JPH08510555A - 第ｘ因子除去血漿の調製のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 第Ｘ因子欠乏血漿を調製するための方法が提供されている。この方法においては、正常血漿を第Ｘ因子に対するモノクローナル抗体をとり付けてある免疫吸着剤と接触させる。第Ｘ因子は該免疫吸着剤に結合し、そして第Ｘ因子欠乏血漿が収集される。抗第Ｘ因子抗体免疫吸着剤は再使用してよい。第Ｘ因子に対するモノクローナルも提供されている。

Description

【発明の詳細な説明】 第Ｘ因子除去血漿の調製のための方法 本発明は、第Ｘ因子除去血漿を調製する方法に関する。具体的には、本発明は 、固相に結合させたモノクローナル抗体を用いて第Ｘ因子除去血漿を製造する方 法に関する。本発明はまた、第Ｘ因子のＬ鎖に対するモノクローナル抗体に関す る。 発明の背景 第Ｘ因子又はスチュワート因子は、ビタミンＫ依存性の血液凝固タンパク質で ある。第Ｘ因子は、約59,000のおよその分子量を有し、ジスルフィド結合によっ て保持されたＨ鎖（分子量142,100）及びＬ鎖（分子量16,000）とから構成され ている。第Ｘ因子は、血液凝固カスケードの内因性及び外因性経路の中間相に関 与する。内因性経路においては、第Ｘ因子は、第VIIIａ因子、カルシウム及びリ ン脂質の存在下に第IXａ因子によって蛋白分解されることにより、第Ｘａ因子へ 変換される。外因性経路においては、第Ｘ因子は、組織因子の存在下に第VIIａ 因子により第Ｘａ因子へと変換される。第Ｘａ因子は、プロトロンビンをトロン ビンに変換する。トロンビンは、次いでフィブリノーゲンをフィブリンへ変換す る。 第Ｘ因子の第Ｘａ因子への切断は、第Ｘ因子のＨ鎖のアミノ側末端に近い特定 のArg-Ile結合において起こると考えられている。Ｌ鎖は切断されずに残る。 第Ｘ因子の仮の構造が提出されている。Leytres，Stephen P．etal.，Gene fo r Human Factor X：A Blood Coagulation Factor Wh ose Gene Organization is Essentially Identical with that of Factor IX an d Protein C; Biochemistry 25：5098-5102（1986）．このＬ鎖はGlaドメイン及 び潜在的成長因子ドメインを含んでいる。加えて、Ｌ鎖は、多くのｇ−カルボキ シグルタミン酸残基及びｂ−ヒドロキシアスパラギン酸残基を含んでいる。 ヒトにおける第Ｘ因子欠乏は、種々の血液凝固異常を引き起こす。第Ｘ因子欠 乏は、先天的か又は、クマリン若しくはワルファリンのような薬物による治療に よるものであり得る。第Ｘ因子の遺伝的欠乏を有する患者は、種々の出血パター ンを示す。第Ｘ因子は、常染色体劣性形質として伝達される。重度に減少した値 （すなわち、第Ｘ因子活性１％未満）は、ホモ接合体においてのみ見られ、約20 ％未満のレベルはヘテロ接合体においてのみ見られる。Graham JB，et al.，Stu art factor defect II．Genetic aspects of a“new”hemorrhagic state．J．C lin．Invest：36，497（1957）.従って、適正な治療が施せるよう、ヒトにおけ る第Ｘ因子の活性を測定できることは重要である。 第Ｘ因子除去又は欠乏血漿は、血液凝固研究に適した血漿であり、本質的に第 Ｘ因子を欠いているが、しかし、血漿に通常存在している他の全ての血液凝固因 子を、本質的に正常な濃度に含んでいる。 第Ｘ因子欠乏血漿は、血漿のような、第Ｘ因子含有液体における第Ｘ因子の活 性を測定するのに適している。 第Ｘ因子欠乏は、プロトロンビン時間（ＰＴ）試験又は部分トロンボプラスチ ン時間（ＰＴＴ）試験のような手段によって測定することができる。そのような 試験を用いるときＰＴ及びＰＴＴが共に 延長されるからである。例えば、ＰＴ試験においては、患者の血漿が第Ｘ因子欠 乏血漿と混合され、そしてＰＴ値が測定されるが、そのＰＴの補正の程度は、そ の患者の血漿中の第Ｘ因子のレベルに比例する。機能的第Ｘ因子は、血液凝固時 間の対数を較正された参照血漿又は新鮮な正常血漿プールの希釈の対数の関数と してプロットすることにより得られた用量−作用曲線を用いて定量される。 このアッセイは、約１％未満の第Ｘ因子活性に対して感受性でなければならな い。加えて、このアッセイは、約50％の第Ｘ因子活性であるボーダーラインの正 常パーセントの第Ｘ因子に対して感受性でなければならない。該アッセイの感度 の多くは、第Ｘ因子欠乏血漿における第Ｘ因子活性の量によって測定される。例 えは、第Ｘ因子欠乏血漿が１％より高い活性第Ｘ因子を含んでいるならば、アッ セイに際して作られた該標準曲線は、５未満から約15％までの第Ｘ因子活性にお いては、感受性でない（図１を見よ）。