JP2608707B2 - 腫瘍結合マーカーｐ５３を検出するための免疫組織化学検定法 - Google Patents
腫瘍結合マーカーｐ５３を検出するための免疫組織化学検定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は腫瘍結合マーカーを検査するための方法に関
し、更に詳しくはこの目的のための免疫組織化学方法に
関する。
し、更に詳しくはこの目的のための免疫組織化学方法に
関する。
＜従来の技術＞ p53と命名される腫瘍結合マーカーもしくは抗原はレ
ーン（Lane）らによって動物の腫瘍中で始めて見出され
た〔Nature 278:261（1979）；デ・レオ（De Leo）らの
Proc.Natl.Acad.Sci.,76:2420−2424（1979）〕。p53分
子は53,000ダルトンの分子量をもつリン蛋白であり、腫
瘍細胞の核中に通常見出される。ロッター（Rotter）ら
はp53に対して陽である腫瘍が進化する傾向があるのに
対して、p53に対して陰である腫瘍は退化する傾向があ
ることを発見した〔Int.J.Cancer 31:315−320（198
3）〕。また、細胞核中のp53の存在は正常細胞から腫瘍
状態への変換の指標になりうる。
ーン（Lane）らによって動物の腫瘍中で始めて見出され
た〔Nature 278:261（1979）；デ・レオ（De Leo）らの
Proc.Natl.Acad.Sci.,76:2420−2424（1979）〕。p53分
子は53,000ダルトンの分子量をもつリン蛋白であり、腫
瘍細胞の核中に通常見出される。ロッター（Rotter）ら
はp53に対して陽である腫瘍が進化する傾向があるのに
対して、p53に対して陰である腫瘍は退化する傾向があ
ることを発見した〔Int.J.Cancer 31:315−320（198
3）〕。また、細胞核中のp53の存在は正常細胞から腫瘍
状態への変換の指標になりうる。
クラウフォード（Crawford）ら〔Int.J.Cancer 30:40
3−408（1982）〕およびベンチモル（Benchimol）ら〔E
MBO J.1:1055−1062（1982）〕は固相放射能免疫検定法
および免疫沈澱検定法を使用して、乳ガン患者の血清中
にp53に対する抗体が存在することを見出した。更に、
クラウフォードらは乳ガン血清中のp53の存在は転移疾
患の徴候でありうることを示唆している。
3−408（1982）〕およびベンチモル（Benchimol）ら〔E
MBO J.1:1055−1062（1982）〕は固相放射能免疫検定法
および免疫沈澱検定法を使用して、乳ガン患者の血清中
にp53に対する抗体が存在することを見出した。更に、
クラウフォードらは乳ガン血清中のp53の存在は転移疾
患の徴候でありうることを示唆している。
種々の腫瘍細胞培養物中でのp53の検出がこの抗原に
特異な種々の抗体を使用して行われた。たとえばレーン
（Lane）らのNature 278:261−263（1979）；デ・レオ
（De Leo）らのProc.Natl.Acad.Sci.,76:2420−2424（1
979）を参照。モノクローナル抗体もヒトおよびマウス
の細胞培養物からのp53に対して製造された。たとえば
トーマス（Thomas）らのVirology 131:502−517（198
3）；ガーネイ（Gurney）らのJ.Virology 34:752−763
（1980）を参照。
特異な種々の抗体を使用して行われた。たとえばレーン
（Lane）らのNature 278:261−263（1979）；デ・レオ
（De Leo）らのProc.Natl.Acad.Sci.,76:2420−2424（1
979）を参照。モノクローナル抗体もヒトおよびマウス
の細胞培養物からのp53に対して製造された。たとえば
