JPH08508015A

JPH08508015A - 妊娠哺乳類の羊膜破壊の検出法

Info

Publication number: JPH08508015A
Application number: JP6520431A
Authority: JP
Inventors: ボロテリアク，ビクター; カウレイ，デビツド・マイケル
Original assignee: ボロテリアク，ビクター; カウレイ，デビツド・マイケル
Priority date: 1993-03-23
Filing date: 1994-03-23
Publication date: 1996-08-27
Anticipated expiration: 2018-08-25
Also published as: EP0689552B1; JP3441076B2; ATE226959T1; US5783396A; EP0689552A1; DE69431621D1; EP0689552A4; WO1994021687A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、免疫測定法および該測定法で有用な試薬を使用して、ヒトを含む妊娠哺乳類の羊膜破壊を検出する方法に関する。その方法では、羊水から適切な蛋白抗原を調製する方法を記載し、蛋白質精製技術を使用して羊水に存在する蛋白混合物からこの蛋白質を選択するための基準を提供し、抗体を抗原に対して高めるのに十分な抗原の純度を評価するための基準を提供し、得られた抗体を免疫測定法でどのように使用して膣中の羊水の有無を検出し、その結果、羊膜の破壊を検出することかできるかを示す。その方法は、他の状況における羊水の検出にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】妊娠哺乳類の羊膜破壊の検出法発明の詳細な説明発明の分野本発明は、免疫測定法および該測定法で有用な試薬を使用して、ヒトを含む妊娠哺乳類の羊膜破壊を検出する方法に関する。その方法では、羊水から適切な蛋白抗原を調製する方法を記載し、蛋白精製技術を使用して羊水に存在する蛋白混合物からこの蛋白質を選択するための基準を提供し、抗体を抗原に対して高めるるのに充分な抗原純度を評価するための基準を提供し、得られる抗体を免疫測定法でどのように使用して膣中の羊水の有無を検出し、その結果、羊膜の破壊を検出することができるかを示す。その方法は、他の状況における羊水の検出にも関する。発明の背景（１）哺乳類の羊膜の破壊（２）哺乳類の羊膜の破壊の検出（３）羊水に存在する蛋白１．哺乳類の羊膜の破壊卵膜（fetal membrane）の早期破壊は、全妊娠の１４〜１６％で認められた（ Polansky，G．H.，et al,，J．Reprod．Med．30:189（1985）；Trap，P.，et al .，Gynecol．Obstet．Invest．28:14（1989））が、別の研究では、全妊娠の３〜１４％で、卵膜の破壊の後に分娩ができなかったことが分かった（Larsen，L. ，Br．Med，J．1:1165（1979））。膜の破壊に関して、Ｄｕｆｆ（Obstet．Gyne col．63:697（1984））は、患者の８０％が２４時間以内に自然分娩となり、残りの１０％は４８時間後も分娩しないことに気付いた。周産期の死亡率は、２４時間の潜伏期後には２倍となり、４８時間後にはさらに２倍になる（Overstreet & Romney，Am．J．Obstet．Gynaecol．90:1036（1966））。分娩の開始が遅れるほど、母親および周産期児の感染および死亡の危険が高まる（Kapeller-Adler ，R．et al.，Biochim．Biophys．Acta．67:542-565（1963）；Overstreet，上記と同じ）。従って、破壊膜の正確な検出は、診断の重要な助けとなる。従って、成熟した胎児では、膜破壊の早期診断により、分娩を早め、その結果、母親および乳児に対する感染の危険を少なくすることができる。早期児では、膜破壊の正確な診断がより重要であり、分娩誘発の必要がある場合は特にそうである。膜破壊の診断の信頼できる容易な方法があれば、産科医にとって臨床上有用であり（Davidson，K．M.，Clin．Obstet ．Gynecol．34:715-722（1991）；Gregg，A，R.，Obstet．Gynecol．Clin．Nort h Am．19:241-249（1992））、また、長期の不要な入院の必要性が少なくなるので、コストも削減される。地方に居住する患者の利益、長期になる入院のために家から離れた第三ケアセンターへの移動、および膜の早期破壊の疑いに対する家族の環境は無視できない。２．哺乳類の羊膜の破壊の検出物理的検査の他に、破壊された卵膜の診断を確立するための現在の技術は次の通りである。（１）膣のｐＨの測定（Go1d，V,，Ann．Chir．et Gynec．Fenniae．47:22（192 7）；（２）胎児の脂肪小球の染色（Von．Numers，C.，Acta．Obst．et Gynec．Scand ．16:249（1936）；（３）胎児の扁平上皮細胞または毛の同定（Phillip，E.，Zmtrolbl．Gynok．53 :1618（1929），Bourgeois，G．A.．Am． J．Obstet．Gynecol．44:80（1942）；（４）羊水の典型的な結晶化の検査（Volet，B,，et al.，Gynaecologica 149:1 51（1960），Borten，M,，et al.，Am．J．Obstet．Gynecol．154:628（1986）（５）膣液のＤＡＯ活性の測定（Elmfors，B.，et al.，J．Obst．Gynecol．Bri t．Commonw．81:361（1974），Gahl，W．A.，et al.，Obstet．Gynecol．60:297 （1982a），Bank，C．M.，et al.，Eur．J．Clin．Chem．Biochem．29:742（199 2）；（６）α−フェトプロテイン（Toth，P,，et al.，Acta． Paaediatr．Hung．3 0:399（1990），Garite，T．J．et al.，Am．J．Perinatol．7:276（1990））；（７）プロラクチン（Kalenga，M．K.，et al.，Rev．fr．Gynecol．Obstet．86 :585（1991））；（８）ヒト胎盤性ラクトゲン（Kalenga，M．K.，et al.，上述）；（９）羊水型のジアミンオキシダーゼ（オーストラリア特許６２２７８８）（１０）胎児フィブロネクチン（Hellemans，P.，et al.，Eur．J．Obstet．Gyn ecol．Reprod．Biol．43:173（1992），Lockwoo d，C．J．et al.，New Engl．J．Med．325:669（1991））；（１１）色素および他の化学薬品の羊膜内注射（Jiminez-Balderaz E．A．Bol． Med．Hosp．Infant Mex．41:p341（1984），Davidson，K．M.，Clin．Obstet．G ynecol．34:715（1991））；（１２）超音波による羊水の量（体積）の測定（Benacerraf，B．R,，J．Ultras ound．Med．11:109（1992），Hellemans，P.，et al.，Eur．J．Obstet．Gyneco l．Reprod．Biol，43:173（1992）；（１３）色素の経口摂取（Meyer，B．A.，et al.，Am．J．Perinatol．8:297（1 991）方法１〜４ Friedman，M．L,，et al.，（Am．J．Obstet．Gynaecol．48:172（1976）によれば、上記方法のいずれかの３つを合わせると９３％の精度が得られるが、膜の破壊の診断において適用される実験室用の全ての方法において、しばしば偽陽性および偽陰性の結果が生じる（Larsen，L.，上述）。方法５：ＤＡＯ活性 Elmfors，B.，et al.，（上述）は、Tornqvist，A.，et al.，（Acta．Obstet ．Gynec．Scand．50:79（1971））の情報を使用して、膣液中のＤＡＯ活性の測定による破壊膜の診断方法を開発した。ＤＡＯ活性は、羊水中に存在するが、膣分泌物には通常ないことから、膜の破壊を診断する方法が与えられる（Elmfors，B.，et al.，上述；Gahl，W．A.，et al.，上述）。膣分泌物中のＤＡＯ活性を集めるために最も広く使用される方法は、吸い取り紙を使用して分泌物を集め、リン酸塩緩衝液を使用して酵素を溶離することである（Elmors,上述）。Wishart，H．M.，et al．（Aust．N.Z．J．Obstet．Gyna ec．19:23（1979））もその方法の使用を支持し、臨床上有用な情報が提供される測定法を見出した。ＤＡＯの測定が膜の破壊の診断における従来の方法の補助として使用できることを示唆する因子が、Gahl，W．A.，et al．（上述）にまとめられている。しかし、その測定の主な欠点は、その測定が酵素活性の測定に依存し、（１）尿、（２）胎便、（３）防腐剤、（４）妊娠血清、（５）精液、（６）ヘモグロビンなどの妨害物質の存在下では誤った結果を示す可能性があるということである。これらの物質は通常、膣に混じっており、従って、妨害物質、不十分な感度および結果の主観的解釈により制限される現在の方法は無効となる。方法６〜８蛋白質α−フェトプロテインならびにホルモンのプロラクチンおよびヒト胎盤性ラクトゲンの測定は、Huber，J．F.，et al.，（Br．J．Obstet．Gynaecol．9 0:1183-1185（1983））により研究されているが、彼らは、多くの陽性の患者の膜が完全であることを見出した。これは、一部では、これらの物質が母親の血清に存在し、従って、血清もしくは羊水またはその両方が膣に存在するときは、テストが陽性になるという事実による。Rochelson B．C．（Obstet．Gynaecol．69 :163-6（1987））もまた、膣液中のα−フェトプロテインの有無に関するテストで、偽陽性の結果を与える血液および血清を見出している。方法９：羊水型のジアミンオキシダーゼオーストラリア特許第６２２７８８号明細書（公開：ＷＯ９０／１００６１）を参照すると、妊娠哺乳類における羊膜の破壊の検出法が述べてあり、これは、初めて二つの形態のジアミンオキシダーゼ−一方の形態は母親の血清に存在し、他方は羊水に存在し、それらは、外見上、異なるポリサッカリド部分および類似した蛋白質部分を有する糖蛋白である−を見出したという発見に基づくものである。羊膜が破壊されると、羊水型のジアミンオキシダーゼが母親の血清中に初めて検出される。しかし、各糖蛋白に関してポリクローナル抗体が開発される一方、モノクローナル抗体を開発することは、各糖蛋白の立体構造または三次元構造が類似していて、エピトープも類似のものになるため、明らかに困難であった。また、血清型のジアミンオキシダーゼおよび羊水型のジアミンオキシダーゼの両方に対して少し交差反応もあった。すなわち、両方とも、ある程度、母親の血清と反応する。このことは、羊水型のジアミンオキシダーゼが胎盤または羊膜を通過できないという保証はなく、わずかだけでも母親の血清に存在することを意味する。方法１０：胎児フィブロネクチン胎児フィブロネクチンの検出は、羊膜の破壊に対して特異的ではない。胎児フィブロネクチンは、羊膜の破壊がなくても膣液中に存在することが示されており（Lockwood，C．J．et al,，New Engl．J．Med．