従って、該第Ｘ因子欠乏血漿中の残存第 Ｘ因子活性は、血漿中の第Ｘ因子活性の測定に対し極めて重大である。 第Ｘ因子欠乏血漿は、１％未満の第Ｘ因子活性を有する組成物の形でBaxter D iagnostics Inc.，Sigma Diagnosticsその他の源から入手可能である。Baxter D iagnostics Inc．から入手可能な組成物は、プールされた正常ヒト血漿からポリ クローナル抗体によって第Ｘ因子を除去することによって調製された、免疫吸着 された第Ｘ因子欠乏血漿である。Sigmaからの組成物は、凍結乾燥された、第Ｘ 因子が先天的に欠乏しているヒト血漿である。 第Ｘ因子に対するポリクローナル抗体を用いて調製された、免疫吸着された第 Ｘ因子欠乏血漿に関連した一つの問題は、該ポリクロ ーナル抗体の特異性にある。ポリクローナル抗体を用いると他の因子も除去され 得る。加えて、該ポリクローナル抗体は、第Ｘ因子に対する高い親和性を持たず 、従って血漿から除去するのにより多くの抗体を使用しなければならない。更に は、調製された免疫吸着カラムは、最終的調製物中における第Ｘ因子活性量の受 け入れがたい増加を伴わずしては、４回又は５回を超えて再生することができな い。従って、その有用性は限られている。最後に、抗体源は、一定でなく新しい 抗体源を連続的に供給しなければならない。こうして、ポリクローナル抗体の使 用は、コストがかかり且つ時間を浪費する。 血漿が１％未満の第Ｘ因子活性を有する供血者から得られた第Ｘ欠乏血漿は、 明らかな理由により、得るのが困難である。 先行技術におけるこれらの問題の解決は、第Ｘ因子に対するモノクローナル抗 体によって血漿を処理することである。しかしながら、標準曲線上において１％ 未満の第Ｘ因子活性のアッセイ感受性を許容する１％未満の第Ｘ因子活性を有す る血漿を得るためにモノクローナル抗体で血漿を処理することは、第Ｘ因子に対 するモノクローナルが調製されたにも関わらず、成功しなかった。 第Ｘ因子モノクローナル抗体は、当該分野において既知である。例えば、Chur ch，William R and Mann，Kenneth G.，A Simple Purification of Human Facto r X Using a High Affinity Monoclonal Antibody Immunoadsorbant, Thrombosi s Research，38：417-424（1985）は、ヒト第Ｘ因子及び第Ｘａ因子のＨ鎖上に 発現されたエピトープを有するモノクローナル抗体（ＦＸ−２ｂ）を記述してい る。第Ｘａ因子に対するその結合定数は９×10^-11Ｍ^-1である。その 抗体は、免疫吸着剤に結合させたとき、第Ｘ因子を精製するのに有用である。Ｂ ＦＸ２ｂ抗体は、Foster W.B．er al.，Monoclonal antibodies selective for the functional state of bovine factor V and factor Va; Thrombosis Resear ch 28：649-662（1982）に記述された方法を用いて調製された。Church，W．et al., Inhibitory Monoclonal Antibody to Factor X that Blocks Prothrombin Activation but not Prothrombosis Enzyme Assembly ，Blood 72（6）：1911-19 21 at 1912（1988）を参照。第Ｘ因子の精製に有用な抗体は、第Ｘ因子を免疫除 去した血漿の調製に有用な抗体ではないかも知れない、ということに注意するこ とが重要である。 Doellgost，G.J．and Rothberger H., Enzyme-Linked Coagulation Assays, A nalytical Biochemistry 152：99-207（1987）はまた、第Ｘ因子及び第Ｘａ因子 に結合するモノクローナル抗体（ＢＧ−Ｘ２及びＢＧ−Ｘ４）を記述している。 これらの抗体は、感度の高い酵素連結凝集アッセイを開発するのに使用されてき た。 最近、第Ｘ因子には結合するが第Ｘａ因子には結合しないモノクローナル抗体 （ＦＸ５２及びＦＸ６４）が開発された。Hoad，Richard B．and Geezy，Caroly n L.，Characterization of monoclonal antibodies to factor X/Xa：Initial observations with a quantitative ELISA procedure; Journal of Immunologic al Methods 136：269-278（1991）を参照のこと。加えて、Hoad and Geezyはま た、第Ｘａ因子に対して特異的なモノクローナル抗体（ＦＸａ２４）をも開発し た。