トーマス（Thomas）らのVirology 131:502−517（198
3）；ガーネイ（Gurney）らのJ.Virology 34:752−763
（1980）を参照。
これらの従来技術の方法は動物の細胞系中のp53の検
出のための免疫蛍光法およびヒトの細胞系中のp53の検
出のための免疫沈澱法を利用するものであった。然しな
がら、本発明者の知る限りにおいて、p53はヒトの腫瘍
試料またはヒトの腫瘍細胞系中で免疫組織化学方法によ
って局在化されたことはなかった。
出のための免疫蛍光法およびヒトの細胞系中のp53の検
出のための免疫沈澱法を利用するものであった。然しな
がら、本発明者の知る限りにおいて、p53はヒトの腫瘍
試料またはヒトの腫瘍細胞系中で免疫組織化学方法によ
って局在化されたことはなかった。
＜発明が解決しようとする問題点とそれを解決するため
の手段＞ 本発明者はヒト細胞中のp53のみならず組織試料中のp
53の検出も可能にする免疫組織化学的53の検定法を開発
した。この改良されたp53検定法は従来技術の免疫蛍光
検定法よりも感度がよく且つ安定であり、そして免疫沈
澱法よりも実施が簡単である免疫酵素着色法を利用する
ものである。
の手段＞ 本発明者はヒト細胞中のp53のみならず組織試料中のp
53の検出も可能にする免疫組織化学的53の検定法を開発
した。この改良されたp53検定法は従来技術の免疫蛍光
検定法よりも感度がよく且つ安定であり、そして免疫沈
澱法よりも実施が簡単である免疫酵素着色法を利用する
ものである。
本発明によれば、ヒトの組織、部分または細胞をガラ
ス・スライド上に固定して、試料中のp53抗原と反応す
る抗−p53抗体と共に培養する。p53抗原−抗体複合体を
次いで酵素で直接に又は間接に標識化した抗−Igの添加
によって局在化させる。次に、この酵素用の発色性基質
溶液を上記のスライドに加えて発色させる。このスライ
ドを次いで顕微鏡下で検査してp53抗原の存在を示す特
異的着色細胞を調べる。
ス・スライド上に固定して、試料中のp53抗原と反応す
る抗−p53抗体と共に培養する。p53抗原−抗体複合体を
次いで酵素で直接に又は間接に標識化した抗−Igの添加
によって局在化させる。次に、この酵素用の発色性基質
溶液を上記のスライドに加えて発色させる。このスライ
ドを次いで顕微鏡下で検査してp53抗原の存在を示す特
異的着色細胞を調べる。
本発明による腫瘍細胞または組織中のp53を検出する
方法は、検査すべき組織または細胞の調製物をガラス・
スライド上に固定し、固定した組織または細胞をp53に
対する抗体と接触させ、この組織または細胞を酵素で直
接に又は間接に標識化した抗−Igと接触させ、この組織
または細胞を酵素の存在下で色を変化させる発色性色素
原の指示薬と接触させ、そしてこのスライドを検査して
p53の存在を調べることから成る。
方法は、検査すべき組織または細胞の調製物をガラス・
スライド上に固定し、固定した組織または細胞をp53に
対する抗体と接触させ、この組織または細胞を酵素で直
接に又は間接に標識化した抗−Igと接触させ、この組織
または細胞を酵素の存在下で色を変化させる発色性色素
原の指示薬と接触させ、そしてこのスライドを検査して
p53の存在を調べることから成る。
本明細書において「酵素で直接に標識化した抗−Ig」
とはIgに対する抗体がネイケン（Nakane）らの方法〔J.
Histochem.Cytochem.22:1084−1091（1974）〕のような
方法によって酵素に結合していることを意味する。抗−
Ig−酵素結合体は１つの試剤を構成する。「酵素で間接
に標識化した抗−Ig」とは抗−Igを１つの試剤としてこ
の検定法に加え、次いでこの発明の検定法において抗−
Igに結合する別のIg−酵素試剤を加えることを意味す
る。酵素で間接に標識化した抗−Igは下記の実施例１に
示す。
とはIgに対する抗体がネイケン（Nakane）らの方法〔J.
