JPH08510474A

JPH08510474A - ノトジンセノシドｒ１（ｎｒ１）及び／又はアストラガルシド（ａｓｉｖ）のようなトリテルペンサポニン類を医薬の製造に使用する方法

Info

Publication number: JPH08510474A
Application number: JP7523729A
Authority: JP
Inventors: ビンダー・ベルント; ツハング・ヴァイエアン; ヴォーユタ・ヨハン
Original assignee: Berbi GmbH
Current assignee: Berbi GmbH
Priority date: 1994-03-16
Filing date: 1995-03-16
Publication date: 1996-11-05
Also published as: DE59511032D1; EP0705103B1; ATA56194A; AT402890B; US5770578A; EP0705103A1; WO1995024905A1

Abstract

(57)【要約】ノトジンセノシドＲ１（ＮＲ１）及び／又はアストラガロシド（ＡＳＩＶ）のようなトリテルペンサポニン類を、繊維素溶解活性の剌激のための、及び内毒素効果の防止のための、特に内毒素ショック状態の患者及び動物を処置し、又は内毒素ショックを回避するための医薬の製造に使用する方法。対応する医薬は冠動脈性心臓疾患、抹消動脈疾患を有する患者及び心筋梗塞又は狭心症にかかっている患者の治療的処置、並びに健康な人々をそのような疾病に対して予防するためにも適している。

Description

【発明の詳細な説明】ノトジンセノシドＲ１（ＮＲ１）及び／又はアストラガルシド（ＡＳＩＶ）のようなトリテルペンサポニン類を医薬の製造に使用する方法背景繊維素溶解系は、血管系内のみならず血管外系においても繊維素の沈積を制御する基礎的防御機構の役目をする。この繊維素溶解系の正しい機能発揮は一方において出血的現象を、そして他方において血栓的現象を防止するために、また繊維素の間質的な沈積及びそれに伴う瘢痕形成を防止するために必要である。組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）は、プラスミノーゲンを、繊維素を分解する活性プラスミンへ変えるチモーゲンの転化による（外部的）繊維素溶解過程の開始において重要な役割を演ずると考えられている。従って更にまた、血漿の繊維素溶解能は、循環しているｔ−ＰＡの濃度によって大きく左右されると考えられる。血漿中のｔ−ＰＡは主として血管壁に由来するものと考えられ、ここでそれはその内皮細胞の中に局在している。更に、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベータ（ｕ−ＰＡ）が繊維素溶解全過程において或る役割を演じている。このプラスミノーゲンアクチベータは（少なくとも部分的に）血管壁からももたらされるものと考えられている。繊維素溶解の主要インヒビターであるプラスミノーゲンアクチベータインヒビタ−１（ＰＡＩ−１）は内皮細胞によっても合成され、そして各ＰＡとＰＡＩ−１との相対的量割合が繊維素溶解能、また従って、例えば心筋梗塞におけるような血栓的過程の防止に対して重要であることを示す種々のデータが存在する。従ってｔ−ＰＡ，ｕ−ＰＡ及びＰＡＩ−１の合成の薬学的制御は内因性の不十分な繊維素溶解を高めるのに有利である。ｔ−ＰＡもＰＡＩ−１も内皮細胞によって産生されるので、これらの内皮細胞の水準面の上での合成及び分泌を制御することは血液の繊維素溶解能に影響を与えるための迅速で直接的な手段である。最近行われた研究は、種々の型の細胞の中でのプラスミノーゲンアクチベータ及びインヒビターの産生が一連の因子によって制御されることを示した。ｔ−ＰＡの内皮細胞の中での合成は、例えばトロンビン、ヒスタミン、ブチラート、レチノール酸及び例えばホルボール-12-ミリスタート-13-アセタート（ＰＭＡ）のような腫瘍促進剤等の多くの剌激物によって高められる。ＰＡＩ−１の発現を制御する因子は、リポ多糖類、トロンビン、インターロイキン１（ＩＬ−１）、腫瘍壊疽因子α（ＴＮＦα）、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、基本繊維芽細胞成長因子（ＢＦＧＦ）及びヘパリンと組み合わせた内皮細胞成長補助物を含む。いずれにしても、上にあげた物質のいずれも生体内で用いることに成功することはできなかった。細菌性内毒素（ＬＰＳ）の有利による細菌性敗血症は生命を脅かす状態の１つであって、ＬＰＳによりもたらされる凝血及び繊維素溶解の変化が血管内凝固形成及びその結果としての器官の障害を惹起する。この場合にＬＰＳは内皮細胞に作用を及ぼし、その際これはこのものの組織因子（ＴＦ）及びＰＡＩ−１の発現を高めると考えられている。