JPH08506806A

JPH08506806A - 有害生物の防除のための材料および方法

Info

Publication number: JPH08506806A
Application number: JP6514069A
Authority: JP
Inventors: ドヴボロフスキー; デイヴィッドエー．カースロン
Original assignee: University of Florida
Current assignee: University of Florida
Priority date: 1992-12-11
Filing date: 1992-12-11
Publication date: 1996-07-23
Anticipated expiration: 2018-04-28
Also published as: ATE184882T1; EP0945504A3; CA2150371C; EP0673387A1; EP0945504A2; DE69230043D1; EP0673387B1; US5358934A; DE69230043T2; WO1994013698A1; JP3401005B2; CA2150371A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、トリプシンの生合成を阻害する特性を有する、新規なペプチドに関する。トリプシンは、血液摂取性昆虫の卵発生のための必須の構成要素を生成する食物消化のための必須の酵素であるので、上記特性によって、これらのぺプチドは、例えば血液摂取性昆虫における子孫の形成を阻害するのに用いられることが可能になった。

Description

【発明の詳細な説明】有害生物の防除のための材料および方法本発明は、ＵＳＤＡ（米国農務省）研究助成金第ＣＲＣＲ１−２３９４号による政府援助を得てなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。発明の背景抗性腺刺激ホルモン、又は卵の発生を阻害するホルモンの存在が、ゴキブリ、ブユの一種（eyegnat）、甲殻類、イエバエおよび力において立証されている。そのようなホルモンは、一般的には、卵抑制ホルモンとして特徴付けることができる。1985年に、Borovskyは、卵抑制ホルモンを7000倍に精製し、吸血した昆虫の体腔内へのホルモン調製物の注入が、卵発生の阻害、および昆虫における生殖不能を生起することを開示した（D．Borovsky（1985年）：Arch．Insect Bioche m.Physiol.，2：333-349）。これらの観察に続いて、D．Borovsky（1988年）Arc h．Ins．Biochem．Physiol.，7：187-210は、吸血性昆虫へのペプチドホルモン調製物の注入または移入が、消化管の上皮細胞におけるトリプシン様の酵素およびキモトリプシン様の酵素であるセリンエステラーゼの生合成の阻害を生起することを開示した。トリプシンは、この昆虫で合成される主要なタンパク質分解酵素（約７０〜８０％）であるから、血液食餌が充分に消化されず、その結果、脂肪体での卵黄タンパク質合成という合成に必要とされる遊離アミノ酸が血リンパ中に放出されない。卵黄タンパク質は合成されず、卵黄が卵巣に蓄積されない。その結果は、投与された昆虫において卵発生が抑止されることになる。卵抑制ホルモンのペプチドは、消化管、又は消化器系の他の部分の内部に存在するときには、効果がない（D．Borovsky（1988年）、前出）。 1985年にBorovskyが報告した7000倍の精製にもかかわらず、卵抑制ホルモンは、本質的に純粋な形態では得られず、アミノ酸配列は全く得られていないか、または得ることができなかった。その後、単離されたペプチド、トリプシン調節性卵抑制因子（ＴＭＯＦ）、およびこのペプチドの２種類の類似物質が米国特許第 5, 011,909号および第5,130,253号明細書、ならびに1990年の出版物（D．