Histochem.Cytochem.22:1084−1091（1974）〕のような
方法によって酵素に結合していることを意味する。抗−
Ig−酵素結合体は１つの試剤を構成する。「酵素で間接
に標識化した抗−Ig」とは抗−Igを１つの試剤としてこ
の検定法に加え、次いでこの発明の検定法において抗−
Igに結合する別のIg−酵素試剤を加えることを意味す
る。酵素で間接に標識化した抗−Igは下記の実施例１に
示す。
＜実施例＞ 以下の実施例は本発明によるp53分析法を具体的に説
明するためのものである。
明するためのものである。
実施例１ この実施例は本発明の分析法を行うための好ましい操
作法を示す。
作法を示す。
1.顕微鏡スライド正荷電ポリマー溶液たとえば蒸留水1m
l当り100μｇのポリ−１−リジン（分子量30,000〜70,0
00）の溶液で５分間処理してから洗浄および乾燥する。
他の正荷電ポリマー溶液たとえばポリ−１−アルギニン
をスライドを前処理するために使用することもできる。
l当り100μｇのポリ−１−リジン（分子量30,000〜70,0
00）の溶液で５分間処理してから洗浄および乾燥する。
他の正荷電ポリマー溶液たとえばポリ−１−アルギニン
をスライドを前処理するために使用することもできる。
2.低温装置を使用して試験すべき組織の凍結部分（６〜
８ミクロン）を切断してポリ−１−リジン被覆のスライ
ドに移す。この凍結部分の代わりに任意のヒト細胞また
は組織調整試料を使用することもできる。
８ミクロン）を切断してポリ−１−リジン被覆のスライ
ドに移す。この凍結部分の代わりに任意のヒト細胞また
は組織調整試料を使用することもできる。
3.直ちに、ザンボニ（Zamboni）の固定剤のような固定
剤中のスライド上に凍結組織部分を４℃で10〜15分間固
定し、pH7.4の0.01Mリン酸塩緩衝食塩水（PBS）中で５
分間洗い、−20℃の冷アセトン中に１分間入れ、最後に
リン酸塩緩衝食塩水中で５分間づつ２回洗う。
剤中のスライド上に凍結組織部分を４℃で10〜15分間固
定し、pH7.4の0.01Mリン酸塩緩衝食塩水（PBS）中で５
分間洗い、−20℃の冷アセトン中に１分間入れ、最後に
リン酸塩緩衝食塩水中で５分間づつ２回洗う。
下記の工程４〜11は18〜25℃の室温で行うのが好まし
い。
い。
4.リン酸塩緩衝食塩水溶液中の２％以上の正常の血清を
組織部分に加えて15分間培養する。過剰の試剤をスライ
ドから除く。
組織部分に加えて15分間培養する。過剰の試剤をスライ
ドから除く。
5.抗−p53モノクローナル抗体（２％正常血清／リン酸
塩緩衝食塩水中1:10に希釈したものが好ましい）を組織
部分に加えて30分間培養する。好ましい具体例におい
て、抗−p53モノクローナル抗体はマウス由来したもの
である。リン酸塩緩衝食塩水溶液中でそれぞれ５分間づ
つ２回洗う。
塩緩衝食塩水中1:10に希釈したものが好ましい）を組織
部分に加えて30分間培養する。好ましい具体例におい
て、抗−p53モノクローナル抗体はマウス由来したもの
である。リン酸塩緩衝食塩水溶液中でそれぞれ５分間づ
つ２回洗う。
6.抗−Ig抗体（リン酸塩緩衝食塩水溶液中1:20に稀釈し
たものが好ましい）を組織部分に加えて30分間培養す
る。好ましい検定において、抗−Ig抗体は抗−p53抗体
の起源の種たとえば抗−マウスIgG抗体に対して種特異
性である。
たものが好ましい）を組織部分に加えて30分間培養す
る。好ましい検定において、抗−Ig抗体は抗−p53抗体
の起源の種たとえば抗−マウスIgG抗体に対して種特異
性である。
7.パーオキシダーゼ／抗−パーオキシダーゼ（PAP）複
合体（好ましくは２％正常血清／リン酸塩緩衝食塩水中
1:50に稀釈したもの）を組織部分に加えて30分間培養す
る。ここでも好ましい検定において、このPAP複合体は
マウスPAP複合体のような抗−p53抗体と同じ種の起源の
ものである。リン酸塩緩衝食塩水中で５分間づつ２回洗
う。
合体（好ましくは２％正常血清／リン酸塩緩衝食塩水中
1:50に稀釈したもの）を組織部分に加えて30分間培養す
る。ここでも好ましい検定において、このPAP複合体は
マウスPAP複合体のような抗−p53抗体と同じ種の起源の
ものである。リン酸塩緩衝食塩水中で５分間づつ２回洗
う。
8.発色性基質溶液を調製する。発色性基質溶液の例は当
