JPH0859699A - ウイルスに関して安全なヒト免疫グロブリンａ単量体及びその製造方法 - Google Patents
ウイルスに関して安全なヒト免疫グロブリンａ単量体及びその製造方法Info
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- JPH0859699A JPH0859699A JP7178534A JP17853495A JPH0859699A JP H0859699 A JPH0859699 A JP H0859699A JP 7178534 A JP7178534 A JP 7178534A JP 17853495 A JP17853495 A JP 17853495A JP H0859699 A JPH0859699 A JP H0859699A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 実質的にＩｇＧを含まない、ウイルスに関し
て安全なヒトＩｇＡ単量体の提供。 【構成】 （ａ）ＩｇＡ含有画分を、実質的にＩｇＧを
含まないＩｇＡ単量体が得られるように精製に付し、そ
して（ｂ）得られた生成物を、ウイルス不活性化のため
の方法に付す方法によって得られるＩｇＡ単量体。
て安全なヒトＩｇＡ単量体の提供。 【構成】 （ａ）ＩｇＡ含有画分を、実質的にＩｇＧを
含まないＩｇＡ単量体が得られるように精製に付し、そ
して（ｂ）得られた生成物を、ウイルス不活性化のため
の方法に付す方法によって得られるＩｇＡ単量体。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ウイルスに関して
安全なヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）単量体、その製
造方法、及びそれを含有する安定な医薬製剤に関する。
安全なヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）単量体、その製
造方法、及びそれを含有する安定な医薬製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】免疫グロブリン（Ｉｇ）は、全ての脊椎
動物の血液、リンパ、及びその他の体分泌物中に存在す
る、特異的な免疫能を有するタンパク質である。免疫グ
ロブリンは、Ｂリンパ球により合成される。免疫グロブ
リンの単量体は、それぞれ、ジスルフィド架橋により連
結された２本のＬ鎖（軽鎖）及びＨ鎖（重鎖）からな
る。免疫グロブリンは、抗体として作用し、抗原により
その分泌が誘導される糖タンパクである。量的には、こ
れらは、全血漿タンパク質の約２０％を構成する。現在
までに、５種類の主な免疫グロブリンのクラスがヒトに
おいて同定されており（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｉｇ
Ｇ及びＩｇＭ）、これらは、そのＨ鎖、血清中濃度、分
子量（約１４６，０００〜９７０，０００）、炭水化物
含有量、電気泳動による移動度、及びその生物学的特性
において異なる。主要なクラスであるＩｇＡ及びＩｇＧ
は、更にサブクラスに分けることができる（例えば、Ｉ
ｇＡ１及びＩｇＡ２）。免疫グロブリンのクラス及びサ
ブクラスの多様性は、抗原結合におけるさまざまに異な
る特異性と同様に、存在する各種遺伝子の組み合わせに
より得られるものである。能動免疫は、誘導された免疫
グロブリンの分泌に基づくものである一方、各種ウイル
ス及び細菌感染症に対する受動免疫においては、免疫グ
ロブリンは供給される。
動物の血液、リンパ、及びその他の体分泌物中に存在す
る、特異的な免疫能を有するタンパク質である。免疫グ
ロブリンは、Ｂリンパ球により合成される。免疫グロブ
リンの単量体は、それぞれ、ジスルフィド架橋により連
結された２本のＬ鎖（軽鎖）及びＨ鎖（重鎖）からな
る。免疫グロブリンは、抗体として作用し、抗原により
その分泌が誘導される糖タンパクである。量的には、こ
れらは、全血漿タンパク質の約２０％を構成する。現在
までに、５種類の主な免疫グロブリンのクラスがヒトに
おいて同定されており（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｉｇ
Ｇ及びＩｇＭ）、これらは、そのＨ鎖、血清中濃度、分
子量（約１４６，０００〜９７０，０００）、炭水化物
含有量、電気泳動による移動度、及びその生物学的特性
において異なる。主要なクラスであるＩｇＡ及びＩｇＧ
は、更にサブクラスに分けることができる（例えば、Ｉ
ｇＡ１及びＩｇＡ２）。免疫グロブリンのクラス及びサ
ブクラスの多様性は、抗原結合におけるさまざまに異な
る特異性と同様に、存在する各種遺伝子の組み合わせに
より得られるものである。能動免疫は、誘導された免疫
グロブリンの分泌に基づくものである一方、各種ウイル
ス及び細菌感染症に対する受動免疫においては、免疫グ
ロブリンは供給される。
【０００３】免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）は、唾液、涙
液、並びに気管支及び腸管の粘膜性分泌物などの外分泌
物中における主要な抗体クラスを示す。それに加えて、
免疫グロブリンＡは、細菌及びウイルス性抗原に対する
第一の防御ラインの一つとして働く。
液、並びに気管支及び腸管の粘膜性分泌物などの外分泌
物中における主要な抗体クラスを示す。それに加えて、
免疫グロブリンＡは、細菌及びウイルス性抗原に対する
第一の防御ラインの一つとして働く。
【０００４】細菌及びウイルス性感染症の予防及び治療
には、免疫グロブリン、例えば免疫グロブリンＡに基づ
く医薬組成物が提唱され、使用されてきた〔例えば、特
開昭５７−５９８１５号（JP-A-57-59815)を参照〕。
には、免疫グロブリン、例えば免疫グロブリンＡに基づ
く医薬組成物が提唱され、使用されてきた〔例えば、特
開昭５７−５９８１５号（JP-A-57-59815)を参照〕。
【０００５】ＩｇＡは、分泌成分である受容体により、
血液側から上皮細胞を経て、細胞外の側へ移送され得
る。
血液側から上皮細胞を経て、細胞外の側へ移送され得
る。
【０００６】純粋な単量体の形態では、ＩｇＡは、２本
のＬ鎖（軽鎖）及び２本のＨ鎖（重鎖）からなり、二量
体の分泌形態では、このような二つの単量体が、いわゆ
るＪ鎖（結合鎖）により連結されている。粘膜及び腺の
分泌物中では、付加的な分泌成分（いわゆるＳＣ成分）
を有する二量体が主に存在する。
のＬ鎖（軽鎖）及び２本のＨ鎖（重鎖）からなり、二量
体の分泌形態では、このような二つの単量体が、いわゆ
るＪ鎖（結合鎖）により連結されている。粘膜及び腺の
分泌物中では、付加的な分泌成分（いわゆるＳＣ成分）
を有する二量体が主に存在する。
【０００７】溶液中では、ＩｇＡは、ＩｇＡ二量体と平
衡状態で、ＩｇＡ単量体として存在する。この平衡状態
では、ＩｇＡ二量体の比率は、最高で、全ＩｇＡの約２
５％に達する。
衡状態で、ＩｇＡ単量体として存在する。この平衡状態
では、ＩｇＡ二量体の比率は、最高で、全ＩｇＡの約２
５％に達する。
【０００８】ＩｇＡは、二つのサブクラス、ＩｇＡ１及
びＩｇＡ２からなり、これらは約８０重量％対約２０重
量％の自然の比率で存在する。この比率は、単離の過程
で変化し得る。免疫グロブリン製剤中、U/dlで表示する
ラムダＬ鎖に対するカッパＬ鎖の自然の比率は、約１：
１である。
びＩｇＡ２からなり、これらは約８０重量％対約２０重
量％の自然の比率で存在する。この比率は、単離の過程
で変化し得る。免疫グロブリン製剤中、U/dlで表示する
ラムダＬ鎖に対するカッパＬ鎖の自然の比率は、約１：
１である。
【０００９】ＩｇＡは、正常なヒト血清の全タンパク質
の約３〜４％を占める。ＩｇＡは、精製の間に、複合体
を形成し、凝集する傾向が非常に大きいため、血清から
のＩｇＡ単量体の単離の収量は通常低く、多くの精製法
の中でも、大規模な製造にも適した方法は、わずかしか
知られていない。
の約３〜４％を占める。ＩｇＡは、精製の間に、複合体
を形成し、凝集する傾向が非常に大きいため、血清から
のＩｇＡ単量体の単離の収量は通常低く、多くの精製法
の中でも、大規模な製造にも適した方法は、わずかしか
知られていない。
【００１０】ＩｇＡ製剤の主な不純物は、除去する必要
のある免疫グロブリンＧの各種サブクラスであり、した
がって精製が必要であり、このため更に、ＩｇＡの収量
が低下する。
のある免疫グロブリンＧの各種サブクラスであり、した
がって精製が必要であり、このため更に、ＩｇＡの収量
が低下する。
【００１１】公知であり、かつ良く用いられている免疫
グロブリン精製のための方法の多くは、物理的特性の違
い、例えば、水性系における溶解性の違い（分画沈殿に
よる精製）、電荷の違い（イオン交換クロマトグラフィ
ーによる精製）又は分子のサイズの違い（分子排除クロ
マトグラフィーによる精製）に基づくものである。
グロブリン精製のための方法の多くは、物理的特性の違
い、例えば、水性系における溶解性の違い（分画沈殿に
よる精製）、電荷の違い（イオン交換クロマトグラフィ
ーによる精製）又は分子のサイズの違い（分子排除クロ
マトグラフィーによる精製）に基づくものである。
【００１２】特開昭５７−５９８１５号（JP-A-57-5981
5)には、ヒト由来の出発物質からの免疫グロブリンの精
製が記載されている。これによると、硫酸アンモニウム
による沈殿の後に、セファクリル（Sephacryl ；登録商
標）Ｓ−２００によるゲルろ過を行い、続いてＩｇＧと
の分離のために、アフィニティクロマトグラフィーを行
う。しかし、単量体のＩｇＡ及びＩｇＧの分子量は、非
常に近いために（ＩｇＡ：１６２kD、ＩｇＧ：１５３k
D、J.F. Heremans, Immunoglobulin A in: TheAntigen
s, Vol. 2〔1974〕, pages 365-522; Academic Press,
New York を参照）、ＩｇＡ単量体の単離は困難であ
る。精製されたＩｇＡは、医薬組成物において活性成分
として使用され、精製には、ヒト由来の出発物質が使用
されるが、ウイルス不活性化のための方法は、特開昭５
７−５９８１５号（JP-A-57-59815)には記載されていな
い。更に又、ＩｇＡは、カプセル又は丸剤中に存在し、
ウイルス不活性化のための方法、特に加熱処理に付すこ
とができない。
5)には、ヒト由来の出発物質からの免疫グロブリンの精
製が記載されている。これによると、硫酸アンモニウム
による沈殿の後に、セファクリル（Sephacryl ；登録商
標）Ｓ−２００によるゲルろ過を行い、続いてＩｇＧと
の分離のために、アフィニティクロマトグラフィーを行
う。しかし、単量体のＩｇＡ及びＩｇＧの分子量は、非
常に近いために（ＩｇＡ：１６２kD、ＩｇＧ：１５３k
D、J.F. Heremans, Immunoglobulin A in: TheAntigen
s, Vol. 2〔1974〕, pages 365-522; Academic Press,
New York を参照）、ＩｇＡ単量体の単離は困難であ
る。精製されたＩｇＡは、医薬組成物において活性成分
として使用され、精製には、ヒト由来の出発物質が使用
されるが、ウイルス不活性化のための方法は、特開昭５
７−５９８１５号（JP-A-57-59815)には記載されていな
い。更に又、ＩｇＡは、カプセル又は丸剤中に存在し、
ウイルス不活性化のための方法、特に加熱処理に付すこ
とができない。
【００１３】A. Collard et al., Ann. Rech. Vet. 15
(4) (1984) 497-501 には、ウシ血清又は初乳から、セ
ファクリルＳ−３００を用いたゲルろ過により、免疫グ
ロブリンＡ、Ｇ及びＭを精製することが記載されてい
る。しかし、収量は低く、又、最終生成物は、ＩｇＧ１
及びＩｇＧ２サブクラスにより汚染されている。更に
又、血清試料からのＩｇＡ及びＩｇＧの分離は、初乳の
場合ほどは成功しない。初乳中では、ＩｇＡは、ＩｇＡ
二量体と付加的なタンパク鎖の複合体からなる分泌型Ｉ
ｇＡとして存在し、複合体の分子が大きいため、ゲル排
除クロマトグラフィーによる分離が容易である。
(4) (1984) 497-501 には、ウシ血清又は初乳から、セ
ファクリルＳ−３００を用いたゲルろ過により、免疫グ
ロブリンＡ、Ｇ及びＭを精製することが記載されてい
る。しかし、収量は低く、又、最終生成物は、ＩｇＧ１
及びＩｇＧ２サブクラスにより汚染されている。更に
又、血清試料からのＩｇＡ及びＩｇＧの分離は、初乳の
場合ほどは成功しない。初乳中では、ＩｇＡは、ＩｇＡ
二量体と付加的なタンパク鎖の複合体からなる分泌型Ｉ
ｇＡとして存在し、複合体の分子が大きいため、ゲル排
除クロマトグラフィーによる分離が容易である。
【００１４】J.R. Patterson et al., J. Clin. Path.
