JPH08507437A - 体液もしくは組織から抽出された合成オリゴヌクレオチドの検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、オリゴヌクレオチドを投与した動物もしくは人間患者から採取された体液もしくは組織試料に存在する特定の合成オリゴヌクレオチドを検出する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 体液もしくは組織から抽出された 合成オリゴヌクレオチドの検出 発明の背景発明の技術分野 本発明は特定の核酸配列の検出に関する。より詳細には本発明は、体液もしく は組織に存在する合成オリゴヌクレオチドの検出に関するものである。関連技術の要約 細胞に存在する特定の核酸配列の検出は当業界にて一般公知である。サウザン 、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー、第９８巻、第５０３〜５１７頁（１ ９７５）は、膜に対しＤＮＡ断片を「ブロッティング」もしくは移行させ、次い で変性したＤＮＡ断片を放射性プローブとハイブリット化させると共にオートラ ジオグラフィーにかけるゲル電気泳動により分離されたＤＮＡ断片にて特定配列 を検出することを教示している。この方法はさらに細胞もしくは組織から抽出さ れたＲＮＡ分子の検出にも拡張されている。極く最近、一層迅速かつ定量的な「 ドット−ブロッティング」法が組織もしくは細胞からのＤＮＡもしくはＲＮＡの 迅速検出につき開発された。 最近、いわゆるアンチセンス手法における治療剤もしくは遺伝子発現調整剤と しての合成オリゴヌクレオチド の開発に相当な関心が寄せられている。たとえばアグローワル、トレンズ・イン ・バイオテクノロジー、第１０巻、第１５２〜１５８頁（１９９１）はアンチセ ンス治療手法の開発につき広範に検討している。アンチセンス治療手法が効果的 であるためには、オリゴヌクレオチドを患者に導入せねばならず、処置すべき特 定組織に到達せねばならない。したがって、体液もしくは組織におけるオリゴヌ クレオチドを検出しうることが必要である。動物モデルにおいては、放射能標識 されたオリゴヌクレオチドが動物に投与され、体液および組織内のその分布がオ リゴヌクレオチドの抽出に続くオートラジオグラフィーにより評価されている［ アグローワル、テムサマニおよびタング、プロシーディング・ナショナル・アカ デミー・サイエンス、第８８巻、第７５９５〜７５９９頁（１９９１）参照］。 しかしながら実用的には、これらの方法を人間患者には拡張することができない 。残念ながら、体液もしくは組織に存在する特定の未標識核酸配列を検出する各 種の技術は、たとえば大型ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子のようなポリヌクレオチド にしか拡張されていない。オリゴヌクレオチドは小寸法であるため、非特異的結 合もしくはバックグランド並びに結合の不存在、非検出性もしくは間違ったマイ ナス結果に関する特殊な問題が存在する。したがって、体液および組織に存在す る特定の合成オリゴヌクレオチド配列を検出するための手法を開発するニーズが まだ残されている。 発明の要点 本発明は、実験動物もしくは人間患者から採取された体液もしくは組織試料に おける合成オリゴヌクレオチドの存在を検出する方法を提供する。本発明による 方法において、体液もしくは組織試料は、オリゴヌクレオチドが投与された動物 もしくは人間から採取されて蛋白分解的に消化（ｄｉｇｅｓｔ）され、次いで抽 出される。次いで全核酸をハイブリッド化膜に移行させる。核酸が付着したハイ ブリッド化膜を予備ハイブリダイズさせ、次いで動物もしくは患者に投与された オリゴヌクレオチドに対し相補的である標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイ ズさせる。