現在、ＬＰＳにより惹起された血管内凝血の症状を呈している患者の直接の十分な処置は不可能であり、そしてＬＰＳにより開始された、例えば過凝固のような症状の処置の手段は、一方においてヘパリンに、そしてもう一方ではその開始された細菌性敗血症の抗生物質による処置に限定されている。中国においては朝鮮にんじんPanax Notoginseng又はAstragaloseのような漢方薬草薬はすでに数千年以前から伝統的な漢方薬のうちで疼痛軽減及び鬱血並びに心臓血管の疾病の処置のために用いられていた。実際に、例えばウィーン、ニューヨークのSpringer Verlagより1984年に刊行されたL．Zechmeisterの”Progress in the Chemistry of 0rganic Natural Pro ducts”第46巻の「ジンセン及び関連する植物のサポニン類」の章においてPanax notogindengの強壮薬、止血剤、冠状動脈治療薬及び止血薬としての性質について示唆されている。同様に、”Chemical Abstracts”119,85683には、Panax not oginsengの抗血栓作用について、そして日本国特許要約JP Kokai No．55-127317 には抗繊維素溶解作用について、また同JP Kokai No．63-198609にはPanax noto ginsengの種々の調剤にの血液潅流促進作用について示差されている。しかしながら、従来存在する刊行物のいずれにおいてもPanax notogindeng又はそれから単離された凝塊溶解作用について示唆されていない。従ってこの、Panax notogi nseng又はAstragalosidの凝塊溶解作用はこれまでまだ全く記述されたことがない。このように、内因性の繊維素溶解活性を上昇させ、或いは種々の内毒素の凝塊形成活性及び抗繊維素溶解活性に対抗的に作用する治療的に実用できる物質は知られていない。発明の一般的な記述ここではまず第一に繊維素溶解能を上昇させ、またＬＰＳの効果を直接防止するために各物質を使用することを記述する。この発明の対象はノトジンセノシドＲ１（ＮＲ１）及び／又はアストラガロシド（ＡＳＩＶ）のようなトリテルペンサポニン類或いは側鎖残基及び／又はグリコシル化によってのみトリテルペンサポニン類と異なっているような化学的に近似の構造を有する物質を、精製した物質又はそれらの混合物の形で非経口的又は経口的に、繊維素溶解能を上昇させ、かつ心臓血管の疾病を防止し、そして例えば敗血性ショックにおけるような内毒素の効果を阻止するために患者を処置するように、溶液の形又はタブレット或いはカプセルの形で投与することのできる医薬の製造に使用する方法である。実施例すべての実施例において下記の物質及び方法を用いた。化学的に純粋なノトジンセノシドＲ１（ＮＲ１）又は化学的に純粋なアストラカロシド（ＡＳＩＶ）は中国、北京の、薬学的及び生物学的生産物の制御のための国立研究所より購入した。ＮＲ１又はアストラガロシドＡＳＩＶは下記式を有する物質である。ＮＲ１又はＡＳＩＶは、0.01ないし100μｇ／ｍlの最終濃度に達するようにインキュベーション媒質の中に溶解して希釈した。フェノール抽出によって調製したリポ多糖類（Escherichia coliリポ多糖類、抗原型026：B6）はSigma社（米国ミズーリ州セントルイス）より入手した。蒸留水中、１ml当たり１mgの濃度を有する溶液を-70℃において貯蔵した。モルホリノプロパンスルホン酸（ドイツ国S erva社）、グアニジンチオシアナート（スイス国Fluka社）、ピペラジン-N,N'- ビス（2-エタン−スルホン酸）（PIPES；Sigma社）、Seakem LEアガロース（米国メイン州、FMC Bioproducts社）、dCTP［Aloha-32P］（米国カリホルニヤ州、 ICN Radiochemicals社）はそれぞれあげた会社から入手した。それぞれの方法において記述される他の諸物質は対応する引用文の中に詳細にあげてある。細胞培養内皮細胞を、Jaffe等により”J．Clin．Invest.”（1973），52，2745-56に記述されたプロトコルと同様にして新鮮なヒト臍帯静脈からコラーゲナーゼ（Sigm a社）により分離した。４−６個の臍帯からの細胞をプールしておき、そして子牛獣皮からの１％のゼラチン（Sigma社）で被覆された75cm²の細胞培養フラスコ（米国ミネソタ州、Costar社）の中に播種した。それらの細胞を、加熱滅菌した補充された20％の子牛血清（ＳＣＳ：米国ユタ州、Hyclone社）、100μg/mlのストレプトマイシン、100IU/mlのペニシリン、250ng/mlのFungizon、１mMのグルタミン（米国カンザス州、JHR Biosciences社）、２IU/mlのヘパリン（Liquemin R oche：スイス国、Hoffmann La Roche社）、50μg/mlのＥＣＧＳ（オーストリア国、Technoclone社）を添加した培地199（Sigma社）の中で、水蒸気飽和した95 ％の空気と５％のC0₂とよりなる雰囲気の中で37℃において集密点（Konfluenz）まで培養した。