Borovsky ，D.A．Carlson，P.R．Griffin，J．Shabanowitz，D.F．Hunt（1990年）：FASEB J．4：3015-3020）に開示された。ＴＭＯＦは、種々の酵素の作用によって、力の消化管内で急速に不活性化される可能性があると考えられている。シュードモナス・フラーギ（Pseudomonas fr agi）から単離されたエンドペプチダーゼ（H．Charbonneau（1989年）：APracti cal Guide to Proteins and Peptide Purification for Microsequencing（P.T. Matsudaira編）、米国カリフォルニア州サンジエゴ、Academic Press社発行、15 〜30ページ）は、アスパラギン酸（Ｄ）のＮ末端でペプチド結合を加水分解することが示された。このような酵素は、力においては、分子の残余からチロシンのＮ末端を加水分解して、このホルモンを不活性化することによって、ＴＭＯＦまたはその類似物質の調節に役割を果たし得る。もう一つの可能性は、このホルモンが、開裂された後でプロリンイミノペプチダーゼ様酵素によって、またはＬ− プロリンの重合体を消化できるプロナーゼ様酵素によって、加水分解され得ることである（H.A．Sober（1968年）：Handbook of Biochem.、米国オハイオ州クリーブランド、The Chemical Rubber社発行、C70ページ）。ＴＭＯＦのＮ−およびＣ−末端は、双方とも保護されていないので、ＴＭＯＦおよびその類似物質は、アミノペプチド（アミノペプチダーゼ）およびカルボキシペプチド（カルボキシペプチダーゼ）の双方またはエンドペプチダーゼによって加水分解できる可能性がある。これら酵素は、昆虫および哺乳類におけるペプチドホルモンの代謝に重要な役割を果たすことが示されている（R.C．Rayne，M．O'Shea（1992年）： In sect Biochem．Mol．Biol.，22: 24-34；J.C．Schwartz，B．Malfroy，S．De La Baume（1981年）Life Sciences29：1715-1740）。疾患媒介節足動物の殺虫剤耐性が急速に増大したことは、我々のホルモンを用いるアプローチが、化学物質を用いるアプローチ（例えば合成ピレトロイド、有機塩素および有機リン酸エステル）に代わる、より安全な策となる。しかしながら、完全な長さのＴＭＯＦホルモン剤の有用性は、このホルモンが消化酵素によって急速に不活性化されることによって、ある程度限定されている。発明の簡単な概要本発明は、有害生物における消化を阻害し、投与された有害生物に生殖不能（卵発生の阻害）を生起する新規なペプチドホルモンに関する。好適な態様では、本発明のペプチドは、血液を摂取する有害生物、例えばカの防除に用いられる。本発明は、構造式：（１）Ｈ₂Ｎ−ＹＤＰＡＰ−ＣＯＯＨ（Ｐ１）、および（２）Ｈ₂Ｎ−ＹＤＰＡＰ₄−ＣＯＯＨ（Ｐ４）を有する２種類の新規なペプチドを特定して例示する。両化合物とも、例えばネッタイシマカ（Aedes aegypti）に対する生物学的活性を有する。本発明の新規なペプチドは、吸血性昆虫、特に、節足動物に媒介されるウイルス疾患（アルボウイルス）の媒介生物となり得るネッタイシマカのような動物種の力に対して、特に活性を有する。これらの昆虫種は、それらの主要な血液消化酵素としてセリンエステラーゼ（トリプシンおよびキモトリプシン様の酵素）を利用する。本発明の化合物は、高い水溶性の白色粉末である。それらは、市販のペプチド合成装置で合成することができる。これらのペプチドは、異なるpH（５〜９）の水溶液中で非常に安定である。ペプチド（１）は、カのホモジネート（それらの消化酵素を含有する）の溶液中に室温で、活性を失うことなく２週間放置可能である。このように、これらのペプチドは、カおよびその他の有害生物の防除のために特に注目される。本発明のペンターおよびオクターペプチドのもう一つの利点は、それらが昆虫の消化管内で、かなり急速に吸収されることである。