JPH08512133A - 活性プラスミノーゲン−活性化因子−阻害剤−タイプ−１の定量 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は止血の分野に属する。本発明は、試料中に存在する活性プラスミノーゲン−活性化因子−阻害剤−タイプ−１（ＰＡＩ−タイプ−１）の定量法に関する。本発明はさらに、該定量に用いるための参照曲線の作成法及び該定量法を実施するためのキット、さらにプラスミノーゲン活性化因子に対する固定化抗体を含むマイクロタイタープレートに関する。試料中に存在する活性プラスミノーゲン−活性化因子−阻害剤−タイプ−１（ＰＡＩ−タイプ−１）を定量するための本発明の方法は、試料から２つのポーションを採取すること、及び少なくとも以下の段階：（ａ）一方のポーションにおいて、ＰＡＩ−タイプ−１とプラスミノーゲン−活性化因子（ＰＡ）との複合体、即ちサンプリングの時点にすでに存在する所謂〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ）−１）〕複合体の総量に対応する値を決定する段階、（ｂ）段階（ａ）で決定された値から、サンプリングの時点に存在する〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ）−１）〕複合体の量を計算する段階、（ｃ）他方のポーションにおいて、該ポーションに、過剰量の活性形態の組織タイププラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）を添加した後に存在する〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体の総量に対応する値を決定する段階、（ｄ）段階（ｃ）で決定された値から、過剰量のｔ−ＰＡを添加した後に存在する〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体の量を計算する段階、（ｅ）段階（ｄ）で測定された複合体の総量から段階（ｂ）で測定された複合体の総量を減算して、サンプリングの時点に存在した活性ＰＡＩ−タイプ−１の量を、該ポーションの容量に相当する試料の容量として得る段階を含み、段階（ａ）のポーションを、ＰＡとＰＡＩ−タイプ−１との複合体化を阻害する手段と接触させ、次いで、固定化抗ｔ−ＰＡ及び標識化抗ＰＡＩと共にインキュベートし、段階（ｃ）のポーションを、過剰量の活性形態ｔ−ＰＡと接触させ、次いで固定化捕獲剤及び標識剤と共にインキュベートすることからなる。

Description

【発明の詳細な説明】 活性プラスミノーゲン−活性化因子−阻害剤−タイプ−１の定量 記述： 試料中に存在する活性プラスミノーゲン−活性化因子−阻害剤−タイプ−１（ ＰＡＩ−タイプ−１）の定量法、該定量に用いるための参照曲線の作成法、該定 量法を実施するためのキット及びプラスミノーゲン活性化因子に対する固定化抗 体を含むマイクロタイタープレートのような担体。 本発明は止血の分野に属する。本発明は、試料中に存在する活性プラスミノー ゲン−活性化因子−阻害剤−タイプ−１（ＰＡＩ−タイプ−１）の定量法に関す る。本発明はさらに、該定量に用いるための参照曲線の作成法及び該定量法を実 施するためのキット、並びにプラスミノーゲン活性化因子に対する固定化抗体を 含むマイクロタイタープレートのような担体に関する。 血栓症、即ち静脈及び動脈中の血餅（血栓）の発生は、血管障害の合併症を形 成し、しばしば急性心筋梗塞の原因となる。血栓症は２つの方法、即ち、凝塊系 及び血小板の活性化を防止若しくは低減させるか、又は形成中の凝塊が 形成されるや否やできるだけ早く分解されるように、所謂繊維素溶解系を活性化 させることにより防止し得る。動脈及び静脈の細胞内層、所謂内皮はこれらのプ ロセスにおいて重要な役割を果たす。内皮は、凝固プロセスを阻害するタンパク 質を供給し、血小板の凝集を阻止する種々の因子を産生する。さらに内皮は、「 ｔ−ＰＡ」とも称される繊維素溶解プロセスを活性化するタンパク質「組織−タ イプのプラスミノーゲン活性化因子」を構成分泌して、形成中の血栓の分解を調 節する。ｔ−ＰＡはさらに、内皮の貯蔵プールから速やかに放出され、比較的大 きな繊維素溶解活性が静脈又は動脈内の危険部位に局所的に到達してその後の血 栓の形成を防止し得る。 繊維素溶解系はさらに、既に形成されている凝塊を溶解することも可能である 。この溶解の公知例は、繊維素溶解酵素ｔ−ＰＡを用いた急性心筋梗塞の治療で ある。この新規な臨床的な適用は、過去数年にわたり多大な興味を集めた。血液 中の繊維素溶解能（主としてｔ−ＰＡ活性）が低下すると血栓症の危険が増大す るとの観察にも拘わらず、血栓症の治療にｔ−ＰＡを用いることに比べて、内在 性（即ち、身体自体が産生する）循環性ｔ−ＰＡの有効性を 利用することに対してはあまり研究が行われていない。特に、ｔ−ＰＡの繊維素 溶解作用は、既に凝固中にｔ−ＰＡが存在する場合に最大になる、即ち、後で加 えられたｔ−ＰＡははるかに効力が劣る。これは、繊維素溶解治療には高用量の ｔ−ＰＡを必要とすることをも示し、十分に高い内在ｔ−ＰＡ活性レベルの重要 性を強調するものである。従って、血栓症の予防には、凝固プロセスの阻害が考 えられるだけでなく、内在ｔ−ＰＡの産生を刺激してｔ−ＰＡの利用可能性を増 大させることも考えられ得る。 血液中に循環するｔ−ＰＡは、動脈又は静脈壁の内皮細胞により産生される。 これらの内皮細胞は、ｔ−ＰＡを合成し、ｔ−ＰＡの基礎分泌（構成分泌）を示 し、且つ内皮細胞の刺激により分泌され得る（「放出」としても知られている急 性分泌）ｔ−ＰＡの細胞ストックをも含んでいる。そのような細胞ｔ−ＰＡスト ックは極めて強力な局所的防御機構である。血栓発生の局所的生理学的制御物質 （例えば、血栓分解産物）はｔ−ＰＡの急性分泌を強力に増大させる。しかし、 血液中のｔ−ＰＡ活性はｔ−ＰＡの量によって決定されるだけでなく、ｔ−ＰＡ に対する特異的阻害剤、所謂プラスミノーゲン−活性化因子−阻害剤−タイプ− １ （ＰＡＩ−タイプ−１）の量によっても決定される。血漿中のＰＡＩ−タイプ− １も特に内皮により合成される。 循環するｔ−ＰＡの活性又は血餅形成中の血管の内皮細胞からのｔ−ＰＡの速 やかな補強の利用可能性は繊維素溶解の重要なパラメーターである。ｔ−ＰＡ活 性が不足すると血栓症が発生し得る。過剰なｔ−ＰＡ活性は出血傾向をもたらし 得る。 ｔ−ＰＡ活性はＰＡＩ−タイプ−１の存在に関連するので、血液又は血漿中の ＰＡＩ−タイプ−１のレベルは患者の繊維素溶解能を決定する重要なパラメータ ーである。血液又は血漿中のＰＡＩ−タイプ−１のレベルの測定は、ある種の欠 損の診断又はある種の薬剤、例えば繊維素溶解系欠損の治療用薬剤の治療効果の 追跡に有用であり得る。 ＰＡ−阻害剤−タイプ−１（ＰＡＩ−タイプ−１）は、組織タイプのプラスミ ノーゲン活性化因子を介して繊維素溶解を調節する最も重要な阻害性タンパク質 である。該阻害剤は1982年に同定され、その活性は、オランダ国特許出願第8201 987号明細書に記載の手順により測定し得るｔ−ＰＡを用いた滴定により測定可 能である。プラスミノーゲン−活性化因子−阻害剤−タイプ−１はプラスミノー ゲン 活性化因子（ｔ−ＰＡ及びウロキナーゼ）の活性、特に組織タイプのプラスミノ ーゲン活性化因子の活性を特異的に阻害する。組織タイプのプラスミノーゲン活 性化因子との反応性はウロキナーゼとの反応性よりはるかに高い。プラスミノー ゲン−活性化因子−阻害剤−タイプ−１は、試料中に種々の分子形態で存在し得 る。該阻害剤は、活性形態としても、ｔ−ＰＡ又はｕ−ＰＡといったプラスミノ ーゲン活性化因子との複合体としても存在し得、さらに潜伏又は不活性形態でも 存在し得る。血液中では、約30％のプラスミノーゲン−活性化因子−阻害剤−タ イプ−１が潜伏形態で存在し得る。これは、試料を極めて簡単に処理するだけで 実際に前記潜伏形態のものが活性化されるにしても、免疫学的技術により血液又 は血漿中に存在する活性ＰＡＩ−タイプ−１の量を測定する際にやっかいな要素 となり得る。プラスミノーゲン−活性化因子−阻害剤−タイプ−１は、Van Mour ikらにより記載の内皮細胞培地から単離された（J．Biol．Chem．259（1984）14 914-14921ページ）。抗血清は、ウサギを免疫感作し、ＩｇＧをＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Pharmacia，Uppsala，Sweden）を用いて精製して得 た。 ｔ−ＰＡ阻害活性の測定は、試料、例えば、阻害剤を含む血漿上に段階濃度の ｔ−ＰＡを滴下することにより滴定を行うオランダ国特許出願第8201987号明細 書に記載の方法で実施し得る。ｔ−ＰＡ活性は、通常のｔ−ＰＡ測定法（前記特 許出願明細書に記載のような）を適用して測定するが、図１は、20μlの血漿の 添加により、Ｘ軸に対して補外すると中和ｔ−ＰＡの量で表される阻害量を示す 曲線を得る方法を示している。これは、組織タイプのプラスミノーゲン活性化因 子の活性を測定する間接的な方法であり、該方法においては、試料を、プラスミ ノーゲン及び組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）を用いてプ ラスミノーゲンをプラスミンに変換するための刺激物質並びにプラスミンと反応 すると検出可能な反応生成物を生成するプラスミン用の基質と共にインキュベー トする。この公知方法は極めて手間がかかり且つ比較的不正確である。従って、 より正確で実施し易い方法が要望されている。該公知方法はさらに、試料の希釈 を必要とするが、希釈することにより、初期に不安定な〔（ｔ−ＰＡ）−（ＰＡ Ｉ−タイプ−１）〕複合体が生成される可能性がある。さらに該方法は、ＰＡＩ −タイプ−１の活性について指標を与え るに過ぎず、直接値を導き出したり又は例えばマイクログラムで表される活性Ｐ ＡＩ−タイプ−１の総量についての指標を与えることはない。