は再希
釈を行い測定する。
【０００７】この従来法における問題点は希釈操作を必
要とするため、操作が非常に煩雑となる点である。又、
希釈血漿では非常に微弱で小さな凝固物しか生じないた
め、未希釈血漿を用いるプロトロンビン時間等の凝固試
験に比べ測定精度が劣る。凝固物の測定には一般的に測
定機器が利用されるが、希釈血漿を用いるフィブリノゲ
ン測定は微弱な凝固物しか生じないため、機器的測定は
本質的に余り適していない。
要とするため、操作が非常に煩雑となる点である。又、
希釈血漿では非常に微弱で小さな凝固物しか生じないた
め、未希釈血漿を用いるプロトロンビン時間等の凝固試
験に比べ測定精度が劣る。凝固物の測定には一般的に測
定機器が利用されるが、希釈血漿を用いるフィブリノゲ
ン測定は微弱な凝固物しか生じないため、機器的測定は
本質的に余り適していない。
【０００８】このような問題を解決する目的で光学的測
定法が提案されている（特開昭５４−２３５９６号公
報、特表平５−５０３００８号公報、特開昭６０−６６
９９６号公報）。しかしながら、これらの方法は一般性
に欠け、利用が極端に制限される。さらに、特表平５−
５０３００８号公報の方法は希釈血漿を用いるため操作
が煩雑である、特開昭５４−２３５９６号公報の方法は
吸光度測定の対照に検体血漿を必要とする、特開昭６０
−６６９９６号公報の方法はフィブリノゲンとフィブリ
ノゲン分解生成物を同時に測定するので、フィブリノゲ
ン量の測定としては煩雑である等の問題を含んでいる。
定法が提案されている（特開昭５４−２３５９６号公
報、特表平５−５０３００８号公報、特開昭６０−６６
９９６号公報）。しかしながら、これらの方法は一般性
に欠け、利用が極端に制限される。さらに、特表平５−
５０３００８号公報の方法は希釈血漿を用いるため操作
が煩雑である、特開昭５４−２３５９６号公報の方法は
吸光度測定の対照に検体血漿を必要とする、特開昭６０
−６６９９６号公報の方法はフィブリノゲンとフィブリ
ノゲン分解生成物を同時に測定するので、フィブリノゲ
ン量の測定としては煩雑である等の問題を含んでいる。
【０００９】これら従来法の問題を解決する目的で、未
希釈血漿を用いて凝固時間を測定するフィブリノゲン測
定方法が提案されている（特開平５−２１９９９３号公
報、特開平６−４６８９８号公報）。
希釈血漿を用いて凝固時間を測定するフィブリノゲン測
定方法が提案されている（特開平５−２１９９９３号公
報、特開平６−４６８９８号公報）。
【００１０】特開平５−２１９９９３号公報では、フィ
ブリン凝集抑制剤である特殊なペプチドを用いることに
より、フィブリン凝集を部分的に抑制し、凝固時間を遅
延させる。それによって、高濃度のフィブリノゲンを含
む検体、すなわち未希釈血漿で測定できる。用いるフィ
ブリン凝集抑制剤は公知であり、GLY-PRO-ARG-PRO がシ
グマ社（ＳＩＧＭＡ、米国）のカタログに記載されてい
る。このようなペプチドは非常に高価であり（GLY-PRO-
ARG-PRO １ｍｇで１１．２５ＵＳドル）、その使用濃度
を考慮すると経済的負担が非常に大きい。又、この方法
では凝固時間が一般的に長く、凝固時間とフィブリノゲ
ン濃度は両対数グラフ上で直線関係にない（トロンビン
時間法では通常、直線関係が認められる）。さらにフィ
ブリノゲンの低値の測定限界は０．６ｇ／Ｌであると判
断される。未希釈血漿を用いる場合、低値の測定限界が
より低いほうが好ましい。
ブリン凝集抑制剤である特殊なペプチドを用いることに
より、フィブリン凝集を部分的に抑制し、凝固時間を遅
延させる。それによって、高濃度のフィブリノゲンを含
む検体、すなわち未希釈血漿で測定できる。用いるフィ
ブリン凝集抑制剤は公知であり、GLY-PRO-ARG-PRO がシ
グマ社（ＳＩＧＭＡ、米国）のカタログに記載されてい
る。このようなペプチドは非常に高価であり（GLY-PRO-
ARG-PRO １ｍｇで１１．２５ＵＳドル）、その使用濃度
を考慮すると経済的負担が非常に大きい。又、この方法
では凝固時間が一般的に長く、凝固時間とフィブリノゲ
ン濃度は両対数グラフ上で直線関係にない（トロンビン
時間法では通常、直線関係が認められる）。さらにフィ
ブリノゲンの低値の測定限界は０．６ｇ／Ｌであると判
断される。未希釈血漿を用いる場合、低値の測定限界が
より低いほうが好ましい。
【００１１】特開平６−４６８９８号公報の方法はｐＨ
４〜７．３の酸性ｐＨ域で測定することを特徴とする。
同公報には、バッファー塩のモル濃度が０．０２〜０．
５Ｍの緩衝液に塩（例えば塩化ナトリウム）を加えてイ
オン強度を増大した緩衝液内で反応を行うことが開示さ
れている。この方法は、ヘパリンやアンチトロンビンII
I （ＡＴIII ）のトロンビン阻害物質の影響を受けない
ことを一つの特徴にしている。実施例でヘパリンの影響
の比較をｐＨ６とｐＨ８で行っているが、この方法の問
題はトロンビンの至適ｐＨ（８．０付近）から著しく離
れたｐＨを好ましいｐＨとして採用し（酸性域のｐＨ６
を最も好ましいｐＨとする）、トロンビン１０ＮＩＨＵ
／ｍｌという、通常、フィブリノゲン測定に用いられる
より少ないトロンビン量を用いる点である。少量のトロ
ンビンを使用し、至適ｐＨから著しく離れたｐＨで測定
しているため、実質的なトロンビン活性が非常に低く、
過剰量のトロンビンを用いるというトロンビン時間法の
基本より外れ、測定精度の面で問題がある。実際に両対
数グラフ上でフィブリノゲン量に対し凝固時間をプロッ
トすると直線関係が得られず、又、フィブリノゲンの低
値での測定が十分に行えないと判断される。
４〜７．３の酸性ｐＨ域で測定することを特徴とする。
同公報には、バッファー塩のモル濃度が０．０２〜０．
５Ｍの緩衝液に塩（例えば塩化ナトリウム）を加えてイ
オン強度を増大した緩衝液内で反応を行うことが開示さ
れている。この方法は、ヘパリンやアンチトロンビンII
I （ＡＴIII ）のトロンビン阻害物質の影響を受けない
ことを一つの特徴にしている。実施例でヘパリンの影響
の比較をｐＨ６とｐＨ８で行っているが、この方法の問
題はトロンビンの至適ｐＨ（８．０付近）から著しく離
れたｐＨを好ましいｐＨとして採用し（酸性域のｐＨ６
を最も好ましいｐＨとする）、トロンビン１０ＮＩＨＵ
／ｍｌという、通常、フィブリノゲン測定に用いられる
より少ないトロンビン量を用いる点である。少量のトロ
ンビンを使用し、至適ｐＨから著しく離れたｐＨで測定
しているため、実質的なトロンビン活性が非常に低く、
過剰量のトロンビンを用いるというトロンビン時間法の
基本より外れ、測定精度の面で問題がある。実際に両対
数グラフ上でフィブリノゲン量に対し凝固時間をプロッ
トすると直線関係が得られず、又、フィブリノゲンの低
値での測定が十分に行えないと判断される。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、血漿検体を
希釈することなく、一般的な凝固検査室で用いられる凝
固時間測定機器を用いて、簡便で経済的負担の少ない、
フィブリノゲン測定を精度良くできる方法および試薬を
提供することを目的とする。
希釈することなく、一般的な凝固検査室で用いられる凝
固時間測定機器を用いて、簡便で経済的負担の少ない、
フィブリノゲン測定を精度良くできる方法および試薬を
提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、トロンビ
ン時間法に従う方法において、高濃度の塩の存在下で反
応を行うことにより、検体を希釈することなく、好まし
い長さの凝固時間が得られ、上記課題が達成できること
を見出し本発明を完成するに至った。
ン時間法に従う方法において、高濃度の塩の存在下で反
応を行うことにより、検体を希釈することなく、好まし
い長さの凝固時間が得られ、上記課題が達成できること
を見出し本発明を完成するに至った。
【００１４】本発明は、検体にトロンビンまたは同様な
活性を有するプロテアーゼを添加して検体中のフィブリ
ノゲンをフィブリンに変換し、凝固時間を測定すること
からなる検体中のフィブリノゲン測定方法であって、未
希釈の検体を用い、高濃度の塩を含有する反応液中で、
該フィブリノゲンの変換を行うことを特徴とするフィブ
リノゲン測定方法に関する。また本発明は、高濃度の
塩、および２０〜５００ＮＩＨＵ／ｍｌのトロンビンま