意外にも、これらの短鎖ペプチドは非常に活性が高い。したがって、該新規なペプチドは、より急速に作用し、昆虫の消化管酵素による該ペプチドのタンパク質分解が低減され、さらに高い活性を有する。該ペプチドは、１％トリフルオロ酢酸による作用を受けないため、ＨＰＬＣにおいてこの酸性溶液を用いて常法により精製された。本発明は更に、本発明のペプチドの付加塩、複合体、またはエステルのようなプロドラッグ、特に、薬学的に、もしくは農業上許容可能な無害の酸付加塩も包含される。酸付加塩は、適切な溶媒中で、親化合物および過剰量の酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、マレイン酸、コハク酸、エタンジスルホン酸又はメタンスルホン酸より標準的な方式で製造される。構造式は、アスパラギン酸（Ｄ）、およびカルボキシル末端のプロリン（Ｐ）に２個の弱い酸性基（カルボキシル基）を有する。したがって、これらの基でのメチルまたはエチルエステルのような誘導体を形成するエステル化は、標準的手順を用いて調製することができる。該ペプチドのＮ末端およびC末端は、代謝酵素によるそれ以上のタンパク質分解を阻害するために遮断することができる。Ｎ末端又はＣ末端を遮断するためのペプチドの誘導体形成は、当該技術では公知である。例えば、当業者に公知である方法によって、Ｎ末端をアセチル化することができ；当該技術において公知であるとおり、Ｃ末端をアミド化することができる。新規なペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸が、天然に産するＬ形旋光性配座ではなくＤ形配座となるように合成することもできる。Ｄ形配座のアミノ酸の存在は、プロテアーゼが本発明のペプチドを分解する可能性を阻害することができる。また、これらの化合物の長鎖炭化水素を有する誘導体形成は、有害生物の体腔内へのクチクラを通過する移入を容易にするであろう。したがって、本発明のもう一つの態様は、脂質または他の担体に結合させた該ペプチドからなる化合物に関する。本発明のもう一つの態様は、本明細書に開示されたペプチドをコードするＤＮＡ配列に関する。これらのＤＮＡ配列は、当業者が容易に合成することができる。該配列は、適切な宿主を形質転換して、該新規なペプチドを発現する能力をこの宿主に賦与するのに用いられる。特に重要な宿主には、細菌、酵母、昆虫ウイルスおよび植物が包含される。これらの宿主のそれぞれに対して、当業者は、特定の宿主で最適に発現されることが公知であるコドンを用いて、ＤＮＡを特異的に設定可能である。好都合なプロモーターを容易に用いることもできる。細菌、酵母およびウイルスは、それぞれ、その後のペプチド製造に用いてもよく、又はこれらの宿主を、標的となる有害生物にペプチドを直接投与するための伝播体として用いることもできる。植物を形質転換して、その結果、この植物を食物とする標的有害生物種に対して該植物を有害にさせることができる。例えばアグロバクテリア（Agrobacteria）を利用して、植物細胞を形質転換する方法は、当業者には周知である。図面の簡単な説明図１：雌性のネッタイシマカの結紮した腹部へのＴＭＯＦならびにその類似物質であるＰ１およびＰ４の注入の用量量応答曲線である。各点は、３〜７回の測定の平均値±平均値の標準誤差である。発明の詳細な説明本発明は、標的有害生物における消化を阻害する新規なペプチドに関する。特定して例示されるのは、カのような血液摂取性昆虫に対する該ペプチドの使用である。本発明の一実施態様は、Ｐ４と称されるオクタペプチドであって、２個のプロリンがＣ末端から除去されたＴＭＯＦのフラグメントである。２個のプロリンの除去は、ＴＭＯＦホルモンの２０％の末端切除に達する。この実質的な末端切除にもかかわらず、該ペプチドは、生物学的活性を保持し、そして、急速に吸収され、よりタンパク質分解を受けにくくなることから、重要な実用的利点を有する。