本発明の方法は上 記問題の解決に向けられている。 EP0450086 A1明細書には、活性ＰＡＩのアッセイ法が記載されている。この方 法は、サンドイッチ法に基づく免疫学的アッセイ法により、それぞれ（Ａ）ヒト 標本中に存在するヒト組織プラスミノーゲン活性化因子−ヒトプラスミノーゲン 阻害剤複合体（〔ｔ−ＰＡ）−（ＰＡＩ）複合体〕及び（Ｂ）ヒト組織プラスミ ノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）を添加したヒト標本中に存在するヒト組織プラ スミノーゲン活性化因子−プラスミノーゲン阻害剤複合体（〔ｔ−ＰＡ）−（Ｐ ＡＩ）〕複合体）を定量し、定量値の差に基づいて活性ヒトプラスミノーゲン活 性化因子阻害剤（ＰＡＩ）の量を定量することからなり、該方法は、（ａ）第１ の抗体として、鏡面反射性表面を有する不溶固体担体に結合したヒトプラスミノ ーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ）に対するモノクローナル抗体を用い、（ｂ） 第２の抗体として、酵素標識したヒト組織プラスミノーゲン活性化因子に対する ポリクローナル抗体を用い、（ｃ）界面活性剤と して、少なくとも16のＨＬＢ（親水性親油性バランス）を有する非イオン界面活 性剤を含む界面活性剤を用いることを含む。第１の抗体としてＰＡＩに対するモ ノクローナル抗体、即ち、固定化抗体を用い、第１の抗体の固定化に、極めて平 滑な表面を有する固体担体を、第２の抗体としてのｔ−ＰＡに対する酵素標識ポ リクローナル抗体と組み合わせて用い、さらに、少なくとも16のＨＬＢ値を有す る非イオン界面活性剤を含む界面活性剤を使用することの相乗効果は、ヒト標本 中に存在する多くのタンパク質、特にｔ−ＰＡ、ＰＡＩなどの固体担体への非特 異的吸着を最大に減少させ、さらに、免疫反応には不要な成分を効果的に洗浄除 去し得るように第２の抗体の非特異的吸着を阻害すると言っている。 特に、ＰＡＩを固定化するために用いられる２つのモノクローナル抗体、即ち 、ＪＴＩ−３及びＪＴＩ−４が記載されており、ＪＴＩ−４が好ましいとされて いる。ＰＡＩに対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−３は、サブクラスＩｇＧ_Iに 属し、ｔ−ＰＡがＰＡＩに結合していても、〔（ｔ−ＰＡ）−（ＰＡＩ）〕複合 体においてさえそのＰＡＩへの結合が阻害されないが、モノクローナル抗体がＰ Ａ Ｉに結合している場合にはその後のｔ−ＰＡとＰＡＩとの結合を阻害するような 抗原決定部位を認識する。 ＰＡＩに対するモノクローナル抗体ＪＴＩ−４は、サブクラスＩｇＧ_Iに属し 、そのＰＡＩへの結合は、ＰＡＩがｔ−ＰＡに結合している場合には阻害されな い。鏡面反射性表面は、中心線平均粗さ（Ｒａ）が1.5μm以下である表面と定義 されている。そのような表面の例には、ポリスチレンビーズ及びガラスビーズが ある。アッセイ系に界面活性剤を用いることにより、非特異的吸着は減少するが 、少なくとも16のＨＬＢを有する非イオン界面活性剤のみが免疫反応を阻害しな いと記載されている。該界面活性剤は、免疫反応に関わらない物質及び標識抗体 の非特異的吸着を阻害するだけであると言っている。適当な例として16.7のＨＬ Ｂを有するＴｗｅｅｎ ２０が挙げられている。さらに該欧州特許出願明細書に は、分子量16,000〜15,000、等電点1.0〜5.0、好ましくは分子量20,000〜46,000 、等電点1.2〜4.8のタンパク質が免疫反応溶液中に存在すると、非特異的吸着が 更に阻害され、従って、バックグラウンドが驚異的に低減され、それによってさ らに高い感度が容易に得られると記載されている。そのような物質の例としては 、 例えば、カゼイン及びペプシンが挙げられている。 図２は、EP-0450086明細書に開示されている〔（ｔ−ＰＡ）−（ＰＡＩ）〕複 合体の免疫学的アッセイについての検量曲線を示しており、〔（ｔ−ＰＡ）−（ ＰＡＩ）〕複合体の濃度と吸光度との関係を示している。図２から、約0.3のＯ Ｄが約４ng/mlの〔（ｔ−ＰＡ）−（ＰＡＩ）〕複合体に対応することが明らか である。さらに活性ＰＡＩ濃度は、段階Ａの結果一段階Ｂの結果×0.42として決 定し得る。0.42はＰＡＩと〔（ｔ−ＰＡ）−（ＰＡＩ）〕との分子量比である。 従って、４ng/mlのｔ−ＰＡ−ＰＡＩのＯＤは、0.42×４ng/mlの活性ＰＡＩに対 応する。 該欧州特許出願第0450086号明細書に開示されている方法は、いくつかの不利 点を有しており、いくつかの望ましくない手段を必要とする。例えば該明細書に 記載の方法は、標準的に利用可能なマイクロタイタープレートで簡易的に実施す ることができない。というのはマイクロタイタープレートは所要の鏡面反射性表 面を有していないからである。これは、好ましくは免疫反応を用いて実施し、標 準装置を用い、少量の試料を用いて実施するか、又は病院の研究室で実施するの が適当であるテストには望ましくない。 それに加えて、ＰＡＩの固定化に、ＰＡＩに対するモノクローナル抗体を用いて も、潜伏ＰＡＩと活性ＰＡＩとの区別がつかず、特定の場合に、ｔ−ＰＡに複合 しているＰＡＩとｔ−ＰＡに複合していないＰＡＩ形態との区別をし得るに過ぎ ない。特にこれは、血小板が、血漿中に放出され得、それによって該引用明細書 に記載のアッセイの結果に影響を与えてアッセイを不正確にし得る比較的高濃度 の潜伏ＰＡＩを含むという事実のために、血小板が豊富な血漿を試料として用い る場合に重要であり得る。ＪＴＩ−４であるのが好ましいモノクローナル抗体は 、そのＰＡＩへの結合がＰＡＩが既にｔ−ＰＡに結合していても阻害されないと いう特徴を有している。さらに、潜伏ＰＡＩと活性ＰＡＩとの区別をし得ないこ とについては何も言及されていないのは明らかである。これは、試料中に存在す る全ての形態のＰＡＩが固定化され、大部分が検出不要な形態のものである種々 の形態のＰＡＩが固定化部位に対して競合し、その結果、〔（ｔ−ＰＡ）−（Ｐ ＡＩ）〕の固定化複合体の検出感度が低下するという結果をもたらすことを意味 する。該明細書に示されている他のモノクローナル抗体ＪＴＩ−３も、種々の形 態のＰＡＩを区別し得ない。不正確な 結果に導く引用アッセイの他の態様は、試料採取の時点からテスト実施の間まで 〔（ｔ−ＰＡ）−（ＰＡＩ）〕複合体を形成するｔ−ＰＡとＰＡＩとの反応が継 続し、それが段階Ａ−Ｂの結果に影響を与え、それによってテストが不正確なも のとなり得るという事実にある。正常なドナー由来の試料の場合には、これは活 性ＰＡＩ値における10〜10％の誤差を意味し得る。特に、ｔ−ＰＡのレベルが増 大しているドナー由来の血漿の場合には、誤差はさらに大きくなるであろう。モ ノクローナル抗体ＪＴＩ−３を用いる該引用明細書に記載の方法は２つの段階で 行わなければならない、即ち、ＰＡＩがモノクローナルＪＴＩ−３に結合した後 ではｔ−ＰＡとの結合は全く生起せず、従って潜在的に活性なＰＩＡの検出が低 下し得るので、ＰＡＩとｔ−ＰＡとの反応は、混合物を固定化モノクローナル抗 体と接触させる前に外因的に生起させなければならない。１つの段階、１つの容 器内で実施し得るアッセイが好ましいことは明らかである。最後に、引用された 方法は、参照法についてInternational Society of Thrombosis and Haemostasi s(ISTH)のScientific and Standardization Committee(SSC)により設定された基 準を満たしていない。ＳＳＣ参 照法についての基準は以下の通りである：免疫喪失及び活性喪失試料は陰性でな ければならない；アッセイとＰＡＩ−１の濃度との良好な一次性が必要である； アッセイはＰＡＩ−２及びＰＡＩ−３を検出してはならず、且つＳｔａｂｉｌｙ ｔｅ（登録商標）血漿へのｔ−ＰＡの添加による変化は20％未満でなければなら ない。Ｓｔａｂｉｌｙｔｅ（登録商標）血漿は、複合体の形成をもたらすｔ−Ｐ ＡとＰＡＩとの反応が生成し得ないように処理された血漿である。 本発明は、上記問題を解決するアッセイ及び該アッセイの実施用キットに関す る。特に、本出願人の知るところでは、該アッセイは、実際にＳＳＣの基準を商 業的に満足し、異常に高いｔ−ＰＡレベルを有するドナー由来の試料のアッセイ にも正常なドナー由来の試料のアッセイにも用い得る最初のアッセイである。前 記引用ＥＰ明細書に記載のテストは、正常より高いｔ−ＰＡレベルを有する試料 を正確に測定するには適さないので、ＳＳＣの要件を満足しない。 