たは同様な活性を有するプロテアーゼを含むフィブリノ
ゲン測定試薬に関する。
活性を有するプロテアーゼを添加して検体中のフィブリ
ノゲンをフィブリンに変換し、凝固時間を測定すること
からなる検体中のフィブリノゲン測定方法であって、未
希釈の検体を用い、高濃度の塩を含有する反応液中で、
該フィブリノゲンの変換を行うことを特徴とするフィブ
リノゲン測定方法に関する。また本発明は、高濃度の
塩、および２０〜５００ＮＩＨＵ／ｍｌのトロンビンま
たは同様な活性を有するプロテアーゼを含むフィブリノ
ゲン測定試薬に関する。
【００１５】本発明の方法によれば、通常のトロンビン
量の使用で、高価なペプチドを用いることなく、塩濃度
を高めるという極めて経済的負担の少ない方法で、未希
釈血漿を検体に用い、凝固時間の過剰な延長もなく、フ
ィブリノゲン濃度の低い検体であっても測定することが
できる。又、従来法の希釈血漿を用いるトロンビン時間
法の市販の測定試薬キットによる測定値と良好な相関関
係が得られる。
量の使用で、高価なペプチドを用いることなく、塩濃度
を高めるという極めて経済的負担の少ない方法で、未希
釈血漿を検体に用い、凝固時間の過剰な延長もなく、フ
ィブリノゲン濃度の低い検体であっても測定することが
できる。又、従来法の希釈血漿を用いるトロンビン時間
法の市販の測定試薬キットによる測定値と良好な相関関
係が得られる。
【００１６】本発明において、高濃度の塩とは一般に血
液凝固検査で汎用される生理的濃度より高濃度の塩を意
味する。詳細には、フィブリノゲン２７５ｍｇ／ｄｌを
含む検体、およびトロンビン１００ＮＩＨＵ／ｍｌ、Ｈ
ＥＰＥＳ １００ｍＭ ｐＨ７．３５を含む試薬を１：
２の容量比で混合し、３７℃にて凝固時間を測定すると
き、５〜１００秒、好ましくは７〜５０秒、さらに好ま
しくは１０〜３０秒の凝固時間を生じさせる塩濃度に調
整する。
液凝固検査で汎用される生理的濃度より高濃度の塩を意
味する。詳細には、フィブリノゲン２７５ｍｇ／ｄｌを
含む検体、およびトロンビン１００ＮＩＨＵ／ｍｌ、Ｈ
ＥＰＥＳ １００ｍＭ ｐＨ７．３５を含む試薬を１：
２の容量比で混合し、３７℃にて凝固時間を測定すると
き、５〜１００秒、好ましくは７〜５０秒、さらに好ま
しくは１０〜３０秒の凝固時間を生じさせる塩濃度に調
整する。
【００１７】本発明の方法では、トロンビンまたは同様
な活性を有するプロテアーゼの作用により検体中のフィ
ブリノゲンがフィブリンに変換される。凝固時間はフィ
ブリノゲン量に依存し、測定条件が同じ時、フィブリノ
ゲン濃度に応じた凝固時間が得られ、それを標準物の凝
固時間と比較することによりフィブリノゲン量が求ま
る。
な活性を有するプロテアーゼの作用により検体中のフィ
ブリノゲンがフィブリンに変換される。凝固時間はフィ
ブリノゲン量に依存し、測定条件が同じ時、フィブリノ
ゲン濃度に応じた凝固時間が得られ、それを標準物の凝
固時間と比較することによりフィブリノゲン量が求ま
る。
【００１８】本発明の方法において、測定は生理的ｐＨ
（ｐＨ７．３）付近およびトロンビンの至適ｐＨを含む
範囲内のｐＨ域で行う。好ましくはｐＨ６．０〜９．
０、より好ましくはｐＨ７．０〜８．０で行う。
（ｐＨ７．３）付近およびトロンビンの至適ｐＨを含む
範囲内のｐＨ域で行う。好ましくはｐＨ６．０〜９．
０、より好ましくはｐＨ７．０〜８．０で行う。
【００１９】本発明で用いるトロンビンの由来は特に限
定されず、ヒト、ウシ、ウマ、ヤギ等の由来のトロンビ
ンを使用することができ、これらは商業的に入手可能で
ある。「同様な活性を有するプロテアーゼ」における
「同様な活性」とは、フィブリノゲンに作用してフィブ
リンを生成するプロテアーゼ活性を意味する。このよう
なプロテアーゼの由来は特に限定されず、バトロキソビ
ン〔ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ、蛇（学名Ａｇｋｉｓｔｒｏ
ｄｏｎ ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ）の毒液由来のプロテア
ーゼ〕などが使用できる。
定されず、ヒト、ウシ、ウマ、ヤギ等の由来のトロンビ
ンを使用することができ、これらは商業的に入手可能で
ある。「同様な活性を有するプロテアーゼ」における
「同様な活性」とは、フィブリノゲンに作用してフィブ
リンを生成するプロテアーゼ活性を意味する。このよう
なプロテアーゼの由来は特に限定されず、バトロキソビ
ン〔ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ、蛇（学名Ａｇｋｉｓｔｒｏ
ｄｏｎ ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ）の毒液由来のプロテア
ーゼ〕などが使用できる。
【００２０】本発明においてトロンビンが用いられる場
合、血漿１ｍｌにつき少なくとも２０ＮＩＨＵの過剰量
が添加される。同様な活性を有するプロテアーゼを用い
る場合は、トロンビンに換算して同等の活性を有する量
が添加される。反応液中のトロンビンまたは同様な活性
を有するプロテアーゼの濃度は、一般に１０〜２００Ｎ
ＩＨＵ／ｍｌ、好ましくは２０〜１００ＮＩＨＵ／ｍｌ
である。
合、血漿１ｍｌにつき少なくとも２０ＮＩＨＵの過剰量
が添加される。同様な活性を有するプロテアーゼを用い
る場合は、トロンビンに換算して同等の活性を有する量
が添加される。反応液中のトロンビンまたは同様な活性
を有するプロテアーゼの濃度は、一般に１０〜２００Ｎ
ＩＨＵ／ｍｌ、好ましくは２０〜１００ＮＩＨＵ／ｍｌ
である。
【００２１】本発明の方法では、検体、およびトロンビ
ンまたは同様な活性を有するプロテアーゼを含む試薬を
１：１〜１：８の容量比で、好ましくは１：２〜１：３
の容量比で混合する。
ンまたは同様な活性を有するプロテアーゼを含む試薬を
１：１〜１：８の容量比で、好ましくは１：２〜１：３
の容量比で混合する。
【００２２】測定には塩として、通常、アルカリ金属ま
たはアルカリ土金属のハロゲン化物を用いる。このよう
な塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム
塩、マグネシウム塩が例示される。好ましくは、塩化ナ
トリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、塩化カ
リウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、塩化カルシウ
ム、塩化マグネシウムなどが使用される。これらの好ま
しい塩を用いる場合、反応液中の塩濃度は、塩化ナトリ
ウムは０．２５〜３Ｍ、好ましくは０．５〜２．５Ｍ、
更に好ましくは１〜２Ｍ、臭化ナトリウムは０．１〜
１．０Ｍ、ヨウ化ナトリウムは０．１〜０．４Ｍ、塩化
カリウムは０．２５〜１．５Ｍ、臭化カリウムは０．１
〜１Ｍ、ヨウ化カリウムは０．１〜０．４Ｍ、塩化マグ
ネシウムは０．０４〜０．２５Ｍ、塩化カルシウムは
０．０４〜０．２５Ｍである。
たはアルカリ土金属のハロゲン化物を用いる。このよう
な塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム
塩、マグネシウム塩が例示される。好ましくは、塩化ナ
トリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、塩化カ
リウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、塩化カルシウ
ム、塩化マグネシウムなどが使用される。これらの好ま
しい塩を用いる場合、反応液中の塩濃度は、塩化ナトリ
ウムは０．２５〜３Ｍ、好ましくは０．５〜２．５Ｍ、
更に好ましくは１〜２Ｍ、臭化ナトリウムは０．１〜
１．０Ｍ、ヨウ化ナトリウムは０．１〜０．４Ｍ、塩化
カリウムは０．２５〜１．５Ｍ、臭化カリウムは０．１
〜１Ｍ、ヨウ化カリウムは０．１〜０．４Ｍ、塩化マグ
ネシウムは０．０４〜０．２５Ｍ、塩化カルシウムは
０．０４〜０．２５Ｍである。
【００２３】上記塩は一種または二種以上を組合わせて
使用してもよい。二種以上の塩を用いる場合、その組合
せは特に制限されないが、塩化ナトリウムと他の塩との
組合せで用いることが好ましく、更に好ましくは塩化ナ
トリウムと臭化ナトリウムの組合せである。