本発明の第二のペプチドは、ＴＭＯＦホルモンのわずか５個のアミノ酸のフラグメントである。Ｐ１と称されるこのフラグメントは、ＴＭＯＦと比較すると５個のプロリンが除去されていて、したがって、完全な長さのホルモンのわずか５０％であるにすぎない。意外にも、本明細書でより充分に説明するとおり、この小型のペプチドは、Ｐ４というオクタペプチドよりはるかに強い活性を有する。本発明は、更に、それぞれ４個および３個のプロリンが除去された、６個および７個のアミノ酸のペプチド、すなわちＰ２およびＰ３も包含する。また、これらのペプチドのその他の明白に変化した形態も本発明の範囲に含まれる。本明細書において用いられるアミノ酸の一文字の符号は、当技術に周知である。簡便のため、アミノ酸に対する三文字の略語と一文字の符号との関係は、下記のとおりである： Ala Ａ Leu Ｌ Arg Ｒ Lys Ｋ Asn Ｎ Met Ｍ Asp Ｄ Phe Ｆ Cys Ｃ Pro Ｐ Gln Ｑ Ser Ｓ Glu Ｅ Thr Ｔ Gly Ｇ Trp Ｗ His Ｈ Tyr Ｙ Ile Ｉ Val Ｖ本発明の新規なペプチドは、周知の合成手順を用いて調製することができる。例えば、周知のメリフィールドの固体担体法を用いてペプチドを調製することができる。Merrifield（1963年）： J．Amer．Chem．Soc．85: 2149-2154およびMe rrifield（1965年）：Science 150: 178-185を参照されたい。この手順は、古典的ペプチド合成の同じ化学反応および保護基の多くを用いるものの、そのカルボキシル末端によって固体担体、通常は、架橋結合したポリスチレン又はスチレンジビニルベンゼン共重合体に固定された、成長するペプチド鎖を与える。この方法は、単に重合体を洗浄することによって各段階での過剰な試薬の除去を実施するので、手順上の操作の数を好都合にも簡素化する。あるいは、周知の分子生物学の手順を用いることによって、これらのペプチドを調製することもできる。本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列は、アミノ酸配列が本明細書に開示されているので、容易に合成することができる。これらのＤＮＡ配列は、本発明のもう一つの態様である。これらの遺伝子は、本発明のペプチドの合成のために、例えば細菌、昆虫ウイルス、植物細胞または真菌を遺伝学的に操作するのに用いることができる。Ｓｆ９という昆虫細胞系（スポドプテラ・フルギペルダ：Spodoptera frugipe rda）、寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１は、米国メリーランド州20852、Ro ckville、Parklawn Drive 12301番地、American Type Culture Collectionより入手可能である。バキュロウイルスのアウトグラファ・カリフォルニカ（Artogr apha californica）という核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、米国テキサス州7 7843、College Station、Texas A&M University付属Texas Agricultural Experi ment Stationより入手可能であり、G．Smith，M.D．Summers（1978年）：Virolo gy89：517-527、および同（1979年）：J．Virology30：828-838に記載されている。スポドプテラ・フルギペルダ（ＳｆＭＮＰＶ）、コリストネウラ・フルニフェラナ（Choristoneura furniferana：ＣｆＭＮＰＶ）（G.Smith,M.D．Summers（ 1981年）：J．Virology39：125-137）またはスポドプテラ・リットラリス（S．Ｉittoralis：Ｓ１ＮＰＶ）（K.A．Harrap，C.C．Payne，J.S．