それら細胞の内皮的特性はそれらの典型的な玉石形状、抗-フォンウィルブラント因子VIII抗体による蛍光抗体試験法における陽性、及びアセチル化した低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）の取り込みによって確認した。初代培養物を集密の時点において0.05%トリプシン/0.02%EDTA（JRH Biosciences社）を用いて捕集し、そして１：３のスプリット比で75cm²の細胞培養フラスコの中に播種した。集密点以前の細胞は同じ条件のもとで集密点に達するまで培養して対数曲線的細胞増殖期においてトリプシン／EDTAにより捕集し、そして10％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む培地199の中に各１mlの部分量づつ液体窒素の中で凍結させた。実験のために各細胞を37℃において解凍し、そしてＳＣＳ、ＥＣＧＳ及びヘパリンを上にあげた濃度で加えた培地199の中で６窪板（直径3.5cm、Costar社）の中で集密点に達するまで培養した。全ての実験において各細胞は第２過程と第３過程との間で用いた。それら細胞にはそれぞれの実験の前の日に新鮮な培地を供給した。細胞培養に用いた全ての物質はCoatest内毒素キット（スウェーデン国、Kabi Vitrum社）によって内毒素が存在しないことを確認した（試験の検出限度＝５pg/ml）。ならし培地（ＣＭ）及び細胞外母質（ＥＣＭ）の調製集密点に達した培養物をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ：Sigma社）で２回洗浄し、そして37℃において、窪１個当たり１mlの、1.25％のＳＣＳと50μg/ml のＥＣＧＳとを加えた培地199によりＮＲ１又はＡＳＩＶとともに上記したそれぞれの濃度においてインキュベートした。このインキュベーションの後でその細胞培養上澄液を集めて遠心分離（細胞破片を除去するため）の後、-70℃において使用まで貯蔵した。対応する各培養物の全細胞数はトリプシン処理の後で血球計数板を用いて求めた。これら又は類似的に処理した培養物のＥＣＭはMimuro等：”Blood”（1987），70，721-28の方法に従って調製した。その単分子層を燐酸塩で緩衝された冷たい食塩溶液（ＰＢＳ：燐酸ナトリウム0.01M、NaCl 0.14M 、pH7.4）で３回洗浄し、そして各細胞性成分を、0.5％トリトンX100を加えたＰＢＳで37℃において10分間インキュベーションすることによって抽出した。各板をもう一度蒸留水で洗浄して残存する細胞性成分を除去し、そして次に細胞破片の存在について顕微鏡検査により調べた。この抽出方法によって可視的細胞破片はそれぞれの板から完全に除去され、そしてＥＣＭは30分間のインキュベーションの後で37℃において、0.1％のＳＤＳを加えた１mlのＰＢＳの中へ掻き取りによって抽出した。この抽出物を１夜４℃においてＰＢＳに対して透析した。ＣＭ、ＥＣＭ及び血漿の中でのｔＰＡ抗原、ｕＰＡ抗原、ＰＡＩ−１抗原、ＰＡＩ−１活性及びtＰＡ／ＰＡＩ−１複合体についての試験ｔＰＡ抗原、ｕＰＡ抗原、ＰＡＩ−１抗原及びtＰＡ／ＰＡＩ−１複合物の濃度を、市販で入手できる酵素と結合したイムノソルベント分析法（エリザ法）（ Technoclone社）により、メーカーより添付された案内書に従い求めた。これらの試験についての試験領域はｔＰＡについては0.3ないし2.5ng/mlであり、ｕＰＡについては0.6ないし10ng/mlであり、ＰＡＩについては1.0ないし30ng/mlであり、そしてtPA/PAI-1複合物については0.2ないし20ng/mlである。ｔＰＡエリザ法により、遊離のｔＰＡ及びＰＡＩ−１との複合物の中のｔＰＡが求められた。ｕＰＡエリザ法によって、遊離のｕＰＡ及びＰＡＩ−１との複合物の中のｕＰＡを決定した。ＰＡＩ−１エリザ法により、遊離の、複合化した、及び潜在するＰＡＩ−１が測定される。ｔＰＡ／ＰＡＩ−１複合物エリザ法は専らｔＰＡ／ＰＡＩ−１複合物の測定に用いられる。血漿の中及びＣＭの中のＰＡＩ−１活性は滴定分析法（Technoclone社）により、そしてメーカーから添付された案内書に従って求めた。ｔＰＡ及びＰＡＩ−１の機能的活性の決定ｔＰＡ及びPAI-1の活性はナトリウムドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に従い、繊維素オートグラフィー（ＦＡ）及び逆繊維素オートグラフィー（ＲＦＡ）の使用のもとに分析した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル及び緩衝液はLaemmli：”Nature”（1970），227，680-85のプロトコルに従って作った。ＦＡはGranelli-Piperno等：”J．Exp．Med.”（19 78），148，223-34と同様に実施した。