彼らは、ＦＸ５２が、血漿中の第Ｘ因子を定量するのに及び血漿から第Ｘ因 子を捕捉するのに有用であり得ることを見いだした。Hoad and Geezyは、慣用の 方法を用いては第Ｘ因子に対 するモノクローナル抗体を生産することができなかったと報告した。従って、彼 らは、フットパッド免疫及びＬＮＣの融合を用いた。ＦＸ５２、ＦＸ６４及びＦ Ｘａ２４は、いずれも第Ｘ因子のＨ鎖と反応した。 抗体として、第Ｘ因子欠乏血漿を調製するのに成功するものであるためには、 その抗体は、他の因子との交差反応性が低くなくてはならず且つ第Ｘ因子に結合 するものでなくてはならない。実用的であるためには、該抗体への第Ｘ因子の結 合は、該抗体が変性されることのないよう十分穏やかな条件下に、可逆的である 必要がある。従って、固体支持体に結合させた該第Ｘ因子抗体は、血漿から除去 された後該免疫吸着剤が再生できるよう、可逆的に第Ｘ因子に結合するものであ る必要がある。次いで、第Ｘ因子は該抗体の変性を起こすことなく除去でき、そ して該免疫吸着剤が再使用できる。この免疫吸着工程により得られた第Ｘ因子欠 乏血漿は、第Ｘ因子活性が１％未満でなければならない。更には、第Ｘ因子欠乏 血漿を用いたアッセイの感度は、標準曲線上において１％未満である必要がある 。 発明の要約 本発明においては、第Ｘ因子除去血漿を調製するのに第Ｘ因子に対するモノク ローナル抗体が使用される。第Ｘ因子に対する固定化モノクローナル抗体を用い て正常な出発血漿から第Ｘ因子欠乏血漿を調製するための方法である。該モノク ローナル抗体は、固体支持体上へ固定化される。次いで、実質的に全ての第Ｘ因 子が第Ｘ因子に対する該抗体に結合するよう、出発血漿が該固体支持体と接触さ せられる。次いで、この第Ｘ因子除去血漿が収集される。本発明は 、第Ｘ因子活性が約１％未満でありそして標準曲線上において１％未満の第Ｘ因 子活性という感度を与えることができる、第Ｘ因子除去血漿を更に含む。本発明 はまた、第Ｘ因子のＬ鎖に対するモノクローナル抗体をも含む。 図面の簡単な記述 図１は、基質として本発明の第Ｘ因子欠乏血漿を用いた第Ｘ因子についての１ 段階凝固アッセイにおいて測定されたときの、種々の％の第Ｘ因子活性を与える よう緩衝剤に希釈された正常血漿プールからの連続希釈の凝固時間のグラフであ る。 図２は、図１において試験されたのと、１％の残存第Ｘ因子活性を与えるよう 第Ｘ因子欠如血漿基質がスパイクされたことを除き同じサンプルの、凝固時間の グラフである。 図３は、先天性第Ｘ因子欠乏血漿を基質として使用した同じサンプルの１段階 凝固アッセイと比較した、本発明の第Ｘ因子欠乏血漿を基質として使用した１段 階第Ｘ因子アッセイにおける、患者サンプルのグラフである。 図４は、Baxter Diagnostics Inc．から商業的に入手可能な第Ｘ因子欠乏血漿 を基質として用いたサンプルの１段階凝固アッセイと比較した、基質として本発 明の第Ｘ因子欠乏血漿を用いた１段階第Ｘ因子アッセイにおける患者サンプルの グラフである。 発明についての詳細な記述 モノクローナル抗体は標準的技術により調製される。Harlow E．and Lane D. ，Antibodies，A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory（1988） を参照のこと。ヒト第Ｘ因子に対する抗体は、Frend'sアジュバントその他の、H unter's Titermaxのような 適当なアジュバントに入れた有効量の第Ｘ因子によって、腹腔（ＩＰ）注射を用 いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫することによって調製される。第Ｘ因子の好まし い量は、約５乃至50μｇであり、最も好ましくは、第Ｘ因子の量は、約10μｇで ある。もし抗原量が高過ぎると、マウスは不耐容性を発現し得る。 マウスは、不完全Freund'sアジュバントその他の適当なアジュバントに入れた 十分量のヒト第Ｘ因子のＩＰ注射によって追加免疫することができる。最も好ま しい一具体例においては、第Ｘ因子の量は約10μｇである。この最も好ましい具 体例においては、第１回の免疫から約３週間後に追加免疫が行われる。マウスは 、リン酸緩衝食塩水その他の適当な緩衝液に入れた有効量の第Ｘ因子で、更に２ 週又はそれ以後にＩＰ注射によって再度追加免疫され、そして約１か月後に再度 追加免疫される。好ましくは、第Ｘ因子の量は、第Ｘ因子10μｇである。融合の 約３日前に、マウスは、有効量の第Ｘ因子でＩＰ注射によって追加免疫される。 最も好ましい一具体例においては、マウスは、１日当たり約50μｇの第Ｘ因子に より毎日追加免疫される。 融合は、標準の技術を用いて行われる。Harlow and Laneを参照のこと。免疫 されたマウスの脾臓からのリンパ球が、マウスの骨髄腫細胞と融合される。マウ スの骨髄腫のタイプは、決定的でない。好ましいマウス骨髄腫細胞系は、Ｘ−６ ３−Ａｇ8.653であり、Ｃ５マウス骨髄腫細胞としても知られている。