本発明は、試料中に存在する活性プラスミノーゲン−活性化因子−阻害剤−タ イプ−１（ＰＡＩ−タイプ−１）の定量法に関し、該方法は、試料から２つのポ ーションを採 取し、少なくとも以下の段階： （ａ）一方のポーションにおいて、ＰＡＩ−タイプ−１とプラスミノーゲン−活 性化因子（ＰＡ）との複合体、即ち、サンプリングの時点にすでに存在している プラスミノーゲン−活性化因子（ＰＡ）との所謂〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ −１）〕複合体の総量に対応する値を決定する段階、及び （ｂ）段階（ａ）で測定された値から、サンプリングの時点に存在する〔（ＰＡ ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体の量を計算する段階、 （ｃ）他方のポーションにおいて、該ポーションに過剰な活性形態の組織タイプ プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）を添加した後に存在する〔（ＰＡ）− （ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体の総量に対応する値を決定する段階； （ｄ）段階（ｃ）で測定された値から、過剰なｔ−ＰＡを添加した後に存在する 〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体の量を計算する段階； （ｅ）段階（ｄ）で測定された複合体の総量から段階（ｂ）で測定された複合体 の総量を減算して、サンプリングの時点に存在した活性ＰＡＩ−タイプ−１の量 を、該ポーショ ンの容量に対応する試料の容量において得る段階 を実施することからなり、 段階（ａ）のポーションを、サンプリングの時点から段階（ａ）までの間にＰ ＡとＰＡＩとの複合体化を阻害するための手段と接触させることを特徴とし、段 階（ａ）は、 − 該ポーションを少なくとも１種の固定化捕獲剤と接触させる段階｛該捕獲剤 は、 （ｉ）ＰＡ、好ましくは〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体のＰＡを 指向し、 （ii）該ポーション中に存在する分子形態のＰＡ、好ましくは〔（ＰＡ）−（Ｐ ＡＩ−タイプ−１）〕複合体のＰＡが前記捕獲剤との複合体を形成するに十分な 量及び特異性をもって存在する｝、 − 該ポーションを少なくとも１種の標識剤と接触させる段階｛該標識剤は、 （ｉ）好ましくは、検出可能な標識（＊）を有しており、 （ii）ＰＡＩ、好ましくは〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体のＰＡ Ｉを指向し、 （iii）該ポーション中に存在する分子形態のＰＡＩ−タイプ−１が前記標識剤 との複合体を形成するに十分な量及 び特異性をもって存在する｝、 − 次いで、適切なインキュベーション及び洗浄段階を実施した後で、固定化捕 獲剤に結合して固定化された（＊）の量に対応する値を決定する段階 からなり、段階（ｃ）は、 − 他方のポーションを過剰な活性形態のｔ−ＰＡと接触させ、それによって、 添加前に該ポーション中に存在する非結合活性ＰＡＩ−タイプ−１が〔（ｔ−Ｐ Ａ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体を形成することを可能にする段階、さら に、 − 該ポーションを段階（ａ）で述べた標識剤及び捕獲剤と接触させる段階、 − 次いで、固定化捕獲剤に結合して固定化された（＊）の量に対応する値を決 定する段階 からなる。 段階（ｃ）において、試料中に存在する実質的に全ての活性プラスミノーゲン −活性化因子−阻害剤−タイプ−１（ＰＡＩ−タイプ−１）は過剰なｔ−ＰＡと 反応して複合体を形成する。この文脈における実質的に全てとは、少なくとも90 ％を意味する。 該ポーションと標識剤及び捕獲剤との接触は、操作数を減らし、アッセイに要 する試薬の量を低減させるために随伴実施する、言い換えれば、上記に開示した 本発明方法の段階（ａ）及び（ｃ）において１段階アッセイを実施するのが好ま しい。標識剤と捕獲剤はどちらも抗体であってよく、その両方又はどちらか一方 がポリクローナル及び／又はモノクローナル抗体であってよい。モノクローナル 捕獲剤が好ましい。 ＰＡとＰＡＩとの複合体化の阻害を確実にするための手段がアッセイの捕獲及 び／又は標識段階に干渉することを防止するように注意する必要がある。あるい は、阻害に反作用し、それによってアッセイの捕獲又は標識段階を可能にしなが ら、段階（ａ）における〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ）〕複合体の形成を阻止し得る追 加手段を講じなければならない。さらに、２つのポーションに分割する前のサン プリングの時点で複合体化を阻害するための手段を試料に課す場合、段階（ｃ） は複合体の形成を必要とするので、段階（ｃ）に用いるべきポーションにおいて 該手段が可逆性であるか又は反作用する必要がある。臨床診療の場合には、サン プリングの時点で直ちに試料を２つのポーションに分 割し、その時点で異なる処理を課すよりも、サンプリングし、試料全体に阻害を 確実にするための手段を課し、その後で段階（ａ）及び（ｃ）用に２つのポーシ ョンに分割するのが好ましい。特に、捕獲及び／又は標識段階に免疫反応が係わ る場合、良好且つ迅速な免疫反応に対して極めて特異的な反応媒体を必要とする 。必要とされる媒体は、免疫反応分野の当業者には周知のものである。本発明の 実施態様の概略原理を示す例として、試料をサンプリングの時点でＰＡとＰＡＩ との複合体化を阻害するに十分な程低いｐＨを有する媒体と接触させ得る。この 複合体化の阻害は、ＰＡがサンプリング後にさらにＰＡＩと反応し得る場合に発 生する不正確性を最小限にするために、サンプリングが行われた後できるだけ早 く生起させる必要がある。被検体から採取した血液試料を、この種のアッセイに よく見られるような凝固防止特性を有する媒体に加えることは当然である。酸性 ｐＨを有するシトレート含有媒体は、該媒体が複合体化の阻害と凝固防止という 上記目標を満足するという事実のために、試料が接触し得る極めて好適な媒体で ある。他の成分の中でも十分量のシトレートを含むＳｔａｂｉｌｙｔｅ（登録商 標）チューブは市販されており、適当 である。Ｓｔａｂｉｌｙｔｅ（登録商標）チューブは、血小板からのその内容物 の放出を阻害するので、さらなる利点を有する。血小板は極めて高率の潜伏ＰＡ Ｉを含んでいるので、この手段は恐らく潜伏ＰＡＩの検出による不正確性を低減 させる。これは、血小板が豊富な試料をテストする際に特に関係し得る。しかし 、そのような酸性媒体は免疫反応には役立たないので、アッセイの捕獲及び／又 は標識段階は実施し得ない。従って、この問題を解決するためには、複合体形成 の阻害を犠牲にすることなく、媒体を免疫反応の実施に好適にする追加手段を講 じなければならない。ｐＨを免疫反応の実施に許容し得るレベルに増大させて複 合体の形成を阻止し、ＰＡ、特にｔ−ＰＡの阻害剤、例えば、ＰＰＡＣＫ（Ｈ− Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＭＫ）を少量含む緩衝液を添加することにより 、段階（ａ）に用いるべきポーションに対する所望要件を満たし得る。さらに、 段階（ｃ）に用いるべきポーションも、〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ）〕複合体化を生 起させ得るレベルにｐＨを戻す手段と接触させ得る。段階（ｃ）に用いるべきポ ーションに、例えば、リン酸緩衝液を添加して酸性ｐＨを中和することは、ポー ション（ｃ）に対する所望の目 的を達成する、即ち、ＰＡとＰＡＩとの複合体化を可能にする好適な手段である 。段階（ａ）に用いるべきポーションの酸性ｐＨを免疫反応を効果的に生成し得 るレベルに変える緩衝液を添加することは、所望の目的に到達する効果的な手段 であるが、〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体の複合体形成の継続的 な阻害を確実にする他の手段を講じる必要がある。サンプリングの時点で、その とき存在する〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ）〕複合体の量に関する状況を維持するため にＰＡ阻害剤を添加し得る。例としてリン酸緩衝液を挙げたが、任意の数の酸性 減少媒体が使用可能であり、当業者には明らかであろう。さらに、ＰＡ、特にｔ −ＰＡ及びｕ−ＰＡの多種の阻害剤が公知である。 本発明の方法は、段階（ａ）及び（ｃ）において１段階ＥＩＡを含むのが好ま しい。段階（ａ）及び（ｃ）における標識剤としてＰＡＩに対するポリクローナ ル抗体を用いるのは適当な実施態様である。捕獲剤はモノクローナル抗体が適当 である。 従って、本発明の定量法の適当な例は、標識剤としてＰＡＩ−タイプ−１に対 する抗体を用い、固定化捕獲剤として、１本鎖ｔ−ＰＡ、２本鎖ｔ−ＰＡ又は〔 （ｔ−ＰＡ） −（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体のような異なる分子形態のｔ−ＰＡを結合し 得る抗体（ａｂ_t-PA）を用いることを含む。 導入部で既に述べたように、プラスミノーゲン−活性化因子−阻害剤−タイプ −１は、組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子ｔ−ＰＡ並びにウロキナーゼ に結合し得る。一般に、主たる興味はＰＡＩ−タイプ−１とｔ−ＰＡとの反応に 向けられ、ＰＡＩ−タイプ−１とウロキナーゼとの反応は二次的な興味である。 しかし、ウロキナーゼの存在がＰＡＩ−タイプ−１の総量に大きく貢献し得る例 外的な場合、即ち、患者が自身の血液又は血漿中に大量のウロキナーゼを有して いる場合（ｕ−ＰＡを用いた血栓症の治療中の場合のような）がある。これらの 場合には、本発明の方法を用いて活性ＰＡＩ−タイプ−１の量を測定するために 、結果がひどく不正確なものにならないようにウロキナーゼに対する抗体をも含 むことが重要なことは明らかである。しかし、通常の場合、ＰＡＩ−タイプ−１ とｔ−ＰＡとの反応性の方がｕ−ＰＡとの反応性よりはるかに高いために、ＰＡ Ｉ−タイプ−１を結合するｕ−ＰＡを含まないことの影響は極くわずかなので、 通常、ウロキナーゼに対 する第２の抗体の使用は必要とされない。さらに、ｕ−ＰＡは通常、ＰＡＩ−タ イプ−１と反応し得ない不活性前駆体（ｓｃ−ｕＰＡ）として存在し、初期に（ ｔｃ−ｕ−ＰＡ）に変換しなければならない。 従って、本発明の方法は、段階（ａ）において、 − 用いるべきポーションを、種々の分子形態の組織タイププラスミノーゲン活 性化因子、例えば、１本鎖（ｔ−ＰＡ）、２本鎖ｔ−ＰＡ又は複合体〔（ｔ−Ｐ Ａ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕に結合し得る抗体を含む捕獲剤と接触させ、さ らに、該ポーションを、種々の分子形態のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化 因子、例えば、１本鎖（ｕ−ＰＡ）、２本鎖ｕ−ＰＡ又は複合体〔（ｕ−ＰＡ） −（ＰＡＩ−タイプ−１）〕に結合し得る抗体を含む第２の捕獲剤と接触させる ことをさらに含み得る。