325:669（1991））、最もよく記載れているのは、中絶のためのテストとしてである。このテスト（Creasy，R ．K.，New Engl．J．Med．325:727（1991））の評価においては、膜の破壊に対して特異的な信頼できるテストの必要性がはっきり確認された。方法１１〜１３色素および他の化学薬品を腹壁を通して羊水に注入して、その出現を膣中で調べた（Jiminez-Balderaz，E．A．上述；Davidoson，P．上述）。これらの方法は、それらが物理的方法であり（Hellemans，P.，et al．上述；Bancerraf，B．R. ，上述）、または、妊娠哺乳類に色素を注入する（Meyer，B．A.，et al.，上述）という点で本発明とは異なる。それらは、免疫測定法ではない。これらの技法は、アレルギー反応の可能性があるので、危険がないとはいえない（Davidson， K．M．上述）。３．羊水に存在する蛋白羊水には多数の蛋白質が存在する。これらは、種々の器官組織に由来する。特に、母親の血清（Sorensen，S．Clinica．Chimica．Acta．202:199（1991））、胎盤、羊水細胞、胎児の尿、胎児の肺および胎児の皮膚に由来する蛋白質が記載されている。これらの蛋白質は、妊娠中にある部分から別の部分に移動したり、１種以上の体液に存在する可能性があることは知られているが、それらの蛋白のほとんどの運命は未知である。例えば、α−フェトプロテインおよびアルブミンは胎児血清および羊水の両方に存在し（Huber，J．F.，et al.上述）、胎児フィブロネクチンは、胎盤膜組織および羊水に存在する。発明の要旨従って、本発明の目的は、羊膜破壊または羊水の漏出の診断のための測定法を提供することであり、該測定法は、信頼性があり、上記の公知測定法に見られる問題点を軽減するものである。従って、本発明は、体液中の羊水を検出するための測定法、特に妊娠哺乳類（特に、妊婦）の羊膜破壊または羊水の漏出を診断するための測定法を提供し、該測定法は、膣液中のＰＲＯＭ抗原（ＰＲＯＭ−Ａｇ）（後述）の有無を検出し、それによって羊水が膣液中に存在することを証明する工程を含む。これは、羊水が母親血清と区別できることを意味する。雌の妊娠に関して、産道、特に子宮頸部の炎症は、母親の血清の膣への漏出を招く可能性がある。羊水は多くの蛋白質を含み、驚くべきことに、羊水に存在する特定の蛋白画分（すなわち、ＰＲＯＭ−Ａｇ）を使用すると、下記で詳述するＰＲＯＭ−Ａｇの検出のための適切な技法により、羊水を膣中の他の体液と区別することができることが、本発明により見出された。羊膜の破壊が生じると、羊水の膣への漏出が起こり、その結果、膣は羊水を含むことになる。すなわち、他の体液中では検出できない羊水蛋白の有無が検出できるならば、羊膜破壊の診断の有用な手段になることは明らかである。従って、これにより、「破水」が生じたことが明確に示され、他の体液の膣への漏出により出される誤った警告は避けることができる。誤った警告は、特に、水泳や入浴後に膣から膣液が漏れたり流出する場合、または母親の血清、exocoelemic液、組織液、尿、精液または過剰な膣液自体などの他の体液が正常な量よりも多く存在する場合に出されやすい。本発明によれば、ＰＲＯＭ−Ａｇは羊水中で検出可能であり、膣に存在するかも知れない他の体液中では検出できないと考えられる。適切な技法（等電点、サブユニット分子量および天然分子量などのテスト）によるこのＰＲＯＭ−Ａｇの検出により、羊水が膣中の他の体液から区別される。しかし、ＰＲＯＭ−Ａｇの最良の測定法は、恐らく、後述する免疫学的方法または免疫測定法を使用するものである。従って、これに関しては、ＰＲＯＭ−Ａｇに対して特異性を有する適切な結合剤、例えば抗体（実際には、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体と考えられる。）が得られると、ＰＲＯＭ−Ａｇの検出に役立つ。すなわち、ＰＲＯＭ−Ａｇに対して特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、羊水の検出に極めて有用である。これらの抗体はまた、羊水からＰＲＯＭ−Ａｇを精製するための他の方法をつくり出すのに極めて有用である。他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体は当業者に周知の方法によって得ることができる。理解されるように、本発明で使用できる抗体は、動物内で、異なる種の動物から得られる蛋白（抗体を生産するための動物に認められるものとは異なる）に対して生産することができる。そのような抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよい。そのような抗体を産生する方法は、Kennett，R．H.，McKearn，T ．J.，and Bechtol，K.B．編,，Monoclonal Antibodies，Hybridomas：A new di mension in biological analyses（モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学的分析における新次元）．Plenum Press，Inc.，New York，pp．361-419（198 0）などの刊行物に記載された方法が容易に利用できるが、これらに限定されない。さらに、感作膵臓細胞の単離方法は、当業界で周知である（Kennett，R．H ．et al.，上述）。ＰＲＯＭ−Ａｇに対して特異的なモノクローナル抗体を産生する本発明のハイブリドーマを生産するための出発物質として用いられる特定のミエローマ細胞系は、本発明では限定されない。そのようなミエローマ細胞系としては、ＳＰ２／０Ａｇ１４（Fiscus，S.A.，et al.，J．Clin．Micro．22:395-401（1985））、およびＦＯＸ−ＮＹ（Taggert，R．T.，et al.，Science 219:1228-1230（1 983））、Ｐ３ｘＧ３Ａｇ８（Kohler，G,，et al.，J．Immunol．6:292（19 76））、４５．６Ｔ６１．７（Margulies，D.，et al.，Cold Spring Harbor Sy mp．Quant．Biol．41:781（1977））、ＷＩ−Ｌ２−７２９ＨＦＺ（Strike，L． E.，et al.，J．Immunol．132:1798（1984））、ＭＰＣ−１１（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ１６７）、Ｊ５５８（ＡＴＣＣＮｏ．ＴＩＢ６）、Ｐ３．６．２．８．１（ＡＴＣＣＮｏ．ＴＩＢ８）、Ｐ１．１７（ＡＴＣＣＮｏ．ＴＩＢ１０）、Ｃ１．１８．４（ＡＴＣＣＮｏ．ＴＩＢ１１）、ＲＰＣ５．４（ＡＴＣＣＮｏ．ＴＩＢ１２）、ＨＯＰＣ１Ｆ／１２（ＡＴＣＣＮｏ．ＴＩＢ１３）、ＲＰＭＩ１８２２６（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ１５５）およびＩＳＭ２．７（Sc huster，J．F.，et al.，Human Immunol，9:137-143（1984））が挙げられる。感作膵臓細胞および周知のミエローマを用いるハイブリドーマ細胞系の産生は、周知の方法を使用して行うことができる（Kennett，R．H.，et al.，上述；Ta ggart，R．T.，上述；Cole，S．P．C.，et al.，Mol．Cell．Bioch．62:109-120 （1984））。ＰＲＯＭ−Ａｇに対して特異的なモノクローナル抗体の産生は、マウスハイブリドーマから得られるものに限定されず、ヒト、ラットまたは他の動物のハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体を含むことができる。完全な抗体分子の代わりに、（Ｆａｂ）₂、ＦａｂおよびＦＶフラグメントなどの抗体フラグメントを使用することができる。また、遺伝子工学技術を使用して適切な抗体およびフラグメントを作ることができる。免疫測定法を作るための方法は、Ishikawa，E.，Biochem．20:375（1987）に記載のものが容易に利用できるが、これに限定されない。ＰＲＯＭ−Ａｇ抗原およびこれに特異的な抗体は、当業界で周知の方法により、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（以下、「ＨＲＰＯ」と言う。）、アルカリホスファターゼ、ウレアーゼおよびルシフェラーゼなどのＥＬＩＳＡまたはＥＩＡにおける酵素で標識することができる。あるいは、ＰＲＯＭ−Ａｇおよびこれに特異的な抗体を、フルオレセイン、ローダミン、テキサス赤（Molecular Probes，Inc.）またはＡＮＳ（１−アニリノ −８−ナフタレンスルホネート）などのＦＩＡにおける蛍光マーカーで標識することができる。また、当業界で周知の方法により、¹²⁵Ｉ、¹⁴Ｃ、³²Ｐまたは³Ｈなどの放射線標識を含むＲＩＡを使用することもできる。使用できる他の標識系としては、不溶粒子標識、特に微小着色ラテックス粒子、金属ゾル（例えば、金のゾル）および色素ゾルなどの粒子直接標識が挙げられる。酵素は、種々のカップリング反応のいずれかを使用して抗体または他の蛋白に結合させてもよい。反応条件は、使用するカップリング試薬そのものに依存して変化する。カップリング試薬としては、例えば、ジイソシアネート、ジアルデヒド、カルボジイミド、イソチオシアネート、第二水銀、イミドエステルおよびビスマレイミドが挙げられる。これらのカップリング反応は、当業界で周知である（Kennedy，J．H.，et al.， Clin，Chim，Acta 70:1（1976））。酵素結合抗体の使用は多く報告されている。酵素結合抗体を使用するアッセイは、ヒト絨毛性ゴナドトロピンなどのホルモン（Van Weemen，B．K．et al.，In t．Arch．Allegy Appl．Immunol．54:88（1987））から感染症（Holmgren，J.， et al.，Infect．Immunity 7:759（1977），and Voller，A.，et al．The Enzym e-Linked Imminoabsorbent Assay（ELISA），Dynatech laboratories，Inc．（1 979））までの範囲に及ぶ。蛍光化合物はまた、酵素とともに使用する試薬と類似した試薬を使用して蛋白に共有的に結合させてもよい。そのような試薬の例としてはフルオレセインイソチオシアネートがあり、この場合、フルオレセイン基がイソチオシアネートカップリング試薬に結合している。利用できる当業界で周知の蛍光マーカーが数多くある（Stryer，L.，Ann．Rev．Bioch．47:819（1978），kennedy，J．H．et al. ，Clin．Chim．Acta 70:1（1976），およびWicker，R.，Ann．N，Y．Acad．Sci ．177:490（1971））。蛋白のビオチン化は、Goding，J．W.，J．Immunol．Methods 39:285（1980）の方法を使用して容易に行われる。典型的には、蛋白１ｍｇにつき、５０〜２５０μｇのビオチンスクシンイミドエステルを必要とする。アビジンは、ＨＲＰＯなどの他の蛋白と結合させる。アビジンはビオチンに強く結合する。アビジン−ビオチン系に対する用途は、酵素結合抗体に対して挙げたものと同様である。放射性標識蛋白は、種々の試薬および標識を使用して得ることができる。周知の ¹²⁵Ｉ標識キットの例としては、Enzymobead放射性ヨウ素化試薬（Bio-Rad L aboratories）およびIodo-Gen試薬（Peirce Chemicals）が挙げられる（Berson ，S．