ハイブリダイズした標識オリゴヌクレオチドの存在を次いで標準的手 法によって検出する。本発明による方法は、アンチセンス オリゴヌクレオチド 療法を受けた患者およびオリゴヌクレオチドの薬物動力学的性質の研究に使用し た動物モデルにてオリゴヌクレオチドを検出すると共に分布位置を決定するのに 有用である。 図面の簡単な説明 第１図は、実施例１〜５に詳細に説明する放射能標識されたプローブを用いる 本発明による方法の実施例の略図である。 第２図は、放射能標識されたプローブを用いて実施例１〜５に説明した実験か ら得られたオートラジオグラフィーの結果を示す。パネルＡにおいて対照パネル 、５０、 ２５、１２．５、６．２、３．１および０ ｎｇのオリゴヌクレオチド（頂部か ら底部まで）はハイブリッド化膜に直接ブロットした。パネルＢは、血清に添加 され、次いで実施例１〜５に説明したように処理された同一量のオリゴヌクレオ チドを示す。 第３図は、実施例１〜５に詳細に説明した抗原標識プローブを用いる本発明に よる方法の実施例の略図である。 第４図は、放射能標識されたプローブを用いて実施例１〜５に説明した実験か ら得られたオートラジオグラフィーの結果を示す。頂部パネルはオートラジオグ ラフィーを示し、底部パネルはオートラジオグラフの走査型濃度測定とオリゴヌ クレオチドの既知濃度とのプロットを示す。 第５図は、アイソトープもしくは非アイソトープ検出を用いる本発明による方 法の使用を例示する。 好適具体例の詳細な説明 本発明は、体液もしくは組織に存在する特定の核酸配列の検出に関する。特に 本発明は、合成オリゴヌクレオチドを投与した動物もしくは人間患者の体液もし くは組織における前記合成オリゴヌクレオチドの検出に関するものである。 本発明は、体液もしくは組織から抽出された合成オリゴヌクレオチドの検出方 法を提供する。本明細書にて用いる「オリゴヌクレオチド」という用語は限定は しないが５′−３′結合リボヌクレオシド、２′−改変リボヌ クレオシドおよび／またはデオキシリボヌクレオシドの全てのポリマーを包含し 、ここで結合は天然ホスホジエステル結合または人工結合、たとえばホスホロチ オエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート 、アルキルホスホノチオエート、スルホネート、カルバメートもしくはホスホト リエステル結合とすることができる。さらに、この種のオリゴヌクレオチドは塩 基および／または糖残基における改変を有するオリゴヌクレオチド、並びに３′ および／または５′末端にヌクレアーゼ耐性を付与する嵩高置換基を有するもの を包含する。ここで用いる「体液」という用語は限定はしないが血液、尿、汗、 粘液分泌物、脳髄液および滑液を包含する。血液を用いる場合は、細胞を遠心分 離して血清もしくは血漿を得ると共に血清もしくは血漿から核酸を抽出すること が好ましい。「組織」という用語はたとえばリンパ組織、肝臓、腎臓、肺、脳、 腸、平滑筋、心筋、横絞筋、真皮および表皮などの任意の器官を構成するものを 包含する。 本発明による方法においては、体液の試料または組織試料を次のように処理す る。最初に体液をたとえばプロテナーゼＫ、プロナーゼまたは他の慣用のプロテ アーゼなど適するプロテアーゼにより蛋白分解的に消化する。次いで試料を分配 剤、好ましくはフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出する。 次いで核酸をイソブタノールおよびエチルエーテルで抽出する。次い で核酸を溶液中に再懸濁させ、一本鎖となし、さらに適するハイブリッド化膜に 施して結合させる。この種の膜は限定はしないがナイロン膜およびポールＡ膜を 包含する。次いで結合した核酸を有する膜を、検出すべきオリゴヌクレオチドに 対し相補的である標識オリゴヌクレオチドで処理する。