JPH08508400A - シュードモナスフラギーコレステロールエステラーゼを用いたコレステロールエステルの加水分解方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 シュードモナス フラギーの菌株、例えばPs．フラギー22．39Ｂ，FERM BP-1051、又はその突然変異株もしくは変異株から得ることのできるコレステロールエステラーゼ酵素であって次のＮ−末端アミノ酸配列：Ala Asp Asn Tyr Ala Ala Thr Arg Tyr Pro Ile Ile Leu Val His Gly Leu Thr Gly Thr Asp Lys Tyr Ala Gly Val Leuを有するコレステロール エステラーゼ、又はコレステロールエステラーゼ活性を有しそしてシュードモナス フラギー FERM BP-1051由来のコレステロール エステラーゼと同一の免疫化学的性質を有するコレステロールエステラーゼを用いコレステロールエステルを処理することによるコレステロール エステルの加水分解方法。この方法は、例えば卵、製紙パルプ、ステロール、ラノリンの処理に対しそして洗浄目的に対しそして有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 シュードモナス フラギー コレステロール エステラーゼを用いたコレステロ ール エステルの加水分解方法 技術分野 本発明は、コレステロール エステルの加水分解方法に関する。更に詳しくは 、本発明はシュードモナス フラギー（Pseudomonas fragi）の菌株から得るこ とのできるコレステロール エステラーゼの使用に関する。 背景技術 以下の内容は周知である；すなわちシュードモナス属に属する構成員のあるも のはコレステロール エステラーゼを生産する能力を有し、他の構成員はリパー ゼを生産する能力を有しそして更にある構成員は両タイプの酵素を生産する能力 を有する。 Smirnov等［Smirnov，V.V.；Kornyushenko，O.N.；Bioko，O.I.；Kolesova，E .A.；Govseeva，N.N.；Endt，V.P.；and Kiprianova，E.A.；Mikrobiologichesk ii Zhurnal（Kiev）；42（5），1980，566-570］による研究において、シュード モナス属に属する細菌の25種の合計591菌株が細胞外コレステロール エステラ ーゼを合成するためのそれらの能力に対して研究された。 Ps．エルギノサ（aeruginosa），Ps．シュードアカリゲネス（pseudoacaligen es），Ps．フルオレセンス（fluorescens），Ps．プチダ（putida）、およびPs ．マルトフィリア（maltophilia）の個々の菌株のみ（研究された培養物の３． ４％）は、コレステロール エステラーゼ活性を有していた。脂肪分解活性は、 Ps．アウレオファシエンス（ aureofaciens）（研究された菌株の１００％において），Ps．セパシア（cepaci a）（75％中），Ps．マルトフィリア（maltophilia）（60％中），Ps．フルオレ センス（fluorescence）（13.3％中）およびPs．エルギノサ（aeruginosa）（60 ％中）において見出された。 この研究から、Ps．フラギー（fragi）培養物のいずれもコレステロール エ ステラーゼを生産できることは知られていない。 発明の要約 本発明によれば、今や以下の内容が見出された；すなわちシュードモナス フ ラギー（Pseudomonas fragi）の菌株は細胞外コレステロール エステラーゼを 生産することができる。更に、驚くべきに以下の内容が見出された；すなわちコ レステロール エステラーゼ活性をつかさどる酵素成分は、またリパーゼ活性を つかさどる成分でもある。 従って、本発明はPs．フラギーの菌株から得られるコレステロール エステラ ーゼの使用、すなわち該コレステロール エステラーゼ酵素を用いエステルを処 理することによるコレステロール エステルの加水分解方法に関する。本発明方 法は卵の処理、パルプ中の樹脂の加水分解プロセスおよびステロール又はラノリ ンの加水分解又は合成方法において特に有用である。 別の面において、本発明はPs．フラギーの菌株から得ることのできるコレステ ロール エステラーゼを含んでなる洗浄組成物を提供する。 図面の簡単な説明 本発明を添付図面を参照しつつ更に説明する： 図１は分光光度定量、例えば例２によって得られるような種々の 酵素に対する動力学曲線（吸光度対時間）を示す。 