業技術において周知であり、ジアミノベンチジン、アミ
ノエチルカーバゾールおよび４−クロロ−α−ナフトー
ルがあげられる。好ましい分析において、ジアミノベン
チジン（10mg）＋30％過酸化水素（20μｌ）＋リン酸塩
緩衝水溶液（16ml）を発色性溶液として使用する。組織
部分に加えて室温で６分間培養する。流出しつつ飲料水
中で５分間洗う。
業技術において周知であり、ジアミノベンチジン、アミ
ノエチルカーバゾールおよび４−クロロ−α−ナフトー
ルがあげられる。好ましい分析において、ジアミノベン
チジン（10mg）＋30％過酸化水素（20μｌ）＋リン酸塩
緩衝水溶液（16ml）を発色性溶液として使用する。組織
部分に加えて室温で６分間培養する。流出しつつ飲料水
中で５分間洗う。
9.組織部分を希釈ヘマトキシリン、マラカイトグリー
ン、またはメチレンブルー中で対比着色する。好ましく
は、ハリス（Harris）のヘマトキシリン（1:10希釈水）
を10分間この組織部分に適用する。流出しつつある飲料
水中で５分間洗う。
ン、またはメチレンブルー中で対比着色する。好ましく
は、ハリス（Harris）のヘマトキシリン（1:10希釈水）
を10分間この組織部分に適用する。流出しつつある飲料
水中で５分間洗う。
10.たとえば、95％エタノール中に２分間づつ２回、無
水エタノール中に２分間づつ２回、そしてキシレン中に
２分間づつ２回浸漬することによって組織部分を脱水す
る。
水エタノール中に２分間づつ２回、そしてキシレン中に
２分間づつ２回浸漬することによって組織部分を脱水す
る。
11.たとえば25×10の倍率でスライドを顕微鏡検査して
特異的に着色された細胞を検出する。
特異的に着色された細胞を検出する。
実施例２ この実施例はガーネイ（Gurney）らによってJ.Virolo
gy 34:752−763（1980）に記載されているような、p53
に対するモノクローナル抗体の製造を実証するものであ
る。
gy 34:752−763（1980）に記載されているような、p53
に対するモノクローナル抗体の製造を実証するものであ
る。
1.Balb/cマウスにSV40形質転換細胞を注入する。
2.免疫動物からの脾臓細胞を、ポリエチレングリコール
1000を使用して、ガルフレ（Gakfre）らのNature266:55
0−552（1977）に記載の方法によりネズミ科の骨髄NSI
と融合させる。
1000を使用して、ガルフレ（Gakfre）らのNature266:55
0−552（1977）に記載の方法によりネズミ科の骨髄NSI
と融合させる。
3.この融合細胞を多重ウエルプレート中で20％子牛胎児
血清、50μＭハイポキサンチン、５μＭアミノプテリン
および10μＭチミジンを含むダルベコ（Dulbecco）の最
小必須培質中で生育させる。
血清、50μＭハイポキサンチン、５μＭアミノプテリン
および10μＭチミジンを含むダルベコ（Dulbecco）の最
小必須培質中で生育させる。
4.生育を示しつつあるウエルからの培養物上澄液を、エ
ングバル（Engvall）およびパールマン（Perlmann）ら
のJ.Immunology 109:129−135（1972）に記載の酵素結
合免疫吸着検定法によって、p53抗原に対する抗体を調
べる。
ングバル（Engvall）およびパールマン（Perlmann）ら
のJ.Immunology 109:129−135（1972）に記載の酵素結
合免疫吸着検定法によって、p53抗原に対する抗体を調
べる。
5.陽性細胞を軟質寒天中でクローン化して、大きな培養
皿中で発展させる。培養上澄液を熱め、−20℃で貯蔵す
る。
皿中で発展させる。培養上澄液を熱め、−20℃で貯蔵す
る。
実施例３ ここに述べるマウスのパーオキシダーゼ／抗−パーオ
キシダーゼ（PAP）複合体の調整物はスターンバーガー
（Sternberger）らのJ.Histochm.Cytochem.18:315−333
（1970）に記載の方法に基づくものである。
キシダーゼ（PAP）複合体の調整物はスターンバーガー
（Sternberger）らのJ.Histochm.Cytochem.18:315−333
（1970）に記載の方法に基づくものである。
1.マウスにホースラディッシュ・パーオキシダーゼ（HR
PO）を注入して抗血清を作る。