A.，et al.，J．Clin．Invest．35:170（1956）and Skelley，D．S.，Clin ．Chem．19:146（1973））。ラテックスビーズを含む凝集または化学発光に基づくイムノアッセイを使用することもできる。特定の測定手段は、使用する標識に依存する。そのような測定手段は、例えば上記で引用した参考文献などで当業界で周知である。存在する抗原の推定量を得る方法は、テストサンプルを既知量の基準抗原と比較して測定することである。また、抗原または抗体を適当な固体の支持体に結合させてもよい。この場合は、抗体を固体支持体に結合させるのが好ましい。本発明に有用な固体支持体の例しては、ポリスチレンまたはポリプロピレンのマイクロタイターウェル；ポリエチレン、ポリピニル、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、またはガラスの試験官、毛細管、ディップスティック、またはビーズ、ラテックスビーズ；ニトロセルロース；ナイロン；セルロース；ポリアクリルアミド；架橋デキストランおよび単結晶ガラスが挙げられる。イムノクロマトグラフィーおよび粒子直接標識の原理を使用した非常に適するアッセイ様式は、ＥＰ−Ａ−２９１１９４およびＥＰ−Ａ−３８３６１９に開示されており、これらは参考文献として本明細書に添付する。固体支持体を被覆するための最適条件は、参照試薬を使用するチェッカー盤滴定によって決定するのが最も良い。最低でも、抗原または抗体の濃度、被覆の時間、温度、緩衝液の条件およびｐＨをテストしなければならない。多くの抗原は、受動的吸収により結合させることができる（Voller，A.，et al.，上述）。実際的な面は、当業者であれば周知であり、それに関する手引きが発行されている（Voller，A.，et al.，上述）。従って、本発明は、下記の場合に利用することができる。（ｉ）出血なしに羊膜の早期破壊がある場合；（ii）出血を伴って羊膜の早期破壊がある場合；（iii）羊膜の破壊なしに産道、特に子宮頸部に外傷がある場合；（iv）羊膜の破壊も外傷もない場合；ならびに（ｖ）破壊および外傷がある場合上記（ｉ）、（ii）および（ｖ）の場合は、膣液中のＰＲＯＭ−Ａｇの有無のテストが陽性である。上記（iii）および（iv）の場合は、ＰＲＯＭ−Ａｇのテストが陰性である。従って、本発明の範囲内では、上記（ｉ）〜（ｖ）の場合の一つまたは全部の診断が予想される。本発明の好ましい態様でのアッセイは、下記工程を含む。（ａ）妊娠している雌から膣液サンプルを得る工程；（ｂ）そのサンプルをＰＲＯＭ−Ａｇ由来の抗体と反応させる工程；および（ｃ）信号増幅による反応性の検出工程。本発明はまた、上記方法で使用するためのテスト系またはテストキットもその範囲内に含む。これには、試験管または他の適する容器などの不活性な表面に固定化されるＰＲＯＭ−Ａｇ抗体も含まれる。その抗体（好ましくは、モノクローナルまたはポリクローナル抗体）は、不活性な表面に物理的または化学的に結合させることができる。反応系のさらに別の成分は、ＰＲＯＭ−Ａｇに対する結合ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり、それには適切な標識が結合している。ＰＲＯＭ− Ａｇとポリクローナルまたはモノクローナル抗体とが反応する際、結合ポリクローナルまたはモノクローナル抗体もＰＲＯＭ−Ａｇに結合し、その後、上記の適切な手段により、標識が検出される。すなわち、標識が酵素である場合は、適切な酵素基質を使用することができる。あるいは、標識に応じて、ＲＩＡ、ＦＩＡ、凝集、化学発光、膜またはディップスティック検出が使用される。ＰＲＯＭ−Ａｇ検出のこれらの技術のいくつかは、それらの技術自体をカバーする公知文献によって、その使用が制限される可能性がある（Yoshitake，S.，I magawa，M.，et al.，J．Biochem，92:1413（1982），Goding，J．W．ed．Monoc lonal Antibodies：Principles and Practices．Academic Press Inc．London（ 1986））。しかし、本発明の開示も、これらの技術をＰＲＯＭ−Ａｇ検出のための用途に限定するものである。というのは、これらの技術のこの特定の用途は、それらの公開時点では予期することができなかったからである。前記記載に関して、「破壊」という用語は、理解されるように、羊膜の穿孔もその範囲内に含むと考えられる。それは、羊膜の完全な破壊を生じるものではない。いくつかの場合は、羊膜に穿孔が十分存在し、その結果、羊水の漏出が生じるが、羊膜の完全な破壊には到らない。本発明の別の一面では、羊水から得ることができ、現在、種々の物理化学的方法により解析が行われている蛋白であって、これらの物理化学的方法を使用して膣液に存在する他の蛋白と明確に区別することができる蛋白も提供する。羊水に存在するこの蛋白（ＰＲＯＭ−Ａｇ）はまた、下記の物理的性質を有することを特徴とする。（ｉ）種々の濃度のアクリルアミドゲルを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより行ったサブユニット分子量が約５５，０００ダルトンである。（ii）ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定した天然の分子量分析により、見掛けの分子量が約３３０，０００ダルトンである。（iii）等電点電気泳動により一つのバンドを有する蛋白であることが示され、等電点は４．９である。（iv）ＰＲＯＭ−Ａｇに対して生産されたモノクローナル抗体は、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイによりテストすると、母親の血清蛋白との反応性はないが、羊水に対しては活性を示す。本発明は、理解されるように、適切な羊水源からのＰＲＯＭ−Ａｇの精製法もその範囲内に含む。特に、蛋白質は、その特定の物理的または化学的性質、生物学的または化学的活性または免疫反応性に応じて蛋白質群を互いに分離する技術を一つまたは連続して使用することにより精製する。そのような技術としては、下記のものが挙げられる。（１）ゲル濾過（Schmidt，A．M.，J．Biol．Chem．267:14987（1989），Metsar ne，K.，et al,，Clinica．Chimica．Acta．180:221（1989））；（２）電気泳動（Carpenter，H.C.，et al.，Electrophoresis．7:221（1986））；（３）アフィニティークロマトグラフィー（Cuatrecasas，P.，J．Biol．Chem． 245:3059（1970））；（４）イオン交換クロマトグラフィー（Iizuka，K.，et al.， Ann．Clin．Biochem．28:373（1991），Clark，P．I.，et al.，Clin．Chim，Ac ta．69:361（1976））；（５）ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー（Stanker，L．H,，et al.， J．Immunol．Methods．76:157（1985），Chertov，O.，et al.，Biomed．Sci．1 :499（1990））；（６）チオフィリック（thiophilic）吸着（Sulk，B.，et al.，J．Immunol．Me thods．149:165（1992））利用できる他の技術としては、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー、免疫吸収（immunoabsorption）または電気溶離が挙げられる。そのような方法を使用すると、蛋白質の複雑な混合物からある蛋白をかなり純粋な形で得ることができることは明らかである。しかし、そのような方法を、羊水に存在する蛋白質の複雑な混合物にそのまま無作為に適用すると、使用する方法およびその方法の各工程後に選択した分画に応じて、異なる蛋白または蛋白群を精製する結果となる。羊水からＰＲＯＭ−Ａｇを精製するための特定の方法は、下記工程を含む。（ｉ）種々の濃度のアクリルアミドゲルを使用してＳＤＳ− ＰＡＧＥにより行われるサブユニット分子量（約５５，０００ダルトン）；（ii）ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定される天然の分子量分析（見掛けの分子量が約３３０，０００ダルトン）；（iii）等電点電気泳動（等電点が４．９である一つのバンドの確認）；（iv）モノクローナル抗体との免疫反応性（サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイによりテストすると、母親の血清蛋白との反応性はないが、羊水とは反応する。）しかし、好ましくは、適切な分画をモノクローナル抗体１Ａ３でテストする。方法羊水蛋白の精製Ｌ／Ｓ（レシチン−スフィンゴミエリン）比評価の要件を十分満たす妊娠末期の羊水試料およびマッチングしていない無作為の母親血清は、the Mater Miseri ocordiae Hospital（ブリスベーン、オーストラリア）から得た。５０個のランダムな妊娠末期の羊水および５０個のマッチングしていない母親血清のサンプル２ｍｌを各々、硫酸アンモニウムで５０％飽和にし、室温で１時間十分混合した後、ベックマン超遠心分離器Ｌ８−Ｍにより、１０，０００ｇで３０分、超遠心分離を行った。沈澱物またはペレットを５．１ｍｌの０．０２Ｍ−Ｋ₂ ＨＰＯ₄（ｐＨ８．０）に再懸濁し、得られた溶液（５ｍｌ）を、シリンジに充填し、カラムの１０倍の体積の０．０２Ｍ−Ｋ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ８．０）と平衡にさせておいたＤＥＡＥＡｆｆｉ−ゲルブルーカラム（１０ｍｌ〔ＢＩＯＲＡＤ〕）に直接載せた。カラムを５０ｍｌの同じ緩衝液で洗浄し、結合した分画を直線勾配の０．０２〜０．８Ｍ−Ｋ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ８．０）で溶離した。未結合および結合分画（１０ｍｌ）を集め、カラムは、カラム床の５倍の体積の２．０Ｍ −ＮａＣｌ／０．０２Ｍ−Ｋ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ８．０）で再生した。個々のサンプルから得た分画を分析し、蛋白質のサブユニット組成物を、垂直スラブゲル装置（ＢＩＯＲＡＤ）を使用して、Laemmliの方法（Nature 227:680 （1970））によるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた。個々の分画（５０μｌ）を２００μｌのサンプル緩衝液（２０％グリセロール（ｖ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５％（ｖ／ｖ）２−β−メルカプトエタノール、０．００１２５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルーおよび１２．５％（ｖ／ｖ）０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）と混合し、１００℃で１０分煮沸し、１０μｌのアリコートを、予め染色した分子量基準物質（ＢＩＯＲＡＤ）とともにゲルに載せた。流動緩衝液（１２５ｍＭのトリス、０．５％のＳＤＳ（ｗ／ｖ）を含む０．９６Ｍのグリシン（ｐＨ８．