該２種の抗体は同一担体上で固定化し得る。試料は両タ イプの抗体に随伴接触させ得る。 本発明の方法のこの実施態様の段階（ａ）及び（ｃ）で、〔（ｔ−ＰＡ）−（ ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体プラス〔（ｕ−ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１） 〕複合体の量に対応する値を決定し得る。特に、本発明の方法に用いるべ き分子形態のＰＡに対する抗体は、少なくとも対応〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイ プ−１）〕複合体の分子形態のＰＡに結合する。 この実施態様における対応標識剤は、〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕 複合体のＰＡＩ−タイプ−１に対する抗体（ａｂ_PAI-タイプ_-1）であってよい。 特に、〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体中に存在する分子形態のＰ ＡＩ−タイプ−１に対する抗体を用いる。 本発明の方法により実施される測定目的に応じて、段階（ａ）及び（ｃ）で得 られた値を用いて、種々のドナーの血漿を比較するか、又は特定の薬剤に対する あるドナーの反応を追跡することができる。これらの目的は、本発明の方法を、 特定の薬剤で治療する前、治療の間及び治療後の一定の期間にわたり数回実施す るか、あるいは、各チェックアップ時に、段階（ａ）及び（ｃ）で得られた値を 前回のチェックアップで得られた値と比較し得る周期的なチェックアップを行う だけで達成し得る。 さらに、これらの値から、段階（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）を介して、血漿又は 血液中に存在する活性ＰＡＩ−タイプ−１のモル量を誘導することも可能である 。これは、段階 （ａ）及び（ｃ）で得られた結果を参照曲線と比較することにより達成し得る。 従って本発明の方法は、段階（ｂ）及び（ｄ）において、段階（ａ）及び（ｃ） で得られたそれぞれの値から、該値を参照曲線上の対応値と比較することにより 〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体の量を計算することをさらに含み 、該参照曲線は、既知濃度の〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体を対 応標識（＊）値に対してプロットするものである。 前記参照曲線は、特定の既知濃度の〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複 合体を含む少なくとも１種の参照試料及び／又は前記参照試料の１種以上の希釈 物を用いて段階（ａ）及び／又は（ｃ）を実施し、それによって、２種の特定濃 度の〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体に対応する少なくとも２つの 値を得、そのようにして決定された値をそれらのそれぞれの公知濃度に対してプ ロットすることによって得ることができる。該既知濃度の〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ −タイプ−１）〕は、参照試料の製造業者から入手し得る。参照試料として用い るべき試料の〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕の濃度が未知であり、測定 しなければならない可能性もある。その場合、参 照試料の〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕の濃度は、例えば、以下の段階 からなる方法で測定し得る： （１）参照試料に、該試料中に存在する少なくとも実質的に全てのｔ−ＰＡが〔 （ｔ−ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体に変換されるような条件を課す 段階、 （２）段階（１）から得た混合物を段階希釈して副次試料を得る段階、 （３）段階（２）で形成された副次試料を〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１） 〕複合体の成分の１つに対する少なくとも１種の固定化捕獲剤と接触させて、固 定化〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体を得る段階、 （４）段階（３）で得られた固定化複合体を、該固定化複合体の１つの成分、好 ましくは、本発明の定量法の段階ａ−ｄの標識剤が指向するものと同じ成分に対 する少なくとも１種の標識剤と接触させる段階（該標識剤はさらに、本発明の定 量法の段階ａ−ｄに用いたものと同じ検出可能標識（＊）を有しているのが好ま しい）、 （５）各副次試料を測定して、副次試料当たりの固定化検出可能標識（＊）の量 に対応する値を得る段階、 （６）段階（５）で得られた値を該値に対応する標識の量 に対してプロットする段階（標識の量は、該標識及び標識剤が指向する〔（ＰＡ ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕の成分についての検量曲線から誘導され得る）。 初期に未知濃度の〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕を含む参照試料の場合 には、正常な血漿は常に過剰な（ＰＡＩ−タイプ−１）を含み、それによって実 質的に全てのｔ−ＰＡが要求されるように実際に変換されることが確実になるの で、正常な血漿を用いるのが好ましい。 段階（１）における実質的に全てとは、90％を上回るｔ−ＰＡが複合体に変換 されることを意味する。段階（１）に記載の参照血漿中に存在する実質的に全て のｔ−ＰＡの変換に適当な条件は、室温で少なくとも１時間インキュベートする ことである。インキュベーション時間の長さは重要ではない。例えば、室温で１ 〜16時間のインキュベーションが適当である。 そのような参照試料の〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体の濃度を 測定するこの方法及び試料中に存在する活性プラスミノーゲン−活性化因子−阻 害剤−タイプ−１の定量について先に記載の実施態様と組み合わせたこの方法は 本発明の一部を構成する。 参照試料の〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体の濃度測定法の特定 の例において、標識剤は、捕獲剤についての定量法に既に記載のように、種々の 分子形態のｔ−ＰＡに対して指向する。従って、段階（３）では、ｔ−ＰＡに対 する固定化捕獲剤を用いて、固定化〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合 体を得る。次いで、段階（４）では、段階（３）からの固定化複合体を固定化〔 （ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体中に含まれる分子形態のｔ−ＰＡに 対する標識剤と接触させる。標識剤は、試料中に存在する活性プラスミノーゲン ＰＡＩ−タイプ−１の定量法の段階（ａ）及び（ｃ）に用いられたものと同じ検 出可能標識を有しているのが好ましい。次いで、既知濃度の純粋ｔ−ＰＡの検量 曲線を用い、当業者には周知の方法でｔ−ＰＡの量を測定し得る。 本発明の活性ＰＡＩ−タイプ−１の定量法に用いるべき参照試料の〔（ＰＡ） −（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体の濃度の測定法は、一般に複合体形態のｔ− ＰＡの量の測定に適当であるとして知られている任意のｔ−ＰＡ測定アッセイを 実施することを含むのが便利であり得る（例えば、Bosらの，Blood Coagulation and Fibrinolysis 3(1992)， 303-307を参照されたい）。 特定の実施態様において、Ｂｏｓらは、以下の段階を含む方法におけるｔ−Ｐ Ａの測定用参照曲線を作成することが可能であると記載している： （１）参照血漿の試料に、参照血漿試料中に存在する実質的に全てのｔ−ＰＡが 〔（ＰＡＩ−タイプ−１）−ｔ−ＰＡ〕複合体に変換されるような条件を課す段 階、 （２）段階（１）から得らえた混合物を段階希釈して副次試料を得る段階、 （３）段階（２）で形成された副次試料をｔ−ＰＡに対する固定化捕獲剤と接触 させて、固定化複合体〔（ｔ−ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕を得る段階、 （４）段階（３）からの固定化複合体を、固定化〔（ｔ−ＰＡ）−（ＰＡＩ−タ イプ−１）〕複合体中に含まれている少なくとも分子形態のｔ−ＰＡに対する標 識剤と接触させる段階（該標識剤は、検出可能標識、好ましくは上記の定量法の 段階（ａ）及び（ｃ）に用いたものと同じ検出可能標識を有している）、 （５）各副次試料を測定して、固定化された副次試料当たりの検出可能標識（＊ ）の量に対応する値を得る段階、 （６）段階（５）で得られた値を、該値に対して計算された標識の量に対してプ ロットする段階（計算は、段階（４）の標識剤が指向する既知量のｔ−ＰＡから 得た測定を基準として実施した）。本発明の方法において、上記のｔ−ＰＡアッ セイを活性ＰＡＩ測定法の一部として用いる。 本発明の方法において、分子形態のＰＡに対する抗体（該用語は、分子形態の ｔ−ＰＡ及びウロキナーゼの両方を含む）は、モノクローナル抗体でもポリクロ ーナル抗体でもよい。