PO）を注入して抗血清を作る。
2.マウス抗−HRPO血清を室温でHRPOと培養する。
3.えられた沈澱物を12,000gで４℃において20分間遠心
分離して冷リン酸塩緩衝食塩水（PBS）で３回洗う。
分離して冷リン酸塩緩衝食塩水（PBS）で３回洗う。
4.沈澱物をHRPO溶液中に再び懸濁させ、次いで1Nの塩酸
を使用してpH2.3に調製することによって溶解させる。
を使用してpH2.3に調製することによって溶解させる。
5.溶液を直ちに1Nの水酸化ナトリウムを使用してpH7.4
に中和する。
に中和する。
6.次に0.08Nの酢酸ナトリウム（2.7ml）と0.15Nの酢酸
アンモニウムを加える。
アンモニウムを加える。
7.沈澱物を冷50％飽和硫酸アンモニウム中で１回洗う。
8.沈澱物を蒸留水にとかし、酢酸ナトリウム／酢酸アン
モニウム食塩水に対して透析する。
モニウム食塩水に対して透析する。
9.透析溶液を20,000gで４℃において16分間延伸分離し
て残存沈澱物を除く。
て残存沈澱物を除く。
10.えられたマウスPAP複合体を分別（小口分け）して−
20℃で貯蔵する。
20℃で貯蔵する。
実施例４ この実施例はネイケン（Nakane）らのJ.Histochem.Cy
tochem.22:1084−1091（1974）に記載の方法のようにし
て抗−Igに酵素を結合させる操作を示すものである。
tochem.22:1084−1091（1974）に記載の方法のようにし
て抗−Igに酵素を結合させる操作を示すものである。
1.ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ（HRPO）酵素
をpH8.0の0.1M重炭酸ナトリウム中の過ヨウ素酸ナトリ
ウムで30〜35分間処理することによって活性化する。
をpH8.0の0.1M重炭酸ナトリウム中の過ヨウ素酸ナトリ
ウムで30〜35分間処理することによって活性化する。
2.0.01Mの炭酸ナトリウム（pH9.5）中で平衡させたファ
デックスＧ−25（米国ニュージャージー州ピスカタウエ
イのファーマシア・インコーポレーテッド製）上のよう
なカラム・クロマトグラフによって、過剰の過ヨウ素酸
ナトリウムをHRPOから除く。
デックスＧ−25（米国ニュージャージー州ピスカタウエ
イのファーマシア・インコーポレーテッド製）上のよう
なカラム・クロマトグラフによって、過剰の過ヨウ素酸
ナトリウムをHRPOから除く。
3.活性化したHRPOを抗−Igに加えて室温で２時間培養す
る。
る。
4.この溶液を氷浴中で４摂氏に冷却する。
5.ナトリウム・ボロハイドライドを冷0.01M炭酸ナトリ
ウム（pH9.5）中にとかして４℃で12〜24時間かけて抗
−Ig−HRPOに加える。
ウム（pH9.5）中にとかして４℃で12〜24時間かけて抗
−Ig−HRPOに加える。
6.この溶液にアセトンを加えて過剰のナトリウム・ボロ
ハイドライドを加え、室温で30分間放置する。
ハイドライドを加え、室温で30分間放置する。
7.抗−Ig−HRPO複合体を蛋白安定化用溶液中で希釈して
−20℃で貯蔵する。
−20℃で貯蔵する。
上記のp53の免疫組織化学検定法には多くの利点があ
る。第１に、この検定法は殆どの病理学研究室において
標準の凍結組織部分を使用してきまりきった手順で実施
することができる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動お
よび免疫沈澱のような従来の検定は臨床研究室できまり
きった手順で実施されない。第２に、この検定法は高度
に安定な反応生成物を利用する免疫パーオキシダーゼ着
色技術を提供する。それ故、着色された試料をp53抗原
の局在の損失なしに数年間貯蔵することができる。他
方、免疫蛍光着色試料は局在を保存するために特別の条
件下で貯蔵しなければならない。第３に、この検定法は
特別の指示、訓練または装置なしに容易に行うことがで
きる。
る。第１に、この検定法は殆どの病理学研究室において
標準の凍結組織部分を使用してきまりきった手順で実施
することができる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動お
よび免疫沈澱のような従来の検定は臨床研究室できまり
きった手順で実施されない。第２に、この検定法は高度
に安定な反応生成物を利用する免疫パーオキシダーゼ着