使用してもよい。二種以上の塩を用いる場合、その組合
せは特に制限されないが、塩化ナトリウムと他の塩との
組合せで用いることが好ましく、更に好ましくは塩化ナ
トリウムと臭化ナトリウムの組合せである。
【００２４】二種以上の塩を用いる場合は、フィブリノ
ゲン２７５ｍｇ／ｄｌを含む検体、およびトロンビン１
００ＮＩＨＵ／ｍｌ、ＨＥＰＥＳ １００ｍＭ ｐＨ
７．３５を含む試薬を１：２の容量比で混合し、３７℃
にて凝固時間を測定するとき、５〜１００秒、好ましく
は７〜５０秒、さらに好ましくは１０〜３０秒の凝固時
間を生じさせる塩濃度に調整する。例えば、塩化ナトリ
ウム１．０〜２．５Ｍおよび臭化ナトリウム０．１〜
０．８Ｍの塩濃度に調整する。
ゲン２７５ｍｇ／ｄｌを含む検体、およびトロンビン１
００ＮＩＨＵ／ｍｌ、ＨＥＰＥＳ １００ｍＭ ｐＨ
７．３５を含む試薬を１：２の容量比で混合し、３７℃
にて凝固時間を測定するとき、５〜１００秒、好ましく
は７〜５０秒、さらに好ましくは１０〜３０秒の凝固時
間を生じさせる塩濃度に調整する。例えば、塩化ナトリ
ウム１．０〜２．５Ｍおよび臭化ナトリウム０．１〜
０．８Ｍの塩濃度に調整する。
【００２５】実際には用いる塩の種類と濃度を適宜選択
することにより、好ましい凝固時間に調節することがで
きる。一般に塩濃度の増加とともに凝固時間が延長す
る。しかし、例えば、塩化ナトリウムまたは塩化カリウ
ムを使用する場合、一定濃度以上になると凝固時間が短
縮する（図１参照）。
することにより、好ましい凝固時間に調節することがで
きる。一般に塩濃度の増加とともに凝固時間が延長す
る。しかし、例えば、塩化ナトリウムまたは塩化カリウ
ムを使用する場合、一定濃度以上になると凝固時間が短
縮する（図１参照）。
【００２６】凝固時間測定機器を用いる場合、一般に、
フィブリノゲン２７５ｍｇ／ｄｌの正常血漿を検体とす
るとき、凝固時間が１０〜３０秒となる塩濃度が好まし
い。凝固時間は試薬中のその他の物質、例えば、ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリエチレングリコール、界
面活性剤等で変化し得るが、塩の種類や濃度を適宜選択
することにより、又、二種類以上の塩の組合せにより調
節することができる。試薬中のトロンビンの量によって
も凝固時間は変化するが、トロンビン量を減少させるこ
とによって凝固時間を延長させることは好ましくない。
又、特開平６−４６８９８号公報に記載の方法のよう
に、トロンビンの至適ｐＨ域より著しく異なるｐＨにお
いて、且つ少量のトロンビンを用いて測定を行うこと
は、実質的にトロンビン活性を著しく低下させた状態で
測定することになるため好ましくない。
フィブリノゲン２７５ｍｇ／ｄｌの正常血漿を検体とす
るとき、凝固時間が１０〜３０秒となる塩濃度が好まし
い。凝固時間は試薬中のその他の物質、例えば、ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリエチレングリコール、界
面活性剤等で変化し得るが、塩の種類や濃度を適宜選択
することにより、又、二種類以上の塩の組合せにより調
節することができる。試薬中のトロンビンの量によって
も凝固時間は変化するが、トロンビン量を減少させるこ
とによって凝固時間を延長させることは好ましくない。
又、特開平６−４６８９８号公報に記載の方法のよう
に、トロンビンの至適ｐＨ域より著しく異なるｐＨにお
いて、且つ少量のトロンビンを用いて測定を行うこと
は、実質的にトロンビン活性を著しく低下させた状態で
測定することになるため好ましくない。
【００２７】従来の希釈血漿を用いるトロンビン時間法
と良好な相関関係を得るためには、各々の塩の好ましい
濃度が存在する。標準物として凍結乾燥した市販管理血
漿を用いて、本発明の方法によりヒト血漿検体を測定す
ると、測定値が従来のトロンビン時間法で測定した値と
乖離することがある（後記の実施例２参照）。この乖離
を生じない塩の種類と濃度を選択することが更に好まし
い。
と良好な相関関係を得るためには、各々の塩の好ましい
濃度が存在する。標準物として凍結乾燥した市販管理血
漿を用いて、本発明の方法によりヒト血漿検体を測定す
ると、測定値が従来のトロンビン時間法で測定した値と
乖離することがある（後記の実施例２参照）。この乖離
を生じない塩の種類と濃度を選択することが更に好まし
い。
【００２８】反応液中の塩化ナトリウム濃度を１．２〜
２．０Ｍ（例えば、試薬中に２．０〜３．０Ｍ）とする
ことにより、乖離を防止することができる。ただし上記
濃度では、凝固時間が短縮されるので、臭化ナトリウム
を添加することにより凝固時間の延長を図り、好ましい
凝固時間に調整することができる。同様の効果は、ヨウ
化ナトリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、塩化カ
ルシウム、塩化マグネシウム等の塩を添加することによ
っても得られる。好ましくは臭化ナトリウムを反応液中
に０．２〜０．７Ｍ（例えば、試薬中に０．３〜１．０
Ｍ）となるように添加する。
２．０Ｍ（例えば、試薬中に２．０〜３．０Ｍ）とする
ことにより、乖離を防止することができる。ただし上記
濃度では、凝固時間が短縮されるので、臭化ナトリウム
を添加することにより凝固時間の延長を図り、好ましい
凝固時間に調整することができる。同様の効果は、ヨウ
化ナトリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、塩化カ
ルシウム、塩化マグネシウム等の塩を添加することによ
っても得られる。好ましくは臭化ナトリウムを反応液中
に０．２〜０．７Ｍ（例えば、試薬中に０．３〜１．０
Ｍ）となるように添加する。
【００２９】あるいは、塩化ナトリウムのみでは乖離が
生じる場合、例えば、反応液中の塩化ナトリウム濃度が
０．２５〜１．０Ｍ程度（試薬中に０．５〜２．０Ｍ程
度）のとき、乖離防止剤を添加することによって乖離を
解消することができる。乖離防止剤としては、フッ化カ
リウム、フッ化ナトリウム、クエン酸ナトリウム等の塩
または塩酸アルキルジアミノエチルグリシン等の界面活
性剤等が使用できる。乖離防止剤の、反応液中の濃度
は、例えばフッ化カリウムまたはフッ化ナトリウムは
０．０５〜０．２Ｍ、クエン酸ナトリウムは２〜５０ｍ
Ｍ、界面活性剤は０．００１〜０．５ｗ／ｖ％である。
生じる場合、例えば、反応液中の塩化ナトリウム濃度が
０．２５〜１．０Ｍ程度（試薬中に０．５〜２．０Ｍ程
度）のとき、乖離防止剤を添加することによって乖離を
解消することができる。乖離防止剤としては、フッ化カ
リウム、フッ化ナトリウム、クエン酸ナトリウム等の塩
または塩酸アルキルジアミノエチルグリシン等の界面活
性剤等が使用できる。乖離防止剤の、反応液中の濃度
は、例えばフッ化カリウムまたはフッ化ナトリウムは
０．０５〜０．２Ｍ、クエン酸ナトリウムは２〜５０ｍ
Ｍ、界面活性剤は０．００１〜０．５ｗ／ｖ％である。
【００３０】特開平５−２１９９９３号公報では、５０
〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム、および２〜２５ｍＭの
塩化カルシウムを試薬中に含有するが、この両方の塩の
濃度は反応液中では更に低い濃度となり、本発明の範囲
に含まれない。特開平６−４６８９８号公報には、塩化
ナトリウムのような塩を加えることが記載されている
が、その濃度は明確でない。同公報には、「塩化ナトリ
ウムのような塩を添加することでイオン強度を増加して
も良い。特に低イオン強度では、トロンビンはＡＴIII
阻害に対して、鈍感であることが分かった。」（同公
報、第３頁、第４欄２７〜３０行）と記載され、本発明
で規定する高濃度の塩を用いることは示唆されない。塩
化ナトリウムの濃度も本発明の規定する範囲内（試薬中
で０．５〜４Ｍ）ではない。
〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム、および２〜２５ｍＭの
塩化カルシウムを試薬中に含有するが、この両方の塩の
濃度は反応液中では更に低い濃度となり、本発明の範囲
に含まれない。特開平６−４６８９８号公報には、塩化
ナトリウムのような塩を加えることが記載されている
が、その濃度は明確でない。同公報には、「塩化ナトリ
ウムのような塩を添加することでイオン強度を増加して