融合され た細胞は、増殖因子を高めた培地を用いて細胞約２×10⁶個の濃度に播種される 。適した培地は、胎仔牛血清のような約20％の血清を含んだダルベッコ改良必須 培地（ＤＭＥＭ）である。細胞増殖を刺激するために マイトジェンのような増殖因子、マクロファージ又は他の適した増殖因子を加え ることが好ましい。プレートはＣＯ₂下に37℃にてインキュベートされる。細胞 は、プレート（例えはマイクロタイター・ウェル）の少なくとも約50％が覆われ たときに試験してよい。非常に多くのコロニーが形成されるため、厳格な選択基 準が必要である。 第１に、ハイブリドーマは、第Ｘ因子につきＥＬＩＳＡアッセイを用いてスク リーニングされる。マイクロタイター・プレートが、約0.5μｇ／ｍＬ乃至８μ ｇ／ｍＬの第Ｘ因子（１μｇ／ｍＬが好ましい）によって被覆される。好ましく は、このプレートを被覆するのに用いられる緩衝剤は、約４乃至40ｍＭ、好まし くは約15ｍＭのカルシウムイオンを含有する。この好ましい緩衝剤は、約７ｐＨ 単位より大きいｐＨにおいて緩衝作用を行う如何なる緩衝剤系であってもよい。 Friefelder，D．Physical Biochemistry，Second Edition，W.H．Freeman and C ompany Chapter 4（1983）を参照のこと。最も好ましい緩衝剤は、0.01Ｍのトリ ス、ｐＨ8.5である。ＥＬＩＳＡは、該ハイブリドーマ上澄のサンプル、ＩｇＧ ／ＩｇＭを接合させた酵素及び該酵素に対する基質を加えることにより、各ステ ップの間の必要な洗浄を伴って、行うことができる。停止溶液を加えることが便 利であり得る。上澄を含有しないサンプル（すなわち、ブランク又はバックグラ ウンド）もまた評価される。ＥＬＩＳＡアッセイにおいてブランクの値の約２倍 より大きい吸光度値を与えるハイブリドーマが注目される。 抗体は、他の因子に対する該ハイブリドーマの交差反応性を評価することによ って更に選択される。該ハイブリドーマからの抗体は 、プロトロンビン、トロンビン、フィブリノーゲン、第Ｖ因子、第XI因子、第XI I因子、第IX因子、第VII因子及び第VIII因子のような他の因子の約１μｇ／ｍＬ でマイクロタイター・プレートを被覆することによって、評価することができる 。第Ｘ因子に対する抗体は、各抗原についてＥＬＩＳＡ方式で試験される。これ ら他の血液凝固因子との交差反応性を有する抗体が注目される。 それらの抗体はサブタイプである。それらは、ＩｇＧ又はＩｇＭであり得る。 好ましい抗体は、ＩｇＧクラスのものであり、最も好ましくはＩｇＧ１サブクラ スである。タイプ及びサブタイプが注目される。 クローンのみがおりそして該クローンの全てが抗体を分泌するものであるとい うことを保証するために、１回又はより多くの限界希釈試験を行わなければなら ない。限界希釈試験は、該細胞を計数しそして細胞を、マイクロタイター・ウェ ル当たり統計的に１つ又はより少ない細胞になるまで希釈することによって、行 われる。 特に適した抗体がＡ１．Ａ；Ａ20．Ｅ；Ａ41．Ｖ；Ｃ28．Ｌ；Ｄ43．Ｇ；Ｂ21 ．Ａ；及びＨ28．Ｃと名づけられる。これらの抗体は、全てＩｇＧサブタイプＧ １であり、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてブランクの約７倍より大きい吸光度を与 え、そして他の因子とは交差反応性が無視し得るか又は全く示さない。等電点電 気泳動法におけるこれらの抗体のＰ．Ｉ．は、約５乃至6.5である。加えて、約1 0^-9〜10^-10Ｍ^-1の親和性定数を有する。こうして、1000より多くのハイブリドー マからの選択により、適した抗体の選択を10未満の抗体へと狭めることができる 。 これらの抗体は、正常ヒト血漿から第Ｘ因子を免疫除去する能力 について全て評価された。最も好ましい抗体はＦＸ７−Ｄ43−Ｇである。 選ばれたクローンは、プリスタン処置した雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに各々細胞約 10⁷個注射した。標準の技術を用いて腹水材料を収集できる。腹水を、10％ＲＰ ＭＩ培地又は他の簡単な培地における組織培養へと導入し直すことができる。 抗体は、プロテインＡ Sepharose（Bio-Radより入手可能）を用いて腹水から 精製することができる。結合緩衝液及び溶出緩衝液は、双方ともBio-Radから市 販されており、精製に用いてよい。腹水は、結合緩衝液を用いて適用される。抗 体は、溶出緩衝液を用いると溶出する。該溶出緩衝液は、約３乃至５、好ましく は５のｐＨを有する。従って、溶出液は直ちに中和される。精製された材料は、 重炭酸塩緩衝剤へと緩衝剤交換され、約４乃至５ｍｇ／ｍＬまで濃縮される。 約５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度の抗体が、アガロース上に固定化される。