Robertson（19 77年）：Virology79：14-31）のような他の核多角体病ウイルス（世界保健機関技術報告第531号を参照されたい）をアウトグラファ・カリフォルニカＮＰＶに代えて用いることもできる。その他の昆虫細胞系、例えばトリコプルシア・ニ（ L.E．Volkman，M.D．Summers（1975年）：J．Viroｌ．16: 1630-1637）、スポドプテラ・エクシグア（Spodoptera exigua）、コリストネウラ・フルニフェラナ（G．Smith，M.D．Summers（1981年）：J．Virol．39: 125-137）およびスポドプテラ・リットラリス（K.A．Harrapら、（1977年）：Virology79：14-31）をスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９）に対して置き換えることもできる。プラスミドの調製、および宿主生物の形質転換に用いられる各種の方法が当業者に周知であり、例えば米国特許第5,011,909号および第5,130,253号に記載されている。これらの特許は、本明細書に参照として包含される。これらの手順は、 T．Maniatis，E.F．Fritsch，J．Sambrook（1982年）：Molecular Cloning：A L aboratory Manual（米国ニューヨーク、Cold Spring Harbor Laboratory発行）にも記載されている。したかって、微生物細胞からＤＮＡを抽出し、制限酵素による切断を実施し、ＤＮＡ断片を電気泳動し、プラスミドにテーリングおよびアニーリングを施してＤＮＡを挿入し、結合したＤＮＡを用いて、細胞、例えば大腸菌もしくは植物細胞を形質転換し、プラスミドＤＮＡを調製する。生産したタンパク質を電気泳動し、そしてＤＮＡの配列を決定することは、遺伝子工学技術の当業者の技量の範囲内にある。血液食餌後の雌の力の成虫に本発明の化合物を注入することによる処置は、卵発生を停止させ、雌の力を生殖不能にすることで生殖できなくする。また、分子生物学の公知の手法を用いて、卵抑制ホルモンを産生する遺伝的に操作した細菌を力の幼虫に摂取させ、または、他の昆虫の幼虫を卵抑制遺伝子を有する細菌またはウイルスに感染させることにより、それらが餌を消化することを不能にし、結果的にそれらを餓死させることもできる。バキュロウイルスおよびエントモポックスウイルスをはじめとする各種の昆虫ウイルスが、当業者に公知である。細菌およびウイルスによる特許請求されたペプチド化合物の生産は、幼虫における飢餓活性、および成虫における生殖不能の原因となるであろう。血液摂取性昆虫の幼虫のこの形式の処理は、細菌を用いて昆虫の個体群を防除することに類似する。環境中の標的有害生物に適用する際は、形質転換株を有害生物の自然界の生息場所に適用することができる。形質転換株は、有害生物中に摂取されて増殖し、その間に、タンパク質分解酵素の生合成および卵子に対する有害な効果を有するペプチドを生産することになる。この生物は、噴霧、浸漬、土壌への注入、種子被覆、種苗被覆又は噴霧などによって適用してよい。環境中に投与する場合、生物の濃度は、一般的には、１０⁶〜１０¹⁰細胞／mlであり、１ヘクタールあたりの投与する体積は、一般的には、約０．１オンス〜２ポンド（約２．８〜９０７．２ｇ）またはそれ以上であろう。標的昆虫が生息する植物の部分に投与する場合、生物の濃度は、通常、１０³〜１０⁶細胞／cm²となる。水性環境中では、昆虫の防除は、形質転換微生物株の脂質含量を変化させることによって、水面下で達成してよい。自生する水生藻類は、その脂質含量のために浮遊することが公知である。脂質含量を変化させることは、形質転換株を水面下の所望の深度に分布させることを可能にする。市販の配合物のためには、結果的に低い増殖率を生起する、適切な選択栄養培地中に生物を維持してよい。各種の培地、例えば酵母エキス又はＬブロスを用いてよい。