発明の詳細な開示 驚くべきことに、今や以下の内容が見出された；すなわちシュードモナス フ ラギーの菌株はコレステロール エステラーゼ活性を有する酵素を生産する能力 を有することおよびコレステロール エステラーゼ活性をつかさどる酵素は、リ パーゼ活性をつかさどる酵素と同一であり、すなわち正しく同じタンパク質はリ パーゼ活性およびコレステロール エステラーゼ活性を有する。 従って、本発明はシュードモナス フラギーから得ることのできるコレステロ ール エステラーゼ酵素を用いコレステロール エステラーゼを処理することを 含んでなるコレステロール エステルの加水分解方法に関する。 好ましい態様において、コレステロール エステラーゼは、和光純薬（株）（ 東京）から注文番号126−02931で入取可能な、Ps．フラギー由来のリパーゼβお よび菌株Ps．フラギー22．39Ｂ，FERM BP-1051又はそれらの突然変異株又は変異 株から由来する。 より好ましい態様において、コレステロール エステラーゼは本明細書に添付 した配列表の配列番号：１により同定されるＮ−末端アミノ酸配列である。 かくして、以下の内容は注目すべきである；すなわちコレステロール エステ ラーゼ活性およびリパーゼ活性を有する本発明方法で用いられる酵素は、例えば コレステロール エステラーゼ作用リパーゼ又はリパーゼ作用コレステロール エステラーゼとして記載される。 本発明方法で用いられるコレステロール エステラーゼは、Ps．フラギーのコ レステロール エステラーゼ生産株、好ましくは菌株 Ps．フラギー22．39Ｂ，FERM BP-1051、又はそれらの突然変異株又は変異株を、 炭素および窒素源並びに無機塩を含有する培地中で培養し、次いで目的の酵素を 回収することによって得ることができる。 高度に精製されたリパーゼは、本明細書の例１で記載される方法により、和光 純薬（株）（東京）から供給される前記リパーゼ調製品リパーゼβ 126−02931 から得られた。アミノ酸分解により、この酵素のＮ−末端アミノ酸配列は、本明 細書に添付された配列表の配列番号：１として同定されたものであることが見出 された。本明細書の例２に記載した方法により、この酵素は又コレステロール エステラーゼ活性を有することが判明した。 本発明方法で用いられるコレステロール エステラーゼは組換えDNA工学によ り得ることもできる。二つのリパーゼおよびコレステロール エステラーゼ活性 を有するタンパク質の発現により、特別な利益が得られる。組換えコレステロー ル エステラーゼは、例えばWO92／05249として公開された国際特許出願（これ はその番号を引用して本明細書に加えられる）において記載される方法を用いる ことにより得ることができる。 従って、本発明は更にコレステロール エステルの加水分解方法に関しこの方 法はシュードモナス フラギー FERM BP-1051由来のコレステロール エステラ ーゼと同一の免疫化学的性質を有しそして実質的なコレステロール エステラー ゼ活性を有するコレステロール エステラーゼ酵素を用いコレステロール エス テルを処理することを含んでなる。 両方のコレステロール エステラーゼおよびリパーゼは、広範囲の工業的応用 を有する。 従って、更に別の面において、本発明は卵の加水分解のためPs． フラギーのリパーゼ生産株から得られるコレステロール エステラーゼの使用、 すなわちコレステロール エステラーゼを用いた卵の処理方法に関する。 更に別の面において、パルプ中の樹脂の加水分解のためのプロセスにおいてPs ．フラギーのリパーゼ生産株から得られるコレステロール エステラーゼの使用 、すなわち樹脂−含有製紙パルプの処理方法に関する。 メカニカルパルプ法は、単独又は穏やかなケミカルパル処理と組合せてパルプ の製造において広く用いられる。これらのプロセスは、４−９の範囲内のpHでお こなわれそして木の成分は比較的小さな化学的変化を受ける。従って、パルプは 相当含量のトリグリセリド、エステルおよび樹脂からのろうを有する。 残留樹脂は引き続きその後の加工および／又はパルプの使用中に問題を引きお こすかもしれない。例えば集塊した樹脂は製紙中又は印刷中紙の切断並びに紙の 品質の低下を引きおこし得る。樹脂の疎水性部分が相当量のトリグリセリドおよ び他のエステルを含有することは公知である。従って、これらを加水分解するこ とが望ましい、何故なら加水分解生成物は水性系中でより容易に除去されるから である。 パルプ中の樹脂の加水分解のためのプロセスは、例えば国際特許出願PCT／DK9 2／00115およびPCT／DK92／00137、又は国際公開WO92／07138およびWO92／13130 において記載されておりそしてそこで記載される如く本質的に実施できる。 更に別の面において、本発明方法はPs．