該 抗体を結合させる好ましい方法は、臭化シアン活性化Sepharose ＣＬ−４Ｂを使 用することである。このSepharose ＣＬ−４Ｂは、煙霧フード内で制御された温 度において臭化シアンで活性化させることができる。Kohn and Wilchek，Bioche mical and Biophysical Research Communications，107（3）：878-884（1982） を参照のこと。 この活性化されたゲルを、脱イオン水で洗浄し、そして重炭酸塩緩衝液ｐＨ8. 5中に再懸濁させ、直ちに該抗体に加える。該抗体は、同じ緩衝液により希釈さ れる。ゲル１ｇ当たりに約２ｍｇの抗体を組み合わせる。該抗体を該ゲルと約２ 〜８℃にて約８時間反応し た後、該懸濁液を濾過し、約ｐＨ8.6の約１Ｍのエタノールアミン中に再懸濁さ せる。該懸濁液を室温にて約２〜４時間回す。焼結ガラスロート中にゲルを回収 し、そしてａ）0.8Ｍの塩化ナトリウム、ｂ）0.1Ｍのグリシン、0.5Ｍの塩化ナ トリウム、ｐＨ3.5、ｃ）0.1Ｍのグリシン、0.5Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ8.5及 び４）約１ＭのＮａＣｌを含んだ約ｐＨ９の３Ｍのグリシンのような平衡化緩衝 液、で洗浄する。この抗第Ｘ因子結合Sephar-ose ＣＬ−４Ｂを、ＨＥＰＥＳそ の他のような緩衝液に懸濁させる（Freifelderを参照）。好ましい緩衝液は、10 ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ7.3である。該緩衝液は、アンチペイン及びポリブレン を1.8μｇ／ｍＬの濃度に含んでよい。このゲルはカラムに充填される。 免疫吸着された、第Ｘ因子欠乏血漿は、収集の２時間以内に緩衝液と安定化剤 とが添加されたクエン酸処理正常ヒト血漿より調製される。約20ｍＬのゲルカラ ム体積を用いて、血漿約200ｍＬから第Ｘ因子を除去できる。遅い流速にて血漿 が該カラムを通過させられる。好ましくは、流速は、約0.4ｍＬ／分より遅いが 、しかし0.7ｍＬ／分まであってもよい。この血漿は好ましくは、カラムの底を 通してポンプ輸送される。各画分が収集されそして１％未満、好ましくは約0.5 ％未満、そして最も好ましくは約0.3％未満の活性を有する該画分がプールされ る。一般的には、最初のおよそのカラム体積に等しい体積が捨てられ、次の５乃 至10のカラム体積が収集されてプールされる。グリシン又はソルビトール又はそ の他の安定化剤を加えてよく、そして製品は凍結感想される。他の因子の濃度は 、正常の範囲にあることが必要である。必要ならば諸々の因子を加えてもよい。 好ましくは、いかなる因子も加える必要はない。 最も好ましい抗体はＦＸ７−Ｄ４３−Ｇである。上に掲げたその他の特徴と共 に、この抗体は、第Ｘ因子のＬ鎖と反応する。この抗体で免疫除去された正常ヒ ト血漿は、0.3％未満の第Ｘ因子活性しか有しない第Ｘ因子欠乏血漿を与え、そ してこの血漿を用いて実施されたアッセイは、標準曲線上で１％未満の第Ｘ因子 活性において感受性がある。 結合させた第Ｘ因子を除去することによって、このカラムは再生できる。この カラムを再生する最も好ましい方法は、３種の別個の溶液でカラムを洗浄するこ とである。最初、カラムは、非特異的に結合したいかなる材料も除去するに十分 なＮａＣｌその他の濃度を有する塩類緩衝液で洗浄される。約１Ｍ未満のＮａＣ ｌの濃度が適当である。次にカラムは、カラムに特異的に結合したいかなるタン パク質をも除去するために、交互に高い及び低いｐＨの緩衝液で洗浄される。こ の高ｐＨ緩衝液は、好ましくは、約0.5ＭのＮａＣｌを含んだ約0.1Ｍのグリシン 、ｐＨ８乃至９、好ましはｐＨ8.5である。この低ｐＨ緩衝液は、好ましくは、 約0.5ＭのＮａＣｌを含んだ0.1Ｍのグリシン、ｐＨ３乃至４、好ましくは3.5で ある。これら高い及び低い緩衝液による洗浄は反復してよい。ゲルは、10ｍＭの ＨＥＰＥＳ、ｐＨ7.0又は他の適当な貯蔵緩衝液中に貯蔵してよい。もしもカラ ムを再生しなければならないのなら、凝血の形成を避けるため、その工程はでき るかぎり速やかに開始する必要がある。 本発明は次の実施例によって説明されるが、それらは純粋に典型例であり、請 求の範囲に記述されたものとしての本発明の真の範囲を限定するものと解しては ならない。 実施例１ 抗体の調製及び選択 マウスの免疫 10匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、Enzyme Research Laboratoryからの約12μｇの ヒト第Ｘ因子を、Freund's完全アジュバントに入れて腹腔内注射により投与した 。最初の追加免疫の３週後に、Freund'sアジュバントを注射したマウスを、Freu nd's不完全アジュバントに入れた12μｇのヒト第Ｘ因子の腹腔内注射により追加 免疫した。