も良い。特に低イオン強度では、トロンビンはＡＴIII
阻害に対して、鈍感であることが分かった。」（同公
報、第３頁、第４欄２７〜３０行）と記載され、本発明
で規定する高濃度の塩を用いることは示唆されない。塩
化ナトリウムの濃度も本発明の規定する範囲内（試薬中
で０．５〜４Ｍ）ではない。
【００３１】さらに、本発明の二次的効果として、塩と
して、例えば、塩化ナトリウムが反応液中で０．６Ｍ以
上の場合、ヘパリンの影響を殆ど回避できるため、ヘパ
リン阻害剤（例えばポリブレン等）を用いる必要がなく
なる。さらに高塩濃度ではアジ化ナトリウムのような防
腐剤も特に必要としなくなるという利点もある。
して、例えば、塩化ナトリウムが反応液中で０．６Ｍ以
上の場合、ヘパリンの影響を殆ど回避できるため、ヘパ
リン阻害剤（例えばポリブレン等）を用いる必要がなく
なる。さらに高塩濃度ではアジ化ナトリウムのような防
腐剤も特に必要としなくなるという利点もある。
【００３２】本発明のフィブリノゲン測定試薬は、高濃
度の塩、および２０〜５００ＮＩＨＵ／ｍｌのトロンビ
ンまたは同様な活性を有するプロテアーゼを含む。本発
明のフィブリノゲン測定試薬は、一種類または二種類の
試薬から構成される形態で用いられるが、一種類の試薬
とするのが好ましい。乖離防止剤を使用する場合は、乖
離防止剤を含む第一試薬、およびトロンビンまたは同様
な活性を有するプロテアーゼを含む第二試薬の二種類の
試薬から構成される形態が好ましい。二種類の試薬とす
る場合は、トロンビン等のプロテアーゼは第二試薬に含
まれ、塩は第一、第二試薬のいずれか一方、もしくは両
方の試薬に含まれる。一種類の試薬の場合、２０〜５０
０ＮＩＨＵ／ｍｌ、好ましくは４０〜２００ＮＩＨＵ／
ｍｌのトロンビン、１０〜４００ｍＭ、好ましくは３０
〜２００ｍＭの緩衝液（剤）ｐＨ６．０〜９．０、好ま
しくはｐＨ７．０〜８．０、および高濃度の塩を含む。
度の塩、および２０〜５００ＮＩＨＵ／ｍｌのトロンビ
ンまたは同様な活性を有するプロテアーゼを含む。本発
明のフィブリノゲン測定試薬は、一種類または二種類の
試薬から構成される形態で用いられるが、一種類の試薬
とするのが好ましい。乖離防止剤を使用する場合は、乖
離防止剤を含む第一試薬、およびトロンビンまたは同様
な活性を有するプロテアーゼを含む第二試薬の二種類の
試薬から構成される形態が好ましい。二種類の試薬とす
る場合は、トロンビン等のプロテアーゼは第二試薬に含
まれ、塩は第一、第二試薬のいずれか一方、もしくは両
方の試薬に含まれる。一種類の試薬の場合、２０〜５０
０ＮＩＨＵ／ｍｌ、好ましくは４０〜２００ＮＩＨＵ／
ｍｌのトロンビン、１０〜４００ｍＭ、好ましくは３０
〜２００ｍＭの緩衝液（剤）ｐＨ６．０〜９．０、好ま
しくはｐＨ７．０〜８．０、および高濃度の塩を含む。
【００３３】詳細には、試薬中の塩の濃度は、フィブリ
ノゲン２７５ｍｇ／ｄｌを含む検体、およびトロンビン
１００ＮＩＨＵ／ｍｌ、ＨＥＰＥＳ １００ｍＭ ｐＨ
７．３５を含む試薬を１：２の容量比で混合し、３７℃
にて凝固時間を測定するとき、５〜１００秒、好ましく
は７〜５０秒、さらに好ましくは１０〜３０秒の凝固時
間を生じさせる濃度に調整する。
ノゲン２７５ｍｇ／ｄｌを含む検体、およびトロンビン
１００ＮＩＨＵ／ｍｌ、ＨＥＰＥＳ １００ｍＭ ｐＨ
７．３５を含む試薬を１：２の容量比で混合し、３７℃
にて凝固時間を測定するとき、５〜１００秒、好ましく
は７〜５０秒、さらに好ましくは１０〜３０秒の凝固時
間を生じさせる濃度に調整する。
【００３４】具体的には、試薬中での塩濃度は、塩化ナ
トリウムは０．５〜４Ｍ、好ましくは１．０〜３．５
Ｍ、更に好ましくは１．５〜３Ｍ、臭化ナトリウムは
０．１５〜１．５Ｍ、ヨウ化ナトリウムは０．１５〜
０．６Ｍ、塩化カリウムは０．３〜２Ｍ、臭化カリウム
は０．１５〜１．５Ｍ、ヨウ化カリウムは０．１５〜
０．６Ｍ、塩化マグネシウムは０．０５〜０．３５Ｍ、
塩化カルシウムは０．０５〜０．３５Ｍである。これら
の塩単独では凝固時間が１００秒を越える濃度も含まれ
るが、例えば塩化ナトリウムとの組合せによる使用で１
００秒以内の凝固時間を得ることができる。
トリウムは０．５〜４Ｍ、好ましくは１．０〜３．５
Ｍ、更に好ましくは１．５〜３Ｍ、臭化ナトリウムは
０．１５〜１．５Ｍ、ヨウ化ナトリウムは０．１５〜
０．６Ｍ、塩化カリウムは０．３〜２Ｍ、臭化カリウム
は０．１５〜１．５Ｍ、ヨウ化カリウムは０．１５〜
０．６Ｍ、塩化マグネシウムは０．０５〜０．３５Ｍ、
塩化カルシウムは０．０５〜０．３５Ｍである。これら
の塩単独では凝固時間が１００秒を越える濃度も含まれ
るが、例えば塩化ナトリウムとの組合せによる使用で１
００秒以内の凝固時間を得ることができる。
【００３５】上記塩は一種または二種以上を組合わせて
使用してもよい。フィブリノゲン測定時に好ましい凝固
時間を得るために、又、標準品と検体の乖離をなくする
目的で、二種類以上の塩を組み合わせて用いるのが好ま
しい。二種以上の塩を用いる場合、その組合せは特に制
限されないが、塩化ナトリウムと他の塩との組合せで用
いることが好ましく、さらに好ましくは塩化ナトリウム
と臭化ナトリウムの組合せである。
使用してもよい。フィブリノゲン測定時に好ましい凝固
時間を得るために、又、標準品と検体の乖離をなくする
目的で、二種類以上の塩を組み合わせて用いるのが好ま
しい。二種以上の塩を用いる場合、その組合せは特に制
限されないが、塩化ナトリウムと他の塩との組合せで用
いることが好ましく、さらに好ましくは塩化ナトリウム
と臭化ナトリウムの組合せである。
【００３６】二種以上の塩を用いる場合は、試薬中の塩
の濃度を、フィブリノゲン２７５ｍｇ／ｄｌを含む検
体、およびトロンビン１００ＮＩＨＵ／ｍｌ、ＨＥＰＥ
Ｓ １００ｍＭ ｐＨ７．３５を含む試薬を１：２の容
量比で混合し、３７℃にて凝固時間を測定するとき、５
〜１００秒、好ましくは７〜５０秒、さらに好ましくは
１０〜３０秒の凝固時間を生じさせる濃度に調整する。
の濃度を、フィブリノゲン２７５ｍｇ／ｄｌを含む検
体、およびトロンビン１００ＮＩＨＵ／ｍｌ、ＨＥＰＥ
Ｓ １００ｍＭ ｐＨ７．３５を含む試薬を１：２の容
量比で混合し、３７℃にて凝固時間を測定するとき、５
〜１００秒、好ましくは７〜５０秒、さらに好ましくは
１０〜３０秒の凝固時間を生じさせる濃度に調整する。
【００３７】ｐＨ調節のための緩衝剤としては、ｐＨ
６．０〜９．０、好ましくはｐＨ７．０〜８．０に緩衝
能を有するものであれば、特に制限なく使用することが
できる。このような緩衝剤としては、トリス、リン酸、
バルビタール、イミダゾール、ベロナール、グリシルグ
リシン、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡ
ＰＳＯ、ＴＡＰＥＳ等が挙げられる。これらの緩衝剤は
商業的に入手可能である。
６．０〜９．０、好ましくはｐＨ７．０〜８．０に緩衝
能を有するものであれば、特に制限なく使用することが
できる。このような緩衝剤としては、トリス、リン酸、
バルビタール、イミダゾール、ベロナール、グリシルグ
リシン、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡ
ＰＳＯ、ＴＡＰＥＳ等が挙げられる。これらの緩衝剤は
商業的に入手可能である。
【００３８】なお、本発明においては、試薬の性能や品
質の維持、製造その他を目的として、各種の物質を適時
添加することができる。その例としては、ＢＳＡ等のタ
ンパク質、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチ
レングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−N,
N,N'N'−四酢酸（ＥＧＴＡ）等のキレート剤、イプシロ
ンアミノカプロン酸、トラネキサム酸、アプロチニン等
の抗線溶剤、ポリブレン等のヘパリン阻害剤、アジ化ナ
トリウム、硫酸ゲンタマイシン等の防腐剤、ポリオキシ
エチレングリコールｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル
類〔例えば、トリトンＸ−１００（商品名）〕、ポリオ
キシエチレングリコールソルビタンアルキルエーテル類
〔例えば、ツイーン−２０（商品名）〕等の界面活性剤