０））と平衡化させた１０〜２４％および４〜１５％直線勾配ゲルで電気泳動を行い、銀染色を使用して蛋白を可視化した。最初の１０個の羊水および３個の母親血清試料から得た全ての分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。次いで、全ての母親血清に存在しなかった蛋白（Ｍ．Ｗ．約５５，０００Ｄａ）を含む、１０個の羊水から得た分画を集めて、次の試料での分析を行った。これに関して、結合分画はこの蛋白を含まないことが分かった。これらの分画は、ＹＭ−１０膜を有する攪拌セルを使用して個々に１０倍に濃縮し、次いで、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で平衡にしたセファクリルＳ−２００（Pharmacia）カラム（２．５ｃｍ×７５ｃｍ）上でクロマトグラフィーを行った。分画（５ｍｌ）を集め、先に記載したようにＳＤＳ／メルカプトエタノールとともにインキュベートし、流動緩衝液で平衡にした１２．５％均一ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した後、銀染色により可視化した。１０の別々の実験から得られた見掛け分子量が３３０，０００ダルトンである問題の蛋白を含む分画をプールし、攪拌セルを使用して、蛋白濃度が１ｍｇ／ｍｌになるまで濃縮し、免疫化プロトコールで使用した。この分画は、ＰＲＯＭ−Ａｇと命名された問題の蛋白を主に含み、抗体産生の免疫原として使用した。モノクローナル抗体の産生およびスクリーニングイムノアッセイ６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの最初の免疫化に対しては、０．１０〜０．１５ｍｇのＰＲＯＭ−Ａｇをフロイントの完全アジュバント（１：１ｖ／ｖ）に乳化させ、各マウスに皮下注射した。フロイントの不完全アジュバント（１：１ｖ／ｖ）を使用して調製した０．１０〜０．１５ｍｇの抗原による追加の免疫化を同じ方法で行った。抗原の最初の追加投与は、免疫化の６週間後に行い、続く追加投与は、２週間おきに８週間行った。免疫化したマウスに対して、最初の免疫化の６週間後、次いで１３週まで１週間ごとに耳の血液を採取し、１部位間接酵素イムノアッセイによって血清の評価を行うことで抗体レベルをモニターした。１部位間接酵素イムノアッセイ法では、１００μｌの抗原（０．２ｍｇ／ｍｌ）／トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）を９６ウェルのマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ免疫プレート）の各ウェルに添加し、室温（約２５℃）で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ〔（低塩）Ｌ／Ｓ〕Ｔｗｅｅｎ（１３６ｍＭのＮａＣｌ；３．２ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄；１．５ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄；２．７ｍＭのＫＣｌ；０．２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０含有）で３回洗浄し、１００ｍＭのＬ−リジンおよび０．５％のＢＳＡを含む０．１ｍｌ／ウェルのＰＢＳ（Ｌ／Ｓ）Ｔｗｅｅｎにより、室温で２時間、ブロックした。プレートをＰＢＳ（Ｌ／Ｓ）Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、０．１０ｍｌのマウス血清を各ウェルに添加した。ブランクは同様に調製したが、非免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した０．１０ｍｌ／ウェルの血清を使用した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで１：１，０００に希釈した０．０５ｍｌ／ウェルのペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧを添加して、室温でさらに１時間インキュベートした。さらに４回洗浄した後、０．１０ｍｌ／ウェルのＡＢＴＳ基質溶液（５ｍＭのクエン酸；５ｍＭのクエン酸三ナトリウム；０．００３％（ｖ／ｖ）のペルオキシドで活性化した０．４ｍＭのアジノビス〔３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸〕ジアンモニウム塩）を添加し、３０分反応を行った。反応を、０．０５ｍｌ／ウェルの３．９％シュウ酸で停止し、Wellcozymeプレート読み取り機（Wellcome Diagnos itics）で吸光度（４０５ｎｍ）を測定した。さらに処理するために、１匹のマウスを選択し（結果を参照）、同じ用量の抗原の最終追加投与（皮下）を行った。３日後、ＣＯ₂窒息によりマウスを犠牲にし、滅菌条件下で脾臓を取り出して、６０ｍｍペトリ皿（ＦＬＯＷ）／ＲＰＭＩ −１６４０培養基（ＦＬＯＷ）に置いた。２６ゲージの針で脾臓の５か所に培養基を注入することにより培養基を脾臓に強制的に入れて脾臓を培養基で満たし、細胞をリリースさせた。その細胞を滅菌遠心分離管に移し、遠心分離（２５０× ｇ、１０分）して、上清を除去した。細胞を１０ｍｌの培養基に再懸濁し、Coul ter計数器（Coulter）により計数した。ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣＳ中で増殖させた１×１０⁷個のＮＳ１細胞を同様に遠心分離にかけ、１０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁して、計数した。脾臓のリンパ球を、５０％ＰＥＧ４０００／ＲＰＭＩ−１６４０を使用して、ＮＳＩミエローマ細胞と１０：１の割合で融合させた。ハイブリッドを、ＨＡＴ（１０ｍＭのハイポキサンチン；０．０４ｍＭのアミノプテリン；１．６ｍＭのチミジン）、２×１０⁵ｆｅｅｄｅｒ細胞／ｍｌ、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシンおよび５０Ｕ／ｍｌゲンタマイシン／ＲＰＭＩ−１６４０を含む選択培地で増殖させた（Goding，1986）。１３６個のハイブリッドが得られた。５個のクローンの分泌ＰＲＯＭ−Ａｇ抗体を上述した１部位間接酵素イムノアッセイにより検出した。これらのハイブリッドのクローン化を限界希釈法により３回行った。クローン１Ａ３／４２を、１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスで腹水癌として増殖させた。マウスには、０．５ｍｌのプリスタン（ＳＩＧＭＡ）を腹腔内注射し、１週間後に、ＲＰＭＩ−１６４０中で調製した１ｍｌの２×１０⁵／ｍｌハイブリドーマ細胞を注射した。後の注射の３週間後に５匹のマウスに腫瘍の発生が認められた。１８ゲージの針をＣＯ₂ 窒息させたマウスの腹膜腔に挿入して腹水を抜き取って、各マウスの腹水を採取した。５匹のマウスから合計８ｍｌの腹水が採取された。モノクローナル抗体の精製リポクリーン（Behring）を添加して腹水をｄｉｌａｐｉｄａｔｅした。リポクリーンは、３：２（ｖ／ｖ）の割合で腹水に添加し、混合して、４℃で３０分置いた。次いで、その溶液を２５００ｒｐｍで１０分遠心分離し、抗体を含む水性分画を集めて、必要なときまで−７０℃で保管した。ｄｉｌａｐｉｄａｔｅした腹水からモノクローナル抗体を精製するために、１００ｍｌのヒドロキシアパタイト（ＢＩＯＲＡＤ）カラム（２．５ｃｍ×２０ｃｍ）を準備し、カラムの１０倍量の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と平衡させた。５ｍｌのｄｉｌａｐｉｄａｔｅした腹水をカラムにかけ、未結合物質をカラムの５倍体積の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）により洗浄した。５０〜５００ｍＭの直線勾配のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を使用して免疫グロブリン分画を溶離し、５ｍｌずつの分画を採取した。免疫グロブリンの精製は、ヘレナ電気泳動装置でアガロースゲル電気泳動を行うことによりモニターした。サンプル（５．０μｌ）をTitan ＨＲＥアガロースゲル（HELENA）の陰極端に負荷し、５０ｍＭのバルビタール緩衝液（ｐＨ８．６）を使用して、直流電圧１００Ｖで２５〜３０分、電気泳動を行った。蛋白質を１０％ＴＣＡ中で１０分固定し、ゲルを乾燥させて、２０％メタノール／１０％酢酸における０．１％クーマシーブルーＲにより染色した。ゲルの着色を２０％メタノール／１０％酢酸中で除去した。抗体は、分画２９〜３４に回収され（図４参照）、プールして、０．６３ｍｇ／ｍｌの蛋白を含む３０ｍｌの抗体溶液を得た。この溶液を１０，０００Ｍ．Ｗ．カットオフ膜を有する攪拌セルを使用して１０倍に濃縮し、０．２ｍｌアリコートにして−７０℃で保管した。抗体を、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を使用して３５μｇ／ｍｌに調整した後、ＥＬＩＳＡのプレートウェルの被覆に使用した。精製したＩｇＧの一部は、１０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）を使用して２ｍｇ／ｍｌに調整し、同じ緩衝液に対して４℃ で一夜透析した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ〔ＳＩＧＭＡ〕）と結合させた。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）によるＩｇＧとの結合使用した方法は、Nakane．P．K.，et al.，（J．Histochem．Cylochem．22:10 84（1974））が記載した方法に基づいた。５ｍｇのホースラディッシュペルオキシダーゼを１．０ｍｌの蒸留水に溶解した。過ヨウ素酸ナトリウム（０．２ｍｌ，０．１Ｍ）を添加してＨＲＰＯを活性化した。これを、室温で３０分、暗所で混合した後、５．０ｌの１．０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．４）を使用して、４℃で一夜、暗所で透析を行った。透析され、活性化された過ヨウ素酸塩−ＨＲＰＯ溶液を、２００ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液でｐＨ９．６に調整した。抗体溶液（３．５ｍｌ；炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）における２ｍｇ／ｍｌの溶液）をＨＲＰＯ（１．１５ｍｌ：１ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．４）における２．０２ｍｇ／ｍｌの溶液）と混合して、４．０ｍｇのＩｇＧ：１．０ｍｇのＨＲＰＯアルデヒドの割合にし、２０ｒｐｍ、室温で２時間、暗所で混合した。次いで、水素化ホウ素ナトリウム水溶液（０．１０ｍｌ；４．０ｍｇ／ｍｌ）をその溶液に添加した後、４℃で２時間放置した。次いで、その溶液（８．２５ｍｌ）を、カラムの１０倍量のＰＢＳ（１３６ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、３．２ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、１．５ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ７．４））で予め平衡にしたバイオゲルＡ−０．５ｍカラム（２．５ｃｍｘ２０ｃｍ）に充填した。Ｒ− Ｚ比の値を着色画分上で調べた。画分４〜８は、Ｒ−Ｚ値が０．２５〜０．６であることを示し（表３）、これをプールして、０．１％チメロサールの存在下、４℃で保管した。このプールしたものをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ洗浄緩衝液で種々の濃度（５０〜１０００倍）に希釈し、ＥＬＩＳＡ法における抱合体としての使用に最適の濃度（１５０倍）を見つけた。モノクローナル抗体（クローン１Ａ３）の反応性の解析羊水のＳＤＳ−ＰＡＧＥ研究４５μｌのサンプル緩衝液（２０％のグリセロール（ｖ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５％（ｖ／ｖ）２−β−メルカプトエタノール、０．００１２５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブル−および１２．５％（ｖ／ｖ）０．５Ｍトリス− ＨＣｌ（ｐＨ６．８））における羊水サンプル（０．０２ｍｇ蛋白／ｍｌの１５ μｌ）を１０分煮沸した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を、Laemml i，U.K.，（Nature 227:680（1970））の方法に従って、７．５および１２％ゲルに対して行った。分子量推定のための検量線を、予め染色して膜に移した基準物質（ＢＩＯＲＡＤ）から得た。電気泳動は、Mini Protean IIシステム（ＢＩＯＲＡＤ）上、１８０Ｖで６０分行った。ウェスタンブロット法を、Towbin（1984）の方法を一部修正して行った。すなわち、Hybond膜（AMERSHAM）を使用し、ブロット緩衝液として、２０％（ｖ／ｖ）メタノールを含む４８ｍＭトリス、３９ｍＭグリシン、ｐＨ９．２を使用した。電気泳動は、トランス−ブロット電気泳動セル（ＢＩＯＲＡＤ）を使用し、１５Ｖで４５分行った。ブロットを１０ｍＭのトリス、０．９％のＮａＣｌ（ｗ／ｖ）、１００ｍＭのＬ−リジン、０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）に室温で２時間浸漬した後、１０ｍＭのトリス、０．９％のＮａＣｌ（ｗ／ｖ）および０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｖ／ｖ）で３×１０分、逐次洗浄した。同じ緩衝液で希釈した（１／１００）抱合体をブロットに添加し、４℃で一夜放置した。ブロットを前記と同様に洗浄し、０．０２％のＨ₂Ｏ₂を含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で調製した基質のＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド）とともに３０分インキュベートした後、ブロットを蒸留水に入れることにより反応を停止した。等電点電気泳動等電点電気泳動を、３％ショ糖および２％Biolyte（ｖ／ｖ）３．５〜９．５（ＢＩＯＲＡＤ）で調製した１％アガロースゲル上で行った。ゲルは、１ＭのＮａＯＨ（陰極）および０．００５ＭのＨ₂ＳＯ₄（陽極）緩衝液を使用して、５Ｗ、１５００Ｖ、１５０ｍＡで１時間、予泳動を行った。セファクリルＳ−２００カラムクロマトグラフィーにより精製した羊水のサンプルおよびＩＥＦ基準物質（ＢＩＯＲＡＤ）を濾紙片上のゲルに載せ、さらに２時間、泳動を行った。蛋白質を、ゲルを表面上に置いてゲルに１５分重みをかけることにより、Hybond上に移した。抗原を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに対して記載した方法により、ブロット上で検出した。ゲルを最初に乾燥させ、３５％メタノール、１３％トリカルボン酸、３．５％スルホサリチル酸を使用して２０分固定し、３０％メタノール、１０％酢酸で洗浄して、クーマシーブルー（０．２％ｗ／ｖ）で染色することにより、蛋白質の染色を行った。ゲルの着色を３０％メタノール、１０％酢酸で除去した。ゲルパーミエーションクロマトグラフィーカラム（２．５ｃｍｘ１００ｃｍ）にセファクリルＳ−２００を充填し、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を使用して１．０ｍｌ／分で１２時間、平衡化した。カラムを平衡化した後（カラムの１０倍量）、ゲル濾過基準物質（ＢＩＯＲＡＤ）を通して基準曲線を作成した。羊水（５０ｍｌ）を５．０ｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に対して４℃で透析し（緩衝液を３回換えて行う）、１０，０００ＭＷカットオフ膜を有する攪拌セル（Amicon）上で２０倍に濃縮した。２ｍｌの濃羊水にデキストランブルー２０００〔（Pharmacia）１％ｖ／ｖ〕を加え、これをカラムに添加して、１画分５ｍｌで分取した。画分を２部位ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。天然の分子量は、ＥＬＩＳＡ陽性の画分に対して、基準曲線から求めた。ＥＬＩＳＡプロトコールＮｕｎｃプレートを、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中に調製した０．２ｍｌ／ウェルの０．２％グルタルアルデヒドを使用して、室温で４時間、活性化した。プレートを１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で３回洗浄し、０．１ｍｌ／ウェルの精製した免疫グロブリン（５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８／０）における３５μｇ／ｍｌの溶液）とともに、４℃で一夜インキュベートした。プレートを０．９％のＮａＣｌで３回洗浄し、０．１ｍｌ／ウェルの１００ｍＭリジン、０．５％ＢＳＡ、０．０２％アジドを添加して、使用するまで最高１４日間、４℃で保管した。使用する前に、免疫グロブリンが結合したプレートを、ＰＢＳ〔（高塩）ＨＳ〕／Ｔｗｅｅｎ洗浄緩衝液（０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含む３．２ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、１．５ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄、２．７ｍＭのＫＣｌ、２７２ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、次いで、同じ緩衝液（２５μｌ／ウェル）を添加してサンプルを適用した。１５個の妊娠末期の羊水をプールし、ＰＢＳ（ＨＳ）／Ｔｗｅｅｎで１／２〜１／１２８に逐次希釈して、基準曲線を作成した。プールした羊水の濃度は、１００Ｕ／ｌＣＯＶＯ抗原の値で示した。アッセイを行うために、サンプルおよび基準物質を２回使用し（０．１ｍｌ／ウェル）、室温で２時間インキュベートした。サンプルの代わりにＰＢＳ（ＨＳ）／Ｔｗｅｅｎ（０．１ｍｌ／ウェル）を含むブランクも行った。羊水コントロールは、２０個の無作為選択期間の羊水から調製し、プレートごとに測定した。ＰＢＳ（ＨＳ）／Ｔｗｅｅｎでさらに３回洗浄した後、５０μｌのＩｇＧ−ＨＲＰＯ抱合体を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ（ＨＳ）／Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、０．１ｍｌのＡＢＴＳ溶液を酵素と１時間反応させた。反応は、３．９％シュウ酸（５０μｌ／ウェル）で停止した。サンプルの吸光度（ＯＤサンプル）を４０５ｎｍの波長で測定した。ブランクの値（ＯＤブランク）を差し引いて、プールした羊水から検量線を作成した。個々の試料およびコントロールの抗原レベルを、基準曲線から計算した。ＰＲＯＭ抗原の基準範囲を決定するための患者の選択正常な基準範囲を決定するために、ＰＲＯＭ抗原レベルを、下記の患者群から得られた膜試料の後破壊（ｐｏｓｔ−ＲＯＭ）で測定した。（ａ）妊娠の各トリメスターから、種々の産科適応症に対して行われる羊水穿刺により、５０個の羊水試料を集めた。（ｂ）帝王切開（ＣＳ）時に、スポイトで２ｍｌの液を吸引することにより、４０個の羊水試料を集めた。（ｃ）膜の人工的破壊（ＡＲＭ）で羊水の漏出が認められ、２ｍｌの液のサンプルがスポイトにより吸引できた女性から７０個の試料を集めた。（ｄ）膜の自然破壊（ＳＲＭ）を経験した女性からさらに５０個の膣液試料を集めた。彼女らの膣には液がたまっているのが認められ、そこから２ｍｌのサンプルがスポイトにより吸引できた。同様にして、ＰＲＯＭ抗原のレベルを、膜の人工的破壊の前（ｐｒｅ−ＲＯＭ）で、分娩室にいる、完全な膜を有する５０人の女性から集めた膣液の試料で測定した。その試料は、その女性が羊水の漏出を経験していない場合および臨床検査で液が明らかでなかった場合は、負のコントロールとみなした。膣の試料を得るために使用した方法は、下記の「膣液採取の方法」の項で記載する。ＰＲＯＭ抗原レベルは、妊娠中、定期的に血液採取を行っていた５００人の妊婦から得た血清でも測定した。膣液採取の方法患者にその方法について知らせた後、膣鏡検査を行って、末端円蓋を可視化した。膣に液が存在する場合は、吸入カニューレに固定された２ｍｌスポイトで吸入した。液が認められなかった場合は、外部頸骨を２ｍｌの滅菌サラインで洗浄した後、液を末端円蓋から吸入した。試料を滅菌サンプル管に入れて検査室に運び、そこで分析を行うまで−７０℃で凍結した。妨害物質アッセイ法で妨害の可能性がある種々の物質を、羊水プールで１：１：に希釈してテストした。羊水プールのＰＲＯＭ抗原レベルは３６Ｕ／ｌであり、ＰＢＳ（Ｈ／Ｓ）／Ｔｗｅｅｎで１：１に希釈した場合は１８Ｕ／ｌのレベルであった。二つの「盲検」試験における試料の選択羊水のＲＯＭ（膜の破壊）前およびＲＯＭ後の液を二つの別々の患者群から集めて、産科医による分析を行った。患者の名前は、研究者には隠しておき、患者の確認は、無作為に割り当てた番号でのみ行った。最初の「盲検」群（試験Ａ）では、試料を、随意ＣＳと記されている６人の妊婦から得た。ＣＳの直前に、「膣液採取の方法」で記載したように、膣液試料を得た。ＣＳ時に、完全な膜を通して滅菌スポイトに羊水を吸入した。各試料に番号を付け、検査室に送って分析に供した。２組の三つ児があったので、ＲＯＭ後の試料は１０個であった。第二の「盲検」群（試験Ｂ）では、前述のように集めた４６個の膣試料のうち、２１個がＲＯＭ前であり、２５個がＲＯＭ後であった。ＲＯＭ前およびＲＯＭ後の試料は、同じ患者からは１４人の女性について得ており（２８個の試料）、他の７個のＲＯＭ前および１１個のＲＯＭ後の試料は、異なる女性から採取した。結果羊水蛋白の同定および精製本発明者らは、５０期間の羊水試料および５０個のマッチングしていない無作為の母親血清を個々に処理して、羊水試料に特異的に存在する蛋白を同定した。最初の５０％硫酸アンモニウム処理により、４０（±２．１）％の血清蛋白および８０（±４．７）％の羊水蛋白が沈澱した（表１）。天然の羊水ならびに硫酸アンモニウム沈澱後の羊水および母親血清の上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動による典型的な蛋白質パターンを図１に示す。