リン酸緩衝液中のヒト第Ｘ因子の約12μｇの腹腔内注射によって、全 てのマウスは最終の２回の追加免疫を受けた。力価に基づいて２匹のマウスが融 合のために選択された。これら２匹のマウスはともに、Freund'sアジュバントを 用いた最初の注射を受けた。融合の３日前、両マウスは、腹腔内注射により、１ 日当たり約50μｇのヒト第Ｘ因子の注射を受けた。 マウス脾臓細胞の骨髄種細胞との融合 これら２匹のマウスから脾臓を採取し、抓き裂いて単一の細胞懸濁液とし計数 した。この脾臓細胞を血清不含培地で洗浄した。マウス骨髄種細胞（Ｃ５）を収 集して計数し、生育性を判定した。この骨髄種細胞の生育性は、少なくとも85％ より大であった。この骨髄種細胞を血清不含培地で洗浄した。約４×10⁸個の脾 臓細胞が、約４×10⁸個の骨髄種細胞に加えられた。総液量は約30ｍＬであった 。細胞を1200ｒｐｍで約10分間遠心し、上澄を除去した。穏やかに混合しつつ、 Whittaker ＲＰＭＩ中の50％のＰＥＧ1500の１ｍＬを加えた。混合を更に２、３ 分続けた。細胞を1200ｒｍｐにて約２分間遠心し、次いで1500ｒｐｍにて約１分 間遠心した。ＰＥＧを除去 しそして約３ｍＬの血清を加えた。細胞を血清に再懸濁させ、そして約37℃にて 約１時間インキュベートした。 約200ｍＬの20％完全ダルベッコ培地及び５μｇ／ｍＬのＳＴＭマイトジェン を加えた。この完全培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン、約0.1％の重炭酸ナトリ ウム、約20％の熱不活化胎仔牛血清、約１％のグリシン、約１％のＨＴ Supplem ent、１％のＧＭＳ−Ｓ（Gibco Laboratories）及び保存剤を含んだ、約25ｍＭ のＨＥＰＥＳ緩衝液と2.5ｇ／Ｌのグルコースを含んだダルベッコ改良必須培地 を含んでいた。このＳＴＭは、in vitro融合のためのS．typhimuriumからのＢ細 胞マイトジェンであり、RIBI Immunochem Research，Inc.から入手できる。ＨＴ SupplementはWhittakerから商業的に入手でき、ヒポキサンチン（136ｍｇ／ｄ Ｌ）とチミジン（76ｍｇ／ｄＬ）とを含有する。約２〜３×10⁶個の脾臓細胞を 含有する約100μＬの融合済材料が、マイクロタイター・プレートに播種された 。これらの細胞をＣＯ₂下に37℃にてインキュベートした。播種された領域の少 なくとも50％が細胞増殖によって覆われたとき、その細胞は試験準備ができてい る。 十分量の細胞増殖が約２週後に見られた。 ハイブリドーマコロニーのスクリーニング 約1000個のコロニーが作られた。各コロニーはＥＬＩＳＡアッセイにおいて評 価された。アッセイは、ｐＨ約8.5の約0.01Ｍのトリスよりなり約15ｍＭのカル シウムイオンを含有する被覆緩衝液を用いてＥＬＩＳＡプレート上に約１μｇ／ ｍＬのヒト第Ｘ因子を被覆することによって行われた。 これらのコロニーから分泌された上澄の連続的希釈が、約0.25Ｍ のＮａＣｌを含有しｐＨ7.4でなお約２％のゼラチン及び0.1％のTween-20を含有 する0.02Ｍのトリス緩衝液（ＴＢＳ）中に調製された。約１：５の連続的希釈が 適当であることが判明した。約100μＬのサンプル又はブランク対照（すなわち 、緩衝液のみ）が、各ウェルに加えられ約30分間インキュベートされた。プレー トを濯ぎ緩衝液で５乃至６回洗浄した。この濯ぎ緩衝液は、0.02％のTween-20を 含む約0.002のイミダゾール緩衝食塩液を含有した。濯ぎ緩衝液は、Kiekegaard & Perry Laboratories Inc.からカタログ番号50-63-00として商業的に入手でき る。 ＴＢＳ中のマウス ヤギ抗マウスＩｇＧ及びＩｇＭ西洋ワサビペルオキシダー ゼ接合体（Jackson catalogue #115-036-068）の１：2000希釈の約100μＬが、 各ウェルに加えられた。プレートを約30分間インキュベートし、濯ぎ緩衝剤で５ 乃至６回洗浄した。 次いで、製造業者の指示書に従って調製した約100μＬの基質を、各ウェルに 加えた。使用した基質は、Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.からのカタロ グ番号50-62-00のＡＢＴＳ（2,2'−アジノージ〔３−エチル−ベンズチアゾリン スルホナート（６）〕ペルオキシダーゼ基質系であった。十分な量の発色の後、 約100μＬの停止溶液を加えた。ＡＢＴＳペルオキシダーゼのための停止溶液はK irkEgaard & Perry Laboratories Inc.よりカタログ番号50-85-01として商業的 に入手できる。発色は、通常約10分後には十分である。発色量を405ｎｍにて分 光光度計によって読み取った。結果をブランク対照のそれと比較した。ブランク 対照の値の少なくとも２倍である値を陽性とみなした。