相補的オリゴヌクレオチ ドをハイブリダイズさせ、次いでハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチド を洗浄除去する。適するラベルは放射性アイソトープラベル、たとえば³²Ｐもし くは³⁵Ｓ、並びに他の任意慣用のラベル、たとえば蛍光性ラベル（たとえばロー ダミンもしくはフルオレセイン）、化学発光性ラベルまたはビオチンおよび酵素 を包含する。 この種のラベルはオリゴヌクレオチドプローブに直接組み込むことができる。 或いは好適具体例において、抗原をオリゴヌクレオチドに付着させ、抗原に対し 特異的に結合する抗体にラベルをカップリングさせることによって、ラベルをプ ローブに付着させる（そして、このプローブはその標的配列にハイブリダイズす る）。特に好適な具体例は、抗原ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）が結合するプローブ とアルカリホスファターゼが結合する、抗−ＤＩＧ抗体もしくは抗原結合性の抗 体断片とを用いる。この具体例において、プローブは脱ホスホリル化に際しオー トラジオグラフィーにより検出しうるルミネセンスを放出する安定なホスホリル 化された化合物を添加して検出される。本発明の目的で、「オートラジオグラフ ィ ー」という用語は露光が光、Ｘ線またはαもしくはβ粒子または放射性化合物の 減衰に際し放出されるγ線により行われるかどうかに拘らずプローブ−ハイブリ ダイズしたハイブリッド化膜をフィルムに隣接させる写真フィルムの露光を包含 することを意図する。当業者は、ＤＩＧの代りに他の任意の抗原を用いることが でき、これも本発明による方法にてＤＩＧに機能的に均等であることを認識する であろう。 さらに、当業者は抗原−抗体対の代りに他のリガンドーリセプタ対をも用いる ことができ、これも機能的に均等であることを認識するであろう。最後に当業者 は、化学発光をもたらす他の任意の酵素−基質組合せ物をアルカルホスファター ゼおよびその試薬の代りに用い、これらも機能的に均等であることを了解するで あろう。 ハイブリダイズおよび洗浄の条件は特に重要である。イオン性ヌクレオチド間 結合を有するオリゴヌクレオチド、たとえばオリゴヌクレオチド ホスホジエス テルもしくはホスホロチオエートについては、６×ＳＳＣにて３７℃における３ 〜１６時間のハイブリダイズに続き６×ＳＳＣにて室温における５〜１０分間の ２回の洗浄が、６２％のＧ＋Ｃ含有量を有する２５量体プローブを用いて５６％ のＧ＋Ｃ含有量を有する２５量体オリゴヌクレオチドの検出に適することが判明 した。より高度の厳密性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｉｅｓ）においては標的オリゴヌ クレオチドが検出されないのに対し、より低い厳密性 においてはバックグランドのハイブリッド化が真の信号を不明瞭にする。非イオ ン性の改変ヌクレオチド間結合またはより低いＧ＋Ｃ含有量を有するオリゴヌク レオチドについては、低い厳密性（たとえばより低い温度、より高い塩濃度）が 役立つであろう。より長いオリゴヌクレオチドまたはより高いＧ＋Ｔ含有量もし くはＲＮＡ成分を有するオリゴヌクレオチドについては、厳密性の増大（たとえ ばより高い温度、より低い塩濃度および／またはホルムアミドのような水素結合 競合剤の存在）が有益であろう。融解温度と各種の改変ヌクレオチド間結合との 関係については充分記載されている［たとえば米国特許第５，１４９，７９８号 の第９図参照、その教示を参考のためここに引用する］。任意所定の改変オリゴ ヌクレオチドにつき、ハイブリッド化条件は先ず最初に後記実施例４に記載した 条件から出発して行うべきであり、標的オリゴヌクレオチドをハイブリッド化膜 に直接ブロットする。次いで厳密性を減少もしくは増大させて、約３ｎｇの標的 オリゴヌクレオチドの検出限界に達するまで改変を行う。