沈澱前および後の羊水は、サブユニットの分子量が５５，０００（±２，０００）ダルトン（Ｄａ）である目立ったバンドを示す。これは、母親血清には見られない。このバンドは、５０個の全ての羊水試料で存在したが、母親血清では見られなかった。母親血清試料は、この蛋白（以後、ＰＲＯＭ−Ａｇと名付けた。）が明らかに存在しなかったので、これ以上の処理はしなかった。羊水の上清（５ｍｌ）を個々に１００ｍｌのＤＥＡＥＡｆｆｉ−ゲルブルーカラムのクロマトグラフィーにかけ、１０ｍｌずつ画分採取を行った。これらの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけると、画分４〜１０がＰＲＯＭ−Ａｇを含むことが分かった。これらの画分をプールすると、１．４ｍｇの蛋白を含んでいた（表１）。このプールの典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は図１の５レーンに見ることができる。抗原を含むＡｆｆｉ−ゲルブルー後のプールを２０倍に濃縮して２．５ｍｌとし、個々に、前検定した（２．５×７．５ｃｍ）セファクリルＳ−２００カラムにかけた。連続して５ｍｌずつ画分採取を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけると、５５，０００Ｄａでその蛋白が同定された。分子量が３１０，０００〜３５０，０００Ｄａに対応する画分は、天然の推定分子量が３３０，０００である蛋白を含むことが分かった。従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で得られたサブユニット分子量の５５，０００Ｄａは、ヘキサマーである天然の蛋白と一致する。その蛋白を含む画分をプールすると、０．３６ｍｇの蛋白が得られた（表１）。典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図２に示す。これによると、その蛋白は実質的に純粋であるが、サブユニット分子量が８２，０００および３０，０００Ｄａの少量の不純物ならびに５７，０００Ｄａの主要不純物を有する。次に、無関係な１０個の羊水試料から得たこれらの調製物をプールし、攪拌セルで濃縮して最終蛋白濃度を１ｍｇ／ｍｌとし、ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫感作に使用した。モノクローナル抗体の産生６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスにＰＲＯＭ−Ａｇを感作させ、６〜１５週の間に７回検査した。これらの血清の羊水に対する免疫反応性を、１部位ＥＬＩＳＡ法を使用してテストし、非免疫ＢＡＬＢ／ｃマウスの血清と比較した。これらの結果を表２に示す。この方法で測定を行うと、２匹のマウス（＃１，３）は免疫応答を示さず、３匹のマウス（＃２，４，５）は部分的に応答を示し、１匹のマウス（＃６）はブランクの吸収に対して５倍の増加を示した。この＃６のマウスを犠牲にして、脾臓細胞をＮＳ１ミエローマ細胞と融合した。この融合により、１３６個のハイブリッドを得た。これらのハイブリッドの培養上清全部について、１部位間接ＥＬＩＳＡにより、羊水および母親血清プールに対する反応性をテストした（表３）。５個のハイブリッドは羊水のみと反応し、９６個は両方の体液と反応し、１７個はどちらとも反応しなかった。羊水のみと反応したハイブリッド１Ａ３／４２、１１Ｂ６／６８、２Ｃ５／４８、２Ｃ６／８６および１２Ｄ２／７７を、限界希釈法により３回クローン化し、羊水および母親血清との反応性を再テストした（図３）。細胞系１Ａ３／４２をさらに分析するために選択し、細胞系１１Ｂ６／６８、２Ｃ５／４８、２Ｃ６／８６および１２Ｄ２／７７は、液体窒素中に保管した。モノクローナル抗体１Ａ３の解析クローン１Ａ３／４２を１２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹膜腔で増殖させた。３週間後に、これらのマウスのうち７匹で腹水の採取を行った。７匹のマウスから１０ｍｌの腹水が得られ、脱脂して、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーにかけた（図４）。個々の画分の羊水に対する反応性を、１部位ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした（図４）。この方法により、実質的にγ−グロブリン画分が分離され、これは、アガロースゲル電気泳動により分析すると、予想した通り、γ領域に主要なモノクローナルバンドを有することが示された（図５）。ヒドロキシルアパタイトカラムから得た精製免疫グロブリン３５ｍｌは０．６２ｍｇ／ｍｌの蛋白を含んでおり、これは、実質的に純粋なモノクローナル抗体であった（図５）。このモノクローナル抗体調製物は、捕獲体として、およびホースラディッシュペルオキシダーゼとの抱合により、次の２部位ＥＬＩＳＡ法での抱合体として使用した。抱合体は、ウェスタンブロット分析により対応する羊水蛋白を解析し、羊水から精製したオリジナル抗原に対してそれを同定するための特異的染色試薬としても使用した。図６ａは、ＳＤＳ−メルカプトエタノールの存在下、４〜１５％勾配のゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動後のウェスタンブロット分析の結果を示す。一つのバンドの反応性のみが認められ、それは、無作為に選択した３個の妊娠期間の羊水で同一である。このバンドは、５５，０００±２，０００Ｄａのサブユニット分子量に対応し（図６ｂ）、羊水から最初に精製した蛋白のものと同一である。蛋白の等電点も、ｐＨ範囲が３〜１０の両性電解質を使用したアガロースゲル等電点電気泳動後のウェスタンブロット分析（モノクローナル１Ａ３−ＨＲＰＯ抱合体を使用）により測定した。この分析に対しては、精製蛋白および無作為に選んだ妊娠期間の天然の羊水の両方を使用した。結果を図７ａに示す。精製蛋白に対して反応性の主要な一つのバンドのみが明白であり（図７ａ）、これは、４．９の等電点に対応する（図７ｂ）。蛋白質の天然の分子量は、前検定したセファクリルＳ−２００カラムから溶離した画分の反応性（図８ａ）を２部位ＥＬＩＳＡを使用してテストすることにより測定した（このアッセイについては下記に記載する。）。このアッセイでは、モノクローナル抗体１Ａ３を捕獲抗体および抱合体として使用する。結果を図８ｂに示す。ＤＥＡＥＡｆｆｉ−ゲルブルー後の羊水２ｍｌをカラムに載せた。分子量３３０，０００±１０，０００Ｄａに対応する画分１７〜１８は、ＥＬＩＳＡテストでの反応性が陽性であった（図８ｃ）。他の画分は、反応性を示さなかった。この天然の分子量は、先の最初の蛋白精製で分かったものに対応し、最初に精製した抗原と反応するモノクローナル抗体１Ａ３と一致する。モノクローナル抗体１Ａ３に基づく羊水蛋白（ＰＲＯＭ−Ａｇ）の２部位直接ＥＬＩＳＡ法の開発および最適化ＥＬＩＳＡ法の最適化蛋白（ＰＲＯＭ−Ａｇ）の迅速かつ感度の高い測定法を可能にすると同時に、試薬が経済的である、この蛋白の２部位ＥＬＩＳＡ法の開発が必要であると考えられた。その測定法における基準物質として使用するために、５０個の羊水をプールした。この羊水プールのＰＲＯＭ−Ａｇ濃度を１００Ｕ／ｌと定めた。試料として、無作為に選択した妊娠期間の羊水および母親血清を使用した。図９に、プレートを被覆するために使用する捕獲抗体の濃度を変えたときの影響を示す。応答は、４０ｎｍでの発色により測定する。３個の羊水および３個の母親血清の試料の平均値（ＳＥＭ）を示す。母親血清は、どんな濃度でも反応しないが、羊水の応答は、２．５μｇ／ウェルで最高に達する。抗体濃度をより高くすると、応答の減少が見られる。これは、恐らく、立体障害または交差反応性の問題により、抗原の結合能が低下するからであると考えられる。捕獲抗体の使用濃度範囲を狭くすると、１．７５μｇ／ウェルで応答が最大であることが示され、この濃度を選択して最適分析法で使用した。図１０に、非特異的蛋白の非特異的結合を抑制するために使用した種々の阻害剤の影響を示す。４種類の試薬を比較した。すなわち、１００ミリモル／ｌのリジン、０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ／１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）；１００ミリモル／ｌのリジン／１００ｍＭの硫酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）；０．５％（ｗ／ｖ）の粉ミルク（Carnation Trim Milk Powder ）／ＰＢＳ；および１％（ｖ／ｖ）の豚血清（ＧＩＢＣＯ）／ＰＢＳである。同じプールの１０個の羊水を逐次希釈（１：２、１：５、１：１０および１：２０）して比較する。ブランクのウェルはサンプル緩衝液（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）のみを含み、抗体−ＨＲＰＯ抱合体のウェルに対する非特異的結合の測定に使用した。種々の阻害剤は、ブランクの値に対してほとんど影響がなかったが、リジン溶液からのＢＳＡの除去、ならびに豚血清および粉ミルクの存在は、リジン／ＢＳＡ阻害剤と比較すると、抗原の結合を阻害した。リジン／ＢＳＡを選択して、最適方法での使用に供した。図１１は、抗体−ＨＲＰＯ抱合体の逐次希釈の影響を示す。結果は、無作為に選択した５個の羊水試料の平均値（ＳＥＭ）を示す。最初のプラトーの後、希釈度が１／１５０より大きくなると、応答は指数関数的に減少する。これは、標識抗体の量が律速になっていることを示す。１／１５０の希釈度を選択して、最適測定法での使用に供した。図１２は、種々のサンプル希釈剤の影響を示す。３つの試薬を比較する。すなわち、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳおよびＰＢＳ／豚血清（１％〔ｖ／ｖ〕）である。同じプールの羊水を逐次希釈（１：２、１：５、１：１０、１：２０および１：５０）して比較する。ブランクのウェルはサンプル希釈剤のみを含み、非特異的結合の影響の比較に使用する。種々のサンプル希釈剤は、非特異的結合に対してほとんど影響がなかったが、Ｔｗｅｅｎの除去または豚血清の添加は、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ試薬の使用による結果と比較すると、蛋白（ＰＲＯＭ− Ａｇ）の結合を阻害するように見えた。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを選択して、最適測定法での使用に供した。図１３は、非特異的結合および抗原の結合に対するサンプル希釈剤のｐＨの影響を示す。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液をｐＨ２、３、４、５、６、７および８で調製し、あるプールの５個の羊水を１：２、１：４、１：８、１：１６および１：３２に希釈するために使用した。緩衝液のみの添加は、非特異的結合の評価のために使用した。ｐＨは、非特異的結合に対してほとんど影響がないと思われる。しかし、抗原の結合は、酸性のｐＨで阻害される。これは、たぶん、抗原または抗体上の帯電した基のマスキングによる。このことは、羊水の低い希釈度ではあまり目立たない。これは、たぶん、羊水自身の緩衝効果によると考えられる。測定法での使用には、ｐＨ７．０のサンプル希釈緩衝液を選択した。