生物を野外で用いる場合、非増殖性濃縮物を適切な選択栄養培地に導入し、高い濃度、一般的には約１０⁵〜１０⁹細胞／mlにまで増殖させ、その後、血液摂取性昆虫の環境に導入するために用いてよい。また、ＴＭＯＦおよびその各種類似物質のヌクレオチド配列を包含する、本発明の遺伝学的材料は、植物を形質転換し、それによって、これらの植物に植物耐性を賦与するのに用いることができる。植物細胞を形質転換するための材料および方法は、当業者には周知である。材料および方法ペプチド合成：新規なペプチドは、標準的な自動化された固相ペプチド合成技術を用いて合成し（G．Barany，R.B．Merrifield（1979年）：In The Peptides, vol，2，（E．Gross et al．編），米国ニューヨーク、Academic Press発行、1- 284頁）、Ｃ₁₈逆相ＨＰＬＣにより精製し、フーリエ変換質量分析法（D.F．Hunt ，J.R．Yates，III，J．Shabanowitz，S．Winston，C.R．Hauer（1986年）：Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 83: 6233-6237）を用いて配列決定することができる。質量分析：前述のとおり操作されるフーリエ変換質量分析計で、質量スペクトルを記録した（D.F．Hunt，J．Shabanowitz，J.R．Yates，III，N.Z．Zhu，D.H. Russell，M.E．Castro（1987年）：Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84：620-623）。質量分析用の試料は、凍結乾燥したＨＰＬＣ分画を５％酢酸５〜２０μｌに溶解することによって調製した。次いで、この溶液の一部、０．５〜１．０μｌ（５〜３０ピコモルのペプチド）を、金めっきしたステンレス鋼プローブの先端（直径２mm）上の１／１のグリセリン／モノチオグリセリンからなる基質１μｌに加えた。試料基質を６〜１０KeVのＣｓ⁺イオンの発射体で衝撃することによって、主として（Ｍ＋Ｈ）⁺イオンの形態のペプチドをこの液体基質から質量分析用の気相へとスパッタリングさせた。Ｃｓ⁺イオンは、質量分析計のイオン源に直接取付けたセシウムイオンガン（米国カリフォルニア州Palo Alto、Antek社）から生成した。メチルエステル形成：塩化アセチル８００μｌをメタノール５mlに撹拌しつつ滴加することによって、メタノールの２規定ＨＣｌの標準溶液を調製した。この溶液を、室温で５分間置いた後、この内１００μｌを、凍結乾燥した試料ペプチドに加えた。試料を室温にて２時間エステル化し、凍結乾燥によって溶媒を除去した。ペプチドのＮアセチル化：ペプチドを５０ｍＭ重炭酸アンモニウム５０μｌ（ pH８．０）に溶解し、直前に調製したアセチル化試薬５０μｌをこの溶液に加えた。アセチル化試薬は、無水酢酸１００μｌを乾燥メタノール３００μ1に加え、１５分間放置した後に、混合物を凍結乾燥することによって調製した。アセチル化されたペプチドは、それ以上精製せすに直接分析した。手動エドマン分解：手動エドマン分解は、前述のとおり（G.A．Tarr（1977年）：Methods in Enzymol，Enzyme Structure，Part E（C.H.W．Hirs，S.N．Tima shef編），Vol．47，335，357ページ）実施し、更に質量分析に用いるためには、変更を加えた（Hunt et al．（1986年）、前出）。顕微手術：血液食餌の１時間後に、細く引いた毛細管を用いて、第４および第５腹節の間で背側に新規なペプチドを注入した。雌の力に血液食餌を与え、直ちに断頭し、１時間以内に細い糸で腹部を結紮して、脳、胸部およびアラタ体から中腸および卵巣を分離した。これらの腹部は、卵黄タンパク質を合成せず、または卵を成熟させなかった。ペプチド濃度（Ｍ）の算出のために、この研究で用いた異なる昆虫の血リンパ含量は、下記のとおりであった：血液食餌の１時間後のネッタイシマカ、３μｌ；血液食餌の１時間後の結紮した腹部、１．