バックグランドおよび 非検出の両問題が除去されるのはこのレベルである。 洗浄の後、膜を乾燥させると共に信号をたとえば蛍光検出、β−放出検出、化 学発光検出もしくはオートラジオグラフィーなどの慣用手段により検出する。 本発明による方法はオリゴヌクレオチド薬物動力学の動物研究に有用であり、 動物にて多量の放射能標識オリ ゴヌクレオチドを使用する必要性を排除する。さらに本発明による方法は、アン チセンス オリゴヌクレオチド療法を受けた人間患者におけるオリゴヌクレオチ ド濃度および分布の検出にも有用であり、投与量の最適化を容易にする。 以下、実施例により本発明の好適具体例につき説明するが、これは決して限定 を意味するものでない。 実施例１ 体液および組織試料の作成 血清もしくは血液に既知量のオリゴヌクレオチドを添加した。２５０μＬの添 加された血清を２５０μＬの２ｍｇ／ｍＬのプロテナーゼＫを含有する抽出緩衝 液（０．５％ＳＤＳ／１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７ ．６／１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中にて１．５〜２時間にわたり６０℃でインキュベ ートした。２００μＬの水を試料に添加し、次いでこれを５００μＬのフェノー ル／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１ 容量／容量）で１ 回抽出し、次いで５００μＬのクロロホルムで１回抽出した。次いで水相を１ｍ Ｌのイソブタノールで２回および５００μＬのエチルエーテルで１回抽出した。 核酸を含有する残留溶液をペレットにまで乾燥させた。ペレットを１０μＬのＴ Ｅ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０／１ｍＭＥＤＴＡ）に再懸濁さ せ、次いで９５℃まで５分間加熱した。次いで４０μＬの２０×ＳＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ ／０．３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を添加した。同様な処理を５００ μＬ程度の少ない尿または０．２５ｃｍ³のリンパ組織を用いて行うことができ る。 実施例２ 膜への抽出核酸の移行 それぞれ１枚ナイロン膜［ゼータ・プローブ（登録商標）、ビオラド社）］お よびワットマン３ＭＭ紙を１０×ＳＳＣで濡らした。濡れたワットマン紙をドッ トブロット装置（ミニホールド１１（登録商標）、シュライヒャー・アンド・シ ュエル社）に入れ、濡れたナイロン膜をワットマン紙の上部に載せた。多重穴の 蓋を装置に被せると共に所定位置に固定し、次いで装置を減圧源に連結した。各 穴を１００μＬの２０×ＳＳＣで洗浄し、次いで実施例１により作製した各試料 を１０μＬ ＴＥ＋４０ｍＬ ２０×ＳＳＧにて穴に添加した。次いで各穴を１ ００μＬの２０×ＳＳＣで洗浄した。次いで減圧を解除し、ナイロン膜を取出し た。次いでナイロン膜を１０分間にわたり短波長（＜３００ｎｍ）のＵＶ光に１ ０ｃｍの間隔にて膜の上側をＵＶ源に指向させながら露光して、核酸を膜に架橋 させた。 実施例３ 標識プローブの作製 放射能標識プローブを作製するため、血液、尿もしくは組織試料を処理すべく 用いたオリゴヌクレオチドに対 し相補的なオリゴヌクレオチドを³²Ｐによりその５′末端にて、１００ｎｇのオ リゴヌクレオチド（５μＬ）と３μＬの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ ミリモル、１０ｍＣｉ／ｍＬ）と１μＬの１０×キナーゼ緩衝液と１μＬのＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（８〜１０単位／μＬ）とを含有する反応混合液中で ３７℃にて３０分間にわたり標識し、次いで６５℃まで３分間加熱した。