無作為に選択した３個の妊娠期間の羊水のＥＬＩＳＡ測定に対するサンプルのインキュベーション時間（０．５、１、２および４時間）の影響を調べた。結果は、４時間での最大応答の割合（％）として表し、ｘ時間での（吸光度〔４０５ｎｍ〕−試薬ブランク）／４時間での（吸光度〔４０５ｎｍ〕−試薬ブランク）として計算する。図１４に示す結果は、１時間で、この指定した最大結合の７８（０．７６）％平均（ＳＥＭ）が達成されたことを示す。１日の労働時間内で測定を行うために、１時間のインキュベーション時間を選択した。無作為に選択した３個の妊娠期間の羊水に対して、抗体−ＨＲＰＯ抱合体とのインキュベーション時間を０．５から１、２および４時間に変えたときの影響を調べた。結果は、４時間での最大応答の割合（％）として表し、ｘ時間での（吸光度〔４０５ｎｍ〕−試薬ブランク）／４時間での（吸光度〔４０５ｎｍ〕−試薬ブランク）として計算する。図１５に示す結果は、抱合された抗体の結合が１時間までに最大結合の７８（０．８９）％平均（ＳＥＭ）になったことを示す。１日の労働時間内で測定を行うために、１時間のインキュベーション時間を選択した。ＡＢＴＳ発色剤による発色時間（０．５〜１２時間）を、あるプールから無作為に選択した５個の妊娠期間の羊水試薬のいくつかの希釈度に対して調べた。サンプルの代わりにＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを含むウェルを試薬ブランクとして使用した。最初の１時間の発色は、全ての希釈度で急速であり、直線的であった。その後、発色はサンプルの全ての希釈度で遅くなり、それは、ウェル中の１Ａ３−ＨＲＰＯ抱合体（ＰＢＳ（高塩）／Ｔｗｅｅｎで１：１５０に希釈）の濃度に無関係と思われた。これらの知見は、ペルオキシダーゼ反応の基質（たぶん過酸化物）が、発色反応での消費速度よりもかなり速い速度で自然に分解し、１時間後には律速になることを示唆する。この影響を避けるために、発色反応に対しては、１時間のインキュベーション時間を選択した。ＰＲＯＭ抗原に対する最適なＥＬＩＳＡ法の評価最適な方法を、その精度、感度および羊水に対する特異性を測定して評価した。図１７に、この測定法の典型的な基準曲線を示す。結果を、１０回の繰り返しの平均（±ＳＥＭ）として表す。希釈していないプールの５０個の羊水のＰＲＯＭ抗原含量を１００Ｕ／ｌのＰＲＯＭ抗原レベルと対応させた。基準曲線は、良好な相関係数（ｒ＝０．９９２）を示し、正常な羊水に存在する蛋白の平均濃度である１００Ｕ／ｌのレベルで１．２２（０．０４）平均（ＳＤ）の吸光度を有する。連続して希釈した３個の個々の羊水の結果を図１８に示す。これらの羊水は、基準曲線と平行関係にあることを示し、このことは、−７０℃で保管した基準物質の抗原が免疫活性を失っていないことと、新しい羊水試料に存在する抗原と免疫学的に同一であることを示す。１２０個の膣液試料の精度曲線を図１９に示す。その測定法は、２０〜９０Ｕ／ｌでＣＶが１０％未満であり、精度が良好であることがわかる。測定内の精度は、各５０回分析した二つのプールから推定した。これらのプールは、２０（１．２）平均（ＳＤ）および５０（１．９）平均（ＳＤ）の値を示し、ＣＶは各々４％および２％であった。測定間の精度は、二つのプールに対して、４つの異なる列で各１０回測定することにより得た。これらのプールは、１９．８（１．５）平均（ＳＤ）および４８．８（２．２）平均（ＳＤ）を示し、ＣＶは各々７．５％および４．５％であった。その測定法における妨害の可能性を、種々の物質について、羊水プールで１：１に希釈することによりテストした。羊水プールのＰＲＯＭ−Ａｇレベルは、ＰＢＳ／Ｔで１：１に希釈したとき、１８Ｕ／ｌであった。妨害に関する研究結果を表４に示す。４０個の羊水、２０個の母親血清および１６個の膣液のアリコートを、粘液溶解剤であるＮ−アセチルシステイン〔（ＮＡＣＣ）（０．８％ＮＡＣＣ／ＰＢＳ（ＬＳ）／Ｔｗｅｅｎ／１Ｍ−ＮａＯＨ，ｐＨ７．０）〕と混合し、室温で５分予インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートに塗布した。結果を図２０に示す。ＮＡＣＣは、４０個の妊娠期間の羊水のＰＲＯＭ抗原レベルに対して何ら影響を及ぼさなかった。これは、ＰＲＯＭ抗原の免疫反応性を阻害しなかったことを示す。しかし、ＮＡＣＣは、視覚検査で認められたように粘液の溶解において活性であり、１６個の膣液試料でＰＲＯＭ抗原の検出が可能であった。羊水のＰＲＯＭ抗原の基準範囲を、妊娠中の異なる妊娠週齢で得た羊水試料に対して調べた。結果を図２１に示す。最初のトリメスターのレベル（２６．５（２．４７）Ｕ／ｌ）は、第三トリメスターのレベル（３０．２（２．５６）Ｕ／ｌ）よりかなり低い。第二トリメスター中のレベル（２８．４（２．０３）Ｕ／ｌ）は第三トリメスターのレベルと同様であった。臨床結果ＲＯＭ後の全試料は、ＰＲＯＭ抗原のレベルが＞１０Ｕ／ｌと関連していた。反対に、ＲＯＭ前の全試料および母親血清のレベルは＜１０Ｕ／ｌであった。従って、＞１０Ｕ／ｌのレベルは、臨床サンプルにおいて膜の破壊を示すことがはっきりした。ＣＳ−ＲＯＭ−前および後の検査（試験Ａ）の結果を表５に示す。全試料は、ＲＯＭ−前または後のいずれかであるかが正確に同定された。膣のＲＯＭ−前および後の検査（試験Ｂ）の結果を表６に示す。最初に、４６個の試料のうち３９個（８４．８％）がＲＯＭ−前または後のいずれであるか正確に同定された。他の７個の試料は、ＲＯＭ−前または後の予想と相違する結果になった。ＲＯＭ−前の群にある７個のうちの２個（表６、Ｎｏ．６および２５）はＰＲＯＭ抗原レベルが＞１０Ｕ／ｌであったし（偽陽性）、ＲＯＭ−後の群にある５個（Ｎｏ．２、４、１１、１８および３０）は、ＰＲＯＭ抗原レベルが＜１０Ｕ／ｌであった（偽陰性）。結果が偽陽性であった二人の母親のカルテを見てみると、彼女らの膜は破壊されていたと考えられる。一方の女性（Ｎｏ．６）は、分娩が確定して分娩室におり、子宮頸はすでに３ｃｍ開いて完全になくなっていたが、前羊水はまだ完全なままで、ＤＡＯテストは陰性であった。他方の女性（Ｎｏ．１５）も３６週の早産で分娩室におり、超音波検査では、羊水のかなりの減少があることが示された。胎児が仮死状態になったとき、そのすぐ後に帝王切開が行われ、手術の際、外科医は、子宮に「少量の液」があったことをコメントした。ＤＡＯテストも陽性と記入され、膜が破壊されていたことがさらに明白になった。結果が偽陰性であった５人の女性のカルテを見てみると、ＡＲＭ時に膜が確かに破壊されていたことはほとんど疑いがないと考えられる。しかし、これらの試料の全部および他の２、３の試料は、可変量の粘液を含むことが示された。粘液があると、試料をピペットで吸入するのが困難である場合があり、粘液は、試料内の抗原がＥＬＩＳＡウェルの基底にある捕獲抗体へ移動するのを阻害する可能性があると仮定した。この仮定をテストするために、粘液溶解剤としてＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣＣ）の使用を調べた。ＮＡＣＣ（０．８％のＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液）に対する結果を図２０に示す。ＮＡＣＣは、５０個の羊水試料および５０個の正常な膣液試料中のＰＲＯＭ抗原レベルに対して影響を及ぼさなかった。このことは、ＮＡＣＣがＰＲＯＭ抗原の免疫反応性を阻害しなかったことを示す。しかし、視覚検査で認められたように、粘液の溶解においては活性であり、ＮＡＣＣ処理をしないと結果が陰性であった２０個の膣液試料のＰＲＯＭ抗原の検定が可能になった。これらの試料は、ＡＲＭ後に採取されており、臨床上陽性であると考えられた。５個の偽陰性サンプルに粘液溶解剤のＮＡＣを添加して再テストすると、３個の試料（表６、Ｎｏ．２、１７および３０）は、陽性の結果が記入された。残り２個の試料については、偽陰性の結果を説明する臨床上の理由が容易に挙げられない。しかし、アルブミンなどのいくつかのＰＲＯＭ抗原に対する阻害物質があったと推測するのが妥当である（表４）。別の可能性は、膣から得た試料の大部分が粘液であり、液はほとんどまたは全くなく、従って陰性の結果になったという説明である。興味深いことは、これらの試料の一つ（Ｎｏ．４）は、ＤＡＯのテストを行っても陰性であったことである。すなわち、４６人の患者のうち、たった２人（４．３％）が、予想される結果と相違するテスト結果になった（測定の特異性：１００％；感度：９４％）。本明細書で述べたモノクローナル抗体１Ａ３は、the European Collection of Animal Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）に寄託され、受理番号９４０３１９０１が付与されている。凡例表２ａ吸光度（４０５ｎｍ）は、１部位間接ＥＬＩＳＡ法で測定した。ｂくり返しの平均（ＳＥＭ）表３ａＲ−Ｚ比ｂ抱合体の画分４〜８をプールすると、そのプールのＲ−Ｚ値は０．３８であった。抱合体は、４℃、０．１％チメロサール中で保管した。図面の簡単な説明図１は、ＰＲＯＭ抗原（矢印）の４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル上での精製に際してＳＤＳ／メルカプトエタノールで変性した後の羊水蛋白を示す。レーン１、２および８：分子量基準物質〔（ＢＩＯＲＡＤ）矢じり〕：１０６，０００、８０，０００、４９，５００、３２，５００、２７，５００、１８，５００Ｄａ（上から下へ）レーン３：羊水レーン４：羊水の硫酸アンモニウムペレットレーン５：ＤＥＡＥＡｆｆｉ−ゲルブルーカラムからの濃縮溶離物レーン６、７：２個の母親血清の硫酸アンモニウムペレットレーン９：分子量基準物質（Ｐｈａｒｍａｃｉａ：９４，０００（不明）、６７，０００、４３，０００、３０，０００、２０，０００、１４，４００Ｄａ（上から下へ）図２は、ＰＲＯＭ抗原（矢印）の４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル上での精製に際してＳＤＳ／メルカプトエタノールで変性した後の羊水蛋白を示す。レーン１、６および８：分子量基準物質〔（ＢＩＯＲＡＤ）矢じり〕：１０６，０００、８０，０００、４９，５００、３２，５００、２７，５００、１８，５００Ｄａ（上から下へ）レーン２：免疫感作に使用したセファクリルＳ−２００カラムからの溶離物レーン３、７：セファクリルＳ−２００カラムからの溶離物レーン４、５：硫酸アンモニウ沈澱後の母親血清の上清図３は、１部位間接ＥＬＩＳＡによるハイブリドーマ上清の母親血清および羊水との反応性を示す。図４は、腹水由来のモノクローナル免疫グロブリンの、ヒドロキシアパタイトカラム上での５０〜５００ｍＭ直線勾配のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）による単離を示す。 □ ２８０ｎｎでの溶離物の吸光度 ■ 捕獲抗原としてヒト羊水を使用した１部位間接ＥＬＩＳＡにおける４０５ｎｍでの溶離物の吸光度図５は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後のモノクローナル抗体のアガロースゲル電気泳動を示す。レーン２および７：２個のランダムな妊娠期間の羊水レーン３〜６：ヒドロキシアパタイトカラムから得た精製ＩｇＧ画分で、図４に示す画分３０〜３３に対応する。図６Ａは、モノクローナル１Ａ３−ＨＲＰＯ抱合体を使用したウェスタンブロット分析によるＰＲＯＭ抗原のサブユニット分子量の推定を示す。ＳＤＳ／メルカプトエタノールとのインキュベーション後の電気泳動は、４〜１５％ＳＤＳ− ＰＡＧＥ勾配ゲル上で行った。