フラギーのリパーゼ生産株から得られ るコレステロール エステラーゼを用いコレステロール エステルを処理するこ とによるステロール又はラノリンの加水分解又は合成に関する。このようなコレ ステロール エステルは、 生皮の脱脂のための皮革の製造において、羊毛産業におけるラノリンの加水分解 に対しそしてステロール／ラノリン、例えば化粧において使用するためのラノス テロールの加水分解／合成に対して好都合に使用できる。 本発明は又Ps．フラギーのリパーゼ生産株から得られるコレステロール エス テラーゼを含んでなる洗浄組成物を提供する。特に、ゲル、すなわちゲル洗浄剤 として処方される洗浄組成物は、工業上の硬い表面の洗浄、特に食肉処理場およ び他の食品産業において使用できる。 特別のゲル洗浄剤は；例えばReseach Disclosure 340，1992年８月開示番号34 035（酵素含有ゲルクリーナー）において記載される如く得ることができる。 以下の例は本発明を説明するものであるが、いかなる場合も権利要求されてい る本発明の範囲を制限するものではない。 例１精製 和光純薬（株）（東京）より市販されそしてFERM BP-1051として寄託された菌 株Ps．フラギー22．39Ｂから由来しそしてヨーロッパ特許公開204284に開示され たPs．フラギーリパーゼ調製品を次の如く均質になるまで精製した。 リパーゼをpH６の50mM酢酸ナトリウム緩衝液を用いＳ−セファロースカチオン 交換器内を通過させた。 リパーゼ活性を有する溶出液を0.8Ｍ酢酸ナトリウムに調節し次いで0.8Ｍ酢酸 ナトリウムで平衡化した、トーヨーパール ブチル（Toyopearl Butyl）カラム に適用した。色彩を含有する物質が消失するまでカラムを0.8Ｍ酢酸ナトリウム で洗った。マトリックスに 結合したリパーゼを50％エタノールで溶出し、濃縮し次いで透析によりエタノー ルから分離した。 次いで50mMトリスアセテート緩衝液を用い、pH７でリパーゼを高性能Ｑ−セフ ァロースアニオン交換器に委ね、次いで（SDS-PAGEで証明される如く）均質にな るまで精製した。 精製リパーゼは、リパーゼ活性に対し次の分析により測定される如く8000LU／ OD280の比活性を有していた。 リパーゼに対する基質は、乳化剤としてアラビアゴムを用いグリセリントリブ チレート（MERCK）を乳化することにより製造した。 リパーゼ活性をpHスタット法を用いpH７で分析した。リパーゼ活性の１単位（ LU）は、毎分１モルの脂肪酸を遊離するために必要とされる量として定義される 。Ｎ−末端アミノ酸分析 前記リパーゼ／コレステロール エステラーゼのＮ−末端アミノ酸配列を、ペ プチドの入手および配列の標準方法［Findlay & Geisow（編），Protein sequen ching-a practical approach，1989，IRL Press］を用いて測定した。 リパーゼ／コレステロール エステラーゼを前記の如く精製した。トリス緩衝 液を除去するため、50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH６）を用い、精製されたリパ ーゼ／コレステロール エステラーゼをスーパデックス200TMカラムに適用した 。 Ｎ−末端アミノ酸は次の如くであることが見出された（添付の配列表の配列番 号：１）： 例２コレステロール エステラーゼ活性に対する分析 コレステロール エステラーゼ活性に対する酵素分析を展開し、そして幾つか のリパーゼのコレステロール エステラーゼを調べた。 分析は次の３つの共役反応に基づいている： １）コレステロール オレエート −−（１）- →コレステロール＋オレイン酸 ２）コレステロール＋Ｏ₂＋H₂O −−（２）- →H₂O₂＋コレステノン ３）H₂O₂＋４−アミノアンチピリン（red） −−（３）- →2H₂O＋４−アミノ−アンチピリン（ox） 含まれる酵素： （1） コレステロール エステラーゼ（分析すべき） （2） コレステロール オキシダーゼ （3） ペルオキシダーゼ ４−アミノアンチピリンのレドックス（redox）反応は、6.89の吸光係数（Ｅ ）を用い500nmの吸光度における変化により追跡する。条件および試薬 pH： 7.0 温度（Ｔ）： 37℃ 緩衝液： 0.4M KH₂PO₄；pH7.0；37℃（54.4mg/ml） 基質： 0.0086M コレステロール オレエート（5.6mg/ml）；1.0m lのポリオキシエチレン−９−ラウリル−エーテル中に56.0mgのコレステロール オレエートを溶解。小さな撹拌棒を加えそして穏やかに撹拌。撹拌しながら9. 0mlの熱（＞50℃）塩水（0.9％w/w）を加える。溶液を室温で放置する。 