それぞれの対応する試料100μlを10cmの長さの、10％のアクリルアミドを含む分解用ゲルと２cmの長さの、４％のアクリルアミドを含む重ねゲルとよりなるゲルの上に導入し、そして室温において16時間、又は着色前縁がゲルの下縁に達するまで進行させた。この電気泳動の後でそれらゲルをまず最初、ＳＤＳを中和するために2.5％のトリトンX100（Serva社）を加えた250mlの水の中に90分間置き（このトリトン溶液は45分間の後に取り替えた）、次にそれらゲルを1.5％のタイプＬアガロース（ドイツ国、Behring社）、プラスミノーゲンに富んだ２mg/mlのフィブリノーゲン（オランダ国、0rganon Technika社）及び0.2IU/mlの牛トロンビン（Sigma社）の含まれた繊維素／寒天／指示薬フィルムの上に置いた。それらのゲルを37℃において湿潤した室の中でインキュベートし、そして種々異なった時間に写真撮影した。ＲＦＡは各ゲルを、基本的に上述のようにして作ったが追加的に0.4IU/mlのウロキナーゼ（Technoclone社）を含んでいる繊維素フィルムの上に置いた。或る特定の試料の中のｔＰＡ及びＰＡＩ−１の活性の定量はその指示薬フィルムの上の溶解帯域のみならず溶解抵抗性帯域をも写真撮影するようにして達成された。これらの帯域は透明紙の上に記録してその描かれた面積を切り離し、そして分析用天秤の上で秤量した。各ＨＵＶＥＣのの中に含まれているプラスミノーゲンアクチベータを免疫学的に同定するために、ＣＭの各試料を４℃においてCNBrで活性化させたセファローズに結合させたモノクローナル抗ｔＰＡ抗体（MPW3VPA：Technoclone社）とともに、又はモノクローナル抗ｕＰＡ抗体（MPW5UK：Technoclone社）とともに、或いは対照群としてセファローズ4B（スゥエーデン国、Pharmacia社）とともに24 時間インキュベートした。次にセファローズを遠心分離によって除去し、そしてその対応する試料の100μlを上記のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び引き続くＦＡにより分析した。細胞溶解物の調製及びＴＦ活性の測定ＬＰＳ及び／又はＮＲＩを含む培地199の中で各ＨＵＶＥＣを37℃において６時間インキュベートした。それらの細胞を凝固用緩衝液（NaCl 130mM、Na-バルビタール８mM及びNa-アセテート12mM、pH=7.4）で３回洗浄し、そして掻き取りによって300μlの凝固緩衝液の中に取り込んだ。それら掻き取られた細胞を凍結し、そして解凍させた。細胞溶解物を１段階凝固アセイ法でＴＦ活性について試験した。この細胞培養液100mlを20mMのCaCl₂の100μlとともに37℃において予め温めておいたプラスチックチューブの中で５分間にわたりコアギュロメータ（ドイツ国、H．Amelung GmbH社）の中でインキュベートした。凝固を、予め温めておいた正常な人のクエン酸血漿100μlの添加により、又は因子Ｘ欠陥血漿（Sigm a社）の添加によって開始させた。ＴＦ活性は家兎脳トロンボプラスチン（Sigma社）を用いて作った標準曲線（log /logプロット）を用いて定量した。100mUの活性は正常ヒト血漿を用いた標準試験における20秒間の凝固時間として定義された。観測された凝固活性がＴＦ活性に相当し、というのは因子Ｘ欠陥血漿を正常血漿の代わりに用いた場合に内皮細胞のプロ凝固活性が全く認められなかったからである。ノーザンブロット分析法によるｔＰＡ、ＰＡＩ−１及びＴＦのｍＲＮＡ量の定量内皮細胞からの全細胞ＲＮＡをChomzynsky及びSacchi：”Anal．Biochem.”（ 1987），162，156-9に記述された酸性グアニジンチオシアナート／フェノール／クロロホルム抽出によって分離した。このＲＮＡ沈殿を50μlの0.5％ＳＤＳの中に再分散させ、そしてその濃度を260nMに設定した。ノーザンブロット分析法のために各ＲＮＡ試料を1.2％のアガロースゲルで電気泳動処理し、それにより分画されたＲＮＡをDuralon-UVTM膜（米国カリフォルニヤ州、Stratagene社）の上に毛管作用により移した。各ＲＮＡのブロットをシールアミール（seal-a-meal ）バッグの中に包み込んで５％ＳＤＳを加えた50mMのＰＩＰＥＳ、100mMのNaCl 、50mMのNa-燐酸塩、１mMのEDTAの中で57℃において少なくとも３時間にわたり予備ハイブリダイゼーションさせた。その予備ハイブリダイゼーション緩衝液を捨て、そしてヒトｔＰＡ、ヒトＰＡＩ−１、ヒトＴＦ又は内部標準ゾンデとして用いたラット−グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼのそれぞれについて32Pで標識したｃＤＮＡゾンデの106CPM/mMを加えた新しい予備ハイブリダイゼーション緩衝液で置き換えた。各ｃＤＮＡ断片をRandom Prime DNA Labelling Kit（ドイツ国、Behringer Mannheim社）により放射能活性的に標識した。