28 (1975) 670-673 によると、２種類の異なるゲルろ過
用媒質、つまりセファデックス（Sephadex；登録商標）
Ｇ−２００及びバイオゲル（Bio-Gel ；登録商標）Ａ−
５Ｍが、血清からの免疫グロブリンの分離に使用され
る。この方法により得られるＩｇＡ画分は、ＩｇＡ単量
体を含まず、替わりに高分子量のＩｇＡを含む。
28 (1975) 670-673 によると、２種類の異なるゲルろ過
用媒質、つまりセファデックス（Sephadex；登録商標）
Ｇ−２００及びバイオゲル（Bio-Gel ；登録商標）Ａ−
５Ｍが、血清からの免疫グロブリンの分離に使用され
る。この方法により得られるＩｇＡ画分は、ＩｇＡ単量
体を含まず、替わりに高分子量のＩｇＡを含む。
【００１５】しかし、免疫グロブリン製造のためにヒト
由来の出発物質を用いる上での大きな問題は、得られる
生成物のウイルスに関する安全性である。ドナーを選択
し、個々のドナーの血漿をそれぞれ試験したにもかかわ
らず、ある種の試験の感度が低いため、感染性病原体、
特に肝炎ウイルス、又はＨＩＶなどのレトロウイルス
が、ドナーのプ−ルに存在していることを否定すること
はできない。
由来の出発物質を用いる上での大きな問題は、得られる
生成物のウイルスに関する安全性である。ドナーを選択
し、個々のドナーの血漿をそれぞれ試験したにもかかわ
らず、ある種の試験の感度が低いため、感染性病原体、
特に肝炎ウイルス、又はＨＩＶなどのレトロウイルス
が、ドナーのプ−ルに存在していることを否定すること
はできない。
【００１６】Cohnによる分画アルコール沈殿による免疫
グロブリン製剤の製造により、１０15単位以上のウイル
スを除去／不活性化することができる〔例えば、Wells
et al., Transfusion 26 (1986) 210-213 を参照〕が、
ウイルスの不活性化が不十分である危険、つまりウイル
スに関する不十分な安全性が、新たな精製法を採用した
場合、特に存在する。
グロブリン製剤の製造により、１０15単位以上のウイル
スを除去／不活性化することができる〔例えば、Wells
et al., Transfusion 26 (1986) 210-213 を参照〕が、
ウイルスの不活性化が不十分である危険、つまりウイル
スに関する不十分な安全性が、新たな精製法を採用した
場合、特に存在する。
【００１７】ウイルスを十分に不活性化するためには、
例えば加熱処理を行うことができる。ウイルス不活性化
のためのその他の方法、例えばＥＰ−Ｂ−０１３１７４
０における溶媒／洗剤系による処理とは反対に、加熱処
理には、脂質により被覆されていないウイルス、例えば
Ａ型肝炎ウイルスも、不活性化されるという利点があ
る。
例えば加熱処理を行うことができる。ウイルス不活性化
のためのその他の方法、例えばＥＰ−Ｂ−０１３１７４
０における溶媒／洗剤系による処理とは反対に、加熱処
理には、脂質により被覆されていないウイルス、例えば
Ａ型肝炎ウイルスも、不活性化されるという利点があ
る。
【００１８】しかし、加熱処理及びその他のウイルス不
活性化のための方法には、かなりのＩｇＡが多量体化及
び／又は重合してしまうという欠点がある。
活性化のための方法には、かなりのＩｇＡが多量体化及
び／又は重合してしまうという欠点がある。
【００１９】ウイルス不活性化のために良く行われる方
法、及び特に加熱処理においては、免疫グロブリン凝集
物の形成が予想されるはずである。しかし、この種の凝
集物は、特に、静脈内投与後に、抗補体活性の上昇と共
に不適合反応を起こす。したがって、ウイルス不活性化
のための工程、又は特に加熱処理を含むある種の精製法
は、安定剤の存在下で実施される。
法、及び特に加熱処理においては、免疫グロブリン凝集
物の形成が予想されるはずである。しかし、この種の凝
集物は、特に、静脈内投与後に、抗補体活性の上昇と共
に不適合反応を起こす。したがって、ウイルス不活性化
のための工程、又は特に加熱処理を含むある種の精製法
は、安定剤の存在下で実施される。
【００２０】安定剤の存在下における加熱処理について
は、例えば、ＥＰ−Ｂ−０１７７８３６に記載されてお
り、それによると、水分含有率３％以下の凍結乾燥免疫
グロブリンＧを、安定剤を加えて、３０〜１００℃で１
０分間〜２００時間加熱する。安定剤により、比較的不
安定な免疫グロブリンの変性が予防され、それによりそ
の生物学的活性が保持される。
は、例えば、ＥＰ−Ｂ−０１７７８３６に記載されてお
り、それによると、水分含有率３％以下の凍結乾燥免疫
グロブリンＧを、安定剤を加えて、３０〜１００℃で１
０分間〜２００時間加熱する。安定剤により、比較的不
安定な免疫グロブリンの変性が予防され、それによりそ
の生物学的活性が保持される。
【００２１】安定剤の存在下で加熱処理を行うことに
は、最終生成物中にもこれらの安定剤が存在し、それを
その後除去しなければならないという欠点がある。
は、最終生成物中にもこれらの安定剤が存在し、それを
その後除去しなければならないという欠点がある。
【００２２】安定剤を用いずに加熱処理を行うことは、
例えば、ＥＰ−Ｂ−０１５９３１１に記載されている。
これによると、血液製品を、水分を含有する（水分含有
率５〜７０％）固相中で、１秒〜１００時間加熱する。
水の替わりに、ヒドロキシル基含有化合物、例えば、メ
タノール、エタノール又はマンニトールを用いることも
できる。
例えば、ＥＰ−Ｂ−０１５９３１１に記載されている。
これによると、血液製品を、水分を含有する（水分含有
率５〜７０％）固相中で、１秒〜１００時間加熱する。
水の替わりに、ヒドロキシル基含有化合物、例えば、メ
タノール、エタノール又はマンニトールを用いることも
できる。
【００２３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、実質
的に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を含まない、ウイルス
に関して安全なヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）単量体
を入手可能とすることである。本生成物は、従来の技術
に関して明らかにされている上記の問題を避けた、簡便
かつ安全な手順により得られるものである。本目的は、
本発明の主題により解決される。
的に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を含まない、ウイルス
に関して安全なヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）単量体
を入手可能とすることである。本生成物は、従来の技術
に関して明らかにされている上記の問題を避けた、簡便
かつ安全な手順により得られるものである。本目的は、
本発明の主題により解決される。
【００２４】
【課題を解決するための手段】本発明の主題は、実質的
にＩｇＧを含まず、免疫グロブリン含有画分を精製し、
ウイルス不活性化のための方法を実施することによって
得られる、請求項１記載の、ウイルスに関して安全なＩ
ｇＡ単量体である。
にＩｇＧを含まず、免疫グロブリン含有画分を精製し、
ウイルス不活性化のための方法を実施することによって
得られる、請求項１記載の、ウイルスに関して安全なＩ
ｇＡ単量体である。
【００２５】その好ましい実施態様は、請求項２〜６の
主題である。
主題である。
【００２６】別の主題は、実質的にＩｇＧを含まないヒ
トＩｇＡ単量体の画分を含む請求項７記載の安定な医薬
組成物（安定な医薬製剤）である。
トＩｇＡ単量体の画分を含む請求項７記載の安定な医薬
組成物（安定な医薬製剤）である。
【００２７】その好ましい実施態様は、請求項８及び９
の主題である。
の主題である。
【００２８】本発明の別の主題は、本発明によるウイル
スに関して安全なＩｇＡ単量体の製造のための、請求項
１０記載の方法である。
スに関して安全なＩｇＡ単量体の製造のための、請求項
１０記載の方法である。
【００２９】本方法の好適な実施態様は、請求項１１〜
２０の主題である。
２０の主題である。
【００３０】本発明の方法によると、実質的にＩｇＧを
含まず、ＩｇＡ単量体として存在し、ウイルスに関して
安全であると考えられる、つまり本製品の使用後、ウイ
ルスによる感染症の発生があり得ないＩｇＡを得ること
が、驚くべきことに可能となった。
含まず、ＩｇＡ単量体として存在し、ウイルスに関して
安全であると考えられる、つまり本製品の使用後、ウイ
ルスによる感染症の発生があり得ないＩｇＡを得ること
が、驚くべきことに可能となった。
【００３１】本発明によるＩｇＡ単量体により、ＩｇＡ
製剤は、ＩｇＡの総重量に対して、ＩｇＡ単量体を、少
なくとも９６重量％含むと理解される。
製剤は、ＩｇＡの総重量に対して、ＩｇＡ単量体を、少
なくとも９６重量％含むと理解される。
【００３２】この見解は、免疫グロブリンが、ウイルス
不活性化のための方法又は加熱処理において使用される
化学物質による処理の後に、凝集物を形成する傾向が高
いことに基づく。現在までに、ウイルス不活性化のため
の処理、及び特に加熱処理に反対する見解があった。現
在では驚くべきことに、本発明の方法によれば、工程
（ｂ）によりウイルス不活性化のための方法を行うこと
により、又は、例えば、炭水化物若しくはアミノ酸など
の通例の安定剤を添加せずに、加熱処理を行った場合
に、ＩｇＡが凝集物形成を起こさないことが見出されて
いる。本発明の好ましい実施態様としては、沈殿を起こ
さない量のポリエチレングリコールを、ウイルス不活性
化効果の向上のために用いた加熱処理、及び特に溶液中
での加熱処理がある。このためには、低分子量ＰＥＧの
使用が好ましい。
不活性化のための方法又は加熱処理において使用される
化学物質による処理の後に、凝集物を形成する傾向が高
いことに基づく。現在までに、ウイルス不活性化のため
の処理、及び特に加熱処理に反対する見解があった。現
在では驚くべきことに、本発明の方法によれば、工程
（ｂ）によりウイルス不活性化のための方法を行うこと
により、又は、例えば、炭水化物若しくはアミノ酸など
の通例の安定剤を添加せずに、加熱処理を行った場合
に、ＩｇＡが凝集物形成を起こさないことが見出されて
いる。本発明の好ましい実施態様としては、沈殿を起こ
さない量のポリエチレングリコールを、ウイルス不活性
化効果の向上のために用いた加熱処理、及び特に溶液中
での加熱処理がある。このためには、低分子量ＰＥＧの
使用が好ましい。
【００３３】本発明による方法に用いられるヒトＩｇＡ
含有出発材料は、好ましくは、ヒト由来の血清、血漿及
び／又は血漿画分である。
含有出発材料は、好ましくは、ヒト由来の血清、血漿及
び／又は血漿画分である。
【００３４】血漿及び／又は血漿画分は、Cohnの方法に
より、アルコールにより処理を行い、Cohn画分II及びII
I （II+III）を用いるのが好適である。
より、アルコールにより処理を行い、Cohn画分II及びII
I （II+III）を用いるのが好適である。
【００３５】ＩｇＡ含有出発材料は、好ましくは、クロ
マトグラフィー法を用いて精製する。特に、ゲル浸透ク
ロマトグラフィー及び／又はチオフィリック・クロマト
グラフィーを用いるのが好ましい。ＩｇＡ含有出発材料
は、例えば、エタノール、ポリエチレングリコール及び
／又は硫酸アンモニウムによる沈殿、及び／又は更にク
ロマトグラフィー法を用い、例えば、イオン交換体、ヒ
ドロキシアパタイト及び／又は硫酸デキストランへの吸
着、及び／又はヘパリンセファロ−ス（Sepharose ；登
録商標）による精製を用いて、予備精製することもでき
る。別の精製法は、夾雑するタンパク質を、ＺｎＳＯ4
又はリバノール（Ribanol ；登録商標）により沈殿させ
ることからなる。このような予備精製を行うことによっ
て、その後の工程において使用されるクロマトグラフィ
ーの材料、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィーに使用
されるゲルを、保存することができる。それによって、
クロマトグラフィーカラムをより長く使用することがで
きるが、この理由のため、本法が、大規模な技術規模に
おける使用に特に適しているのである。
マトグラフィー法を用いて精製する。特に、ゲル浸透ク
ロマトグラフィー及び／又はチオフィリック・クロマト
グラフィーを用いるのが好ましい。ＩｇＡ含有出発材料
は、例えば、エタノール、ポリエチレングリコール及び
／又は硫酸アンモニウムによる沈殿、及び／又は更にク
ロマトグラフィー法を用い、例えば、イオン交換体、ヒ
ドロキシアパタイト及び／又は硫酸デキストランへの吸
着、及び／又はヘパリンセファロ−ス（Sepharose ；登
録商標）による精製を用いて、予備精製することもでき
る。別の精製法は、夾雑するタンパク質を、ＺｎＳＯ4
又はリバノール（Ribanol ；登録商標）により沈殿させ
ることからなる。このような予備精製を行うことによっ
て、その後の工程において使用されるクロマトグラフィ
ーの材料、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィーに使用