の他に、糖類（例えばラクトース）、アミノ酸類、ポリ
エチレングリコール、グリセロール等の物質が挙げられ
る。
質の維持、製造その他を目的として、各種の物質を適時
添加することができる。その例としては、ＢＳＡ等のタ
ンパク質、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチ
レングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−N,
N,N'N'−四酢酸（ＥＧＴＡ）等のキレート剤、イプシロ
ンアミノカプロン酸、トラネキサム酸、アプロチニン等
の抗線溶剤、ポリブレン等のヘパリン阻害剤、アジ化ナ
トリウム、硫酸ゲンタマイシン等の防腐剤、ポリオキシ
エチレングリコールｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル
類〔例えば、トリトンＸ−１００（商品名）〕、ポリオ
キシエチレングリコールソルビタンアルキルエーテル類
〔例えば、ツイーン−２０（商品名）〕等の界面活性剤
の他に、糖類（例えばラクトース）、アミノ酸類、ポリ
エチレングリコール、グリセロール等の物質が挙げられ
る。
【００３９】本発明のフィブリノゲン測定試薬は、構成
試薬を混合したもの、あるいは各構成試薬の集合体とす
ることができる。混合試薬、あるいは各構成試薬は常法
に従って、賦形剤と共に反応液中で所定の濃度となるよ
うに精製水や緩衝液に溶解した剤形の、そのまま直接、
測定に供することのできる形態、あるいは使用時、適時
所望の濃度に希釈する濃厚液の形態、さらには、凍結乾
燥品の形態とすることができる。このうち、凍結乾燥品
の形態が通常採用される形態であり、使用に際し精製水
または緩衝液に溶解する。また各構成試薬は同一の形態
あるいは別の形態とすることもできる。
試薬を混合したもの、あるいは各構成試薬の集合体とす
ることができる。混合試薬、あるいは各構成試薬は常法
に従って、賦形剤と共に反応液中で所定の濃度となるよ
うに精製水や緩衝液に溶解した剤形の、そのまま直接、
測定に供することのできる形態、あるいは使用時、適時
所望の濃度に希釈する濃厚液の形態、さらには、凍結乾
燥品の形態とすることができる。このうち、凍結乾燥品
の形態が通常採用される形態であり、使用に際し精製水
または緩衝液に溶解する。また各構成試薬は同一の形態
あるいは別の形態とすることもできる。
【００４０】本発明の試薬の好ましい組成としては、一
種類の試薬の場合、試薬溶液中にトロンビン２０〜５０
０ＮＩＨＵ／ｍｌ、好ましくは４０〜２００ＮＩＨＵ／
ｍｌ、ＨＥＰＥＳ １０〜４００ｍＭ、好ましくは３０
〜２００ｍＭ、ｐＨ６．０〜９．０、好ましくはｐＨ
７．０〜８．０、塩化ナトリウム０．５〜４Ｍ、好まし
くは１．０〜３．５Ｍ、更に好ましくは１．５〜３Ｍ、
臭化ナトリウム０．１５〜１．５Ｍ、好ましくは０．３
〜１Ｍを含む組成が挙げられる。その他の物質として、
例えば、ＢＳＡ ０．０１〜４ｗ／ｖ％、またはラクト
ース ０．０１〜４ｗ／ｖ％を含んでいてもよい。
種類の試薬の場合、試薬溶液中にトロンビン２０〜５０
０ＮＩＨＵ／ｍｌ、好ましくは４０〜２００ＮＩＨＵ／
ｍｌ、ＨＥＰＥＳ １０〜４００ｍＭ、好ましくは３０
〜２００ｍＭ、ｐＨ６．０〜９．０、好ましくはｐＨ
７．０〜８．０、塩化ナトリウム０．５〜４Ｍ、好まし
くは１．０〜３．５Ｍ、更に好ましくは１．５〜３Ｍ、
臭化ナトリウム０．１５〜１．５Ｍ、好ましくは０．３
〜１Ｍを含む組成が挙げられる。その他の物質として、
例えば、ＢＳＡ ０．０１〜４ｗ／ｖ％、またはラクト
ース ０．０１〜４ｗ／ｖ％を含んでいてもよい。
【００４１】本発明の方法の典型的な操作について説明
する。１〜８倍、好ましくは２〜３倍容量の試薬（二種
類の試薬の場合はその合計）を、好ましくは３７℃に平
衡化した検体（通常は血漿）に添加する。反応混合物の
凝固時間をそれ自体既知の測定方法で測定する。標準物
の凝固時間と比較することにより検体中のフィブリノゲ
ン量が求まる。
する。１〜８倍、好ましくは２〜３倍容量の試薬（二種
類の試薬の場合はその合計）を、好ましくは３７℃に平
衡化した検体（通常は血漿）に添加する。反応混合物の
凝固時間をそれ自体既知の測定方法で測定する。標準物
の凝固時間と比較することにより検体中のフィブリノゲ
ン量が求まる。
【００４２】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説
明する。以下の実施例において、％は特に断りのない限
りｗ／ｖ％を意味する。
明する。以下の実施例において、％は特に断りのない限
りｗ／ｖ％を意味する。
【００４３】実施例１ １００ＮＩＨＵ／ｍｌトロンビン（ウシ由来、シグマ社
製）、０．５％ＢＳＡ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ
７．３５を含む溶液に塩化ナトリウム０．１〜３Ｍとな
るように添加した。同様の溶液に臭化ナトリウム０．１
〜３Ｍ、塩化カリウム０．１〜１．４Ｍ、ヨウ化カリウ
ム０．１〜１．４Ｍ、塩化カルシウム０．１〜０．４
Ｍ、塩化マグネシウム０．１〜０．７Ｍとなるように添
加した（濃度は試薬中の濃度を示す）。
製）、０．５％ＢＳＡ、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ
７．３５を含む溶液に塩化ナトリウム０．１〜３Ｍとな
るように添加した。同様の溶液に臭化ナトリウム０．１
〜３Ｍ、塩化カリウム０．１〜１．４Ｍ、ヨウ化カリウ
ム０．１〜１．４Ｍ、塩化カルシウム０．１〜０．４
Ｍ、塩化マグネシウム０．１〜０．７Ｍとなるように添
加した（濃度は試薬中の濃度を示す）。
【００４４】市販管理血漿カリプラズマ（ビオメリュー
社製：フランス）（フィブリノゲン量２７５ｍｇ／ｄ
ｌ）を検体として、その１００μｌを３７℃で２分間加
温後、室温に置いた上記試薬２００μｌを添加し、凝固
時間測定機器ＫＣ−４（アメルング社製：ドイツ）で凝
固時間を測定した。その結果を図１に示す。
社製：フランス）（フィブリノゲン量２７５ｍｇ／ｄ
ｌ）を検体として、その１００μｌを３７℃で２分間加
温後、室温に置いた上記試薬２００μｌを添加し、凝固
時間測定機器ＫＣ−４（アメルング社製：ドイツ）で凝
固時間を測定した。その結果を図１に示す。
【００４５】塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化カ
リウムの０．１Ｍの凝固時間３．５秒は測定機器で測定
できる最低時間であり、実際の凝固時間はこれより短い
と考えられる。塩化ナトリウムの場合、１Ｍまでは濃度
の増加とともに凝固時間が延長するが、１Ｍ以上では凝
固時間は短縮した。臭化ナトリウムでは、濃度の増加と
ともに凝固時間は延長し、２Ｍでは３００秒以内で凝固
は生じなかった。塩化カリウムは塩化ナトリウムと似た
傾向があった。ヨウ化カリウムは０．７Ｍでは３００秒
以内に凝固しなかった。塩化マグネシウムは０．４Ｍで
は３００秒以内に凝固しなかった。塩化カルシウムは
０．４Ｍでは３００秒以内に凝固しなかった。各々の塩
について好ましい濃度を選択することにより、検体を希
釈することなくフィブリノゲン測定で好ましい凝固時間
が得られることが判明した。
リウムの０．１Ｍの凝固時間３．５秒は測定機器で測定
できる最低時間であり、実際の凝固時間はこれより短い
と考えられる。塩化ナトリウムの場合、１Ｍまでは濃度
の増加とともに凝固時間が延長するが、１Ｍ以上では凝
固時間は短縮した。臭化ナトリウムでは、濃度の増加と
ともに凝固時間は延長し、２Ｍでは３００秒以内で凝固
は生じなかった。塩化カリウムは塩化ナトリウムと似た
傾向があった。ヨウ化カリウムは０．７Ｍでは３００秒
以内に凝固しなかった。塩化マグネシウムは０．４Ｍで
は３００秒以内に凝固しなかった。塩化カルシウムは
０．４Ｍでは３００秒以内に凝固しなかった。各々の塩
について好ましい濃度を選択することにより、検体を希
釈することなくフィブリノゲン測定で好ましい凝固時間
が得られることが判明した。
【００４６】実施例２ 実施例１と同じ濃度のトロンビン、ＢＳＡ、ＨＥＰＥＳ
を含む溶液に、１Ｍ塩化ナトリウム、０．４Ｍ臭化ナト
リウム、０．９Ｍ塩化カリウム、０．２Ｍヨウ化カリウ
ム、０．１５Ｍ塩化カルシウム、０．１５Ｍ塩化マグネ
シウムの各塩をその濃度となるようそれぞれ添加した