その他： 15％（w/w）のタウロコール酸，Na塩（150mg/ml）；1.75 ％（w/w）の４−アミノアンチピリン（17.5mg/ml）；６％（w/w）フェノール（6 0mg/ml） カップリング酵素：コレステロール オキシダーゼ，シグマ（商標）Ｃ−1512 （１ｍｇタンパク質／ｍｌ）。 ペルオキシダーゼ，シグマ（商標）Ｐ−8250（39.5プルプ ロガリン単位／ml）。 酵素： コレステロール エステラーゼ（0.02−0.4Ｕ／ml）手順 １cmの標準シリカキュベット内に、2.07mlの緩衝液、0.10mlのタウロコール酸 ；0.10mlのペルオキシダーゼおよび0.50mlの基質をピペットで分注し次いで逆に することにより混合した。 次いで0.10mlのフェノールを添加しそして逆にすることにより混合した。次い で0.05mlの４−アミノアンチピリンおよび0.03mlのコレステロール オキシダー ゼを添加し、そして500nmで基線を得た。最後に0.05mlのコレステロール エス テラーゼを加え、次いで５00nmでΔOD（dA／dt）を得る。コレステロール エステラーゼ単位の計算 ： １コレステロール エステラーゼ単位は、pH7.0および37℃で１分当たり１μm oleのコレステロール エステラーゼを加水分解するであろう酵素の量として定 義される。検査される酵素 検査される酵素を下記の表１に掲げる。ただ１つの酵素タンパク 質が存在していたことを確認するため、高純度の酵素調製品を適用した、注：精 製法は例１に示される。 検査される酵素（注表１）を同じOD基準で用いた。対照としてシグマ（商標） からのコレステロール エステラーゼを用いた。この酵素から成る、OD＝0.077 を有する50fμｌの溶液、約0.077mg／mlを用いた。 全ての酵素を400−600秒間走査し、そして前記勾配dA／dtを間隔30−120秒に 対し計算した。これらの結果から表１に示される活性を計算した。分光光度定量 を図１に示す。 表１から以下の内容は明らかである；すなわちシグマ（商標）からの対照およ び例１に従って得られるPs．フラギー コレステロール エステラーゼ／リパー ゼのみが著るしいコレステロール エス テラーゼ活性を有する。Ps．フルオレセンス由来のリパーゼは著るしいコレステ ロール エステラーゼ活性を示さなかった。 配列表 （2） 配列番号１に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：27個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （iii）ハイポセティカル：なし （ｖ）フラグメント型：Ｎ−末端 （vi）起源： （Ａ）生物名：シュードモナス フラギー （xi）配列：配列番号：１：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｋ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．コレステロール エステルの加水分解方法であって、シュードモナス フ ラギーの菌株から得ることのできるコレステロール エステラーゼ酵素を用いコ レステロール エステルを処理することを含んでなる、前記方法。 ２．コレステロール エステラーゼが、シュードモナス フラギー22．39Ｂ， FERM BP-1051、又はその突然変異株又は変異株から得ることのできる、請求の範 囲第１項記載の方法。 ３．コレステロール エステラーゼが次のＮ−末端アミノ酸配列： を有する、請求の範囲第１又は２項記載の方法。 ４．卵を処理するための、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の方法 。 ５．樹脂−含有製紙パルプの処理のための、請求の範囲第１〜３項のいずれか １項に記載の方法。 ６．ステロール又はラノリンの加水分解又は合成のための、請求の範囲第１〜 ３項のいずれか１項に記載の方法。 ７．コレステロール エステルの加水分解方法であって、シュードモナス フ ラギー FERM BP-1051由来のコレステロール エステラーゼと同一の免疫化学的 性質を有しそして実質的なコレステロール エステラーゼ活性を有するコレステ ロール エステラーゼ酵素を用いコレステロール エステルを処理することを含 んでなる、前 記方法。 ８．シュードモナス フラギーの菌株から得ることのできるコレステロール エステラーゼを含んでなる洗浄組成物。 ９．コレステロール エステラーゼが、シュードモナス フラギー22．39Ｂ， FERM BP-1051の菌株又はその突然変異株もしくは変異株から得ることのできる、 請求の範囲第８項記載の組成物。 10．コレステロール エステラーゼが、次のＮ−末端アミノ酸配列： を有する、請求の範囲第８又は９項記載の組成物。