されるゲルを、保存することができる。それによって、
クロマトグラフィーカラムをより長く使用することがで
きるが、この理由のため、本法が、大規模な技術規模に
おける使用に特に適しているのである。
【００３６】ＩｇＧ二量体の分離のためには、アフィニ
ティクロマトグラフィーを、付加的に、例えば固定化プ
ロテインＡ若しくはＧ、又は固相マトリックスに結合さ
せた抗ＩｇＧ抗体上で行うのが好ましい。
ティクロマトグラフィーを、付加的に、例えば固定化プ
ロテインＡ若しくはＧ、又は固相マトリックスに結合さ
せた抗ＩｇＧ抗体上で行うのが好ましい。
【００３７】付加的に行うアフィニティクロマトグラフ
ィーは、工程（ａ）の前、工程（ａ）と工程（ｂ）の
間、及び／又は工程（ｂ）の後に行うことができ、最も
好適には、クロマトグラフィーによる精製の前又は後に
行う。
ィーは、工程（ａ）の前、工程（ａ）と工程（ｂ）の
間、及び／又は工程（ｂ）の後に行うことができ、最も
好適には、クロマトグラフィーによる精製の前又は後に
行う。
【００３８】工程（ｂ）による方法を実施するには、前
の工程において得られた生成物を、溶解した又は固体の
形で使用するのが好適である。固体の形での加熱処理に
は、加熱処理に付す生成物の水分含有率は、好ましく
は、５〜７０重量％である。別の好ましい実施態様にお
いては、凍結乾燥物を、固体の形で使用する。加熱処理
を、工程（ｂ）により行うのであれば、加熱処理は、好
ましくは、４０℃〜８０℃の間の温度、特に５０℃〜６
５℃の間の温度で行う。加熱処理は、少なくともウイル
スの不活性化に十分な期間、好ましくは３０分〜１０時
間の間の期間行う。好ましくは、加熱処理は、特にＥＰ
−Ａ−０１５９３１１記載の方法により、蒸気処理によ
り行う。
の工程において得られた生成物を、溶解した又は固体の
形で使用するのが好適である。固体の形での加熱処理に
は、加熱処理に付す生成物の水分含有率は、好ましく
は、５〜７０重量％である。別の好ましい実施態様にお
いては、凍結乾燥物を、固体の形で使用する。加熱処理
を、工程（ｂ）により行うのであれば、加熱処理は、好
ましくは、４０℃〜８０℃の間の温度、特に５０℃〜６
５℃の間の温度で行う。加熱処理は、少なくともウイル
スの不活性化に十分な期間、好ましくは３０分〜１０時
間の間の期間行う。好ましくは、加熱処理は、特にＥＰ
−Ａ−０１５９３１１記載の方法により、蒸気処理によ
り行う。
【００３９】しかし、加熱処理のほか、ウイルス不活性
化のためのいずれの方法も使用することができる。した
がって、例えば、ＥＰ−１３１７４０記載の溶媒／洗剤
処理又はＥＰ−５００６１記載の洗剤処理を適用するこ
とができる。ウイルス不活性化のための方法として、β
−プロピオラクトンと共に紫外線の照射を含む方法も、
好適である。
化のためのいずれの方法も使用することができる。した
がって、例えば、ＥＰ−１３１７４０記載の溶媒／洗剤
処理又はＥＰ−５００６１記載の洗剤処理を適用するこ
とができる。ウイルス不活性化のための方法として、β
−プロピオラクトンと共に紫外線の照射を含む方法も、
好適である。
【００４０】免疫グロブリン含有画分を、感染性因子不
活性化のための方法に付すための別の方法としては、Ｄ
Ｅ−４４３４５３８に記載されているような、ポリエー
テルの存在下で化学的又は物理的処理を行う方法が有用
である。ポリエーテルとしては、ポリヒドロキシエーテ
ル、例えばポリアルキレングリコール、並びに特にポリ
エチレングリコール及びポリプロピレングリコールを、
この目的のために使用することができる。
活性化のための方法に付すための別の方法としては、Ｄ
Ｅ−４４３４５３８に記載されているような、ポリエー
テルの存在下で化学的又は物理的処理を行う方法が有用
である。ポリエーテルとしては、ポリヒドロキシエーテ
ル、例えばポリアルキレングリコール、並びに特にポリ
エチレングリコール及びポリプロピレングリコールを、
この目的のために使用することができる。
【００４１】病原性因子の不活性化のためには、例え
ば、ＥＰ−２４７９９８記載のトリプシン又はキモトリ
プシンなどの中性ペプチドヒドロラーゼの使用も考慮す
べきである。
ば、ＥＰ−２４７９９８記載のトリプシン又はキモトリ
プシンなどの中性ペプチドヒドロラーゼの使用も考慮す
べきである。
【００４２】加熱処理を、ウイルス不活性化に通例用い
られている一つ又は数種の他の公知の方法、特に紫外線
照射、界面活性剤による処理、及び／又は溶媒／洗剤系
による処理と組み合わせるのも好適である。それによ
り、それぞれの工程を、同時に（例えば、紫外線照射と
同時に加熱処理を行う）又はいかなる順序によっても行
うことができる。
られている一つ又は数種の他の公知の方法、特に紫外線
照射、界面活性剤による処理、及び／又は溶媒／洗剤系
による処理と組み合わせるのも好適である。それによ
り、それぞれの工程を、同時に（例えば、紫外線照射と
同時に加熱処理を行う）又はいかなる順序によっても行
うことができる。
【００４３】加熱処理と、ウイルス不活性化のための一
つ又は数種の方法とを組み合わせることによって、これ
らの異なる不活性化手順において機能する各種作用メカ
ニズムを使用することができ、これにより生成物のウイ
ルスに関する安全性を、更に向上させることができる。
つ又は数種の方法とを組み合わせることによって、これ
らの異なる不活性化手順において機能する各種作用メカ
ニズムを使用することができ、これにより生成物のウイ
ルスに関する安全性を、更に向上させることができる。
【００４４】加熱処理の前に、水に対する透析を、好適
に行うこともできる。この透析には、製剤中に存在する
汚染物質の多くを除去することができるという長所があ
る。更にまた、もし適用可能であれば用いられた、又は
製剤中に存在する安定化物質を、同様に除去することが
できる。
に行うこともできる。この透析には、製剤中に存在する
汚染物質の多くを除去することができるという長所があ
る。更にまた、もし適用可能であれば用いられた、又は
製剤中に存在する安定化物質を、同様に除去することが
できる。
【００４５】工程（ａ）により、ゲル浸透クロマトグラ
フィーを行う場合には、分子の分離は、分子ふるいとし
て機能するゲルを用い、各種分子サイズの相違に基づ
く。したがって、ゲル浸透クロマトグラフィーは、適用
されるイオン強度には、通常は依存しない。ゲル浸透ク
ロマトグラフィーの材料としては、通例使用されている
ゲル浸透クロマトグラフィーのマトリックス、例えば、
スペロース（Superose；登録商標）、セファクリル、セ
ファロース又はセファデックスを使用することができ
る。
フィーを行う場合には、分子の分離は、分子ふるいとし
て機能するゲルを用い、各種分子サイズの相違に基づ
く。したがって、ゲル浸透クロマトグラフィーは、適用
されるイオン強度には、通常は依存しない。ゲル浸透ク
ロマトグラフィーの材料としては、通例使用されている
ゲル浸透クロマトグラフィーのマトリックス、例えば、
スペロース（Superose；登録商標）、セファクリル、セ
ファロース又はセファデックスを使用することができ
る。
【００４６】本発明の方法においては、驚くべきこと
に、ゲル浸透クロマトグラフィーに使用されるある種の
マトリックス上におけるＩｇＡ単量体からのＩｇＧの分
離は、イオン強度にも依存していることが証明されてい
る。このような場合においては、分離されるべき物質と
ゲルマトリックスとの間の付加的な疎水性／親水性及び
／又は静電的相互作用が、役割を果たしている可能性が
あると結論される。
に、ゲル浸透クロマトグラフィーに使用されるある種の
マトリックス上におけるＩｇＡ単量体からのＩｇＧの分
離は、イオン強度にも依存していることが証明されてい
る。このような場合においては、分離されるべき物質と
ゲルマトリックスとの間の付加的な疎水性／親水性及び
／又は静電的相互作用が、役割を果たしている可能性が
あると結論される。
【００４７】したがって、本発明によると、疎水性／親
水性及び／又は静電的ゲル浸透クロマトグラフィーを、
疎水性／親水性及び／又は静電的相互作用と親和性効果
とを同時に有するマトリックスにより行うのが好まし
い。これによりＩｇＧとＩｇＡが非常に良く分離され、
ゲル浸透クロマトグラフィーのために上述したような通
例使用されている材料を使用した場合よりも、驚く程優
れた結果が得られる。
水性及び／又は静電的ゲル浸透クロマトグラフィーを、
疎水性／親水性及び／又は静電的相互作用と親和性効果
とを同時に有するマトリックスにより行うのが好まし
い。これによりＩｇＧとＩｇＡが非常に良く分離され、
ゲル浸透クロマトグラフィーのために上述したような通
例使用されている材料を使用した場合よりも、驚く程優
れた結果が得られる。
【００４８】本発明によるゲル浸透クロマトグラフィー
においては、好ましくは、例えば、スーパーデックス
（Superdex；登録商標）又はスペロース〔いずれもファ
ルマシア（Pharmacia ）社製〕などの、生体分子の高速
タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）に用い
られる架橋アガロースゲルを用いるか、又は合成材料の
ゲルを用いる。
においては、好ましくは、例えば、スーパーデックス
（Superdex；登録商標）又はスペロース〔いずれもファ
ルマシア（Pharmacia ）社製〕などの、生体分子の高速
タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）に用い
られる架橋アガロースゲルを用いるか、又は合成材料の
ゲルを用いる。
【００４９】ゲル浸透クロマトグラフィーの替わりに、
チオフィリッククロマトグラフィーを用いることもで
き、両方の精製法を組み合わせることも可能である。チ
オフィリッククロマトグラフィーに好適な吸着剤は、好
ましくは、いわゆるＴゲルであり、これらは、Ｒ−ＳＯ
2 −ＣＨ2 −若しくはＲ−Ｓ−ＣＨ2 −ＣＨ2 −ＳＯ2
−などの構造を含み、タンパク質のイオウ含有構造に向
けられた合成担体物質又は炭水化物に基づいている。
チオフィリッククロマトグラフィーを用いることもで
き、両方の精製法を組み合わせることも可能である。チ
オフィリッククロマトグラフィーに好適な吸着剤は、好
ましくは、いわゆるＴゲルであり、これらは、Ｒ−ＳＯ
2 −ＣＨ2 −若しくはＲ−Ｓ−ＣＨ2 −ＣＨ2 −ＳＯ2
−などの構造を含み、タンパク質のイオウ含有構造に向
けられた合成担体物質又は炭水化物に基づいている。
【００５０】チオフィリックマトリックス上への血漿又
は血漿画分の吸着、及びそれに続くＩｇＡ単量体を含む
画分の溶離も、ＩｇＡ単量体含有製剤の製造のための好
適な方法を示している。
は血漿画分の吸着、及びそれに続くＩｇＡ単量体を含む
画分の溶離も、ＩｇＡ単量体含有製剤の製造のための好
適な方法を示している。
【００５１】ウイルスに関して安全であるヒトＩｇＡ単
量体としては、実質的にＩｇＧを含まないものが製造さ
れ、使用される。
量体としては、実質的にＩｇＧを含まないものが製造さ
れ、使用される。
【００５２】「実質的にＩｇＧを含まない」とは、全免
疫グロブリンにおけるＩｇＧの比率が、１０重量％未
満、好ましくは５重量％未満、そして特に３重量％未満
であることを意味する。
疫グロブリンにおけるＩｇＧの比率が、１０重量％未
満、好ましくは５重量％未満、そして特に３重量％未満
であることを意味する。
【００５３】ＩｇＡ単量体は、好ましくは、ＩｇＧ二量
体も実質的に含まない。「ＩｇＧ二量体を実質的に含ま
ない」とは、全免疫グロブリンにおけるＩｇＧ二量体の
比率が、５重量％未満、好ましくは３重量％未満、そし
て特に放射免疫拡散法（ＲＩＤ）の検出限界以下である
ことを意味する。
体も実質的に含まない。「ＩｇＧ二量体を実質的に含ま
ない」とは、全免疫グロブリンにおけるＩｇＧ二量体の
比率が、５重量％未満、好ましくは３重量％未満、そし
て特に放射免疫拡散法（ＲＩＤ）の検出限界以下である
ことを意味する。
【００５４】本発明により製造され、使用される、ウイ
ルスに関して安全なヒトＩｇＡ単量体は、好ましくは、
フィブリノーゲン及び／又はプラスミノーゲンを含まな
い。フィブリノーゲン及び／又はプラスミノーゲンを含
まないというのは、これらの汚染物質が、例えば、放射
免疫拡散法（ＲＩＤ）、凝固試験又は繊維素溶解試験な
どの通常の試験によっては検出できないことを意味す
る。このようにして、免疫グロブリンの投与により、生
体に更に負担をかけ得る物質が、本発明による製剤及び
それを含む医薬組成物中には存在しないことが確認され
る。
ルスに関して安全なヒトＩｇＡ単量体は、好ましくは、
フィブリノーゲン及び／又はプラスミノーゲンを含まな
い。フィブリノーゲン及び／又はプラスミノーゲンを含
まないというのは、これらの汚染物質が、例えば、放射
免疫拡散法（ＲＩＤ）、凝固試験又は繊維素溶解試験な
どの通常の試験によっては検出できないことを意味す
る。このようにして、免疫グロブリンの投与により、生
体に更に負担をかけ得る物質が、本発明による製剤及び
それを含む医薬組成物中には存在しないことが確認され
る。
【００５５】本発明により製造され、使用されるＩｇＡ