５μｌ；スポドプテラ・カルシトランス（S．calcitrans）、１０μｌ；Ｌ．アントフォラ（L.anthophora）、コリストネウラ・フェリス（C．felis）およびコリストネウラ・バリイペンニス（C．variipennis）、それぞれ０．５μｌ。注入したペプチドの最終モル濃度を算出するため、注入した体積（０．２５〜０．５μｌ）のそれぞれにこれらの体積を加えた。中腸からのタンパク質分解酵素の調製および定量：雌性昆虫、および結紮した腹部を切開し、後部中腸を取り出し、食塩水で洗浄し、ガラス製ホモジナイザーを用いて、８ミリモルＴＰＣＫ（キモトリプシン阻害剤）を含有する５０ミリモルトリスＨＣｌ緩衝液（pH７．９）中で均一化した。ＴＰＣＫのこの濃度では、キモトリプシン活性は試料中に全く検出されなかった。４℃にてホモジネートを 10000Ｇで５分間遠心分離し、次いで、上清を回収し、［１，３−³Ｈ］ＤＦＰ（５μCi、比活性：３５Ci／mmol、米国イリノイ州Arlington Heights、Amersham 社）とともに４℃で１８時間インキュベートした。インキュベートした後、［１，３−³Ｈ］ＤＩＰ−トリプシン様誘導体を検定し、合成されたトリプシンの量を定量した（D．Borovsky，Y．Schlein（1988年）：Arch．Insect．Biochem．P hysiol．8：249-260）。キモトリプシン活性は、中腸での全タンパク質分解活性の７％を占めていたので、追跡しなかった（BorovskyおよびSchlein（1988年）：前出）。実験動物の各群は４群から構成されていた：（ａ）血液を給餌し、新規なペプチドを注入し、直ちに検定；（ｂ）血液を給餌し、ペプチドは注入せず（対照）；（ｃ）血液を給餌し、生理食塩水を注入し、２４時間後に検定；および（ｄ）血液を給餌し、新規なペプチドを注入し、２４時間後に検定。群（ａ）から得られた結果は、バックグラウンドとして考慮し、実験群および対照群（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）から差し引き、下記のとおり表した：阻害率(％)＝［100−｛（ｄ−ａ）／（ｃ−ａ）｝ｘ100］下記は、本発明を実施するための、最善の方式を包含する手順を例示する実施例である。これらの実施例は、限定的に説明を行うものではない。特に指示されない限り、百分率はすべて重量により、溶媒混合物の比率はすべて体積による。実施例１：カに対する本発明のペプチドの投与本発明のペプチドの有効性を示すため、発明者らは、雌の力に血液食餌を給餌し、直ちにそれらの腹部を結紮し、異なる量のＴＭＯＦおよび数種類の類似物質（３．３ｘ１０^-3〜５．４ｘ１０^-13Ｍ）を注入した。ペプチドは、結紮した腹部の群に注入した（１濃度につき３〜７群、１群につき２匹の腹部）。２４時間後、トリプシン様酵素の生合成について腹部を検定した。中腸におけるトリプシン様酵素の生合成阻害（％）を、線形回帰分析を用いてＬｏｇ（Ｍ）に対してプロットした：ｙ＝１２５．７＋８．８ｘ、ｒ²＝０．８９７、ｄｆ＝９、ＴＭＯＦ（Ａ）についてＰ＜０．０１；ｙ＝９２＋１２．２８ｘ、ｒ²＝０．８７５、ｄｆ＝３、Ｐ４についてＰ＜０．０５；ｙ＝８４＋６．４８ｘ、ｒ²＝０．９７７、ｄｆ＝４、Ｐ１についてＰ＜０．０１（図１）。これらのペプチドのＥＤ₅₀は、ＴＭＯＦ：５ｘ１０^-9Ｍ、Ｐ１：８ｘ１０^-6Ｍ：およびＰ４：５ｘ１０^-4Ｍであった。ペプチドはそれぞれ（ＴＭＯＦ）Ｐ１およびＰ４）、トリプシン様酵素の生合成を阻害する能力を示した。Ｐ１およびＰ４は、昆虫に摂取されたときに、より安定性を有する可能性がある。すなわち、より速やかに消化管に到達し、したがって、ＴＭＯＦのようなペプチダーゼによる攻撃を受けることがないと考えられる。実施例２：ＴＭＯＦおよび新規なペプチドの構造ＴＭＯＦのＣＰＫ原子モデル、およびコンピュータでシミュレーションした立体図は、分子のＣ末端は、６個のプロリン残基を有しているために溶体中で左巻きのらせん配座を形成している可能性を示唆する。