加えて、ハイブリドーマ の数が非常に多かったため、ブランクの７倍より高い値を与えるクローンのみを 、更なる試験のために選択した。他の細胞系は貯蔵のために凍結した。 交差反応性試験 30を超えるハイブリドーマがＥＬＩＳＡの結果に基づいて選択された。これら のハイブリドーマの各々を、次の抗原との交差抗原性について試験した。プロト ロンビン（Ｆ1.2フラグメント）、フィブリノーゲン、第Ｖ因子、第XI因子、第 ＸII因子、第IX因子、第VIII因子、及び第ＶII因子。 抗原の各々を、被覆緩衝剤を用いて約１μｇ／ｍＬでマイクロタイター・プレ ート上に被覆した。アッセイ手順を、上記の方法及び試薬を用いて行った。評価 されたハイブリドーマのうち10がプロトロンビンのＦ1.2フラグメントと交差反 応し、それら10のうち２が第ＶII因子と交差反応した。これらのハイブリドーマ を、更なる評価から除外した。 ハイブリドーマのサブタイプ分け 標準のサブタイプ分け手順を用いて、ハイブリドーマをサブタイプ分けした。 約25のクローンを試験した。19のクローンがIgG1 Kに、２つのクローンかIgG2a に、２つのクローンがIgG2bにサブタイプ分けされ、そして１つのクローンかIgM であった。IgGクローンのみを、更なる評価のために選択した。これらのクロー ンのうち、２つは更なる評価から除外した。一方のクローンは、他のサブタイプ との僅かな交差反応性のため、除外された。他方のクローンは、不十分な量の抗 体しか分泌していないように見えたため、除外した。これら17の抗体のうち７つ の抗体を、それらが全体として良好に増殖しそして良好な抗体産生を与えるよう に見えたため、選択した 。 主要クローンの調製 選んだこれら７つのハイブリドーマを次の通りに名付けた。Ａ１、Ａ20、Ａ41 、Ｃ28、Ｄ43、Ｂ21及びＨ28。 主要なクローンが、これら７つの細胞系の各々から調製され、それらの細胞は 、約10⁶個の該主要な細胞をプリスタン処理マウスに継代接種された後、単純な 培地を用いて組織培養へと導入された。約10日後、約２週間にわたって腹水材料 が１日おきに収集され、10％のＲＰＭＩ培地を用いてそれらの細胞が組織培養に 導入された。各抗体の適切な濃度は、ＲＩＤ法によって測定したところによると 約４ｍｇ／ｍＬであった。 各クローンの腹水を、Bio-Rad Affi-Prep Maps II Protein Aとして商業的に 入手できるプロテインＡの10ｍＬカラムを用いて精製した。結合緩衝液及び溶出 緩衝液もまた、Bio-Radより商業的に入手可能である。米国特許第4,704,366号を 参照のこと。該カラムをカラム体積の６倍の結合緩衝液で平衡化させた。約40ｍ ｇ（結合緩衝液中に１：２に希釈した腹水の約10ｍＬ）の未精製の抗体をカラム に適用した。溶出液は、結合緩衝液を用いて、全体で２回の再適用のために連続 的にカラムに再適用した。抗体は、溶出緩衝液を用いて溶出させ、そして該抗体 を含有する画分を収集し、収集された液１ｍＬ当たり１Ｍのトリス50μＬを用い て直ちに中和した。この抗体を含有する画分をプールした。プールされたこの画 分を、貯蔵のための中性のｐＨのリン酸緩衝食塩液へと緩衝液交換した。タンパ ク質の最終濃度は、約４乃至５ｍｇ／ｍＬであった。最終液量は、約６乃至6.5 ｍＬであった。 各抗体につき、Bio-Rad Phastシステムを用いて当電点電気泳動を実施した。 そのPhastゲルタイプは、ＩＥＦ3-9であった。各抗体のＰＩは、5.1及び6.5であ った。 第Ｘ因子活性の阻害研究．．． 実施例２ 免疫吸着カラムの調製 Kohn and Wilchek，Biochemical & Biophysical Research Communications，1 07（3）878-8814（1982）によって記述された手順を用いて煙霧フード中でSepha rose CL-4Bゲルを臭化シアンによって活性化させた。温度を制御するために、超 低温循環浴（約−40℃）を用いた。活性化されたゲルを、脱イオン水で洗浄し、 そしてｐＨ約8.5の約0.1Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁させた。抗体を 、ｐＨ約8.5の約0.1Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液へと緩衝液交換した。このゲル を精製された抗第Ｘ因子抗体へ、ゲル１ｇ当たり抗体２ｍｇの濃度に、直ちに加 えた。このゲル抗体混合物を、約２乃至８℃にて終夜混合した。このゲルを、濾 過により分離し、そして約１ＭのエタノールアミンｐＨ約8.6中に再懸濁させた 。この懸濁液を、室温にて約２乃至４時間回した。このゲルを焼結ガラス漏斗内 に回収し、約５カラム体積の約0.8ＭのＮａＣｌで、次いで約２カラム体積の約0 .5ＭのＮａＣｌを含んだｐＨ約3.5の0.1Ｍのグリシンで、次いで約２カラム体積 の約0.5ＭのＮａＣｌを含んだｐＨ約8.5の0.1Ｍのグリシンで、そして次いで約 ５カラム体積のｐＨ約7.0の10ｍＭのＨＥＰＥＳで、順次洗浄した。