においては、サブクラスＩｇＡ１及びＩｇＡ２は、好ま
しくは、天然ＩｇＡの組成に対応する比率で存在する。
においては、サブクラスＩｇＡ１及びＩｇＡ２は、好ま
しくは、天然ＩｇＡの組成に対応する比率で存在する。
【００５６】本発明の主題には、本発明による、ウイル
スに関して安全なヒトＩｇＡ単量体を、場合により、通
例使用されている医薬担体及び／又は希釈剤と共に含む
医薬組成物もある。
スに関して安全なヒトＩｇＡ単量体を、場合により、通
例使用されている医薬担体及び／又は希釈剤と共に含む
医薬組成物もある。
【００５７】本発明により製造することのできるＩｇＡ
を使用することによって、安定であり、ウイルスに関し
て安全であり、付加的に加熱処理することのできる医薬
組成物を入手可能とすることが可能となった。
を使用することによって、安定であり、ウイルスに関し
て安全であり、付加的に加熱処理することのできる医薬
組成物を入手可能とすることが可能となった。
【００５８】本医薬組成物は、ＩｇＡに加えて、ＩｇＡ
と適合可能であり、医薬組成物の目的に好適かつ有用で
あるかぎりにおいて、その他の活性成分（活性要素）を
含むことができる。
と適合可能であり、医薬組成物の目的に好適かつ有用で
あるかぎりにおいて、その他の活性成分（活性要素）を
含むことができる。
【００５９】本発明による医薬組成物は、炎症、感染症
及び／又はアレルギーの予防及び治療に特に好適であ
る。
及び／又はアレルギーの予防及び治療に特に好適であ
る。
【００６０】医薬担体及び希釈剤としては、通例使用さ
れる薬剤学的に許容しうる担体及び希釈剤を使用するこ
とができる。
れる薬剤学的に許容しうる担体及び希釈剤を使用するこ
とができる。
【００６１】医薬組成物の製造は、公知の通例使用され
る方法により行われ、意図する投与形態に特に依存する
ものである。
る方法により行われ、意図する投与形態に特に依存する
ものである。
【００６２】ＩｇＡは、局所、粘膜、例えば口腔粘膜、
又は全身的に投与することができる。
又は全身的に投与することができる。
【００６３】投与量は、投与モード及び投与頻度、並び
に障害、例えば炎症の程度及び重症度に依存する。Ｉｇ
Ａを高い総用量で投与する場合、少量ずつ数回に分けて
ＩｇＡを投与するのが好ましいことが多い。投与量及び
投与モードに関するこれらの考察は、当業界における技
術者には、一般的に公知である。
に障害、例えば炎症の程度及び重症度に依存する。Ｉｇ
Ａを高い総用量で投与する場合、少量ずつ数回に分けて
ＩｇＡを投与するのが好ましいことが多い。投与量及び
投与モードに関するこれらの考察は、当業界における技
術者には、一般的に公知である。
【００６４】例えば、ＩｇＡは、３回又はそれ以上に分
けて、経口投与（通常は１〜１０g/日、重症の場合はそ
れ以上）するのが好ましい。
けて、経口投与（通常は１〜１０g/日、重症の場合はそ
れ以上）するのが好ましい。
【００６５】ＩｇＡは、代表的には、例えば、静脈内注
射、持続的注入、又はその両方により、全身的に投与す
るすることができる。代表的には、５０〜２，０００mg
ＩｇＡ/kg/日を投与する。まれではあるが、ＩｇＡ
を、通常は約５０〜１００mgＩｇＡ/kg/日の投与量で、
筋肉内に投与することもできる。
射、持続的注入、又はその両方により、全身的に投与す
るすることができる。代表的には、５０〜２，０００mg
ＩｇＡ/kg/日を投与する。まれではあるが、ＩｇＡ
を、通常は約５０〜１００mgＩｇＡ/kg/日の投与量で、
筋肉内に投与することもできる。
【００６６】免疫グロブリンは、例えば、吸入法（最高
１０ml/ 日、１０〜１００mg ＩｇＡ/ml ）により粘膜
に、又はスプレー若しくは点鼻により鼻に（１５〜２０
０mg/ml ）、又は関節内注射（必要に応じて、１０〜１
００mg ＩｇＡ/ml の溶液を、１〜５ml含む）により投
与することもできる。その他の投与モードとしては、座
剤（１００〜１，０００mg ＩｇＡ／投与）及び経皮プ
ラスターが挙げられる。経皮プラスターは、例えば、皮
膚の炎症を治療するのに使用することができる。
１０ml/ 日、１０〜１００mg ＩｇＡ/ml ）により粘膜
に、又はスプレー若しくは点鼻により鼻に（１５〜２０
０mg/ml ）、又は関節内注射（必要に応じて、１０〜１
００mg ＩｇＡ/ml の溶液を、１〜５ml含む）により投
与することもできる。その他の投与モードとしては、座
剤（１００〜１，０００mg ＩｇＡ／投与）及び経皮プ
ラスターが挙げられる。経皮プラスターは、例えば、皮
膚の炎症を治療するのに使用することができる。
【００６７】このような投与剤型（形態）としては、ウ
イルス感染症の予防及び治療に通例用いられる形態、及
び特に、カプセル、錠剤、顆粒、丸剤、小丸剤及びマイ
クロカプセルなどの経口投与剤型が挙げられ、これらは
腸のウイルス感染症の治療のために、好ましくは通例用
いられる胃液耐性の腸溶性コーティングを施して提供さ
れる。
イルス感染症の予防及び治療に通例用いられる形態、及
び特に、カプセル、錠剤、顆粒、丸剤、小丸剤及びマイ
クロカプセルなどの経口投与剤型が挙げられ、これらは
腸のウイルス感染症の治療のために、好ましくは通例用
いられる胃液耐性の腸溶性コーティングを施して提供さ
れる。
【００６８】更に又、本医薬製剤は、非経口投与に好適
な投与剤型、又は注射若しくは注入に好適な組成物の剤
型で存在することもできる。
な投与剤型、又は注射若しくは注入に好適な組成物の剤
型で存在することもできる。
【００６９】ヒトの予防的及び治療的処置のための、本
発明による医薬組成物の１日当たり投与量は、本発明に
よるＩｇＡ単量体については、１０〜５，０００mgであ
る。しかし、これは特に、患者の全般的状態及び年齢、
及び障害の重症度により決定される。
発明による医薬組成物の１日当たり投与量は、本発明に
よるＩｇＡ単量体については、１０〜５，０００mgであ
る。しかし、これは特に、患者の全般的状態及び年齢、
及び障害の重症度により決定される。
【００７０】
【実施例】以下の実施例は、本発明をより綿密に本発明
を説明するものであるが、本発明を実施例に限定するも
のではない。カラムクロマトグラフィーを示す図におい
ては、いずれの場合もＸ軸は溶離量をmlで示す。以下の
略語を用いた： ＯＤ．．．光学密度 Ｈｐ．．．ハプトグロビンサブユニット ＬＣ．．．Ｌ鎖 ＨＣ．．．Ｈ鎖 Ｍ ．．．単量体 Ｄ ．．．二量体 Ａ ．．．凝集物 ＰＢＳ．．リン酸緩衝食塩水
を説明するものであるが、本発明を実施例に限定するも
のではない。カラムクロマトグラフィーを示す図におい
ては、いずれの場合もＸ軸は溶離量をmlで示す。以下の
略語を用いた： ＯＤ．．．光学密度 Ｈｐ．．．ハプトグロビンサブユニット ＬＣ．．．Ｌ鎖 ＨＣ．．．Ｈ鎖 Ｍ ．．．単量体 Ｄ ．．．二量体 Ａ ．．．凝集物 ＰＢＳ．．リン酸緩衝食塩水
【００７１】実施例１ ヨーロッパ特許出願ＥＰ−０５０６６５１に記載されて
いるように、Cohn II+III 画分をヒト血漿より得、リン
酸酢酸緩衝液により抽出した。得られた物質を、−２℃
の温度で、pH５．３でエタノールと混合して、最終濃度
１２％とし、得られた沈殿物を分離し、−２０℃で貯蔵
した。このペーストを、以下の方法により処理した。１
ml当たり大豆トリプシン阻害剤〔シグマ（Sigma ）社、
セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ；Ｉ−Ｓ型〕１０μg を含
む０．９％ＮａＣｌ溶液を、ぺ−スト１ｇ当たり２５ml
加えた。本ペ−ストを、４℃で一夜攪拌して懸濁し、そ
れによりタンパク質の一部を溶解した。非溶解成分の分
離のために、本懸濁液を、１８，９００×ｇ、４℃で６
０分間遠心分離した。沈殿物は廃棄した。上清を、ヘパ
リンセファロースＣＬ−６Ｂ（Pharmacia-LKB 社、ウプ
サラ、スエーデン）と混合し、４℃で一夜攪拌した。次
に、ゲルを、上清からナイロンフィルター（メッシュサ
イズ８５μm ）により分離した。ゲルを、０．９％Ｎａ
Ｃｌ溶液により２回洗浄した（各回とも、試料の体積の
１／４の溶液を用いた）。上清と洗浄液を合わせた。
いるように、Cohn II+III 画分をヒト血漿より得、リン
酸酢酸緩衝液により抽出した。得られた物質を、−２℃
の温度で、pH５．３でエタノールと混合して、最終濃度
１２％とし、得られた沈殿物を分離し、−２０℃で貯蔵
した。このペーストを、以下の方法により処理した。１
ml当たり大豆トリプシン阻害剤〔シグマ（Sigma ）社、
セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ；Ｉ−Ｓ型〕１０μg を含
む０．９％ＮａＣｌ溶液を、ぺ−スト１ｇ当たり２５ml
加えた。本ペ−ストを、４℃で一夜攪拌して懸濁し、そ
れによりタンパク質の一部を溶解した。非溶解成分の分
離のために、本懸濁液を、１８，９００×ｇ、４℃で６
０分間遠心分離した。沈殿物は廃棄した。上清を、ヘパ
リンセファロースＣＬ−６Ｂ（Pharmacia-LKB 社、ウプ
サラ、スエーデン）と混合し、４℃で一夜攪拌した。次
に、ゲルを、上清からナイロンフィルター（メッシュサ
イズ８５μm ）により分離した。ゲルを、０．９％Ｎａ
Ｃｌ溶液により２回洗浄した（各回とも、試料の体積の
１／４の溶液を用いた）。上清と洗浄液を合わせた。
【００７２】ヘパリンセファロ−スＣＬ−６Ｂに結合し
ない物質を、５０mMリン酸ナトリウム＋１５０mMＮａＣ
ｌからなるpH７．５の緩衝液により予め平衡化しておい
たリシンセファロース４Ｂ（Pharmacia-LKB 社）カラム
（内径＝２．６cm；ゲル５８ml）上に、流速１．３ml/
分で流した。非結合物質を、以降のＩｇＡの単離に用い
た。
ない物質を、５０mMリン酸ナトリウム＋１５０mMＮａＣ
ｌからなるpH７．５の緩衝液により予め平衡化しておい
たリシンセファロース４Ｂ（Pharmacia-LKB 社）カラム
（内径＝２．６cm；ゲル５８ml）上に、流速１．３ml/
分で流した。非結合物質を、以降のＩｇＡの単離に用い
た。
【００７３】（カラムに結合したプラスミノーゲンは、
５０mMリン酸ナトリウム、０．５MＮａＣｌ及び０．２M
イプシロン−アミノカプロン酸からなる、pH７．５の
緩衝液１００mlによる洗浄工程によって、溶離すること
ができる）。
５０mMリン酸ナトリウム、０．５MＮａＣｌ及び０．２M
イプシロン−アミノカプロン酸からなる、pH７．５の
緩衝液１００mlによる洗浄工程によって、溶離すること
ができる）。
【００７４】リシンセファロースと結合しない物質か
ら、硫酸デキストラン（Sigma 社；ナトリウム塩；分子
量約５，０００）による沈殿により、リポタンパク質を
除去した。試料１ml当たり、１０％硫酸デキストラン溶
液０．０８ml及び１M 塩化カルシウム溶液１mlを、これ
に加えた。混合物を、２５〜３０℃で３０分間攪拌し、
次に遠心分離した。沈殿物を廃棄し、カルシウムイオン
を除去するために、上清を、アミコン（Amicon社、ビバ
リー、ＭＡ、ＵＳＡ）スパイラルモジュールＳ１Ｙ３０
クロスフロー（Spiral Module S1Y30 Cross Flow）を用
いて、試料の３倍量の０．９％ＮａＣｌに対して室温で
透析した。
ら、硫酸デキストラン（Sigma 社；ナトリウム塩；分子
量約５，０００）による沈殿により、リポタンパク質を
除去した。試料１ml当たり、１０％硫酸デキストラン溶
液０．０８ml及び１M 塩化カルシウム溶液１mlを、これ
に加えた。混合物を、２５〜３０℃で３０分間攪拌し、
次に遠心分離した。沈殿物を廃棄し、カルシウムイオン
を除去するために、上清を、アミコン（Amicon社、ビバ
リー、ＭＡ、ＵＳＡ）スパイラルモジュールＳ１Ｙ３０
クロスフロー（Spiral Module S1Y30 Cross Flow）を用
いて、試料の３倍量の０．９％ＮａＣｌに対して室温で
透析した。
【００７５】固体状の硫酸アンモニウムを、攪拌しなが
ら、透析した物質に加え、最終濃度２M とした。次に、
攪拌を３０分間続け、形成された沈殿物を、１，５４０
×ｇ、４℃で遠心分離した（上清は廃棄した）。
ら、透析した物質に加え、最終濃度２M とした。次に、
攪拌を３０分間続け、形成された沈殿物を、１，５４０
×ｇ、４℃で遠心分離した（上清は廃棄した）。
【００７６】沈殿物を、pH７．４のリン酸緩衝等張食塩
水（以降、ＰＢＳと略す）に再懸濁し、アミコンスパイ
ラルモジュールＳ１Ｙ３０クロスフローを用いて、試料
の３倍量のＰＢＳに対して、室温で透析した。透析した
物質を、遠心分離により澄明にし、ヒドロキシアパタイ
トカラム〔バイオラッド（BioRad）社、リッチモンド、
ＣＡ、ＵＳＡ；マクロプレップセラミックヒドロキシア
パタイト（macro prepceramic hydroxyapatite ）; ２
０μ；ゲル５０ml；内径＝２．６cm〕を用いて分離し
た。２ml/ 分の流速で、１回当たり２００mlの試料を、
緩衝液Ａ（ＰＢＳ、pH７．４）により平衡化したカラム
に適用した。ＩｇＡは、ヒドロキシアパタイトに結合
し、これは、pH６．８のＰＢＳ中緩衝液Ｂ（１５mMＮａ