動物実験この研究においては専ら雄のBALB/cマウス（体重18-30g）のみを用いた。全ての実験はエーテル麻酔のもとに実施した。各マウスに、尾静脈を介してＬＰＳ（ 10ng/g）及び／又はＮＲ１（１μg/g）を５μg/lの容積で静脈注射した。それぞれ記載した時点においてクエン酸ナトリウム（最終濃度0.13M）で抗凝集化させたそれぞれの血液試料を採取した。血小板を含まない血漿を30 分間にわたる2500Ｇでの遠心分離により４℃において採集し、そして-70℃において試験まで保存した。人におけるＮＲ１含有抽出物の投与 24時間の間に４×100mg当量のノトジンセンＲ１（ＮＲ１）を含む抽出物を６人の任意の健康な基員において投与した。最初の投与の直前及び最後の投与の直後にそれぞれ血液採取を行った。これらの血液試料において上記の方法と同様にしてプラスミノーゲンアクチベータインヒビター１（ＰＡＩ−１）抗原、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔｐＡ）抗原及びウロキナーゼ−プラスミノーゲンアクチベータ（ｕＰＡ）抗原のそれぞれの含有量を求めた。統計的分析結果は平均値±標準偏差としてあげてある。シグニフィカンスを確認するために非対のスチューデントｔ−検定を用いた。例１培養したヒト請静脈内皮細胞中のｔＰＡ、ｕＰＡ及びＰＡＩ−１の産生に対するＮＲ１の効果培養したＨＵＶＥＣにおけるｔＰＡ抗原（領域Ａ）、ｔ−ＰＡ／ＰＡＩ−１複合物（領域Ｂ）及びＰＡＩ −１抗原（領域Ｃ）の産生に対するノトジンセノシドＲ１（ＮＲ１）の効果いくつかのＨＵＶＥＣを種々の濃度のＮＲ１（0.01-100μg/ml）とともに24時間にわたりインキュベートし、そしてそのＣＭをｔＰＡ抗原、ＰＡＩ−１抗原及びtＰＡ／ＰＡＩ−１複合物について、物質及び方法のところで記述したと同様に試験した。結果はそれぞれ３重に行った３つの実験の平均値である。各値は平均値±標準偏差として図１に示してある。シグニフィカンスは対照群と比較してあげてある（^*p＜0.05、^**p＜0.01、^***p＜0.001）。図１Ａに示すように、次第に上昇する濃度のＮＲ１によるＨＵＶＥＣの24時間にわたる処置はそのような類の処理された細胞のＣＭの中のｔＰＡ抗原の投与量に依存する上昇をもたらした。100μg/mlＮＲ１により最大の効果に達した（100mg/ml ＮＲ１：9.6±0.7ng／ 105個の細胞／24時間、対照群：5.8±0.4ng／105個／24時間、n=9、p＜0.05）。図１Ｂに示すように、次第に上昇する濃度のＮＲ１の存在のもとでＣＭ中のｔＰＡ／ＰＡＩ−１複合物も同様に上昇した（10 0μg/ml ＮＲ１：63.5±2.6ng／105個の細胞／24時間、対照群：40.2±7ng／105 個の細胞／24時間、n=9、p＜0.01）。培養したＨＵＶＥＣのＥＣＭの中のＰＡＩ−１抗原産生に対するノトジンセノシド（ＮＲ１）の効果いくつかのＨＵＶＥＣを種々の濃度のＮＲ１（0.01-100μg/ml）とともに24時間にわたりインキュベートした。そのＥＣＭを、物質及び方法のところで記述したと同様に採取し、そしてＰＡＩ−１抗原について試験した。それらの値は６つの独立の窪からの平均値±標準偏差である。ＮＲ１で処理したＨＵＶＥＣのＣＭの中及びＥＣＭの中のＰＡＩ−１抗原は対照群に比してそれほど大きくは変化しなかった（ＣＭ：100μgＮＲ１／ml：2.92±0.32μg／105個の細胞／24時間、対照群：2.78±0.45μg／105個の細胞／24時間、n=9、ＥＣＭ：100μg/ml ＮＲＩ：42.55±3.15ng／24時間、対照群：42.27±1.66ng／ml／24時間、n=6）（図１Ｃ、図２）。ノトジンセノシドＲ１（ＮＲ１）による処理の後の培養したＨＵＶＥＣのｔＰＡ抗原（領域Ａ）及びＰＡＩ−１抗原（領域Ｂ）の産生の時間的経過（図３）いくつかのＨＵＶＥＣをそれぞれ記載した時間にわたり、ＮＲ１の非存在のもとに（白丸）、又はその100μg/mlの存在のもとに（黒丸）インキュベートした。それぞれ記載した時点において対応するＣＭを採取し、そしてｔＰＡ抗原及びＰＡＩ−１抗原について、物質及び方法のところで記述したと同様にして試験した。それぞれの結果はそれぞれ３重に行った３つの実験の平均値である。各値は平均値±標準偏差であり、対照群と比較して^*p＜0.05、^**p＜0.01であげてある。図３に示すように、100μg/mlＮＲ１でそれぞれ６、12又は24時間にわたり処理した各ＨＵＶＥＣの中のｔＰＡ抗原は対照群に比して時間依存的に上昇し、これに対してそのような類の処理された細胞のＣＭの中のＰＡＩ−１抗原はあまり大きくは変化しなかった。ノトジンセノシドＲ１は、培養したＨＵＶＥＣのｕＰＡ抗原分泌に影響を及ぼす。 