レーン１、５、６および８：前染色した低レンジの分子量基準物質（ＢＩＯＲＡＤ）：１０６，０００、８０，０００、４９，５００、３２，５００、２７，５００、１８，５００Ｄａ（上から下へ）レーン２、３、４および７：セファクリルＳ−２００カラムクロマトグラフィーにより精製した４個のランダムな羊水図６Ｂは、図６Ａから得た基準曲線を示す。 □ 分子量基準物質 ■ ＰＲＯＭ抗原の位置（５５，０００＋２，０００ダルトン）図７Ａは、１Ａ３−ＨＲＰＯ抱合体を使用したウェスタンブロット分析によるＰＲＯＭ抗原の等電点の推定を示す。等電点電気泳動は、アガロースゲル（ｐＨ範囲：３〜１０）上で行った。レーン１：蛋白質に対して染色したＩＥＦ基準物質（ＢＢＩＯＲＡＤ）：ｐＩは４．６５、５．１０、６．０、７．０、７．１、７．５、７．８、８．０、８．２および９．６（上から下へ）レーン２：１Ａ３−ＨＲＰＯ抱合体で染色した精製ＰＲＯＭ抗原レーン３：蛋白質に対してブロットおよび染色したランダムな妊娠期間の羊水図７Ｂは、図７Ａから得た基準曲線を示す。 □ 等電点電気泳動ｐＩマーカー（ＢＩＯＲＡＤ） ■ ＰＲＯＭ抗原の位置（ｐＩ＝４．９）図８Ａは、羊水のＤＥＡＥＡｆｆｉゲルブルー後の画分のセファクリルＳ− ２００カラムからの溶離を示す。 □ 基準物質の溶離（Ｉ）サイログロブリン６７０，０００Ｄａ（II）牛ガンマグロブリン１５８，０００Ｄａ（III）鶏卵のオボアルブミン（４４，０００Ｄａ）（IV）ウマのミオグロブリン（１７，５００Ｄａ）（Ｖ）ビタミンＢ１２（１３５０Ｄａ） ● 蛋白の溶離（２８０ｎｍでの吸光度）図８Ｂは、セファクリルＳ−２００カラム上でのゲルパーミエーションクロマトグラフィーによるＰＲＯＭ抗原の天然分子量の推定を示す。 □ 基準物質の溶離（２８０ｎｍでの吸光度） ■ １部位間接ＥＬＩＳＡスクリーニングにより測定したＰＲＯＭ抗原の溶離図８Ｃは、セファクリルＳ−２００カラムを通過した分子量基準物質からのＰＲＯＭ抗原の天然分子量の推定を示す。 □ ゲルパーミエーション基準物質の溶離：（Ｉ）６７０，０００、（II）１５８，０００、（III）４４，０００、（ＩＶ）１７，５００および（Ｖ）１，３５０ダルトン（２８０ｎｍでの吸光度） ● 基準曲線（ゲルパーミエーション基準物質のＬｏｇＭＷ〔ＢＩＯＲＡＤ〕） ■ ＰＲＯＭ抗原の位置（天然ＭＷ＝３３０，０００ダルトン）図９は、３個の羊水および３個の母親血清の検出におけるウェルの被覆に使用する捕獲抗体の濃度を変えたときの影響を示す。 □ ３個の羊水の平均（ＳＤ） ■ ３個の母親血清の平均（ＳＤ）図１０は、逐次希釈した羊水プール中のＰＲＯＭ抗原の反応性に対する４種類の阻害剤の影響を示す。 □ １００ｍＭリジン、０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）／１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０） ■ ＰＢＳ、５％（ｗ／ｖ）粉ミルク ○ １００ｍＭリジン／１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０） ▲ ＰＢＳ、１％（ｖ／ｖ）豚血清図１１は、５個のランダムな羊水の反応性に対する１Ａ３−ＨＲＰＯ抱合体の希釈の影響を示す。 □ ５個のランダムな羊水の平均（ＳＤ）図１２は、羊水プールの反応性に対する３種類のサンプル希釈剤の影響を示す。 □ ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ■ ＰＢＳ ○ ＰＢＳ／豚血清図１３は、逐次希釈の羊水の反応性に対するサンプルの希釈剤のｐＨの影響を示す。図１４は、サンプルのインキュベーション時間を変えたときの３個の羊水の反応性に対する影響を示す。 □ 平均図１５は、１Ａ３−ＨＲＰＯ抱合体とのインキュベーション時間を変えたときの羊水プールの反応性に対する影響を示す。 □ ３個のランダムな羊水の平均（ＳＤ）図１６は、ＨＲＰＯ基質とのインキュベーション時間を変えたときの種々の希釈の羊水プールの反応性に対する影響を示す。図１７は、最適化ＥＬＩＳＡ法で得られた典型的基準曲線を示す。基準物質の５回の測定における平均（ＳＤ）図１８は、希釈した３個の個々の妊娠期間の羊水を基準曲線と比較して示す。 □ 基準の羊水プール＋×○ 個々の羊水図１９は、１２０個の膣液試料の精度を示す。ＣＶは、差ｘ１００／平均としてくり返しにより計算する。図２０は、４０個の羊水におけるＰＲＯＭ抗原レベルに対するＮ−アセチルシステインとの予インキュベーションの影響を示す。Ａ．Ｆ．羊水Ｎ−ＡＣＣＮ−アセチルシステインＶ．Ｆ．膣液図２１は、第一、第二および第三トリメスターの羊水におけるＰＲＯＭ抗原レベルの基準範囲を示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１２月１６日【補正内容】蛋白質の複雑な混合物。しかし、そのような方法を、羊水に存在する蛋白質の複雑な混合物にそのまま無作為に適用すると、使用する方法およびその方法の各工程後に選択した画分に応じて、異なる蛋白または蛋白群を精製する結果となる。羊水からＰＲＯＭ−Ａｇを精製するための特定の方法は、下記工程を含む。（ｉ）羊水を硫酸アンモニウムと反応させる工程；（ii）反応（ｉ）の反応物を遠心分離して、ペレットまたは沈澱物を得る工程；（iii）ペレットまたは沈澱物を緩衝液に再懸濁し、得られた溶液をＤＥＡＥＡｆｆｉ−ゲルブルーのカラムに通す工程；（iv）カラムに通した後、未結合の画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によりテストして、サブユニットの分子量が約５５，０００ダルトンである蛋白の有無を調べる工程；（ｖ）該５５，０００ダルトンの分子量を有する画分を濃縮し、該濃縮画分をセファクリルＳ−２００カラムに通して、分子量が３３０，０００である画分を採取する工程。方法羊水蛋白の精製Ｌ／Ｓ（レシチン−スフィンゴミエリン）比評価の要件を十分満たす妊娠期間の羊水試料およびマッチングしていない無作為の母親血清は、the Mater Miseri ocordiae Hospital（ブリスベーン、オーストラリア）から得た。５０個のランダムな妊娠期間の羊水および５０個のマッチングしていない母親血清のサンプル２ｍｌを各々、硫酸アンモニウムで５０％飽和にし、室温で１時間十分混合し（８）抗体が請求項５に記載のモノクローナル抗体１Ａ３であることを特徴とする請求項７に記載の検出方法。（９）抗体を不活性表面に固定化することを特徴とする請求項７に記載の検出方法。（１０）信号の増幅のために、酵素基質と反応性のある酵素を抗体に結合させて含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。（１１）酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。（１２）酵素基質がアジノビス（３−エチルベンズチアゾリン硫酸）ジアンモニウム塩であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/577 ＢＧ０１Ｎ 33/53 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 9162−4Ｂ 15/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者カウレイ，デビツド・マイケルオーストラリア国、クイーンズランド・ 4113、ブリスベン、メープルリーフ・ストリート・16

Claims

【特許請求の範囲】（１）下記物理的性質：（ｉ）種々のアクリルアミド濃度のゲルを使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥによるサブユニットの分子量が約５５，０００ダルトンである；（ii）ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定した天然の分子量分析で示される見掛け上の分子量が約３３０，０００ダルトンである；（iii）等電点電気泳動により一つのバンドを有することが示され、等電点は約４．９である；および（iv）サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるテストで母親血清タンパクに対しては反応性がないが、羊水に対しては反応性があるモノクローナル抗体と免疫反応するを有することを特徴とする羊水に存在する抗原。（２）下記工程：（ｉ）羊水を硫酸アンモニウムと反応させる工程；（ii）反応（ｉ）の反応物を遠心分離して、ペレットまたは沈澱物を得る工程；（iii）ペレットまたは沈澱物を緩衝液に再懸濁し、得られた溶液をＤＥＡＥＡｆｆｉ−ゲルブルーのカラムに通す工程；（iv）カラムに通した後、未結合の画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によりテストして、サブユニットの分子量が約５５，０００ダルトンである蛋白の有無を調べる工程；（ｖ）該５５，０００ダルトンの分子量を有する画分を濃縮し、該濃縮画分をセファクリルＳ−２００カラムに通して、分子量が３３０，０００である画分を採取する工程を含む、羊水から抗原を精製する方法。（３）緩衝液が０．０２ＭのＫ₂ＨＰＯ₄であることを特徴とする請求項２に記載の方法。（４）請求項１に記載の抗原と免疫反応する結合剤。（５）結合剤がモノクローナルまたはポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項４に記載の結合剤。（６）the European Animal Cell Culture Collectionに寄託され、受理番号が９４０３１９０１であるモノクローナル抗体１Ａ３。（７）下記工程：（ｉ）妊娠している雌から膣液サンプルを得る工程；（ii）該サンプルを下記の物理的性質：（ａ）種々のアクリルアミド濃度のゲルを使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥによるサブユニットの分子量が約５５，０００ダルトンである；（ｂ）ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定した天然の分子量分析で示される見掛け上の分子量が約３３０，０００ダルトンである；（ｃ）等電点電気泳動により一つのバンドを有することが示され、等電点は約４．９である；および（ｄ）サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるテストで母親血清タンパクに対しては反応性がないが、羊水に対しては反応性があるモノクローナル抗体と免疫反応するを有する抗原に由来する抗体と反応させる工程；および（iii）工程（ii）の反応性を検出する工程を含むヒトを含む妊娠哺乳類の羊膜の破壊の検出法。（８）抗体が請求項５に記載のモノクローナル抗体１Ａ３であることを特徴とする請求項６に記載の検出方法。（９）抗体を不活性表面に固定化することを特徴とする請求項６に記載の検出方法。（１０）信号の増幅のために、酵素基質と反応性のある酵素を抗体に結合させて含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。（１１）酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項８に記載の方法。（１２）酵素基質がアジノビス（３−エチルベンズチアゾリン硫酸）ジアンモニウム塩であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。