Ｈ2 ＰＯ4 ／Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）１４０mlにより、溶離す
ることができた。
水（以降、ＰＢＳと略す）に再懸濁し、アミコンスパイ
ラルモジュールＳ１Ｙ３０クロスフローを用いて、試料
の３倍量のＰＢＳに対して、室温で透析した。透析した
物質を、遠心分離により澄明にし、ヒドロキシアパタイ
トカラム〔バイオラッド（BioRad）社、リッチモンド、
ＣＡ、ＵＳＡ；マクロプレップセラミックヒドロキシア
パタイト（macro prepceramic hydroxyapatite ）; ２
０μ；ゲル５０ml；内径＝２．６cm〕を用いて分離し
た。２ml/ 分の流速で、１回当たり２００mlの試料を、
緩衝液Ａ（ＰＢＳ、pH７．４）により平衡化したカラム
に適用した。ＩｇＡは、ヒドロキシアパタイトに結合
し、これは、pH６．８のＰＢＳ中緩衝液Ｂ（１５mMＮａ
Ｈ2 ＰＯ4 ／Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）１４０mlにより、溶離す
ることができた。
【００７７】緩衝液Ｂによりヒドロキシアパタイトから
溶離された物質を、アミコンスパイラルモジュールＳ１
Ｙ３０Ａクロスフローを用いて、試料の３倍量のpH５．
０の５０mM酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液に対して室温で
透析した。
溶離された物質を、アミコンスパイラルモジュールＳ１
Ｙ３０Ａクロスフローを用いて、試料の３倍量のpH５．
０の５０mM酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液に対して室温で
透析した。
【００７８】透析した物質を、一括工程（バッチ方法）
により、アニオン交換体と混合した。タンパク質１０mg
当たり２mlのゲル懸濁液が存在するように、イオン交換
体〔フラクトゲル（Fractogel ；登録商標）ＥＭＤ Ｔ
ＭＡＥ６５０（Ｓ）；粒子径０．０２〜０．０４mm；メ
ルク（Merck ）社、ダルムシュタット、ドイツ；pH５．
０の５０mM酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液中、１：２で懸
濁）を試料に加えた。懸濁液を４℃で一夜攪拌した。非
結合物質をブフナー漏斗により分離し、ゲルをpH５．０
の５０mM酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液により２回洗浄し
た。次にゲルを、pH６．０の５０mM酢酸ナトリウム／酢
酸＋８０mMＮａＣｌにより、４℃で２時間攪拌した。次
に、ゲルを、ブフナー漏斗を用いてタンパク質から分離
した。
により、アニオン交換体と混合した。タンパク質１０mg
当たり２mlのゲル懸濁液が存在するように、イオン交換
体〔フラクトゲル（Fractogel ；登録商標）ＥＭＤ Ｔ
ＭＡＥ６５０（Ｓ）；粒子径０．０２〜０．０４mm；メ
ルク（Merck ）社、ダルムシュタット、ドイツ；pH５．
０の５０mM酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液中、１：２で懸
濁）を試料に加えた。懸濁液を４℃で一夜攪拌した。非
結合物質をブフナー漏斗により分離し、ゲルをpH５．０
の５０mM酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液により２回洗浄し
た。次にゲルを、pH６．０の５０mM酢酸ナトリウム／酢
酸＋８０mMＮａＣｌにより、４℃で２時間攪拌した。次
に、ゲルを、ブフナー漏斗を用いてタンパク質から分離
した。
【００７９】溶離した物質を、ジアフロ（Diaflo）限外
ろ過膜ＹＭ３０を装備したアミコンスタードセル（Amic
on stirred cell ）により濃縮し、タンパク質濃度１０
mg/ml とした。
ろ過膜ＹＭ３０を装備したアミコンスタードセル（Amic
on stirred cell ）により濃縮し、タンパク質濃度１０
mg/ml とした。
【００８０】この物質を、スーパーデックス２００プレ
ップグレード（prep grade）ＨＲ３５／６００（Pharma
cia-LKB 社）カラムを用い、ゲルろ過により、本発明に
より分離した。各分離ごとに、試料１０mlを、pH７．４
のＰＢＳにより平衡化したゲルに、流速２．５ml/ 分で
適用し、アイソクラチックに（isocratically ）溶離し
た。このカラムを用いたことにより、まだ存在している
ＩｇＧの大部分とその他の汚染成分を、ＩｇＡから除去
することができた（図１に、スーパーデックス２００Ｈ
Ｒ３５／６００によるゲルろ過を示す）。ＩｇＡ含有画
分を集め、合わせ、更に、プロテインＧセファロース４
ファストフロー（Sepharose 4 fast flow ）（Pharmaci
a-LKB 社；pH７．４のＰＢＳにより平衡化）により処理
した。試料５０ml当たりゲル１mlを用い、このアフィニ
ティクロマトグラフィーを一括工程（バッチ方法）によ
り行った。懸濁液を、４℃で一夜攪拌した。遠心分離に
より、ゲルを試料から分離し、ＰＢＳにより２回洗浄し
た。上清及び洗浄液を合わせ、透析バッグ〔スペクトラ
ポア（Spectrapor） MWCO 12,000-14,000 〕中で蒸留水
に対して透析した。
ップグレード（prep grade）ＨＲ３５／６００（Pharma
cia-LKB 社）カラムを用い、ゲルろ過により、本発明に
より分離した。各分離ごとに、試料１０mlを、pH７．４
のＰＢＳにより平衡化したゲルに、流速２．５ml/ 分で
適用し、アイソクラチックに（isocratically ）溶離し
た。このカラムを用いたことにより、まだ存在している
ＩｇＧの大部分とその他の汚染成分を、ＩｇＡから除去
することができた（図１に、スーパーデックス２００Ｈ
Ｒ３５／６００によるゲルろ過を示す）。ＩｇＡ含有画
分を集め、合わせ、更に、プロテインＧセファロース４
ファストフロー（Sepharose 4 fast flow ）（Pharmaci
a-LKB 社；pH７．４のＰＢＳにより平衡化）により処理
した。試料５０ml当たりゲル１mlを用い、このアフィニ
ティクロマトグラフィーを一括工程（バッチ方法）によ
り行った。懸濁液を、４℃で一夜攪拌した。遠心分離に
より、ゲルを試料から分離し、ＰＢＳにより２回洗浄し
た。上清及び洗浄液を合わせ、透析バッグ〔スペクトラ
ポア（Spectrapor） MWCO 12,000-14,000 〕中で蒸留水
に対して透析した。
【００８１】この方法により得られた最終生成物を分析
した。
した。
【００８２】ゲルろ過による分析を、流速０．５ml/ 分
でランニング緩衝液としてＰＢＳを用いた分析用スーパ
ーデックス２００ＨＲ１０／３０ＦＰＬＣカラム（Phar
macia-LKB 社）により行った。光学密度（ＯＤ）は、フ
ロースルーセル（flow-through cell ）中、２８０nmで
測定し、溶離体積（ml）に対して記録した。
でランニング緩衝液としてＰＢＳを用いた分析用スーパ
ーデックス２００ＨＲ１０／３０ＦＰＬＣカラム（Phar
macia-LKB 社）により行った。光学密度（ＯＤ）は、フ
ロースルーセル（flow-through cell ）中、２８０nmで
測定し、溶離体積（ml）に対して記録した。
【００８３】図２に示した分析結果により、最終生成物
は、主として、ＩｇＡ単量体、及び溶液中でＩｇＡ単量
体から形成された少量のＩｇＡ二量体５〜１０％からな
るものであった。
は、主として、ＩｇＡ単量体、及び溶液中でＩｇＡ単量
体から形成された少量のＩｇＡ二量体５〜１０％からな
るものであった。
【００８４】ＩｇＡ凝集物は、２％未満で存在した。＞
５mg/ml に濃縮されたＩｇＡ溶液中では、ＩｇＧは、放
射免疫拡散法によっては検出されず、これは、ＲＩＤプ
レートデンシトメトリーの感度限界に基づき、０．０２
５mg/ml 未満のＩｇＧが存在していることを示す。した
がって、本発明により得られた最終生成物は、１％未満
のＩｇＧを含有する。プラスミノーゲン及びフィブリノ
ーゲンも又、検出されなかった（表１）。出発物質（Ｎ
ａＣｌ抽出ペースト）に関するＩｇＡの収率は、７〜１
２％に達した。
５mg/ml に濃縮されたＩｇＡ溶液中では、ＩｇＧは、放
射免疫拡散法によっては検出されず、これは、ＲＩＤプ
レートデンシトメトリーの感度限界に基づき、０．０２
５mg/ml 未満のＩｇＧが存在していることを示す。した
がって、本発明により得られた最終生成物は、１％未満
のＩｇＧを含有する。プラスミノーゲン及びフィブリノ
ーゲンも又、検出されなかった（表１）。出発物質（Ｎ
ａＣｌ抽出ペースト）に関するＩｇＡの収率は、７〜１
２％に達した。
【００８５】表１ ＩｇＡの精製結果（出発物質は、Cohn画分II+IIIから１
２％エタノールにより沈殿し、０．９％ＮａＣｌにより
抽出されたペーストである）。ＩｇＡ、ＩｇＧ及びプラ
スミノーゲンは、放射免疫拡散法（Mancini, G., Carbo
nara, A.O., Heremans, J.F., Immunochemistry 2 〔19
65〕235-254 ）により分析し；フィブリノーゲンは、オ
クタロニー法（Acta Path. Microbiol. Scand.26 〔194
9〕507-515 ）により検出した。
２％エタノールにより沈殿し、０．９％ＮａＣｌにより
抽出されたペーストである）。ＩｇＡ、ＩｇＧ及びプラ
スミノーゲンは、放射免疫拡散法（Mancini, G., Carbo
nara, A.O., Heremans, J.F., Immunochemistry 2 〔19
65〕235-254 ）により分析し；フィブリノーゲンは、オ
クタロニー法（Acta Path. Microbiol. Scand.26 〔194
9〕507-515 ）により検出した。
【００８６】
【表１】
【００８７】実施例２ 実施例１に記載したように、０．９％ＮａＣｌ中で攪拌
することによって、Cohn画分II+IIIから１２％エタノー
ルにより沈殿したペーストから、抽出物を得た。
することによって、Cohn画分II+IIIから１２％エタノー
ルにより沈殿したペーストから、抽出物を得た。
【００８８】固体状硫酸アンモニウムを加えることによ
って、抽出物を沈殿させた。溶液の最終硫酸アンモニウ
ム濃度は、２M であった。沈殿物を、１，５４０×ｇ、
４℃で１０分間遠心分離した。上清は廃棄した。沈殿物
を、ＰＢＳに溶解し、出発時の容量に調節した。
って、抽出物を沈殿させた。溶液の最終硫酸アンモニウ
ム濃度は、２M であった。沈殿物を、１，５４０×ｇ、
４℃で１０分間遠心分離した。上清は廃棄した。沈殿物
を、ＰＢＳに溶解し、出発時の容量に調節した。
【００８９】次に、０．９％ＮａＣｌ溶液に対して透析
を行った（透析バッグ：スペクトラポアＭＷＣＯ １２
〜１４kD）。透析された物質は、遠心分離、及び０．２
μmのフィルターによるろ過により、清澄化した。
を行った（透析バッグ：スペクトラポアＭＷＣＯ １２
〜１４kD）。透析された物質は、遠心分離、及び０．２
μmのフィルターによるろ過により、清澄化した。
【００９０】この方法により前処理を行った試料（２ml
のアリコート）を、本発明によりスーパーデックス２０
０プレップグレード（prep grade）ＨＲ１６／６０カラ
ムにより分離し、ＩｇＡ含有画分を単離した。
のアリコート）を、本発明によりスーパーデックス２０
０プレップグレード（prep grade）ＨＲ１６／６０カラ
ムにより分離し、ＩｇＡ含有画分を単離した。
【００９１】本発明により単離した試料を、還元条件下
で、ＳＤＳゲル電気泳動（Laemmli,Nature 227 〔197
0〕680-685 ）により分析した。ゲルを、クマシーブリ
リアントブルーによるタンパク質染色に付し、ビデオデ
ンシトメーター（BioRad社）により評価した。バンドの
強度（ＯＤ）を、ゲル中の分離長（mm）に対して記録し
た。主要バンドは、ＩｇＡのＨ鎖及びＬ鎖を示す（図３
に、ＳＤＳゲル電気泳動のデンシトメトリーによる評価
を示し；「ＬＣ」は、Ｌ鎖であり、「ＨＣ」は、Ｈ鎖で
ある）。ＩｇＧのＨ鎖が少量（ＩｇＡの＜１０％）観察
された。残存するＩｇＧは、次にプロテインＧセファロ
ース処理を行うことによって除去することができた。
で、ＳＤＳゲル電気泳動（Laemmli,Nature 227 〔197
0〕680-685 ）により分析した。ゲルを、クマシーブリ
リアントブルーによるタンパク質染色に付し、ビデオデ
ンシトメーター（BioRad社）により評価した。バンドの
強度（ＯＤ）を、ゲル中の分離長（mm）に対して記録し
た。主要バンドは、ＩｇＡのＨ鎖及びＬ鎖を示す（図３
に、ＳＤＳゲル電気泳動のデンシトメトリーによる評価
を示し；「ＬＣ」は、Ｌ鎖であり、「ＨＣ」は、Ｈ鎖で
ある）。ＩｇＧのＨ鎖が少量（ＩｇＡの＜１０％）観察
された。残存するＩｇＧは、次にプロテインＧセファロ
ース処理を行うことによって除去することができた。