次いで 標識されたオリゴヌクレオチドを０．４ＭＮＨ₄ＯＡｃおよびエタノールで沈澱 させ、５０μＬのＨ₂Ｏに再懸濁させた。 或いは、非放射性の化学発光性プフローブをゼニウス５（登録商標）オリゴヌ クレオチド・テーリング・キット（ベーリング・マンハイム社）により製造業者 の指針にしたがって作製した。１μｇのオリゴヌクレオチドを末端トランスフェ ラーゼの存在下にジゴキシゲニン−１１−ｄｄｕＴＰ／ｄＡＴＰ（ＤＩＧ−１１ −ｄｄｕＴＰ／ｄＡＴＰ）で３′テール処理した。２０μＬ容量の反応混合物は ４μＬの５×反応緩衝液（１Ｍカリウムカコジレート、１２５ｍＭトリス−ＨＣ ｌ、１．２５ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン、２５℃にてｐＨ６．６）と４μＬの ２５ｍＭ塩化コバルトと１００ピコモルのオリゴヌクレオチドと１μＬの１ｍＭ ＤＩＧ−１１−ｄｄｕＴＰ（２′，３′−ジデオキシウリジン−５′−トリホ スフェートを１１の原子を介しジゴキシゲニンに結合）と５０単位の末端トラン スフェラーゼとを含有した。この 反応混合物を３７℃にて１５分間インキュベートし、次いで氷上に載せた。１μ Ｌの２０ｍｇ／ｍＬグリコーゲンと１μＬの２００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０ ）とを反応混合物に添加し、次いでこれを０．１容量の４Ｍ塩化リチウムおよび ２．５容量の冷エタノールの添加により沈澱させ、次いで混合すると共に−７０ ℃にて３０分間インキュベートした。オリゴヌクレオチドをペレット化し、ペレ ットを７０％エタノールで洗浄し、直接に３０ｐＬの１０ｍＭトリスーＨＣｌ（ ｐＨ７．０〜８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ／１％ＳＤＳに再懸濁させた。 実施例４ プローブオリゴ・ヌクレオチドの 予備ハイブリッド化およびハイブリッド化 実施例２により作製した膜を１０ｍＬのハイブリッド化緩衝液（１Ｍ ＮａＣ ｌ／１％ＳＤＳ／１０％硫酸デキストランおよび１５０ｐｇ／ｍＬ ｔＲＮＡ） にて１〜３時間にわたり３７℃で予備ハイブリッド化させた。ハイブリッド化溶 液における膜に対し、最終濃度３μｇ／ｍＬの未標識の相補性オリゴヌクレオチ ド（５×１０⁵ｃｐｍ／ｍＬ；２５０ｎｇ／ｍＬプローブの最終濃度）で希釈さ れた標識オリゴヌクレオチドプローブを添加し、次いで３７℃にて３〜１６時間 にわたりインキュベーションを持続した。この膜を６×ＳＳＣで２回洗浄し（１ 回の洗浄につき５〜１０分間）、次いで室温にて乾燥させた。 実施例５ 膜に特異的に結合したプローブの検出 実施例４により作製した膜に特異的に結合したプローブの検出を次のように行 った。膜をＸ線フィルムで露光し、次いでこれを現像すると共に走査型濃度測定 にかけ、膜に直接ブロットした既知量のオリゴヌクレオチドの試料を比較とした 。血清試料につき第２図に示した結果は、０．２５ｍＬの血清につき約３ｎｇの オリゴヌクレオチドの検出を示した。同様な結果が尿および組織の試料について も得られた。 抗原ＤＩＧをプローブに付着させる実験において、ゼニウス３（登録商標）核 酸検出キット（ベーリンガー・マンハイム社）を用い製造業者の指針にしたがっ てアルカリホスファターゼ結合の抗−ＤＩＧ抗体Ｆａｂ断片の結合によりプロー ブを検出した。要するに、実施例４に記載したように作製した特異的に結合した プローブオリゴヌクレオチドを有するハイブリッド化膜を封鎖剤により１００ｍ Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌの溶液中で３０〜６０ 分間にわたり封鎖し、次いでアルカリホスファターゼに結合した抗−ＤＩＧ抗体 Ｆａｂ断片を同一溶液にて膜に添加した。