（濃度は試薬中の濃度を示す）。
を含む溶液に、１Ｍ塩化ナトリウム、０．４Ｍ臭化ナト
リウム、０．９Ｍ塩化カリウム、０．２Ｍヨウ化カリウ
ム、０．１５Ｍ塩化カルシウム、０．１５Ｍ塩化マグネ
シウムの各塩をその濃度となるようそれぞれ添加した
（濃度は試薬中の濃度を示す）。
【００４７】未希釈および生理的食塩水で１．５、２、
３倍希釈した市販管理血漿カリプラズマ（フィブリノゲ
ン量２７５ｍｇ／ｄｌ）を検体とした。また、従来のト
ロンビン時間法である市販のフィブリノゲン測定試薬キ
ット：フィブリノゲンキット（ビオメリュー社製）を用
い、フィブリノゲン量を求めたヒト血漿を検体（６検
体）とした。測定は実施例１と同様に行った。その結果
を表１に示す。
３倍希釈した市販管理血漿カリプラズマ（フィブリノゲ
ン量２７５ｍｇ／ｄｌ）を検体とした。また、従来のト
ロンビン時間法である市販のフィブリノゲン測定試薬キ
ット：フィブリノゲンキット（ビオメリュー社製）を用
い、フィブリノゲン量を求めたヒト血漿を検体（６検
体）とした。測定は実施例１と同様に行った。その結果
を表１に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】表１に示すように、カリプラズマ及びその
希釈物を検体とするとき、各塩ともフィブリノゲン量の
低下に応じて、凝固時間が延長した。ヒト血漿において
も、フィブリノゲン量に応じた凝固時間の延長が認めら
れた。このことは未希釈の検体を用いてフィブリノゲン
量が測定できることを示す。ただし本実施例の塩濃度で
は、カリプラズマのような凍結乾燥品の市販管理血漿
（使用時、水に溶解する）をフィブリノゲン測定の標準
とすると、それにより求まるヒト血漿での測定値は、従
来の希釈法によって求めた値よりかなり低い値となる。
例えば、表１のヒト血漿３８０ｍｇ／ｄｌの検体の秒数
より、カリプラズマを標準としてフィブリノゲン量を概
算すると、塩化ナトリウム等では１００ｍｇ／ｄｌ以上
低値になる。この現象は他の塩についても同様に認めら
れる。このような乖離は、実際の検査においては市販管
理血漿を標準に用いることが多いので、不都合となる場
合が多い。
希釈物を検体とするとき、各塩ともフィブリノゲン量の
低下に応じて、凝固時間が延長した。ヒト血漿において
も、フィブリノゲン量に応じた凝固時間の延長が認めら
れた。このことは未希釈の検体を用いてフィブリノゲン
量が測定できることを示す。ただし本実施例の塩濃度で
は、カリプラズマのような凍結乾燥品の市販管理血漿
（使用時、水に溶解する）をフィブリノゲン測定の標準
とすると、それにより求まるヒト血漿での測定値は、従
来の希釈法によって求めた値よりかなり低い値となる。
例えば、表１のヒト血漿３８０ｍｇ／ｄｌの検体の秒数
より、カリプラズマを標準としてフィブリノゲン量を概
算すると、塩化ナトリウム等では１００ｍｇ／ｄｌ以上
低値になる。この現象は他の塩についても同様に認めら
れる。このような乖離は、実際の検査においては市販管
理血漿を標準に用いることが多いので、不都合となる場
合が多い。
【００５０】次に、乖離を生じない好ましい条件の例を
実施例３〜５に示す。実施例３および４は、凝固時間測
定機器ＫＣ−４を用いた例であり、ＫＣ−４は凝固物の
形成を力学的に検出する機器である。実施例５は光学的
方法により凝固時間を測定する機器を用いた例である。
実施例３〜５に示す。実施例３および４は、凝固時間測
定機器ＫＣ−４を用いた例であり、ＫＣ−４は凝固物の
形成を力学的に検出する機器である。実施例５は光学的
方法により凝固時間を測定する機器を用いた例である。
【００５１】実施例３ 本実施例では、乖離を解消するためにフッ化カリウム、
クエン酸ナトリウム、塩酸アルキルジアミノエチルグリ
シンを用いた。本実施例は二種類の試薬溶液を用いる場
合の例である。 試薬の調製：１Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍフッ化カリ
ウム、３０ｍＭクエン酸三ナトリウム、０．０１％塩酸
アルキルジアミノエチルグリシンおよび０．１Ｍ ＨＥ
ＰＥＳ ｐＨ７．３５となるように調製し第一試薬とし
た。トロンビン１００ＮＩＨＵ／ｍｌ、０．１Ｍ塩化ナ
トリウム、０．１％ＢＳＡおよび０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ
ｐＨ７．３５となるように調製し、第二試薬とした。
クエン酸ナトリウム、塩酸アルキルジアミノエチルグリ
シンを用いた。本実施例は二種類の試薬溶液を用いる場
合の例である。 試薬の調製：１Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍフッ化カリ
ウム、３０ｍＭクエン酸三ナトリウム、０．０１％塩酸
アルキルジアミノエチルグリシンおよび０．１Ｍ ＨＥ
ＰＥＳ ｐＨ７．３５となるように調製し第一試薬とし
た。トロンビン１００ＮＩＨＵ／ｍｌ、０．１Ｍ塩化ナ
トリウム、０．１％ＢＳＡおよび０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ
ｐＨ７．３５となるように調製し、第二試薬とした。
【００５２】測定：未希釈および生理的食塩水で２、
３、４倍希釈した市販管理血漿カリプラズマ（フィブリ
ノゲン量２７５ｍｇ／ｄｌ）を標準とした。標準および
ヒト血漿１００μｌに第一試薬を１００μｌ添加し、３
７℃で２分間加温後、第二試薬２００μｌを添加し、凝
固時間測定機器ＫＣ−４（アメルング社製：ドイツ）で
凝固時間を測定した。標準の検量線よりヒト血漿のフィ
ブリノゲン量を求めた。 同市販管理血漿およびヒト血漿を従来のトロンビン時間
法である市販のフィブリノゲン測定試薬キット：フィブ
リノゲンキット（ビオメリュー社製）を用い、その操作
手順に従い、ＫＣ−４を用いてフィブリノゲン量を測定
した。
３、４倍希釈した市販管理血漿カリプラズマ（フィブリ
ノゲン量２７５ｍｇ／ｄｌ）を標準とした。標準および
ヒト血漿１００μｌに第一試薬を１００μｌ添加し、３
７℃で２分間加温後、第二試薬２００μｌを添加し、凝
固時間測定機器ＫＣ−４（アメルング社製：ドイツ）で
凝固時間を測定した。標準の検量線よりヒト血漿のフィ
ブリノゲン量を求めた。 同市販管理血漿およびヒト血漿を従来のトロンビン時間
法である市販のフィブリノゲン測定試薬キット：フィブ
リノゲンキット（ビオメリュー社製）を用い、その操作
手順に従い、ＫＣ−４を用いてフィブリノゲン量を測定
した。
【００５３】結果：本発明の方法における検量線を図２
に示す。両対数グラフ上で凝固時間とフィブリノゲン量
が直線となる関係が得られた。尚、フィブリノゲン量２
５０ｍｇ／ｄｌのサンプルの凝固時間は約２２秒であっ
た。従来のトロンビン時間法との相関を図３に示す。相
関係数０．９５３、回帰式ｙ＝１．００８ｘ−１４の良
好な関係が認められ、標準とヒト血漿検体間に乖離を認
めなかった。
に示す。両対数グラフ上で凝固時間とフィブリノゲン量
が直線となる関係が得られた。尚、フィブリノゲン量２
５０ｍｇ／ｄｌのサンプルの凝固時間は約２２秒であっ
た。従来のトロンビン時間法との相関を図３に示す。相
関係数０．９５３、回帰式ｙ＝１．００８ｘ−１４の良
好な関係が認められ、標準とヒト血漿検体間に乖離を認
めなかった。
【００５４】以下の実施例４および５では、標準とヒト
血漿検体間の乖離を解消するために、高濃度の塩化ナト
リウムを用いた。凝固時間を延長させる目的で臭化ナト
リウムを添加している。臭化ナトリウムを用いなくと
も、この濃度の塩化ナトリウムを使用することにより乖
離は解消される。 実施例４ 試薬の調製：トロンビン１００ＮＩＨＵ／ｍｌ、２．６
Ｍ塩化ナトリウム、０．４Ｍ臭化ナトリウム、０．１％
ＢＳＡおよび０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３５とな
るように調製した。
血漿検体間の乖離を解消するために、高濃度の塩化ナト
リウムを用いた。凝固時間を延長させる目的で臭化ナト
リウムを添加している。臭化ナトリウムを用いなくと
も、この濃度の塩化ナトリウムを使用することにより乖
離は解消される。 実施例４ 試薬の調製：トロンビン１００ＮＩＨＵ／ｍｌ、２．６
Ｍ塩化ナトリウム、０．４Ｍ臭化ナトリウム、０．１％