少なくとも分子形態のＰＡに対する抗体がＰＡＩ−タイプ −１との複合体を形成する分子形態の対応ＰＡに結合するのが好ましい。いくつ かの抗ｔ−ＰＡ抗体が利用可能であり、いずれが適当であるかは当業者が容易に 決定し得るところである〔Mc Gregorら，Thromb．Haemostas，53（1985）45；Ma tsuoら，Thromb．Res．51(1989)，485及びVan Zonneveldら，Thromb．Haemostas ，57(1987)，82〕。 本発明の方法に用い得るＰＡＩ−タイプ−１（ａｂ_{PAI-タイフ゜-1}）に対する抗体 は、ＰＡＩ−タイプ−１を注射した哺乳動物の血清から得られ得る。既に述べた ように、そうような抗体は既に利用可能になっており（Van Mourikら）、 精製されたＰＡＩ−タイプ−１もAmerrican Diagnosticaから市販されている。 本発明の方法に用い得る多くの検出可能標識の例がある。例えば、放射性標識 、基質として色素原を有し、生成及び蛍光基として発色団を有する酵素を含む色 素産生標識である。当業者が利用し得る多くのそのような標識が存在する。特に 適当な検出可能標識は西洋ワサビペルオキシダーゼである。これはイムノアッセ イにおける標識として頻繁に用いられる。通常イムノアッセイに用いられるいず れの検出可能標識も本発明の方法に用いるのに適当であり、当業者には明らかで ある。 固定化標識剤の量は、用いられる検出可能標識に応じて決定される。例えば、 色素産生標識を使用して、当業者には周知の方法で光学密度を測定することによ り標識剤の量に対応する値を決定する。既に述べたように、次いで誘導された値 を用いて、活性ＰＡＩ−タイプ−１の量を例えばマイクログラムのような重量又 はモルで測定し得る。本発明方法により、高い正確度及び精度と共に予想外に高 い感度、高い特異性が得られる。他のテストにおいてこれらの特性を妨害し得る 多くの要素が排除又は防止された。遊離 ｔ−ＰＡはｔ−ＰＡとの複合体以外は検出されない。ｔ−ＰＡが過剰に過ぎると 、潜在的に複雑な要素となり得るが、テストにより、20ng/mlを超える量のｔ− ＰＡのみが問題を生起し得ることが示された（図３）。これは、ＰＡＩに対する 固定化抗体を用いるテストに比べて取るに足らない問題である。本発明の方法は 、段階（ｃ）においてｔ−ＰＡを15ng/ml未満の量で用いて干渉を防止するのが 好ましい。 捕獲剤は、本発明の方法の場合、例えば、当業界において周知の方法でマイク ロタイタープレートのウエルに固定化し得る。表面のＲａに関して何ら特定的な 要件は必要とされない、即ち、EP-0450086明細書で引用された方法に比べて、タ ンパク質の非特異的吸着の十分な排除を確実にするのに超平滑表面を必要としな い。多くの他の抗体固定化法が公知であり、本発明の方法における固定化に適当 である。 本発明の定量法の実施についての他の提案実施態様は、段階（ａ）及び（ｃ） のポーションに、複合体〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕に対する特異的 抗体（該抗体は他の分子形態のＰＡ及びＰＡＩ−タイプ−１に結合し得 ない）を添加し、次いで該複合体に結合した抗体の量を測定することからなる。 例えば、抗体を固定化し、複合体に対する捕獲抗体として用いることが可能で あり、その場合、例えば複合体の成分のいずれかに対する標識抗体（該標識抗体 は検出可能標識を有している）との固定化複合体の量の測定に用いることができ る。 あるいは、複合体をＰＡに対する捕獲剤と共に固定化し、複合体特異抗体（該 抗体は、標識抗体として機能し、従って検出可能標識を有している）と接触させ 得る。 本発明の他の態様により、上記本発明の定量法の実施に要求される成分からな るキットが提供される。そのようなキットは、少なくとも、 − 既知量の〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体、又は正常な血漿を 含む１種の参照試料、 − 〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体のＰＡ成分、又はその別個の 成分よりはむしろそのような複合体自身に特異的な少なくとも１種の固定化捕獲 剤を含む担体、例えばマイクロタイタープレートを含む１個の容器、 − 〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体の成分 の１つ、好ましくはＰＡＩ−タイプ−１又はそのような複合体に対する少なくと も１種の標識剤（該標識剤は、好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼのような 検出可能標識を有している）を含む１個の容器、 − ｔ−ＰＡを含む１個の容器 からなる。 特に、上記本発明キットの特定の実施態様は、少なくとも、 − 固定化捕獲剤としての固定化ａｂ_u-PA及び場合によってさらに固定化ａｂ_{t- PA} 及び標識剤として、好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼのような検出可能 標識を有する抗体ａｂ_{PAI-タイフ゜-1} を含む。 本発明はさらに、関連分子形態のｔ−ＰＡに対する固定化抗体を含むマイクロ タイタープレートのような担体、及び関連分子形態のｕ−ＰＡに対する固定化抗 体をさらに含むそのようなマイクロタイタープレートにも関する。該抗体は特に 、〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体中で結合している分子形態に結 合し得る。 以下に呈示される知見に基づいて、以下の標準アッセイ プロトコルを考案した。材料及び方法 ヒトＰＡＩ−１（ロット番号：02604）はAmerican Diagnostica（Greenwich， U.S.A.）から、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ− Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｓｅｐｈａｃｒｙ ｌ Ｓ−３００、ＣＮＢｒ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ及びＳＰＤＰ（Ｎ−スク シンイミジル３−（ピリジルジチオ）プロピオネート））はPharmacia，Uppsala ，Swedenから、ｔ−ＰＡ（Ａｃｔｉｌｙｓｅ）は、Boehringer Mannheimから、 西洋ワサビペルオキシダーゼ（Grad I，108090）はBoehringer Mannheimから、 ＴＭＢ（３，３′，５，５′−テトラメチルベンズアミジン）はSigmaから、カ ゼインはMerck，Darmstadt，Germanyから、ＰＰＡＣＫ（Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒ ｏ−Ａｒｇ−ＣＭＫ，２.５ＴＦＡ）はBachem-Bubendorf，Switzerlandから、酸 性シトレートを含むＳｔａｂｉｌｙ ら購入した。ＰＢＳＴ：0.005Mのホスフェート、0.13Mのホスフェート、0.13Mの ＮａＣｌ、0.05％(v/v)のＴｗｅｅｎ ２０（ｐＨ7.4）。 先に記載（Bosら，Production and characterisation o f a set of monoclonal antibodies against tissue-type plasminogen activat or(t-PA)．Fibrinolysis 1992；6：173-182）のようにして、抗ｔ−ＰＡモノク ローナル抗体を合成した。全ての形態のｔ−ＰＡと等しく良好に反応する抗体は 本明細書ではＯＴ０７と称される。コーティングに最適なＯＴ０７濃度を検出す るために、ポリスチレンマイクロタイタープレートを、0.04MのＴｒｉｓ・ＨＣ ｌ（ｐＨ7.4）中１〜15μg/mlの範囲のＯＴ０７濃度で、４℃で一晩インキュベ ートした。次いで、プレートを洗浄し、乾燥した。最適濃度は、８〜12μg/ml、 好ましくは9.5〜10.5μg/mlの範囲である。ある条件下では、血漿は、〔（ｔ− ＰＡ）−（ＰＡＩ−１）〕複合体及び〔（ｕ−ＰＡ）−（ＰＡＩ−１）〕複合体 を含んでいてよい。アッセイにおいて後者の複合体の濃度を測定するのにも、Ｏ Ｔ０７と抗ｕ−ＰＡモノクローナル抗体との混合物、即ち、それぞれ３〜10μg/ mlのＯＴ０７、２〜10μg/mlの抗ｕ−ＰＡの混合物でプレートをコーティングす る。 抗ＰＡＩ−１ポリクローナル抗体をウサギに産生させた。ウサギに、フロイン トの完全アジュバントと0.15MのＮａＣｌ中のＰＡＩ−１溶液の１：１（v/v）混 合物（濃度：5 0μgＰＡＩ−１／ml）を注射した。30日間隔でフロイントの不完全アジュバント との同一ＰＡＩ−１溶液の１：１（v/v）混合物で追加免疫した。Ｐｒｏｔｅｉ ｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーを用いて免疫感作したウサギの血 清からウサギポリクローナル抗体を精製した。血清試料を1.5Mのグリシン、３M のＮａＣｌ、0.01％のＮａＮ₃（v/v）（ｐＨ8.9）に２倍希釈し、同一緩衝液で 実施されるＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに加えた。５カラム容 量の緩衝液で洗浄後、抗体を0.1Mのグリシン（ｐＨ2.5）で溶離し、直ちに１Mの Ｔｒｉｓ（ｐＨ7.7）で中和し、0.1MのＮａ₂ＨＰＯ₄、ＫＨ₂ＰＯ₄でｐＨ7.5に調 整した0.1MのＮａＣｌ中で徹底的に透析した。 製造業者（Pharmacia社）により推奨されたＳＰＤＰ法を用いて、精製された ウサギポリクローナル抗体をＨＲＰ（＝西洋ワサビペルオキシダーゼ）と結合し た。