この抗体溶液を膜と共に３０分間にわ たりインキュベートし、次いで膜を取出し、新たなハイブリッド化バッグに入れ た。次いで膜を室温にて１回の洗浄当り１５分間にわたり１００ｍＭトリス−Ｈ Ｃｌ（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ（これは予め０．４５μｍの濾過膜で濾過）で２回洗浄した。洗浄の後 、膜がまだ濡れている間に膜を２枚のアセテートシートの間に入れた。次いで０ ．５ｍＬ（１００ｃｍ²膜当り）の０．３３ｍＭ ４−メトキシ−４−（３−ホ スフェートフェニル）−スピロ（１，２′−ジオキセタン−３，２′−アダマン タン）二ナトリウム塩／７５０ｍＭ ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノー ル（ｐＨ９．６）／０．８８ｍＭ ＭｇＣｌ₂／１．１３ｍＭセチルトリメチル アンモニウムブロマイド／０．０３５ｍＭフルオレセイン界面活性剤を膜の上部 表面に施し、液体シールを膜とアセテートシートとの間に形成させた。次いでア セテート被覆膜を用いてＸＡＲ（登録商標）フィルム（コダック社）のシートに ６０分間露光させた。露光したフィルムを現像し、次いで濃度計およびＲＶ９３ ４型２．０濃度計ソフトウェアー（ＥＣアパレータス・コーポレーション社）に よりコンピュータで走査した。次いで平均濃度を既知の濃度のオリゴヌクレオチ ドに対しプロットした。結果を第４図に示す。 これらの結果は、本発明による方法が３ｎｇ／ｍＬ程度の低い濃度にて体液も しくは組織に存在するオリゴヌクレオチドを検出しうることを示す。さらに本発 明による方法を用いて、体液もしくは組織に存在するオリゴヌクレオチドを定量 することもできる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 アグラワル、スディール アメリカ合衆国 01545 マサチューセッ ツ州 シュルーズベリー ランプライター ドライブ 61

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 体液もしくは組織に存在する合成オリゴヌクレオチドを検出するに方法で あって、 （ａ）体液もしくは組織試料を蛋白分解的に消化する工程と、 （ｂ）蛋白分解的に消化された試料を分配剤で抽出する工程と、 （ｃ）試料中に存在する検出すべき合成オリゴヌクレオチドを包含する核酸をイ ソブタノールおよびエチルエーテルで抽出する工程と、 （ｄ）核酸を溶液中に再懸濁する工程と、 （ｅ）核酸をハイブリッド化膜に結合させる工程と、 （ｆ）核酸が結合された膜を、検出すべき合成オリゴヌクレオチドに対して相補 的である標識されたオリゴヌクレオチドプローブで処理する工程と、 （ｇ）膜を洗浄して、膜に結合された核酸に対しハイブリダイズしない標識オリ ゴヌクレオチドを除去する工程と、 （ｈ）膜におけるプローブの存在を検出する工程とを 備える合成オリゴヌクレオチドの検出方法。 ２． 体液が血液である請求項１に記載の方法。 ３． 体液が尿である請求項１に記載の方法。 ４． 組織がリンパ組織である請求項１に記載の方法。 ５． 標識されたオリゴヌクレオチドプローブが放射能 標識されたプローブである請求項１に記載の方法。 ６． 標識されたオリゴヌクレオチドプローブは抗原もしくはリガンドであって 、プローブの検出する工程が、 （ａ）膜を適する封鎖剤で封鎖する工程と、 （ｂ）膜を抗原もしくはリガンドに対し特異的に結合する抗原結合性の抗体断片 もしくはレセプタと共にインキュベートして、化学発光を生じる基質に対して作 用する酵素と結合させる工程と、 （ｃ）膜を洗浄して、非特異的に結合した抗体、抗原結合性抗体断片もしくはレ セプタを除去する工程と、 （ｄ）基質を添加して、これに酵素を作用させる工程と、 （ｅ）膜を写真フィルムに露光する工程とを 備える請求項１に記載の方法。