100μg/mlＮＲ１の存在のもとにインキュベートした各ＨＵＶＥＣのＣＭをｕＰＡ抗原について試験したときに、これらの細胞により産生されたｕＰＡ抗原の量が、対照群の条件のもとで培養した各ＨＵＶＥＣのＣＭに比して重大に変化することが見出された（100μg/ml ＮＲ１：2.9±0.6ng／106個の細胞／24時間、対照群：2.5±0.8ng／106個／24時間、n=9）。例２培養したヒト請静脈内皮細胞の中のｔＰＡ活性及びＰＡＩ−１活性に対するＮＲ１の効果ノトジンセノシドＲ１は培養したＨＵＶＥＣの中のｔＰＡ活性を上昇そせ、そしてＰＡＩ−１活性を低下させる。ＨＵＶＥＣのＣＭ試料の繊維素オートグラフィー（ＦＡ）：（図４）いくつかのＨＵＶＥＣのＣＭを24時間後に捕集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び引き続いてのＰＡによって、物質及び方法のところで記述したと同様にして試験した。レーン１：各ＨＵＶＥＣの非処理のＣＭ、レーン２：セファロースに結合させたモノクローナル抗ｔＰＡ抗体とともに予備インキュベートした各ＨＵＶＥＣのＣＭ、レーン３：セファロースに結合させたモノクローナル抗ｕＰＡ抗体とともに予備インキュベートした各ＨＵＶＥＣのＣＭ、レーン４：セファロース４Ｂとともに予備インキュベートした各ＨＵＶＥＣのＣＭ、レーン５：精製したヒトｔＰＡ、レーン６：精製したヒトｕＰＡ。24時間にわたり対照群の条件のもとでインキュベートした各ＨＵＶＥＣから得られたＣＭをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び引き続くＦＡにより分析したときに、70,000又は120,000の明瞭な分子量を有する２つの主要な溶解帯域が見出された。これらの溶解帯域はモノクローナル抗− ｔＰＡ抗体を用いての予備インキュベーションによっては除去できなかったけれども、モノクローナル抗−ｕＰＡ抗体を用いての予備インキュベーションによって除去できた（図４）。従ってこの溶解帯域は70kDaにおける遊離のｔＰＡによりもたらされたものであり、そしてＰＡＩ−１との複合物の中のｔｐＡによってそのより分子量の高い方の溶解帯域がもたらされたものであることを結論することができる。培養された各ＨＵＶＥＣの中のｔＰＡ活性及びtＰＡ／ＰＡＩ−１複合物と組み合わされた活性（領域Ａ）及びＰＡＩ−１活性に対する（領域Ｂ）繊維素オートグラフィー（ＦＡ）及び逆繊維素オートグラフィー（ＲＦＡ）を用いた分析によるノトジンセノシドＲ１（ＮＲ１）の効果（図５）集密状態のＨＵＶＥＣを種々の濃度のＮＲ１（0.001-100μg/ml）を用いてインキュベーションした後でそのＣＭをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び引き続くＦＡ又はＲＦＡにより、物質及び方法のところで記述したと同様にして処理した。これらの図における溶解帯域及び溶解抵抗性帯域を透明紙の上に移し、切り抜いて分析用天秤の上で秤量した。これら透明紙の重量をＮＲ１の濃度に対してプロットした（下方の部分）。各データはそれぞれ独立の、類似の結果を示した３つの実験の結果である。レーン１：対照群、レーン２：0.01μg/mlＮＲ１、レーン３：0.1 μg/ml ＮＲ１、レーン４：1.0μg/ml ＮＲ１、レーン５：10μg/ml ＮＲ１、レーン６：100/ml ＮＲ１。ＮＲ１を含まないか、又はこれを次第に上昇する濃度で含んで24時間培養した各ＨＵＶＥＣのＣＭをＦＡ又はＲＦＡで分析したときに、溶解帯域の大きさの投与量に依存する上昇を確認することができたが、これに対して、溶解抵抗性帯域の大きさはＮＲ１の量の上昇とともに減少した（図５Ａ及びＢ）。溶解帯域又は溶解抵抗性帯域の大きさを、物質及び方法のところで記述したと同様に定量したときに、そのｔＰＡに依存する溶解の３倍までに達する上昇を確認することができたが、これに対して、ＰＡＩ−１に依存する溶解抵抗性は対照群に比して100μg/ml ＮＲ１の存在において20％に低下した（図５Ａ及びＢ）。例３培養したヒト請静脈内皮細胞の中のｔＰＡ及びＰＡＩ−１のｍＲＮＡに対するＮＲ１の効果いくつかのＨＵＶＥＣにおけるｔＰＡ及びＰＡＩ−１のmＲＮＡ発現に対するノトジンセノシドＲ１（ＮＲ１）の効果集密状態におけるＨＵＶＥＣをＮＲ１の非存在のもとで（Ｃ）又は存在（100 μg/ml）のもとに（Ｔ）12時間にわたりインキュベートした。非処理の、及びＲＮ１で処理した各ＨＵＶＥＣのＲＮＡ抽出物のノーザンブロット分析法を32P で標識したいくつかのｃＤＮＡ−ゾンデを用いてｔＰＡ、ＰＡＩ−１及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡについて実施した。オートラジオグラムの上に存在するバンドの強度をデンシトメトリーにより評価し、そしてｔＰＡ又はＰＡＩ−１に対する特異的ｍＲＮＡを、負荷量の差を補償するためにＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡに対して標準化した。信号強度を、非処理の対照群細胞からの信号に比してのＮＲ１で処理した各ＨＵＶＥＣの信号の割合として比較した。