【００９２】上述の方法により、出発物質を、本発明に
よるゲルろ過法により直接清澄化した後に、ＩｇＡを単
離することが可能であった。
よるゲルろ過法により直接清澄化した後に、ＩｇＡを単
離することが可能であった。
【００９３】出発物質（ＮａＣｌ抽出ペースト）に対す
るＩｇＡの収率は、約３８％に達した。
るＩｇＡの収率は、約３８％に達した。
【００９４】実施例３ ヒト血漿のプール（少なくとも１，０００人のドナー）
を、ＩｇＡ単離の出発物質として使用した。
を、ＩｇＡ単離の出発物質として使用した。
【００９５】−２０℃で貯蔵した血漿プ−ル８００mlを
解凍し、沈殿物（低温沈殿物）を分離し、上清を、高速
遠心分離により清澄化した。清澄化された上清を、等量
の１４％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）
（１４重量％、pH８．０の０．１００M Ｔｒｉｓ、０．
１５０M ＮａＣｌに溶解）と混合し、４℃で１６時間攪
拌し（ＰＥＧの最終濃度は、７％に達した）、次に２０
分間遠心分離した（１８，９００×ｇ、４℃）。pH６．
５の０．１０M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５０MＮａＣ
ｌ緩衝液を含む緩衝液中、２１％（W/V ）ＰＥＧ６００
０により、上清のＰＥＧ最終濃度を１４％とし、再び４
℃で１６時間攪拌し、更に一回遠心分離した（６，００
０×ｇ、２０分、４℃）。沈殿物を、０．１M Ｔｒｉ
ｓ、０．１５M ＮａＣｌ−ＨＣｌ緩衝液（pH８．０）３
００〜３５０mlに溶解し、各回に再蒸留水５L を用いて
４回透析した〔４℃、排除限界５０キロダルトン（kD）
の透析バッグ〕。透析液を、遠心分離により清澄化し
た。沈殿した物質は廃棄した。
解凍し、沈殿物（低温沈殿物）を分離し、上清を、高速
遠心分離により清澄化した。清澄化された上清を、等量
の１４％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）
（１４重量％、pH８．０の０．１００M Ｔｒｉｓ、０．
１５０M ＮａＣｌに溶解）と混合し、４℃で１６時間攪
拌し（ＰＥＧの最終濃度は、７％に達した）、次に２０
分間遠心分離した（１８，９００×ｇ、４℃）。pH６．
５の０．１０M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５０MＮａＣ
ｌ緩衝液を含む緩衝液中、２１％（W/V ）ＰＥＧ６００
０により、上清のＰＥＧ最終濃度を１４％とし、再び４
℃で１６時間攪拌し、更に一回遠心分離した（６，００
０×ｇ、２０分、４℃）。沈殿物を、０．１M Ｔｒｉ
ｓ、０．１５M ＮａＣｌ−ＨＣｌ緩衝液（pH８．０）３
００〜３５０mlに溶解し、各回に再蒸留水５L を用いて
４回透析した〔４℃、排除限界５０キロダルトン（kD）
の透析バッグ〕。透析液を、遠心分離により清澄化し
た。沈殿した物質は廃棄した。
【００９６】pH７．６の３M 硫酸アンモニウム、０．０
４０M Ｔｒｉｓ、酢酸により、この遠心分離物の上清の
硫酸アンモニウムの最終濃度を２M とした。次に、４℃
で１時間攪拌し、再び遠心分離した（１９，８００×
ｇ、２０分間、４℃）。沈殿物を、生理食塩水１５０〜
１７０mlに溶解し、排除限界１２〜１４kDの透析バッグ
中、４℃で１６時間、等張塩化ナトリウム５L を用いて
２回透析を行った。本溶液中の硫酸亜鉛濃度を、２．５
M ＺｎＳＯ4 （蒸留水に溶解）を透析液に徐々に添加す
ることによって、０．１００M とした。同時に、蒸留水
に溶解した１M Ｎａ2 ＣＯ3 を添加することによって、
pHを６〜８（好ましくは７）に保持した。次に、２５℃
で２時間攪拌し、遠心分離した。沈殿物は廃棄した。上
清を、再蒸留水に対して４℃で３回透析した。
４０M Ｔｒｉｓ、酢酸により、この遠心分離物の上清の
硫酸アンモニウムの最終濃度を２M とした。次に、４℃
で１時間攪拌し、再び遠心分離した（１９，８００×
ｇ、２０分間、４℃）。沈殿物を、生理食塩水１５０〜
１７０mlに溶解し、排除限界１２〜１４kDの透析バッグ
中、４℃で１６時間、等張塩化ナトリウム５L を用いて
２回透析を行った。本溶液中の硫酸亜鉛濃度を、２．５
M ＺｎＳＯ4 （蒸留水に溶解）を透析液に徐々に添加す
ることによって、０．１００M とした。同時に、蒸留水
に溶解した１M Ｎａ2 ＣＯ3 を添加することによって、
pHを６〜８（好ましくは７）に保持した。次に、２５℃
で２時間攪拌し、遠心分離した。沈殿物は廃棄した。上
清を、再蒸留水に対して４℃で３回透析した。
【００９７】この物質（表２中、「硫酸亜鉛上清」とし
て記載されている）は、ＩｇＡ及びハプトグロビンをほ
ぼ等量含み、ＩｇＧは残存していなかった。
て記載されている）は、ＩｇＡ及びハプトグロビンをほ
ぼ等量含み、ＩｇＧは残存していなかった。
【００９８】表２ 放射免疫拡散分析により求めた、各精製工程における生
成物中のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びハプトグロビン
（Ｈｐ）の（総タンパク質に対する）分布％、及びＩｇ
Ａの収率（出発物質に対する％で表示）。個別に行った
５回までの試験により求めた範囲を示す。
成物中のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びハプトグロビン
（Ｈｐ）の（総タンパク質に対する）分布％、及びＩｇ
Ａの収率（出発物質に対する％で表示）。個別に行った
５回までの試験により求めた範囲を示す。
【００９９】
【表２】
【０１００】１％リバノール（Rivanol ；登録商標）
（６，９−ジアミノ−２−エトキシアクリジン ラクテ
ートを再蒸留水に溶解したもの）により、硫酸亜鉛によ
る沈殿後に透析を行った物質の最終リバノール濃度を、
０．１％（w/v ）とした。反応の間、pHは低下した。
０．０１０M ＮａＯＨにより、混合物のpHを、７．８〜
８．０に保持した。その後、室温で１時間攪拌し、遠心
分離した。沈殿物は廃棄した。上清を、再蒸留水に対し
て４℃で３〜６回透析した。透析液を、限外ろ過により
〔好ましくは、アミコンＹＭ１０膜、Amicon社、ビバリ
ー、ＭＡ、ＵＳＡを装備したアミコンスターセル（Amic
on Stir Cell）中で〕濃縮した。
（６，９−ジアミノ−２−エトキシアクリジン ラクテ
ートを再蒸留水に溶解したもの）により、硫酸亜鉛によ
る沈殿後に透析を行った物質の最終リバノール濃度を、
０．１％（w/v ）とした。反応の間、pHは低下した。
０．０１０M ＮａＯＨにより、混合物のpHを、７．８〜
８．０に保持した。その後、室温で１時間攪拌し、遠心
分離した。沈殿物は廃棄した。上清を、再蒸留水に対し
て４℃で３〜６回透析した。透析液を、限外ろ過により
〔好ましくは、アミコンＹＭ１０膜、Amicon社、ビバリ
ー、ＭＡ、ＵＳＡを装備したアミコンスターセル（Amic
on Stir Cell）中で〕濃縮した。
【０１０１】透析を行ったリバノール上清を、カチオン
交換体（Ｓ−セファロースファストフロー（S-Sepharos
e fast flow; Pharmacia-LKB社）によるバッチ処理に付
した。
交換体（Ｓ−セファロースファストフロー（S-Sepharos
e fast flow; Pharmacia-LKB社）によるバッチ処理に付
した。
【０１０２】Ｓ−セファロースファストフローの前処
理：ゲル懸濁液４mlを、pH８．０の０．２００M Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液６mlと混合し、遠心分離した。ゲル
を、pH８．０の０．０１０M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液５
０ml中に再懸濁し、遠心分離することによって、洗浄
し、pH８．０の０．０１M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中、懸濁液
（ゲル１部、緩衝液１部）として貯蔵した。使用前に、
懸濁液の一部を遠心分離し、上清を廃棄し、得られたゲ
ルを吸着試験に使用した。
理：ゲル懸濁液４mlを、pH８．０の０．２００M Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液６mlと混合し、遠心分離した。ゲル
を、pH８．０の０．０１０M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液５
０ml中に再懸濁し、遠心分離することによって、洗浄
し、pH８．０の０．０１M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中、懸濁液
（ゲル１部、緩衝液１部）として貯蔵した。使用前に、
懸濁液の一部を遠心分離し、上清を廃棄し、得られたゲ
ルを吸着試験に使用した。
【０１０３】リバノール上清５mlを、２M Ｔｒｉｓ−Ｂ
ａｓｅにより、pH８に調節した。この物質を、Ｓ−セフ
ァロースファストフローゲル０．５mlと混合した。４℃
で（振とうしながら）２時間保温した後、混合物を遠心
分離し、上清を更に、ゲルろ過により精製した。上清の
２mlのアリコートを、スーパーデックス２００プレップ
グレードＨＲ１６／６０ＦＰＬＣカラム（Pharmacia-LK
B 社）を用いて、クロマトグラフィーに付した。ＩｇＡ
含有画分を集め、水に対して透析した。この物質は、放
射免疫拡散分析によると、少なくとも９８％のＩｇＡを
含有していた。ＩｇＧ及びハプトグロビンは、検出する
ことができなかった（＜２％）。
ａｓｅにより、pH８に調節した。この物質を、Ｓ−セフ
ァロースファストフローゲル０．５mlと混合した。４℃
で（振とうしながら）２時間保温した後、混合物を遠心
分離し、上清を更に、ゲルろ過により精製した。上清の
２mlのアリコートを、スーパーデックス２００プレップ
グレードＨＲ１６／６０ＦＰＬＣカラム（Pharmacia-LK
B 社）を用いて、クロマトグラフィーに付した。ＩｇＡ
含有画分を集め、水に対して透析した。この物質は、放
射免疫拡散分析によると、少なくとも９８％のＩｇＡを
含有していた。ＩｇＧ及びハプトグロビンは、検出する
ことができなかった（＜２％）。
【０１０４】また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（還元条件、Laemmli の系による）及びその後行
ったデンシトメトリー（実施例２に記載）によっても、
ＩｇＡのＨ鎖とＬ鎖のバンドのみが示された（図４で
は、「ＩｇＡ」及び／又は「ＩｇＧ」は、ＩｇＡ及び／
又はＩｇＧのＨ鎖の位置を示し；「Ｈｐ」及び／又は
「Ｉｇ−ＬＣ」は、ハプトグロビンサブユニット及び／
又は免疫グロブリンのＬ鎖の位置を示す）。
気泳動（還元条件、Laemmli の系による）及びその後行
ったデンシトメトリー（実施例２に記載）によっても、
ＩｇＡのＨ鎖とＬ鎖のバンドのみが示された（図４で
は、「ＩｇＡ」及び／又は「ＩｇＧ」は、ＩｇＡ及び／
又はＩｇＧのＨ鎖の位置を示し；「Ｈｐ」及び／又は
「Ｉｇ−ＬＣ」は、ハプトグロビンサブユニット及び／
又は免疫グロブリンのＬ鎖の位置を示す）。
【０１０５】実施例４ ヨーロッパ特許出願ＥＰ−０５０６６５１に記載されて
いるように、Cohn画分II+IIIを、リン酸酢酸緩衝液によ
り抽出したヒト血漿から得た。この物質を、−２℃、pH
５．３でエタノールと混合し、濃度１２％とした。この
手順により形成された沈殿物を除去した。上清を、上記
したようにアニオン交換体により処理した。
いるように、Cohn画分II+IIIを、リン酸酢酸緩衝液によ
り抽出したヒト血漿から得た。この物質を、−２℃、pH
５．３でエタノールと混合し、濃度１２％とした。この
手順により形成された沈殿物を除去した。上清を、上記
したようにアニオン交換体により処理した。
【０１０６】タンパク質の結合したアニオン交換体を、
更に、本発明により処理した。ペースト１００ｇを蒸留
水１，０００mlに懸濁し、ブフナー漏斗によりろ過し
た。
更に、本発明により処理した。ペースト１００ｇを蒸留
水１，０００mlに懸濁し、ブフナー漏斗によりろ過し
た。
【０１０７】保持されたゲル物質を、蒸留水２L により
洗浄した。洗浄したゲル物質を、０．５M ＮａＣｌ（蒸
留水に溶解）３００mlと混合し、４℃で１０分間保温し
て、次に遠心分離した。
洗浄した。洗浄したゲル物質を、０．５M ＮａＣｌ（蒸
留水に溶解）３００mlと混合し、４℃で１０分間保温し
て、次に遠心分離した。
【０１０８】上清（表３中、「ＮａＣｌ抽出物」として
示す）を保持し、滅菌ろ過した。
示す）を保持し、滅菌ろ過した。
【０１０９】抽出物を、等量の、pH６．０の２M 硫酸ア
ンモニウム、０．１M 酢酸ナトリウム溶液と混合し、硫
酸アンモニウム濃度が１M であるこの混合物を、チオフ
ィリッククロマトグラフィーカラムに付した。
ンモニウム、０．１M 酢酸ナトリウム溶液と混合し、硫
酸アンモニウム濃度が１M であるこの混合物を、チオフ
ィリッククロマトグラフィーカラムに付した。
【０１１０】カラム（Pharmacia-LKB 社製のＸＲ−１６