ＢＳＡおよび０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３５とな
るように調製した。
【００５５】測定：未希釈および生理的食塩水で２、
３、４、６、１１倍に希釈した市販管理血漿カリプラズ
マ（フィブリノゲン量２７５ｍｇ／ｄｌ）を標準とし
た。標準およびヒト血漿１００μｌを、３７℃で２分間
加温後、試薬２００μｌを添加し、凝固時間測定機器Ｋ
Ｃ−４で、凝固時間を測定した。標準の検量線よりヒト
血漿のフィブリノゲン量を求めた。 同市販管理血漿およびヒト血漿を従来のトロンビン時間
法である市販のフィブリノゲン測定試薬キット：フィブ
リノゲンキットを用い、その操作手順に従い、ＫＣ−４
を用いてフィブリノゲン量を測定した。
３、４、６、１１倍に希釈した市販管理血漿カリプラズ
マ（フィブリノゲン量２７５ｍｇ／ｄｌ）を標準とし
た。標準およびヒト血漿１００μｌを、３７℃で２分間
加温後、試薬２００μｌを添加し、凝固時間測定機器Ｋ
Ｃ−４で、凝固時間を測定した。標準の検量線よりヒト
血漿のフィブリノゲン量を求めた。 同市販管理血漿およびヒト血漿を従来のトロンビン時間
法である市販のフィブリノゲン測定試薬キット：フィブ
リノゲンキットを用い、その操作手順に従い、ＫＣ−４
を用いてフィブリノゲン量を測定した。
【００５６】結果：本発明の方法における検量線を図４
に示す。両対数グラフ上で凝固時間とフィブリノゲン量
が約４０ｍｇ／ｄｌまで直線関係が認められ、実際上２
５ｍｇ／ｄｌまでの測定が可能であった。尚、フィブリ
ノゲン量２５０ｍｇ／ｄｌのサンプルの凝固時間は約１
１．５秒であった。従来のトロンビン時間法との相関を
図５に示す。相関係数０．９７４、回帰式ｙ＝１．００
４ｘ−１２の良好な関係が認められ、標準とヒト血漿検
体間に乖離を認めなかった。
に示す。両対数グラフ上で凝固時間とフィブリノゲン量
が約４０ｍｇ／ｄｌまで直線関係が認められ、実際上２
５ｍｇ／ｄｌまでの測定が可能であった。尚、フィブリ
ノゲン量２５０ｍｇ／ｄｌのサンプルの凝固時間は約１
１．５秒であった。従来のトロンビン時間法との相関を
図５に示す。相関係数０．９７４、回帰式ｙ＝１．００
４ｘ−１２の良好な関係が認められ、標準とヒト血漿検
体間に乖離を認めなかった。
【００５７】実施例５ 試薬の調製：トロンビン５０ＮＩＨＵ／ｍｌ、２．９Ｍ
塩化ナトリウム、０．８Ｍ臭化ナトリウム、０．１％Ｂ
ＳＡ、０．０５％カオリンおよび０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ
ｐＨ７．３５となるように調製した。 測定：未希釈および生理的食塩水で２、３、４倍に希釈
した市販管理血漿カリプラズマ（フィブリノゲン量２７
５ｍｇ／ｄｌ）を標準とした。標準およびヒト血漿１０
０μｌを、３７℃で２分間加温後、試薬２００μｌを添
加し、凝固時間測定機器オプション８（ビオメリュー社
製）で、凝固時間を測定した。標準の検量線よりヒト血
漿のフィブリノゲン量を求めた。 同市販管理血漿およびヒト血漿を従来のトロンビン時間
法である市販のフィブリノゲン測定試薬キット：フィブ
リノマットオプション（ビオメリュー社製）を用い、そ
の操作手順に従い、オプション８を用いてフィブリノゲ
ン量を測定した。 結果：本発明の方法における検量線を図６に示す。両対
数グラフ上で凝固時間とフィブリノゲン量が直線となる
関係が認められた。尚、フィブリノゲン量２５０ｍｇ／
ｄｌのサンプルの凝固時間は約１８秒であった。従来の
トロンビン時間法との相関を図７に示す。相関係数０．
９６３、回帰式ｙ＝０．９２６ｘ−５の良好な関係が認
められた。凝固時間を光学的に検出する機器を用いる本
実施例においても、標準とヒト血漿検体間に乖離を特に
認めなかった。
塩化ナトリウム、０．８Ｍ臭化ナトリウム、０．１％Ｂ
ＳＡ、０．０５％カオリンおよび０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ
ｐＨ７．３５となるように調製した。 測定：未希釈および生理的食塩水で２、３、４倍に希釈
した市販管理血漿カリプラズマ（フィブリノゲン量２７
５ｍｇ／ｄｌ）を標準とした。標準およびヒト血漿１０
０μｌを、３７℃で２分間加温後、試薬２００μｌを添
加し、凝固時間測定機器オプション８（ビオメリュー社
製）で、凝固時間を測定した。標準の検量線よりヒト血
漿のフィブリノゲン量を求めた。 同市販管理血漿およびヒト血漿を従来のトロンビン時間
法である市販のフィブリノゲン測定試薬キット：フィブ
リノマットオプション（ビオメリュー社製）を用い、そ
の操作手順に従い、オプション８を用いてフィブリノゲ
ン量を測定した。 結果：本発明の方法における検量線を図６に示す。両対
数グラフ上で凝固時間とフィブリノゲン量が直線となる
関係が認められた。尚、フィブリノゲン量２５０ｍｇ／
ｄｌのサンプルの凝固時間は約１８秒であった。従来の
トロンビン時間法との相関を図７に示す。相関係数０．
９６３、回帰式ｙ＝０．９２６ｘ−５の良好な関係が認
められた。凝固時間を光学的に検出する機器を用いる本
実施例においても、標準とヒト血漿検体間に乖離を特に
認めなかった。
【００５８】
【発明の効果】トロンビン時間法に基づくフィブリノゲ
ン測定で、高濃度の塩の存在下で反応を行うことによ
り、検体を希釈することなく測定でき、従来の希釈法に
比べ操作が著しく簡便となる。本方法においては、フィ
ブリン凝集抑制剤のような高価なペプチドを使用しない
ので経済的にも有利である。又、過剰量のトロンビンを
用いるというトロンビン時間法の基本に則しているの
で、精度良く測定を行うことができる。さらに、高濃度
の塩を存在させることにより、防腐的効果やヘパリンの
影響を回避する効果が二次的効果としてある。本発明の
方法は従来の希釈法による測定結果と高い相関性があ
り、血液凝固検査として日常検査に用いることができ
る。
ン測定で、高濃度の塩の存在下で反応を行うことによ
り、検体を希釈することなく測定でき、従来の希釈法に
比べ操作が著しく簡便となる。本方法においては、フィ
ブリン凝集抑制剤のような高価なペプチドを使用しない
ので経済的にも有利である。又、過剰量のトロンビンを
用いるというトロンビン時間法の基本に則しているの
で、精度良く測定を行うことができる。さらに、高濃度
の塩を存在させることにより、防腐的効果やヘパリンの
影響を回避する効果が二次的効果としてある。本発明の
方法は従来の希釈法による測定結果と高い相関性があ
り、血液凝固検査として日常検査に用いることができ
る。
【図１】塩濃度と凝固時間の関係を示すグラフである。
【図２】本発明の二試薬系での血液凝固時間測定機器Ｋ
Ｃ−４を用いた場合の検量線を示すグラフである。
Ｃ−４を用いた場合の検量線を示すグラフである。
【図３】本発明の二試薬系での血液凝固時間測定機器Ｋ
Ｃ−４を用いた場合での市販キットとの相関を示すグラ
フである。
Ｃ−４を用いた場合での市販キットとの相関を示すグラ
フである。
【図４】本発明の一試薬系での血液凝固時間測定機器Ｋ
Ｃ−４を用いた場合の検量線を示すグラフである。
Ｃ−４を用いた場合の検量線を示すグラフである。
【図５】本発明の一試薬系での血液凝固時間測定機器Ｋ
Ｃ−４を用いた場合での市販キットとの相関を示すグラ
フである。
Ｃ−４を用いた場合での市販キットとの相関を示すグラ
フである。
【図６】本発明の一試薬系での血液凝固時間測定機器オ
プション８を用いた場合の検量線を示すグラフである。
プション８を用いた場合の検量線を示すグラフである。
【図７】本発明の一試薬系での血液凝固時間測定機器オ
プション８を用いた場合での市販キットとの相関を示す
グラフである。
プション８を用いた場合での市販キットとの相関を示す
グラフである。
Claims (17)
- 【請求項１】 検体にトロンビンまたは同様な活性を有
するプロテアーゼを添加して検体中のフィブリノゲンを
フィブリンに変換し、凝固時間を測定することからなる
検体中のフィブリノゲン測定方法であって、未希釈の検
体を用い、高濃度の塩を含有する反応液中で、該フィブ
リノゲンの変換を行うことを特徴とするフィブリノゲン
測定方法。 - 【請求項２】 反応液中の塩の濃度が、フィブリノゲン
２７５ｍｇ／ｄｌを含む検体、およびトロンビン１００
ＮＩＨＵ／ｍｌ、ＨＥＰＥＳ １００ｍＭｐＨ７．３５
を含む試薬を１：２の容量比で混合し、３７℃にて凝固