これらのデータは類似の結果を示した２つの独立の実験の結果を表わす。図６に示すように、ＮＲ１の各ＨＵＶＥＣの中のｔＰＡの分泌に対する剌激効果はその特異的ｍＲＮＡ発現の水準にも反映されていた。ｔＰＡ特異的ｍＲＮＡは100μg/mlのＮＲ１で12時間にわたり処理したＨＵＶＥＣにおいては２倍の値にまで上昇したが、これに対し、ＰＡＩ −１に特異的なｍＲＮＡの発現はＮＲ１によっては制御されなかった（3.2kb：対照群の82％値 2.2kb：対照群の86％）。10μg/mlのシクロヘキシミドの存在のもとにノーザンブロット分析法の試験を行った場合には、ＮＲ１のｔＰＡ特異的ｍＲＮＡに対する剌激効果が阻止された（データは示していない）。例４試験管内でのＰＡＩ−１抗原、活性及びＰＡＩ−１のｍＲＮＡの、内毒素によりもたらされる制御作用に対するＮＲ１の効果図７に示すように、各細胞のＬＰＳ（１μg/ml）による12時間の処理によってもたらされるＰＡＩ−１抗原の制御は、種々異なった濃度のＲＮ１により同時的に処理することにより拮抗される。この拮抗作用の大きさはそのＮＲ１濃度（0. 1-100μg/ml）について投与量依存性であり、そしてＬＰＳによって惹起されたＰＡＩ−１抗原の増加はそれら細胞の100μg/mlＮＲ１による共インキュベーションにより重大に低下した（対照群細胞：347±34ng／105個の細胞／12時間、ＬＰＳで処理した細胞：946±42ng／105個の細胞／12時間、ＬＰＳ及びＮＲ１で処理した細胞：469±29ng／105個の細胞／12時間）。各細胞のＰＡＩ−１活性の変化はＰＡＩ−１抗原の変化に対して平行していた（対照群細胞：5.48±0.78U／1 05個の細胞／12時間、ＮＲ１で処理した細胞：4.77±0.26U／105個の細胞／12時間、ＬＰＳ及びＮＲ１で処理した細胞：4.77±0.26U／105個の細胞／12時間、n=6）。ＰＡＩ−１のｍＲＮＡは１μg /ml ＬＰＳ及び／又は100μg/ml ＮＲ１で処理した細胞において測定した。ＰＡＩ−１に特異的なｍＲＮＡの量（3.2kb）の、ＬＰＳにより引き起こされた２倍までの上昇はＬＰSの存在のもとでのみならずＮＲ１の存在のもとでも1.37倍の上昇に低下した（図８）。例５試験管内でのＰＡＩ−１活性の、ＬＰＳにより惹起される制御に対するＮＲ１の効果試験管内のいくつかの研究はマウスにおけるＬＰＳの注入が血漿／ＰＡＩ−１活性の迅速な上昇をもたらすことを示した。10ng/g（体重）のＬＰＳの投与によって注入の２時間後に対照群の値を７倍までに超える重大な上昇を確認することができたが、最高値には注入の４時間後に達した。より後の時点においてそのＰＡＩ−１活性はゆっくりと正常値にもどった。これに対して、同時的にＬＰＳとＮＲ１（１μg/g）とで処理した動物においてはそのＰＡＩ−１活性は注入の４時間後に照合群の値に戻った（ＬＰＳで処理した群：11.3±3.IH/mL、ＬＰＳとＮＲ１とで処理した群：4.3±1.0U/mL、対照群：4.9±0.3U/ml、n=5-8）（図９）。例６培養したＨＵＶＥＣにおける内毒素（ＬＰＳ）によりもたらされるＴＦ活性及びｍＲＮＡの誘導に対するＮＲ１の効果非処理のＨＵＶＥＣにおいては非常にわずかな量のＴＦ活性しか見出されなかった（0.78±0.15mU／106個の細胞、n=9）。このＴＦ活性はＬＰＳによる処理（１μg/ml、６時間）によってＨＵＶＥＣの中で88.6±6.5mU／106個の細胞（n=6 ）の値に上昇した。１μg/mlのＬＰＳで６時間処理した後に測定したＨＵＶＥＣの中のＴＦ活性は、同様にＮＲ１による共インキュベーションによって大きく拮抗された（ＬＰＳとＮＲ１とで処理した細胞：56.0±1.9mU／106個の細胞）。この拮抗作用の大きさはＮＲ１濃度に関して同様に投与量に依存したが、その際10 0μg/mlのＮＲ１によって約36.8％の阻害に達した（図１０）。ＴＦのｍＲＮＡの重大な上昇がＬＰＳによるＨＵＶＥＣの処理によって観測され、これは２時間後で照合値を９倍超える上昇（2.4±3.1±3.5 kb）に達した。ＬＰＳによって高められたＴＦ−ｍＲＮＡの値はＮＲ１との共インキュベーションにより同様に拮抗された。ＴＦ−ｍＲＮＡ値は対照群を約４倍超える値に低下した。細胞を100μg/mlのＮＲ１だけで処理した場合に、そのＴＦ−ｍＲＮＡの値は対照値の40％に低下した（図１１）。例７ヒト内皮細胞培養物におけるｔＰＡ及びＰＡＩの抗原的濃度に対するアストラガメシドの作用培養したＨＵＶＥＣにおけるｔＰＡ抗原及びＰＡＩ−１抗原の産生に対するアストラガロシドＩＶ（ＡＳＩＶ）の効果ＨＵＶＥＣを種々の濃度のＡＳＩＶ（0.01-100μg/ml）とともに24時間にわたりインキュベートし、そしてそのＣＭを、物質及び方法のところで記述したと同様にｔＰＡ抗原及びＰＡＩ−１抗原について試験した。それぞれの結果はそれぞれ３重に行なった３つの実験の平均値である。それらの値は平均値±標準偏差として図１２及び１３に示してある。