／２０型）に、Ａｆｆｉ−Ｔチオフィリックアガロース
〔ケム・エン・ティー（Kem-En-Tee）社、コペンハーゲ
ン、デンマーク〕３０mlを充填し、pH６．０の１M 硫酸
アンモニウム、０．０５M 酢酸ナトリウム溶液により平
衡化した。
／２０型）に、Ａｆｆｉ−Ｔチオフィリックアガロース
〔ケム・エン・ティー（Kem-En-Tee）社、コペンハーゲ
ン、デンマーク〕３０mlを充填し、pH６．０の１M 硫酸
アンモニウム、０．０５M 酢酸ナトリウム溶液により平
衡化した。
【０１１１】混合物を、流速０．８〜１．０ml/ 分で、
カラムに流した。非結合タンパク質を、pH６．０の１M
硫酸アンモニウム、０．０５M 酢酸１２０mlにより洗浄
した。次に、ＩｇＡ含有画分を、pH６．０の０．６M 硫
酸アンモニウム、０．０３M酢酸１２０mlにより溶離し
た。まだ結合した状態の残存タンパク質を、pH８．０の
５０mMＴｒｉｓ １２０mlにより洗浄し、カラムを、１
M 硫酸アンモニウム、０．０５M 酢酸により、再び平衡
化した。
カラムに流した。非結合タンパク質を、pH６．０の１M
硫酸アンモニウム、０．０５M 酢酸１２０mlにより洗浄
した。次に、ＩｇＡ含有画分を、pH６．０の０．６M 硫
酸アンモニウム、０．０３M酢酸１２０mlにより溶離し
た。まだ結合した状態の残存タンパク質を、pH８．０の
５０mMＴｒｉｓ １２０mlにより洗浄し、カラムを、１
M 硫酸アンモニウム、０．０５M 酢酸により、再び平衡
化した。
【０１１２】０．６M 硫酸アンモニウムにより溶離した
画分を、カットオフ値が５０kDである透析バッグ中、蒸
留水に対して３回透析した。
画分を、カットオフ値が５０kDである透析バッグ中、蒸
留水に対して３回透析した。
【０１１３】透析した物質（表３中、「硫酸アンモニウ
ム溶離物」として示す）を、遠心分離により、約３mg/m
l まで濃縮し、１０mlのアリコートで、ゲルろ過カラム
（スーパーデックスＳ２００プレップグレードＨＲ３５
／６００、Pharmacia-LKB 社）によるクロマトグラフィ
ーに付した。
ム溶離物」として示す）を、遠心分離により、約３mg/m
l まで濃縮し、１０mlのアリコートで、ゲルろ過カラム
（スーパーデックスＳ２００プレップグレードＨＲ３５
／６００、Pharmacia-LKB 社）によるクロマトグラフィ
ーに付した。
【０１１４】ＩｇＡ含有画分を集めてプールし、ＰＢＳ
に対して数回透析した。
に対して数回透析した。
【０１１５】ＩｇＡの収率は、「ＮａＣｌ抽出物」のＩ
ｇＡ含有率と比較して、約２２〜３０％であった（表
３）。
ｇＡ含有率と比較して、約２２〜３０％であった（表
３）。
【０１１６】本発明により精製した物質は、放射免疫拡
散分析により測定したところ、最高９５％のＩｇＡを含
んでいた（表３）。図５に、Laemmli の系による還元さ
れた試料のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
と、その後のゲルのデンシトメトリー（実施例２に記
載）とを示す。ＩｇＡのＨ鎖（「ＩｇＡ−ＨＣ」）及び
Ｌ鎖（「ＩｇＡ−ＬＣ」）に特徴的なバンドのみが確認
された。
散分析により測定したところ、最高９５％のＩｇＡを含
んでいた（表３）。図５に、Laemmli の系による還元さ
れた試料のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
と、その後のゲルのデンシトメトリー（実施例２に記
載）とを示す。ＩｇＡのＨ鎖（「ＩｇＡ−ＨＣ」）及び
Ｌ鎖（「ＩｇＡ−ＬＣ」）に特徴的なバンドのみが確認
された。
【０１１７】純度が＞９９％であるＩｇＡは、一括工程
（バッチ工程）により、プロテインＧセファロースファ
ストフロー（Pharmacia-LKB 社）による処理を更に行う
ことによって、単離することができた。
（バッチ工程）により、プロテインＧセファロースファ
ストフロー（Pharmacia-LKB 社）による処理を更に行う
ことによって、単離することができた。
【０１１８】プロテインＧセファロースファストフロー
の量は、バッチ中にまだ含まれるＩｇＧ１０mg当たり、
ゲル物質が１ml存在するように、調節した。振とうしな
がら３〜６時間保温した後、ＩｇＧの結合したプロテイ
ンＧセファロースを、遠心分離により分離した。上清
を、蒸留水に対して透析した。
の量は、バッチ中にまだ含まれるＩｇＧ１０mg当たり、
ゲル物質が１ml存在するように、調節した。振とうしな
がら３〜６時間保温した後、ＩｇＧの結合したプロテイ
ンＧセファロースを、遠心分離により分離した。上清
を、蒸留水に対して透析した。
【０１１９】この最終生成物も、分析用スーパーデック
ス２００ＨＲ１０／３０ゲルろ過カラムを用いて分析し
た（実施例１に記載の方法）。これは、大部分がＩｇＡ
単量体からなり、少量（５〜１０％）のＩｇＡ二量体も
含んでいた（図６；「Ｄ」＝ＩｇＡ二量体、「Ｍ」＝Ｉ
ｇＡ一量体、「Ａ」＝凝集物）。ＩｇＡ凝集物は、存在
しても＜２％程であった。本発明により製造された最終
生成物中には、放射免疫拡散法によっては、ＩｇＧは検
出することができなかった。用いた方法の感度限界に基
づくと、これは、このＩｇＡ製剤中、ＩｇＧが１％未満
しか存在していないことを意味している。
ス２００ＨＲ１０／３０ゲルろ過カラムを用いて分析し
た（実施例１に記載の方法）。これは、大部分がＩｇＡ
単量体からなり、少量（５〜１０％）のＩｇＡ二量体も
含んでいた（図６；「Ｄ」＝ＩｇＡ二量体、「Ｍ」＝Ｉ
ｇＡ一量体、「Ａ」＝凝集物）。ＩｇＡ凝集物は、存在
しても＜２％程であった。本発明により製造された最終
生成物中には、放射免疫拡散法によっては、ＩｇＧは検
出することができなかった。用いた方法の感度限界に基
づくと、これは、このＩｇＡ製剤中、ＩｇＧが１％未満
しか存在していないことを意味している。
【０１２０】表３ 放射免疫拡散分析により求めた各精製工程の生成物中の
ＩｇＧ及びＩｇＡの分布（総タンパク質に対する％とし
て示す）、及びＩｇＡの収率（出発物質に対する％とし
て示す）。個別に行った４回の精製手順において認めら
れた範囲を示す。
ＩｇＧ及びＩｇＡの分布（総タンパク質に対する％とし
て示す）、及びＩｇＡの収率（出発物質に対する％とし
て示す）。個別に行った４回の精製手順において認めら
れた範囲を示す。
【０１２１】
【表３】
【０１２２】実施例５ 精製製剤中のＩｇＡサブクラスの組成並びにカッパ及び
ラムダＬ鎖の分布実施例１、３及び４において製造され
た本発明のＩｇＡ製剤を、そのＩｇＡサブクラスの分布
について、放射免疫拡散プレート〔ザ・バインディング
サイト（The Binding Site）、バーミンガム、英国〕を
用いて（供給者の指示による方法で）試験し、血漿プー
ル（１，０００人以上の健康な成人血液ドナーから得
た）と比較した。本発明により製造された生成物中のＩ
ｇＡサブクラスの分布は、正常血漿のそれと、ほとんど
相違しなかった（表４）。
ラムダＬ鎖の分布実施例１、３及び４において製造され
た本発明のＩｇＡ製剤を、そのＩｇＡサブクラスの分布
について、放射免疫拡散プレート〔ザ・バインディング
サイト（The Binding Site）、バーミンガム、英国〕を
用いて（供給者の指示による方法で）試験し、血漿プー
ル（１，０００人以上の健康な成人血液ドナーから得
た）と比較した。本発明により製造された生成物中のＩ
ｇＡサブクラスの分布は、正常血漿のそれと、ほとんど
相違しなかった（表４）。
【０１２３】精製したＩｇＡのＬ鎖の組成は、ベーリン
グ（Behring ）社より得た放射免疫拡散プレートにより
調べた（マールブルグ、ドイツのBehring 社の指示によ
る方法）。精製したＩｇＡと標準血漿プールとの間で、
カッパ：ラムダ比に相違は観察されなかった（全ての免
疫グロブリンクラスのカッパ：ラムダ比を調べた）（表
５）。
グ（Behring ）社より得た放射免疫拡散プレートにより
調べた（マールブルグ、ドイツのBehring 社の指示によ
る方法）。精製したＩｇＡと標準血漿プールとの間で、
カッパ：ラムダ比に相違は観察されなかった（全ての免
疫グロブリンクラスのカッパ：ラムダ比を調べた）（表
５）。
【０１２４】これらの結果により、本発明により製造さ
れたＩｇＡは、血清中に含まれるＩｇＡと、その組成が
一致することが示された。
れたＩｇＡは、血清中に含まれるＩｇＡと、その組成が
一致することが示された。
【０１２５】表４ 放射免疫拡散法により測定した精製ＩｇＡ製剤のＩｇＡ
サブクラスの分布。
サブクラスの分布。
【０１２６】
【表４】
【０１２７】第５表 放射免疫拡散法により測定した精製ＩｇＡのＬ鎖の組成
（単位/dl による評価）。
（単位/dl による評価）。
【０１２８】
【表５】
【０１２９】実施例６ 精製ＩｇＡ製剤の生物学的有効性の試験 本発明による精製後のＩｇＡ生成物の、細菌を認識し、
結合する能力を、試験系において試験した。
結合する能力を、試験系において試験した。
【０１３０】E. coli 懸濁液（Ｎｒ ＣＯＰＯ５４、
１．３９×１０10/ml ）から、２０μl アリコートを採
り、本発明により製造されたＩｇＡ（１mg/ml ）１．４
ml、及び／又はコントロール（対照）としてヒト血漿プ
ール（１mg/ml ＩｇＡ）１．４mlに懸濁した。ウシ血清
アルブミンの１％（w/v ）ＰＢＳ溶液（以下ＰＢＳ／Ｂ
ＳＡと略す）０．１００mlを加えた。これを、時おり振
とうしながら、４℃で６０分間保温した。次にこれを遠
心分離〔エッペンドルフ（Eppendorf ）社、１２，００
０rpm 、５分間、４℃〕し、細菌を、各回にＰＢＳ／Ｂ
ＳＡ１mlを用いて４回洗浄した。細菌を、ＰＢＳ／ＢＳ
Ａ ０．５mlに再懸濁した。次に、懸濁液を、蛍光標識
抗ヒトＩｇＡ抗体〔フルオレセイン（ＤＴＡＦ）とコン
ジュゲート化したアフィピュア（affi pure ）ウサギＦ
（ａｂ）2 抗ヒトＩｇＡ（アルファ鎖仕様）、ジャクソ
ンイムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch）社、ウエ
ストグローブ、ＰＡ、ＵＳＡ〕２０μl と混合し、時お
り振とうしながら、４℃で６０分間保温した。次に、細
菌懸濁液を、各回にＰＢＳ／ＢＳＡ１mlを用いて、４回
洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ０．５mlに懸濁した。細菌に対
するＩｇＡ及び蛍光標識抗ヒトＩｇＡの結合を、蛍光活
性化セルソーター（cell sorter ）〔型：ＦＡＣスター
プラス（Star-Plus ）、ベクトンディキンソン（Becton
Dickinson）社、マウンテンビュー、ＣＡ、ＵＳＡ〕に
より測定した。
１．３９×１０10/ml ）から、２０μl アリコートを採
り、本発明により製造されたＩｇＡ（１mg/ml ）１．４
ml、及び／又はコントロール（対照）としてヒト血漿プ
ール（１mg/ml ＩｇＡ）１．４mlに懸濁した。ウシ血清
アルブミンの１％（w/v ）ＰＢＳ溶液（以下ＰＢＳ／Ｂ
ＳＡと略す）０．１００mlを加えた。これを、時おり振
とうしながら、４℃で６０分間保温した。次にこれを遠
心分離〔エッペンドルフ（Eppendorf ）社、１２，００
０rpm 、５分間、４℃〕し、細菌を、各回にＰＢＳ／Ｂ
ＳＡ１mlを用いて４回洗浄した。細菌を、ＰＢＳ／ＢＳ
Ａ ０．５mlに再懸濁した。次に、懸濁液を、蛍光標識
抗ヒトＩｇＡ抗体〔フルオレセイン（ＤＴＡＦ）とコン
ジュゲート化したアフィピュア（affi pure ）ウサギＦ
（ａｂ）2 抗ヒトＩｇＡ（アルファ鎖仕様）、ジャクソ
ンイムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch）社、ウエ
ストグローブ、ＰＡ、ＵＳＡ〕２０μl と混合し、時お
り振とうしながら、４℃で６０分間保温した。次に、細
菌懸濁液を、各回にＰＢＳ／ＢＳＡ１mlを用いて、４回
洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ０．５mlに懸濁した。細菌に対
するＩｇＡ及び蛍光標識抗ヒトＩｇＡの結合を、蛍光活
性化セルソーター（cell sorter ）〔型：ＦＡＣスター
プラス（Star-Plus ）、ベクトンディキンソン（Becton
Dickinson）社、マウンテンビュー、ＣＡ、ＵＳＡ〕に
より測定した。
【０１３１】蛍光標識抗体と共に保温したが、ＩｇＡ含
有生成物とは保温しなかった（替わりに、純粋なＰＢＳ
と保温した）細菌を、ブランクとした。分析の結果（図
７、Ｘ軸は蛍光強度を示し、Ｙ軸は検出細菌数を示
す）、本発明により単離されたＩｇＡは、血漿プールか
ら得たＩｇＡと同様に、細菌と良好に結合することが示
された。血漿ＩｇＡと保温した細菌の７４％と、本発明
により精製されたＩｇＡと共に保温した細菌の７７％
が、ＩｇＡと結合した。
有生成物とは保温しなかった（替わりに、純粋なＰＢＳ
と保温した）細菌を、ブランクとした。分析の結果（図
７、Ｘ軸は蛍光強度を示し、Ｙ軸は検出細菌数を示
す）、本発明により単離されたＩｇＡは、血漿プールか