ゲルは必要 な時まで貯蔵できる。結合効率は、70％より大きいと測定された。 実施例３ 免疫除去血漿の調製 血漿１Ｌ当たり約100ｍＬのゲルを用いてゲルに結合させた抗第Ｘ因子抗体を カラムの形に調製した。このカラムを約10ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ約7.3で平衡 化させた。クエン酸処理した血漿をこのカラムに加えた。カラムの直線流速は、 ベッドの高さを少なくとも30分の貯留時間で除すことによって計算した。血漿は カラムの底から溶出させた。最初のカラム体積は廃棄した。次の10カラム体積を 収集した。0.9％未満の血漿を受け入れることができるが、この血漿は0.3％未満 の第Ｘ因子活性を有していた。グリシン（約９ｇ／Ｌ）及びソルビトール（約９ ｇ／Ｌ）のような安定化剤を加えた。この第Ｘ因子欠乏血漿は、２〜８℃の間で 貯蔵しなければならない。この血漿は、約１ｍＬの該血漿を含んだ別個のバイア ル中へ小分けしてよい。次いで、それらのバイアルを凍結乾燥した。 この抗第Ｘ因子カラムは、使用後直ちに再生した。このカラムを約６カラム体 積の約0.8ＭのＮａＣｌで、次いで３カラム体積の0.1Ｍのグリシンを含有するｐ Ｈ3.5のグリシン緩衝液で、次いで３カラム体積のｐＨ8.5のグリシン緩衝液で、 洗浄した。高い及び低い緩衝液による洗浄は繰り返してよい。このカラムを、0. 1％のアジ化ナトリウムを含有するｐＨ7.0の10ｍＭのＨＥＰＥＳ中に貯蔵した。 実施例４ 免疫除去した第Ｘ因子血漿の性能 表１に掲げた各因子について、Ｄ43．Ｇのサブクローンの各々についての第Ｘ因 子血液凝固アッセイを用いて％因子活性を測定し、ＩＰ10−31（ポリクローナル 抗体を用いて調製した免疫除去された 第Ｘ因子欠乏血漿）及び先天性欠乏血漿と比較した。ＰＴ及ＡＰＴＴも測定した 。 第Ｘ因子の活性のレベルは、検出不可能であり、他の因子は正常範囲内にあっ た。 実施例５ 第Ｘ因子についての標準的１段階凝固アッセイ 第Ｘ因子についての１段階凝固アッセイの標準曲線が決定された。種々の％の 第Ｘ因子活性を与えるために、正常血漿プールをOwner's緩衝液で希釈した。第 Ｘ因子欠乏血漿を用いて各希釈血漿の１段階第Ｘ因子凝固時間を得た。結果は表 ３及び図１に提示されている。第Ｘ因子は、残存の１％第Ｘ因子活性を与えるた めに、第Ｘ因子を第Ｘ因子欠乏血漿に加えた。結果は表３及び図２に提示されて いる。図１と図２との比較は、図２における曲線の低い側の末端において感受性 の損失を示している。従って、該血漿中の第Ｘ因子の活性が１％より低いことが 重要である。 実施例６ 患者サンプルの評価 20の患者サンプルと２つの対照とを、１段階凝固アッセイにおいて評価し、％ 第Ｘ因子活性を測定した。これらのサンプルは、ａ）本発明からの第Ｘ因子欠乏 血漿（表４及び図３〜５においてMONOとして示されている）、b)ＩＰ10−31、及 びＣ）先天性の第Ｘ因子欠乏血漿を用いて評価した。結果を下の表４及び図３〜 ４に提示してある。 図は、モノクローナル免疫吸着血漿と第Ｘ因子のための他の市販の基質との間 の高い相関を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 モトリー，レスリー アメリカ合衆国33173フロリダ、マイアミ、 サウスウエスト103プレイス 7817 (72)発明者 ウォン，ヒン アメリカ合衆国33332フロリダ、フォート ローダーデイル、ウェントワース 2966

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 第Ｘ因子欠乏血漿を調製するための方法であって、 ａ）第Ｘ因子に対するモノクローナル抗体であって、第Ｘ因子と免疫反応性 であり10^-9乃至10^-10の範囲の親和性定数を有するものであるモノクローナル抗 体を固体支持体に固定化し、 ｂ）該固定化したモノクローナル抗体と血漿を接触させて実質的に第Ｘ因子 の全てを該モノクローナル抗体に結合させ、そして ｃ）該固体支持体から第Ｘ因子除去血漿を収集する ことを含む方法。 ２． 該第Ｘ因子除去血漿が１％未満の第Ｘ因子活性を有するものである、請求 項１の方法。 ３． 該第Ｘ因子除去血漿が0.3％未満の第Ｘ因子活性を有するものである、請 求項１の方法。 ４． 該抗体がＤ43−Ｇである、請求項１の方法。 ５． 請求項１の方法によって作られた第Ｘ因子欠乏血漿。 ６． 第Ｘ因子に対するモノクローナル抗体であって、 ａ．第Ｘ因子のＬ鎖に結合し、 ｂ．10^-9より大きい親和性定数を有し、そして ｃ．１％未満の第Ｘ因子活性を有する第Ｘ因子免疫除去血漿を与える ことを特徴とする抗体。 ７． Ｄ43．Ｇと名付けられたモノクローナル抗体としての特徴を有する、モノ クローナル抗体。