結合後、反応混合物を、0.1Mのホスフェート，0.1MのＮａＣｌ（ｐＨ.5）中 で実施されるＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラム上で分画した。結合体を含 む画分をプールし、結合体溶媒〔0.05％（v/v）のＴｗｅｅｎ ２０及び0.2％（ w/v）のカゼイン（ｐＨ7.5）を含む、0.1MのＮａ₂ＨＰＯ₄・２ Ｈ₂Ｏ；0.03MのＫＨ₂ＰＯ₄；0.13MのＮａＣｌ〕中に作業希釈濃度に希釈した。 主として、総ｔ−ＰＡ抗原についての上記１段階酵素イムノアッセイ（Bosら ，A one-step enzyme immunoassay for the determination of total tissue-ty pe plasminogen activator（t-PA）antigen in plasma．Blood Coagul．Fibrino l．1992;3:303-307）を用いて、ｔ−ＰＡの濃度を測定した。 ＰＡＩ−１喪失血漿を調製するために、製造業者の指示に従って、精製された 抗ＰＡＩ−１抗体をＣＮＢｒ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上で固定化した。固定 化抗体カラム上を通過させて血漿からＰＡＩ−１を除去した。全てのＰＡＩ−１ 抗原を血漿から除去し、２種の異なるＥＩＡ、即 eden；カタログ番号:210221）及びＩｎｎｏｔｅｓｔ ＰＡＩ−１（Innogenetic s BA，Antwerp，Belgium）により評価した。 テストキットに用いるべき参照血漿の検量は以下の通りである： 〔（ｔ−ＰＡ）−（ＰＡＩ−１）〕を含み、遊離ｔ−Ｐ Ａを含まない、参照として用いるべき血漿試料を、0.01MのＥＤＴＡ及び0.05％ のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ／ＥＤＴＡ）で希釈する。希釈した 血漿をＨＲＰと結合した等量のポリクローナル抗ｔ−ＰＡと混合する。 Bosらにより記載の方法〔Blood Coagulation & Fibrinolysis 3（1992）303〕 に従って、全てのｔ−ＰＡ抗原を除去した別の血漿試料を既知量の純粋ｔ−ＰＡ でスパイクする。除去／スパイクした血漿をＰＢＳＴ／ＥＤＴＡで段階希釈し、 段階希釈物のアリコートをＨＲＰと結合した等量のポリクローナル抗ｔ−ＰＡと 混合する。 推定参照血漿／ポリクローナル抗ｔ−ＰＡ−ＨＲＰ結合体混合物、及び段階希 釈された除去／スパイク血漿／ポリクローナル抗ｔ−ＰＡ−ＨＲＰ結合体混合物 の両方の100μlアリコートをマイクロタイタープレートのＯＴ０７コーティング ウエル中、室温で３時間インキュベートする。記載のように、洗浄、発色、反応 の停止を行う。 得られた除去／スパイク血漿段階希釈物のＯＤを試料中に存在するｔ−ＰＡの 濃度に対してプロットする。推定参照血漿中のｔ−ＰＡの濃度をグラフから読み 取る。ｔ−Ｐ Ａ／ＰＡＩ−１は１：１複合体であるから、参照血漿中のモルＰＡＩ−１濃度は そのようにして検出されたｔ−ＰＡ濃度に等しいことは明らかである。アッセイプロトコル − 血液のような測定するべき試料を、〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕 複合体の形成を阻害する手段（該手段は、可逆性であるか、又は試料採取後に反 作用し得る）を含む容器内に入れる。該容器は、凝固を阻害する手段をさらに含 む。両方の目的を達成する手段がＳｔａｂｉｌｙｔｅ（登録商標）チューブ内に 存在する。次いで、試料を２つの副次試料に分割する。一方の副次試料はＰＰＡ ＣＫ含有ＰＢＳＴで慣用的に２倍希釈し（最終ＰＰＡＣＫ濃度：30μM）、他方 をＰＢＳＴで４倍希釈する。しかし、非希釈試料も低ＰＡＩ−１活性レベルを有 する（と予想される）試料の場合には許容され得、高希釈試料は、ＰＡＩ−１活 性レベルが高い（と予想される）試料及び〔（ｔ−ＰＡ）−（ＰＡＩ−１）〕複 合体の場合に許容され得る。 − ４倍希釈された副次試料75μlに、ＰＢＳＴ中のｔ−ＰＡ溶液15μlを加えて 、10ngｔ−ＰＡ／mlの最終濃度を得る。他方には、ＰＢＳＴ15μlを加える。 − 次いで、試料を結合体溶媒中のＨＲＰ−結合ポリクローナル抗ＰＡＩ−１抗 体溶液60μlと混合する。 − 両方の副次試料を室温で１時間インキュベートする。これらの混合物の100 μlアリコートを、マイクロタイタープレートのＯＴ０７（材料及び方法の項参 照）コーティングウエルに移し、室温で３時間インキュベートする。 − 次いで、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄する。ＴＭＢ基質を加え、室温で25 分間インキュベートする。 − ２NのＨ₂ＳＯ₄100μlを加えて反応を停止し、得られた黄色をマルチチャン ネル分光光度計（Organon Tekinika，Turnhout，Belgium）で測定する。測定す べきパラメーターと無関係な特定の化合物の有無によるＯＤ値の偏差を最小限に するために、できるだけ近似した方法で段階（ａ）及び（ｃ）のポーションを処 理するのが好ましい。 この種のいずれのアッセの場合と同様に、検量材料が必要であることは明らか である。検量材料として血漿を用いる場合には、以下の検量手順が有効であるこ とが見いだされた。 検量剤として用いるべくプールされた正常な血漿を37℃で24時間インキュベー トして、内在活性ｔ−ＰＡを〔（ｔ −ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体に変換した。このインキュベーショ ンの後では遊離ｔ−ＰＡは全く存在しない。次いでｔ−ＰＡ抗原の量を測定し（ Bosら，A one-step enzyme immunoassay for the determination of total tiss ue-type plasminogen activator（t-PA）antigen in plasma．Blook Coagul．Fi brinol．1992;3:303-307）、ｔ−ＰＡとＰＡＩ−１が１：１複合体であると仮定 して、血漿プール中のＰＡＩ−１の量を計算する。上記標準プロトコルに従って 、血漿プールの２倍段階希釈物を用いて、未知（副次）試料中のＰＡＩ−１濃度 を読み取り得る検量曲線を形成する。典型的な検量曲線を図４に示す。 該アッセイにより、サンプリング時点の〔（ｔ−ＰＡ）−（ＰＡＩ−１）〕複 合体の量、ｔ−ＰＡにより複合体化され得るＰＡＩ−１の総量及び活性ＰＡＩ− １の量に等しいこれらの２つの値の間の差を得る。 このアッセイを、International Society of Thrombosis and HaemostasisのS cientific and Standardization Committee(SSC)のSubcommittee on Fibrinolys is（Working party of Drs．Declerck，Gram，Jespersen and Kluft）のブライ ンドテストで評価した。該テストは可能な参照法 を同定するべく設計された。ＳＳＣ参照法の基準は：免疫喪失試料及び活性喪失 試料は陰性でなければならない；アッセイとＰＡＩ−１濃度との良好な一次性が なければならない；アッセイではＰＡＩ−２及びＰＡＩ−３を検出してはならな い、即ち、胎盤ＰＡＩ及び尿ＰＡＩ並びにＳｔａｂｉｌｙｔｅ（登録商標）血漿 へのｔ−ＰＡの添加により発生する変化は20％未満でなければならないというも のであった。このテストに用いられた試料を表１に要約する。これら及び他の試 料を用いて得られた結果を以下に示す。一次性 ０、4.6、17及び55.8のＰＡＩ−１／mlでスパイクしたＰＡＩ−１免疫喪失血 漿は、添加されたＰＡＩ−１濃度と検出されたＰＡＩ−１濃度との優秀な一次的 相関関係（ｒ＝0.9998）、ｙ＝0.951@＋0.01を示した。これは、相関関係だけで なく、絶対数もＳＳＣ基準と一致することを示している。アッセイの特異性 − 自家法に従ってＰＡＩ−１抗原を除去した血漿試料（２種の異なるＰＡＩ− １抗原テストにより決定された；材料及び方法の項参照）は当該アッセイにおい て何の応答 も示さなかった。しかし、Verheijenらにより記載の光度測定アッセイ（Verheij en JH，Chang GTG，Kluft C．Evidence for the occurrence ofａfast-acting i nhibitor of tissue-type plasminogen activator in human plasma．Thromb Ha emostas 1984;51:392-395）ではまだかなり明白なＰＡＩ−１活性が示され、該 活性は、他のプロテアーゼ阻害剤によるものか、又は先に記載のｔ−ＰＡ結合タ ンパク質によるものであり得る。ＳＳＣテスト（表１）からの免疫喪失試料も活 性喪失試料も当該アッセイにおいて陰性であった。 − 妊娠中の女性（高レベルのＰＡＩ−２を有する）由来で、ＰＡＩ−１を除去 した血漿試料は当該ＥＩＡにおいて陰性であった。ＰＡＩ−１を喪失し、ＰＡＩ −２（50ng/ml）又はＰＡＩ−３（5.5μg/ml）（ＳＳＣテスト：表１）でスパイ クした血漿試料は陰性であった。 − Ｓｔａｂｉｌｙｔｅ（登録商標）血漿にｔ−ＰＡを添加すると、結果が20％ を大きく下回る程に変化する（表１）。 − 血小板が豊富な（ＰＲＰ）血漿及び血小板が乏しい（ＰＰＰ）血漿（同一ド ナー由来の）を、凍結及び融解 （血小板を透析するべく）した後で比較すると、ＰＲＰの活性ＰＡＩ−１の値は ＰＰＰに比べてわずかな増大を示したが、抗原レベルはＰＰＰに比べてＰＲＰの 方がかなり高かった。これは、全ＰＡＩ−１抗原の大多数が血小板中に不活性形 態で存在するという事実と一致する。 ＰＡＩ−１は37℃でインキュベートするとその活性を喪失することは公知であ る。