ら得たＩｇＡと同様に、細菌と良好に結合することが示
された。血漿ＩｇＡと保温した細菌の７４％と、本発明
により精製されたＩｇＡと共に保温した細菌の７７％
が、ＩｇＡと結合した。
【０１３２】これらの結果から、ある種の細菌と結合す
るＩｇＡの生物学的機能は、本発明による精製後も保持
されることが示された。
るＩｇＡの生物学的機能は、本発明による精製後も保持
されることが示された。
【０１３３】実施例７ 存在する可能性のあるウイルス性汚染物質の不活性化の
ための単離ＩｇＡの凍結乾燥及び加熱処理 本発明により製造されたＩｇＡ濃度が１０mg/ml である
ＩｇＡ４mlを、凍結乾燥した。その後、凍結乾燥した物
質を、凍結乾燥用バイアル中で、（試料の総重量に対し
て７％の水を加えることによって）加湿した。その後、
密閉したバイアルを、６０℃で１０時間加熱処理し、次
いで８０℃で１時間加熱した。
ための単離ＩｇＡの凍結乾燥及び加熱処理 本発明により製造されたＩｇＡ濃度が１０mg/ml である
ＩｇＡ４mlを、凍結乾燥した。その後、凍結乾燥した物
質を、凍結乾燥用バイアル中で、（試料の総重量に対し
て７％の水を加えることによって）加湿した。その後、
密閉したバイアルを、６０℃で１０時間加熱処理し、次
いで８０℃で１時間加熱した。
【０１３４】加熱処理した試料を、ＰＢＳにより出発時
の容積に戻し、この方法により得た溶液を、スーパーデ
ックスＳ２００ＨＲ１０／３０ＦＰＬＣカラムによるゲ
ルろ過（実施例１に記載）により分析した。図８
（「Ｍ」＝ＩｇＡ単量体、「Ｄ」＝ＩｇＡ二量体、
「Ａ」＝凝集物）には、凍結乾燥及び加熱処理後、Ｉｇ
Ａはまだ、ＩｇＡ単量体を９６％以上含有していること
が示されている。
の容積に戻し、この方法により得た溶液を、スーパーデ
ックスＳ２００ＨＲ１０／３０ＦＰＬＣカラムによるゲ
ルろ過（実施例１に記載）により分析した。図８
（「Ｍ」＝ＩｇＡ単量体、「Ｄ」＝ＩｇＡ二量体、
「Ａ」＝凝集物）には、凍結乾燥及び加熱処理後、Ｉｇ
Ａはまだ、ＩｇＡ単量体を９６％以上含有していること
が示されている。
【０１３５】実施例８ 溶解ＩｇＡの加熱処理 本発明により単離されたＩｇＡを、蒸留水により濃度
０．４mg/ml に溶解し、水浴中で、異なる温度で種々の
時間保温した。
０．４mg/ml に溶解し、水浴中で、異なる温度で種々の
時間保温した。
【０１３６】その後、この物質を、実施例１に記載した
ように、スーパーデックス２００ＨＲ１０／３０ゲルろ
過カラムにより分析した。
ように、スーパーデックス２００ＨＲ１０／３０ゲルろ
過カラムにより分析した。
【０１３７】非処理ＩｇＡ製剤（図２又は図６を参照）
と比較したところ、６０℃の温度で３０分間（図９）、
又は４０℃の温度で８時間加熱した場合のいずれも、凝
集物は形成されなかったことが示された。４０℃で８時
間加熱し、更に５０℃で８時間加熱した後でさえも（図
１１）、２％未満の凝集物が観察されたのみであった。
図９〜１１では、「Ｍ」、「Ｄ」及び／又は「Ａ」は、
ＩｇＡ単量体、ＩｇＡ二量体及び／又は凝集物の位置を
示す。
と比較したところ、６０℃の温度で３０分間（図９）、
又は４０℃の温度で８時間加熱した場合のいずれも、凝
集物は形成されなかったことが示された。４０℃で８時
間加熱し、更に５０℃で８時間加熱した後でさえも（図
１１）、２％未満の凝集物が観察されたのみであった。
図９〜１１では、「Ｍ」、「Ｄ」及び／又は「Ａ」は、
ＩｇＡ単量体、ＩｇＡ二量体及び／又は凝集物の位置を
示す。
【０１３８】実施例９ カラム剤との親水性／疎水性、及び／又は静電的相互作
用の影響を試験するために、実質的にＩｇＡ及びＩｇＧ
からなる試料を、異なるゲル剤を充填した同じ大きさの
ゲルろ過カラムにより分析した。このために、同じ大き
さのアリコートを、カラムに適用し、同一の溶離条件
（０．５ml/ 分）で、アイソクラティックに溶離した。
用の影響を試験するために、実質的にＩｇＡ及びＩｇＧ
からなる試料を、異なるゲル剤を充填した同じ大きさの
ゲルろ過カラムにより分析した。このために、同じ大き
さのアリコートを、カラムに適用し、同一の溶離条件
（０．５ml/ 分）で、アイソクラティックに溶離した。
【０１３９】リン酸緩衝０．１５M ＮａＣｌ溶液により
平衡化したゲルろ過カラムにより、以下の分析を行った
（流速：０．５ml/ 分、光学密度（ＯＤ）を２８０nmで
測定）。
平衡化したゲルろ過カラムにより、以下の分析を行った
（流速：０．５ml/ 分、光学密度（ＯＤ）を２８０nmで
測定）。
【０１４０】スーパーデックス２００ＨＲ１０／３０カ
ラム（Pharmacia-LKB 社）（図１２）と、スペロース６
ＨＲ１０／３０カラム（Pharmacia-LKB 社）（図１３）
を用いて、同様にＩｇＧ及びＩｇＡを分離した。
ラム（Pharmacia-LKB 社）（図１２）と、スペロース６
ＨＲ１０／３０カラム（Pharmacia-LKB 社）（図１３）
を用いて、同様にＩｇＧ及びＩｇＡを分離した。
【０１４１】これに対して、高イオン強度（２M ＮａＣ
ｌ）の条件下でゲルろ過を行ったところ、タンパク質の
ピークがより接近して移動したため、スーパーデックス
２００ＨＲ１０／３０カラムでは、分離することはでき
なかった（図１４）。この結果により、スーパーデック
ス２００によるＩｇＡ及びＩｇＧの分離は、分子量の違
い（ＩｇＡ：１６２kD、ＩｇＧ：１５３kD、〔Heremans
J.F., Immunoglobulin IgA, in The Antigens, vol. 2
(1974) p. 365-522; Academic Press, New York〕）ば
かりでなく、ＩｇＧ及びＩｇＡのカラム剤との疎水性及
び／又は静電的相互作用の違いにも依存することが示さ
れた。
ｌ）の条件下でゲルろ過を行ったところ、タンパク質の
ピークがより接近して移動したため、スーパーデックス
２００ＨＲ１０／３０カラムでは、分離することはでき
なかった（図１４）。この結果により、スーパーデック
ス２００によるＩｇＡ及びＩｇＧの分離は、分子量の違
い（ＩｇＡ：１６２kD、ＩｇＧ：１５３kD、〔Heremans
J.F., Immunoglobulin IgA, in The Antigens, vol. 2
(1974) p. 365-522; Academic Press, New York〕）ば
かりでなく、ＩｇＧ及びＩｇＡのカラム剤との疎水性及
び／又は静電的相互作用の違いにも依存することが示さ
れた。
【図１】実施例１ カラム：スーパーデックス２００ＨＲ３５／６００ Cohn III沈殿物からＩｇＡを単離するために、分取のた
めに作動したもの。
めに作動したもの。
【図２】実施例１ カラム：スーパーデックス２００ＨＲ１０／３０ 最終生成物（ＩｇＡ）の分析。
【図３】実施例２ ＩｇＡ：ゲル電気泳動／デンシトメトリー。
【図４】実施例３ ＩｇＡ：ゲル電気泳動／デンシトメトリー。
【図５】実施例４ ＩｇＡ：ゲル電気泳動／デンシトメトリー。
【図６】実施例４ カラム：スーパーデックス２００ＨＲ１０／３０ ＩｇＡ最終生成物（「Ｍ」単量体、「Ｄ」二量体、
「Ａ」凝集物）。
「Ａ」凝集物）。
【図７】実施例６ ＩｇＡにより被覆されたE. coli 。 Ｘ軸：蛍光強度 Ｙ軸：検出された細菌数
【図８】実施例７ カラム：スーパーデックス２００ＨＲ１０／３０ 凍結乾燥後、ＰＢＳ中に再構成されたＩｇＡ。
【図９】実施例８ カラム：スーパーデックス２００ＨＲ１０／３０ 熱処理（６０℃、３０分）後のＩｇＡ。
【図１０】実施例８ カラム：スーパーデックス２００ＨＲ１０／３０ 熱処理（４０℃、８時間）後のＩｇＡ。
【図１１】実施例８ カラム：スーパーデックス２００ＨＲ１０／３０ 熱処理（４０℃、８時間＋５０℃、８時間）後のＩｇ
Ａ。
Ａ。
【図１２】実施例９ カラム：スーパーデックス２００ＨＲ１０／３０ 緩衝液：ＰＢＳ（０．１５M ＮａＣｌ）によるＩｇＡ及
びＩｇＧの分離。
びＩｇＧの分離。
【図１３】実施例９ カラム：スペロース６ＨＲ１０／３０ 緩衝液：ＰＢＳ（０．１５M ＮａＣｌ）によるＩｇＡ及
びＩｇＧの分離。
びＩｇＧの分離。
【図１４】実施例９ カラム：スーパーデックス２００ＨＲ１０／３０ 緩衝液：ＰＢＳ及び２M ＮａＣｌによるＩｇＡ及びＩｇ
Ｇの分離。
Ｇの分離。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マルタ・エイブル オーストリア国、アー−1180 ウィーン、 グスタブ−ツェルマークガッセ ２ (72)発明者 レギーネ・トマジッツ オーストリア国、アー−1020 ウィーン、 ブルマウアーガッセ ９／８ (72)発明者 ヘルマン・ヴォルフ オーストリア国、アー−1180 ウィーン、 ヴァイトルフガッセ 15
Claims (21)
- 【請求項１】 （ａ）実質的にＩｇＧを含まないＩｇＡ
単量体が得られるように、免疫グロブリン含有画分を精
製する工程、及び（ｂ）ウイルス不活性化のための方法
を実施する工程によって得られる、ウイルスに関して安
全なヒトＩｇＡ単量体。 - 【請求項２】 精製が、ゲル浸透クロマトグラフィー及
び／又はチオフィリッククロマトグラフィーのようなク
ロマトグラフィーによる精製を含むことを特徴とする、
請求項１記載のＩｇＡ単量体。 - 【請求項３】 ウイルス不活性化のための方法として、
加熱処理を実施することを特徴とする、請求項１又は２
記載のＩｇＡ単量体。 - 【請求項４】 ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を天然組成比で含
むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載
のＩｇＡ単量体。 - 【請求項５】 フィブリノーゲンを含まないことを特徴
とする、請求項１〜４のいずれか１項記載のＩｇＡ単量
体。 - 【請求項６】 プラスミノーゲンを含まないことを特徴
とする、請求項１〜５のいずれか１項記載のＩｇＡ単量
体。 - 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項記載のヒト
ＩｇＡ単量体の画分を含むことを特徴とする安定な医薬
製剤。 - 【請求項８】 実質的にヒトＩｇＡ単量体からなる請求
項７記載の安定な医薬製剤。 - 【請求項９】 薬剤学的に許容しうる助剤及び添加剤を
付加的に含む、請求項７又は８記載の安定な医薬製剤。 - 【請求項１０】 請求項１記載のウイルスに関して安全
なＩｇＡ単量体を製造する方法であって、（ａ）実質的
にＩｇＧを含まないＩｇＡ単量体が得られるように、免
疫グロブリン含有画分を精製する工程、及び（ｂ）ウイ
ルス不活性化のための方法を実施する工程を含む方法。 - 【請求項１１】 精製のために、ゲル浸透クロマトグラ
フィー及び／又はチオフィリッククロマトグラフィーの
ようなクロマトグラフィーを実施することを特徴とす
る、請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 ウイルス不活性化のための方法が、Ｉ
ｇＡ単量体を加熱することを含むことを特徴とする、請
求項１０又は１１記載の方法。 - 【請求項１３】 免疫グロブリン含有画分として、ヒト
血清、血漿、血漿画分又は初乳を使用することを特徴と
する、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１４】 出発物質として、CohnII+III画分を使
用することを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか
１項記載の方法。 - 【請求項１５】 出発物質を予備精製することを特徴と
する、請求項１０〜１４記載のいずれか１項記載の方
法。 - 【請求項１６】 ゲル浸透クロマトグラフィーを、親水
性／疎水性及び／又は静電的相互作用により実施するこ
とを特徴とする、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１７】 ゲル浸透クロマトグラフィーを、スー
パーデックス（Superdex；登録商標）を用い、親水性／
疎水性及び／又は静電的相互作用により実施することを
特徴とする、請求項１６記載の方法。 - 【請求項１８】 アフィニティクロマトグラフィーを、
更に精製の工程として実施することを特徴とする、請求
項１０〜１７のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１９】 ウイルス不活性化のための方法とし
て、４０℃と８０℃の間（最も好ましくは５０℃と６５
℃の間）で、ウイルス不活性化に充分な期間、加熱処理
を実施することを特徴とする、請求項１０〜１８のいず
れか１項記載の方法。 - 【請求項２０】 水に対する透析を、加熱処理の前に実
施することを特徴とする、請求項１０〜１９のいずれか
１項記載の方法。 - 【請求項２１】 血漿又は血漿画分を、チオフィリック
マトリックスに吸着させ、ＩｇＡ単量体を含む画分を溶
離することを特徴とする、ＩｇＡ単量体を含む製剤を製
造する方法。
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