色技術を提供する。それ故、着色された試料をp53抗原
の局在の損失なしに数年間貯蔵することができる。他
方、免疫蛍光着色試料は局在を保存するために特別の条
件下で貯蔵しなければならない。第３に、この検定法は
特別の指示、訓練または装置なしに容易に行うことがで
きる。
本発明を特定の具体例について説明したけれども、そ
れらの詳細は限定条件と解釈すべきではない。本発明の
精神と範囲を逸脱することなしに種々の均等操作、変化
および変形が実施しうることは明らかだからである。そ
れ故、このような均等操作は本発明に包含されるもので
あることを理解すべきである。
れらの詳細は限定条件と解釈すべきではない。本発明の
精神と範囲を逸脱することなしに種々の均等操作、変化
および変形が実施しうることは明らかだからである。そ
れ故、このような均等操作は本発明に包含されるもので
あることを理解すべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デビツド イー ドイル アメリカ合衆国イリノイ州 60005 ア ーリントン ハイツ サウス リツジ アベニユー 1222 (56)参考文献 ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．131, （1983）Ｐ．502−517 Ｐａｔｏｌ，Ｐｏｌ．，Ｖｏｌ．34, Ｎｏ．２（1983）Ｐ．173−184 Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｖｏｌ. 125，Ｎｏ．３（1982）Ｐ．359−363
Claims (1)
- 【請求項１】ヒト細胞または組織試料中のp53抗原を検
出するための免疫組織化学検定法であり、 （ａ）顕微鏡スライドをポリ−１−リジン及びポリ−１
−アルギニンからなる群から選ばれる正荷電ポリマー溶
液で処理し、 （ｂ）組織又は細胞試料を切断してこの試料を顕微鏡ス
ライドに移し、 （ｃ）スライド上の試料を固定剤中で固定し、 （ｄ）この試料をマウス抗−p53モノクローナル抗体と
接触させ、 （ｅ）この試料を抗−マウスIgG抗体と接触させ、 （ｆ）この試料をマウスのパーオキシダーゼ／抗−パー
オキシダーゼ（PAP）複合体と接触させ、 （ｇ）この試料をジアミノベンチジンと過酸化水素とを
含む発色性基質溶液と接触させ、そして （ｈ）着色した細胞の存在についてスライドを顕微鏡で
検査する、 ことからなる免疫組織化学検定法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US73798685A | 1985-05-28 | 1985-05-28 | |
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| JP2608707B2 true JP2608707B2 (ja) | 1997-05-14 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP61117728A Expired - Lifetime JP2608707B2 (ja) | 1985-05-28 | 1986-05-23 | 腫瘍結合マーカーｐ５３を検出するための免疫組織化学検定法 |
Country Status (2)
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| JP (1) | JP2608707B2 (ja) |
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-
1986
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| Ｐａｔｏｌ，Ｐｏｌ．，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．２（１９８３）Ｐ．１７３−１８４ |
| ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１３１，（１９８３）Ｐ．５０２−５１７ |
Also Published As
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