時間を測定するとき、５〜１００秒の凝固時間を生じさ
せる濃度である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 検体、およびトロンビンまたは同様な活
性を有するプロテアーゼを含む試薬を１：１〜１：８の
容量比で混合する請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 塩がナトリウム塩、カリウム塩、カルシ
ウム塩、およびマグネシウム塩から選ばれる一種または
二種以上である請求項１または２記載の方法。 - 【請求項５】 塩が塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、
ヨウ化ナトリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、ヨウ
化カリウム、塩化カルシウム、および塩化マグネシウム
から選ばれる一種または二種以上である請求項１または
２記載の方法。 - 【請求項６】 反応液中の塩の濃度が、塩化ナトリウム
は０．２５〜３Ｍ、臭化ナトリウムは０．１〜１．０
Ｍ、ヨウ化ナトリウムは０．１〜０．４Ｍ、塩化カリウ
ムは０．２５〜１．５Ｍ、臭化カリウムは０．１〜１
Ｍ、ヨウ化カリウムは０．１〜０．４Ｍ、塩化マグネシ
ウムは０．０４〜０．２５Ｍ、塩化カルシウムは０．０
４〜０．２５Ｍである請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 塩として塩化ナトリウムと他の塩とを組
合わせて用いる請求項５記載の方法。 - 【請求項８】 反応液が塩化ナトリウム１．０〜２．５
Ｍ、および臭化ナトリウム０．１〜０．８Ｍを含有する
請求項１または２記載の方法。 - 【請求項９】 一種類または二種類の試薬を用いる請求
項１〜８のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】 高濃度の塩、および２０〜５００ＮＩ
ＨＵ／ｍｌのトロンビンまたは同様な活性を有するプロ
テアーゼを含むフィブリノゲン測定試薬。 - 【請求項１１】 フィブリノゲン２７５ｍｇ／ｄｌを含
む検体、およびトロンビン１００ＮＩＨＵ／ｍｌ、ＨＥ
ＰＥＳ １００ｍＭ ｐＨ７．３５を含む試薬を１：２
の容量比で混合し、３７℃にて凝固時間を測定すると
き、５〜１００秒の凝固時間を生じさせる濃度の塩を含
む請求項１０記載の試薬。 - 【請求項１２】 乖離防止剤を含む第一試薬、およびト
ロンビンまたは同様な活性を有するプロテアーゼを含む
第二試薬からなり、第一試薬および第二試薬のいずれか
一方の試薬、もしくは両方の試薬に塩が含まれることを
特徴とする請求項１０記載の試薬。 - 【請求項１３】 塩がナトリウム塩、カリウム塩、カル
シウム塩、およびマグネシウム塩から選ばれる一種また
は二種以上である請求項１０または１１記載の試薬。 - 【請求項１４】 塩が塩化ナトリウム、臭化ナトリウ
ム、ヨウ化ナトリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、
ヨウ化カリウム、塩化カルシウム、および塩化マグネシ
ウムから選ばれる一種または二種以上である請求項１０
または１１記載の試薬。 - 【請求項１５】 試薬中の塩の濃度が、塩化ナトリウム
は０．５〜４Ｍ、臭化ナトリウムは０．１５〜１．５
Ｍ、ヨウ化ナトリウムは０．１５〜０．６Ｍ、塩化カリ
ウムは０．３〜２Ｍ、臭化カリウムは０．１５〜１．５
Ｍ、ヨウ化カリウムは０．１５〜０．６Ｍ、塩化マグネ
シウムは０．０５〜０．３５Ｍ、塩化カルシウムは０．
０５〜０．３５Ｍである請求項１４記載の試薬。 - 【請求項１６】 トロンビン２０〜５００ＮＩＨＵ／ｍ
ｌ、緩衝剤１０〜４００ｍＭ ｐＨ６．０〜９．０、塩
化ナトリウム０．５〜４Ｍ、および臭化ナトリウム０．
１５〜１．５Ｍを含む請求項１０記載の試薬。 - 【請求項１７】 トロンビン４０〜２００ＮＩＨＵ／ｍ
ｌ、緩衝剤３０〜２００ｍＭ ｐＨ７．０〜８．０、塩
化ナトリウム１．０〜３．０Ｍ、および臭化ナトリウム
０．３〜１．０Ｍを含む請求項１０記載の試薬。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6209940A JP2994557B2 (ja) | 1994-09-02 | 1994-09-02 | フィブリノゲン測定方法およびその測定試薬 |
| US08/521,868 US5851836A (en) | 1994-09-02 | 1995-08-31 | Method for determining fibrinogen and reagent for determination thereof |
| EP95113736A EP0699909B1 (en) | 1994-09-02 | 1995-09-01 | Method for determining fibrinogen and reagent for determination thereof |
| DE69524161T DE69524161T2 (de) | 1994-09-02 | 1995-09-01 | Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogen und Reagenz zu dessen Bestimmung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6209940A JP2994557B2 (ja) | 1994-09-02 | 1994-09-02 | フィブリノゲン測定方法およびその測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0870895A true JPH0870895A (ja) | 1996-03-19 |
| JP2994557B2 JP2994557B2 (ja) | 1999-12-27 |
Family
ID=16581187
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6209940A Expired - Fee Related JP2994557B2 (ja) | 1994-09-02 | 1994-09-02 | フィブリノゲン測定方法およびその測定試薬 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5851836A (ja) |
| EP (1) | EP0699909B1 (ja) |
| JP (1) | JP2994557B2 (ja) |
| DE (1) | DE69524161T2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012181033A (ja) * | 2011-02-28 | 2012-09-20 | Sysmex Corp | ループスアンチコアグラント検出用試薬キット及びループスアンチコアグラントの存否を判定する方法 |
| JP2014212736A (ja) * | 2013-04-26 | 2014-11-17 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | トロンビン含有試薬及び測定方法 |
| JP2015148626A (ja) * | 2015-03-30 | 2015-08-20 | 積水メディカル株式会社 | 血液凝固反応における血液凝固時間延長剤 |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1221479B1 (en) * | 1999-09-27 | 2006-11-22 | Sysmex Corporation | Method for stabilizing thrombin |
| DE10325173B4 (de) * | 2003-06-04 | 2007-11-08 | Stief, Thomas, Dr.med. | Nachweisverfahren für Fibrinogen und/oder Fibrinogen-Derivate |
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