シグニフィカンスは対照群と比較してあげてある（^*p＜0.05、^**p＜0.01、^***p＜0.001）。図１２に示すように、各ＨＵＶＥＣを、次第に上昇する濃度のＡＳＩＶを用いて24時間処理した場合に、そのように処理された細胞のＣＭの中のｔＰＡ抗原の投与量に依存する上昇がもたらされた。100μg/mlのＡＳＩＶにより最高の効果に達した。図１３は培養した種々のＨＵＶＥＣの中でのＰＡＩ−１抗原産生に対する効果を示す。ＨＵＶＥＣ（図１３）は種々異なった濃度のＡＳＩＶ（0.01-100μg/ml ）とともに24時間インキュベートした。そのＣＭは、物質及び方法のところで記述したと同様に捕集してＰＡＩ−１抗原について試験した。それぞれの値はそれぞれ３重に行なった３つの実験からの平均値±標準偏差である。ＡＳＩＶで処理したＨＵＶＥＣのＣＭの中の抗原は対照群に比して重大に変化した。例８ヒト内皮細胞の中のｔＰＡ及びＰＡＩ−１のメッセンジヤーリボ核酸（ｍＲＮＡ）に対するアストラガロシドの作用ＨＵＶＥＣにおけるｔＰＡ及びＰＡＩ−１のｍＲＮＡ発現に対するアストラガロシドＡＳＩＶの効果（図１４）集密状態におけるＨＵＶＥＣを、それぞれ６、12及び24時間にわたりＡＳＩＶの非存在のもとで、又はその存在（100μg/ml）のもとでインキュベートした。非処理のＨＵＶＥＣ及びＡＳＩＶで処理したＨＵＶＥＣのＲＮＡ抽出物のノーザンブロット分析を32Pで標識したいくつかのｃＤＮＡ−ゾンデを用いてｔＰＡ、ＰＡＩ−１及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡについて行なった。オートラジオグラムの上に存在しているバンドの強度をデンシトメトリーによって評価し、そしてｔＰＡ又はＰＡＩ−１に対する特異的ｍＲＮＡを、負荷量の差を補償するためにＧＡＰＤＨのｍＲＮＡに対して標準化した。信号強度は非処理対照群細胞の信号と比較ししての、ＮＲ１で処理したＨＵＶＥＣの信号の割合として比較した。これらデータは、類似の結果を示した２つの独立の実験の結果を表わす。図１４に示すように、ＨＵＶＥＣにおける、ＡＳＩＶのｔＰＡ分泌に対する剌激効果及びＰＡＩ−１分泌に対する阻害効果は特異的ｍＲＮＡ発現の水準にも反映されていた。例９内毒素で処理した内皮細胞培養物におけるＰＡＩ−１及び組織因子発現に対するアストラカロシテドＡＩＶの作用図１５に示すように、それら細胞を種々の濃度でＬＰＳで12時間にわたり処理することによりもたらされたＰＡＩ−１抗原の制御はＡＳＩＶによる同時的処理によって大きく低下する（^**p＜0.01、^***p＜0.001）。この拮抗作用の大きさはＡＳＩＶの濃度（0.1-100μg/ml）に関して投与量依存性であった。それら細胞のＰＡＩ−１活性の変化はＰＡＩ−１抗原の変化と平行であった（データは示していない）。図１６は内毒素により惹起された組織因子（ＴＦ）のＨＵＶＥＣにおける発現に対するＡＳＩＶの効果を示す。ＡＳＩＶはＬＰＳにより誘発されるＴＦ制御をほとんど完全に拮抗する。ＴＦのｍＲＮＡの重大な上昇がＬＰＳによるＨＵＶＥＣの処理の後で観測された。ＬＰＳにより高められたＴＦのｍＲＮＡの値はＡＳＩＶとの組み合わせにより類似的な態様で拮抗された（図１７）。例１０ヒトにおけるノトジンセンＲ１の含まれた種々の抽出物の繊維素溶解活性に対する作用図１８、１９及び２０には、健康な基員におけるｔＰＡ、ＰＡｉ及びｕＰＡに対するＮＲ１含有抽出物の効果があげられている。ｔＰＡの上昇及びＰＡＩ−１の低下がもたらされ、これは組織培養におけるＮｒ−１又はＡＳＩＶの効果に相当する。

Claims

【特許請求の範囲】１．ノトジンセノシドＲ１（ＮＲ１）及び／又はアストラガロシド（ＡＳＩＶ）のようなトリテルペンサポニン類を繊維素溶解活性の低下した状態又は内毒素効果の処置のための医薬の製造のために使用する方法。２．ノトジンセノシドＲ１（ＮＲ１）及び／又はアストラガロシド（ＡＳＩＶ）のようなトリテルペンサポニン類を内毒素ショック状態の患者又は動物の処置のため、又は内毒素ショックの防止のための医薬の製造に使用する、請求の範囲１に従う方法。３．ノトジンセノシドＲ１（ＮＲ１）及び／又はアストラガロシド（ＡＳＩＶ）のようなトリテルペンサポニン類を、冠状動脈性心臓疾患、抹消動脈疾患を有する患者及び心筋梗塞又は狭心症にかかった患者をその繊維素溶解能を高めるように予防し、又は処置するための医薬の製造に使用する、請求の範囲１に従う方法。４．ノトジンセノシドＲ１（ＮＲ１）及び／又はアストラガロシド（ＡＳＩＶ）のようなトリテルペンサポニン類を、低下した繊維素溶解能、又は健康な人の内毒素効果の防止のための医薬の製造にも使用する、請求の範囲１に従う方法。５．ノトジンセノシドＲ１（ＮＲ１）及び／又はアストラガロシド（ＡＳＩＶ）のようなトリテルペンサポニン類を、種々の添加剤、安定化剤又は生体能力を高める物質の存在のもとにＮＲ１又はＡＳＩＶを活性物質として含む、溶液、タブレット又はカプセルの形の調剤としての医薬の製造に使用する、請求の範囲１ないし４の１つに従う方法。