このプロセスが当該アッセイにも該当するかどうかを評価するために、同一 血漿のアリコートを異なる温度で異なる時間インキュベートした。次いで、活性 ＰＡＩ−１（当該アッセイ）のレベル、ＰＡＩ−１抗原（Innotest，Innogeneti cs，Belgium）及び見かけＰＡＩ−１活性（Verheijen JH，Chang GTG，Kluft C. により記載の分光光度測定アッセイ．Evidence for the occurrence of a fast- acting inhibitor of tissue-type plasminogen activator in human plasma．T hromb Haemostas 1984；51：392-395）のレベルを測定した。 抗原の量はインキュベーション時間及び温度に無関係であることが見いだされ た。２種のＰＡＩ−１活性テストは、特に37℃で減少を示しているが、分光光度 測定アッセイで評価したＰＡＩ−１活性の見かけ半減期は当該アッセイで観察さ れたものよりはるかに短い。これは、分光光度測定アッセイでも検出されるが、 当該ＥＩＡでは検出されないＰＡＩ−１とは別のプロテアーゼ阻害剤によるもの であり得る。当該ＥＩＡによれば、ＰＡＩ−１活性の見かけ半減期は、37℃、18 ℃及び４℃で、それぞれ、２時間、23時間、 及び24時間以上であった。これは、Philipsらが検出した値、それぞれ、2.3、20 及び117時間とかなり一致したものであった（Philips Mら，A specific immunol ogic assay for functional plasminogen activator inhibitor-1 in plasma．S tandardized measurement of the inhibitor and related parameters in patie nts with venous thromboembolic disease．Thromb Haemostas 1992；68:486-49 4）。 正常な安静ドナー由来の血漿を用いた場合には、ｔ−ｐＡとＰＡＩ−１との反 応を防止するような特別な予防処置を取る必要がないことが観察された（Philip s M.ら，前出）。ｔ−ＰＡと共にインキュベートしていない副次試料において、 ＰＰＡＣＫを用いた場合と用いない場合のアッセイを行って上記観察を確認した （示さず）。わずかな差が認められたが、ＰＰＡＣＫを用いなかった場合には、 活性ＰＡＩ−１の見かけレベルは平均して10％低くなった。しかし、ｔ−ＰＡの レベルが増大している患者の場合には、正確な結果を得るためには、段階（ａ） の試料ポーションに対して複合体化を阻止する手段が絶対に必要である。アッセイの再現性 ２種の別々の血漿を６倍で測定してアッセイ内可変性を 評価した。２種の試料は、１ml当たり（平均して）8.8ng及び14.4ngの活性ＰＡ Ｉ−１を含んでいた。それらのアッセイ内ＣＶはそれぞれ、4.5％及び8.3％であ った。 日を変えて４回（１日１回の測定）、同一試料を測定すると、（平均して）9. 1ng及び14.1ngの活性ＰＡＩ−１値が検出され、アッセイのＣＶはそれぞれ、5.5 ％及び6.4％であった。 ＰＡＩ−１のレベルが非常に低い（1ng/mlのオーダーの）試料では、かなり高 いＣＶ（約30％）を有する結果が得られた。そのような試料は標準手順（上記参 照）におけるものより低い希釈物で再評価する必要がある。正常な活性ＰＡＩ−１レベル 16種の正常で健康なドナーの血漿では、0.6〜18.6ng/mlの範囲の活性ＰＡＩ− １レベルが検出された。ｔ−ＰＡ／ＰＡＩ−１複合体の形態のＰＡＩ−１レベル は、1.1〜9.5ng/mlの範囲であった。本発明のアッセイを用いると、引用した欧 州特許出願第0450086号の場合より感度が良い。血液の採取 抗凝固剤としてシトレート又はＥＤＴＡを用いて正常体から血液を採取し、遠 心し、すぐ-80℃で貯蔵する場合に は、活性ＰＡＩ−１からｔ−ＰＡ／ＰＡＩ−１複合体への変換の阻止に何ら特別 な予防処置を必要としない。該アッセイは患者のレベルの評価にも用いられるの で、止血バランスがひどく乱され得る場合そのような手段が必要であり、Ｓｔａ ｂｉｌｙｔｅ（登録商標）チューブ（酸性シトレート）の使用が好ましい。本ア ッセイの実施例で用いられる緩衝液は該アッセイのｐＨを約7.4に補正する。該 緩衝液は、免疫反応を効果的に実施し得るｐＨにするものでなければならない。 Ｓｔａｂｉｌｙｔｅ（登録商標）チューブを用いることのさらなる利点は、血小 板に及ぼす安定化作用、即ち、極めて高率で血小板中に存在する潜伏ＰＡＩの血 漿への放出を防止し、それによって不正確な測定を発生させ得る潜在的源を排除 することにある。

───────────────────────────────────────────────────── 【要約の続き】 ーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）を添加した後に存在する 〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体の総量に 対応する値を決定する段階、（ｄ）段階（ｃ）で決定さ れた値から、過剰量のｔ−ＰＡを添加した後に存在する 〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体の量を計 算する段階、（ｅ）段階（ｄ）で測定された複合体の総 量から段階（ｂ）で測定された複合体の総量を減算し て、サンプリングの時点に存在した活性ＰＡＩ−タイプ −１の量を、該ポーションの容量に相当する試料の容量 として得る段階を含み、段階（ａ）のポーションを、Ｐ ＡとＰＡＩ−タイプ−１との複合体化を阻害する手段と 接触させ、次いで、固定化抗ｔ−ＰＡ及び標識化抗ＰＡ Ｉと共にインキュベートし、段階（ｃ）のポーション を、過剰量の活性形態ｔ−ＰＡと接触させ、次いで固定 化捕獲剤及び標識剤と共にインキュベートすることから なる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試料中に存在する活性プラスミノーゲン−活性化因子−阻害剤−タイプ−１ （ＰＡＩ−タイプ−１）の定量法であって、試料から２つのポーションを採取し 、少なくとも以下の段階： （ａ）一方のポーションにおいて、ＰＡＩ−タイプ−１とプラスミノーゲン−活 性化因子（ＰＡ）との複合体、即ちサンプリングの時点にすでに存在するプラス ミノーゲン−活性化因子（ＰＡ）との所謂〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１） 〕複合体の総量に対応する値を決定する段階、 （ｂ）段階（ａ）で決定された値から、サンプリング時点で存在する〔（ＰＡ） −（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体の量を計算する段階、 （ｃ）他方のポーションにおいて、該ポーションに、過剰量の活性形態の組織タ イプのプラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）を添加した後に存在する〔（Ｐ Ａ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体の総量に対応する値を決定する段階、 （ｄ）段階（ｃ）で決定された値から、過剰量のｔ−ＰＡ を添加した後に存在する〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体の量を計 算する段階、及び （ｅ）段階（ｄ）で測定された複合体の総量から段階（ｂ）で測定された複合体 の総量を減算して、サンプリング時点に存在する活性ＰＡＩ−タイプ−１の量を 、該ポーションの容量に対応する試料の容量において得る段階 を実施することからなり、 段階（ａ）のポーションを、サンプリング時点から段階（ａ）までのＰＡとＰ ＡＩ−タイプ−１との複合体化を阻害する手段と接触させること、 段階（ａ）は、 − 該ポーションを（ｉ）ＰＡ、好ましくは〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１ ）〕複合体のＰＡを指向し、（ii）該ポーションに存在する分子形態のＰＡ、好 ましくは〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体が捕獲剤との複合体を形 成するに十分な量及び特異性をもって存在する少なくとも１種の固定化捕獲剤と 接触させ、 − 前記ポーションを（ｉ）好ましくは検出可能な標識（＊）を有し、（ii）Ｐ ＡＩ、好ましくは〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体のＰＡＩを指向 し、（ii i）該ポーション中に存在する分子形態のＰＡＩ−タイプ−１が標識剤との複合 体を形成するに十分な量及び特異性をもって存在する少なくとも１種の標識剤と 接触させ、 − 次いで、適切なインキュベーション及び洗浄段階の後で、固定化捕獲剤に結 合することにより固定化された（＊）の量に対応する値を決定することからなり 、 段階（ｃ）は、 − 他方のポーションを、過剰量の活性形態のｔ−ＰＡと接触させ、それによっ て添加の前に該ポーション中に存在する結合していない活性ＰＡＩ−タイプ−１ が〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体を形成することを可能にし、さ らに − 該ポーションを段階（ａ）に記載の標識剤及び捕獲剤と接触させ、 − 次いで、固定化捕獲剤に結合することにより固定化された（＊）の量に対応 する値を決定することからなることを特徴とする方法。 ２．捕獲剤が、１本鎖ｔ−ＰＡ、２本鎖ｔ−ＰＡ又は〔（ｔ−ＰＡ）−（ＰＡＩ −タイプ−１）〕複合体のような異なる分子形態のｔ−ＰＡと結合し得る抗体（ ａｂ_t-PA）、 好ましくはモノクローナル抗体である請求項１に記載の方法。 ３．標識剤が、ＰＡＩ−タイプ−１、好ましくは〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ −１）〕複合体のＰＡＩに対する抗体である請求項１又は２に記載の方法。 ４．１本鎖ｕ−ＰＡ、２本鎖ｕ−ＰＡ又は〔（ｕ−ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ− １）〕複合体のような異なる分子形態のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因 子と結合し得る第２の捕獲剤、例えば、抗体（ａｂ_u-PA）、好ましくはモノクロ ーナル抗体をさらに含む請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。 ５．ＰＡに対する捕獲剤が少なくとも分子形態の対応〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タ イプ−１）〕複合体と結合する請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。 ６．ＰＡＩ−タイプ−１に対する標識剤、特に抗体（ａｂ_{PAI-タイフ゜-1}）が、ＰＡ Ｉ−タイプ−１を注射した哺乳動物の血清から得られる請求項１から５のいずれ か一項に記載の方法。 ７．サンプリング時点から段階（ａ）までの間、ＰＡとＰＡＩ−タイプ−１との 複合体化を阻害するための手段が、 例えば、酸性シトレートを添加して、試料のｐＨを、複合体化を阻害する酸性レ ベルまで変化させるか、又はＰＡ、特にＰＰＡＣＫ（Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ− Ａｒｇ−ＣＭＫ）のようなｔ−ＰＡの阻害剤を添加することを含む請求項１から ６のいずれか一項に記載の方法。 ８．段階（ｃ）に用いるべきポーションにも、サンプリングの時点から、ＰＡと ＰＡＩ−タイプ−１との複合体化を阻害する手段を課し、段階（ｃ）の前に、該 ポーションに複合体化の阻害に反作用するか又は該作用を逆にする追加手段を課 す請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。 ９．複合体化を阻害するための手段が、十分に酸性のｐＨで維持するのに必要な 手段であり、阻害に反作用する手段が、例えばリン酸緩衝液を添加して、酸性ｐ Ｈを捕獲及び／又は標識が生起し得るレベルまで変えることを含む請求項８に記 載の方法。 １０．段階（ａ）及び（ｃ）の前に、両方のポーションに、免疫反応を可能にす るが、しかしそれによって段階（ａ）で〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕 への複合体化が阻害されたままでいることを確実にするための手段を課し、該手 段は、例えば、段階（ａ）及び場合によって段階（ｃ） で、段階（ａ）のポーションにＰＰＡＣＫのようなｔ−ＰＡ阻害剤を添加して、 ｐＨを、捕獲及び／又は標識が生起し得るレベルに変えて、複合体化の阻害を確 実にすることからなる請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。 １１．検出可能標識が、基質として色素原と、生成系として発色団を有する酵素 であり、該検出可能標識が、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼである請求項１ から１０のいずれか一項に記載の方法。 １２．捕獲剤がマイクロタイタープレートのウエルに固定化されている請求項１ から１１のいずれか一項に記載の方法。 １３．固定化標識剤の量が、試料のＯＤ値を測定することにより決定される請求 項１から１２のいずれか一項に記載の方法。 １４．段階（ｂ）及び（ｄ）において、段階（ａ）及び（ｃ）で得られたそれぞ れの値から、該値と参照曲線上の対応値とを比較して〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タ イプ−１）〕複合体の量を計算することをさらに含み、該参照曲線が、〔（ＰＡ ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体の既知濃度を固定化標識剤によって産生さ れた対応ＯＤ値に対してプ ロットしたものである請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。 １５．前記参照曲線が、特定の既知濃度の〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１） 〕複合体を含む少なくとも１種の参照試料及び／又は該参照試料の１種以上の希 釈物を用いて段階（ａ）又は（ｃ）を実施し、それによって２種の特定濃度の〔 （ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体に対応する少なくとも２つの値を得 、決定された値を該複合体のそれぞれの特定濃度に対してプロットすることによ り得られる請求項１４に記載の方法。 １６．請求項１５に記載の方法に用いるべき参照試料中の特定の既知濃度の〔（ ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体を定量する方法において、複合体化形 態のｔ−ＰＡの定量に好適なｔ−ＰＡ定量アッセイの使用。 １７．以下の段階： （１）参照試料に、該試料中に存在する少なくとも実質的に全てのｔ−ＰＡが〔 （ｔ−ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体に変換されるような条件を課す 段階、 （２）段階（１）から得られた混合物の段階希釈物を調製して副次試料を得る段 階、 （３）段階（２）で形成された副次試料を、〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１ ）〕複合体の成分の１つに対する少なくとも１種の固定化捕獲剤と接触させて、 固定化〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体を得る段階、 （４）段階（３）からの固定化複合体を、該固定化複合体の１つの成分、好まし くは請求項１５に記載の方法の段階ａ−ｄに用いたものと同じ検出可能標識（＊ ）を有している、請求項１５に記載の定量法の段階ａ−ｄにおける標識剤が指向 するのと同じ成分に対する少なくとも１種の標識剤と接触させる段階、 （５）各副次試料を測定して、副次試料当たりの固定化検出可能標識（＊）の量 に対応する値を得る段階、及び （６）請求項１５又は１６に記載の方法に用いるべき参照試料中の特定の既知濃 度の〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体を定量するために、段階（５ ）で得られた値を該値に対応する標識の量であって、該標識及び標識剤が指向す る〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕の成分についての検量曲線から誘導さ れ得る標識の量に対してプロットする段階 からなる方法の使用。 １８．標識剤がｔ−ＰＡを指向する請求項１７に記載の使用。 １９．段階（３）で、固定化〔（ｔ−ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体 を生成するｔ−ＰＡに対する固定化捕獲剤を用い、段階（４）で、段階（３）で 得られた固定化複合体を、固定化〔（ｔ−ＰＡ）−（ｐＡＩ−タイプ−１）〕複 合体中に含まれる関連分子形態のｔ−ＰＡに対する標識剤であって、請求項１５ 又は１６に記載の方法の段階ａ−ｄに用いられているものと同じ検出可能標識を 有している標識剤と接触させる請求項１７又は１８に記載の使用。 ２０．請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法を実施するための成分を含 むキットであって、少なくとも、 − 既知量の〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体を含む１種の試料、 − ＰＡ、好ましくは〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ−１）〕複合体のＰＡを指 向するか又はそのような複合体自体を特異的に指向する少なくとも１種の固定化 捕獲剤を含む、マイクロタイタープレートのような担体を含む１個の容器、 − ＰＡＩ、好ましくは〔（ＰＡ）−（ＰＡＩ−タイプ− １）〕複合体のＰＡＩを指向するか又はそのような複合体自体を特異的に指向す る標識剤であって、好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼのような検出可能標 識を有している標識剤の少なくとも１種を含む１個の容器、 − ｔ−ＰＡを含む１個の容器 を含むキット。 ２１．ｔ−ＰＡに対する固定化抗体（ａｂ_t-PA）、好ましくはＯＴ０７のような モノクローナル抗体を含み、場合によって、 − マイクロタイタープレート上の固定化捕獲剤としてのｕ−ＰＡに対する固定 化抗体、及び − 標識剤としてのＰＡＩ−タイプ−１に対する抗体（ａｂ_{PAI-タイフ゜-1}） をさらに含む請求項２０に記載のキット。 ２２．リン酸緩衝液及び場合によってＰＰＡＣＫ（Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａ ｒｇ−ＣＭＫ）を含む容器をさらに含む請求項２０又は２１に記載のキット。 ２３．ｔ−ＰＡに対する固定化抗体（ａｂ_t-PA）、場合によってｕ−ＰＡに対す る固定化抗体（ａｂ_u-PA）をさらに含む担体、例えばマイクロタイタープレート 。