新規なペプチドを、Ｃ−又はＮ−末端のアミノ酸が除去され、または置換されるように合成した。Ｃ末端での左巻きらせんを破壊することにより、ペプチドのＥＤ₅₀を５ｘ１０^-4Ｍから８ｘ１０^-6モルへと低下させた。これらの実験では結紮された腹部を用いたことから、これらの結果は、ペプチダーゼに対するホルモンおよびその類似物質の相対的耐性ではなく、それらの二次構造が、生物学的活性に重要な役割を果たすことを示している。Ｃ末端に６個のプロリンを有することで、おそらく、ホルモンは安定な左巻きらせんを形成し、完全な活性を有することになる。しかし、２個のプロリンを除去した場合、ホルモンは、安定な左巻きらせんを形成できず、自由に回転する４個のプロリンが、細胞の受容体との結合を妨げることになる。本明細書に記載した実施例および態様は、例示の目的のみのためだけではなく、それを考慮した各種の容易な変更または変化が、当業者により考えられる可能性があり、また、本出願の精神および範囲、ならびに添付の請求の範囲に包含されることを理解されたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 15/09 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9452−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．構造式：Ｈ₂Ｎ−ＹＤＰＡＰ_n−ＣＯＯＨ［式中、ｎ＝１〜４である］を有するペプチド、およびその塩、誘導体又はプロドラッグ。２．請求の範囲１記載のペプチドにおいて、構造式Ｈ₂Ｎ−ＹＤＰＡＰ−ＣＯＯＨを有するペプチド。３．請求の範囲１記載のペプチドにおいて、構造式Ｈ₂Ｎ−ＹＤＰＡＰＰＰＰ− ＣＯＯＨを有するペプチド。４．請求の範囲１記載のペプチドにおいて、ペプチドのＮ末端がアセチル化されているペプチド。５．請求の範囲１記載のペプチドにおいて、ペプチドのＣ末端がアミド化されているペプチド。６．請求の範囲１記載のペプチドにおいて、Ｄ−アミノ酸からなるペプチド。７．請求の範囲１記載のペプチドにおいて、脂質に結合されているペプチド。８．構造式：Ｈ₂Ｎ−ＹＤＰＡＰ_n−ＣＯＯＨ［式中、ｎ＝１〜４である］を有するペプチドをコードする、単離されたＤＮＡ分子。９．請求の範囲８記載のＤＮＡ分子において、Ｈ₂Ｎ−ＹＤＰＡＰ−ＣＯＯＨで示されるペプチドをコードするＤＮＡ分子。１０．請求の範囲８記載のＤＮＡ分子において、Ｈ₂Ｎ−ＹＤＰＡＰＰＰＰ−ＣＯＯＨで示されるペプチドをコードするＤＮＡ分子。１１．構造式：Ｈ₂Ｎ−ＹＤＰＡＰ_n−ＣＯＯＨ［式中、ｎ＝１〜４である］を有するペプチドをコードする異種ＤＮＡを含む、原核生物ベクター又は昆虫ウイルスベクター。１２．請求の範囲１１記載のベクターにおいて、ペプチドが式Ｈ₂Ｎ−ＹＤＰＡＰ−ＣＯＯＨを有するベクター。１３．請求の範囲１１記載のベクターにおいて、ペプチドが式Ｈ₂Ｎ−ＹＤＰＡＰＰＰＰ−ＣＯＯＨを有するベクター。１４．構造式：Ｈ₂Ｎ−ＹＤＰＡＰ_n−ＣＯＯＨ［式中、ｎ＝１〜４である］を有するペプチド、およびその塩、誘導体またはプロドラッグ、ならびに担体からなる殺虫剤組成物。１５．請求の範囲１１記載の殺虫剤において、ペプチドが式Ｈ₂Ｎ−ＹＤＰＡＰ −ＣＯＯＨを有する殺虫剤。１６．請求の範囲１１記載の殺虫剤において、ペプチドが式Ｈ₂Ｎ−ＹＤＰＡＰＰＰＰ−ＣＯＯＨを有する殺虫剤。１７．請求の範囲１４記載の殺虫剤において、前記ペプチドのＣ末端がアミド化されている殺虫剤。１８．請求の範囲１４記載の殺虫剤において、ペプチドのＮ末端がアセチル化されている殺虫剤。１９．請求の範囲１４記載の殺虫剤において、ペプチドが脂質に結合されている殺虫剤。２０．構造式：Ｈ₂Ｎ−ＹＤＰＡＰ_n−ＣＯＯＨ［式中、ｎ＝１〜４である］を有するペプチドをコードするＤＮＡを含む、形質転換された宿主細胞。２１．請求の範囲２０記載の形質転換された宿主細胞において、ペプチドがＨ₂ Ｎ−ＹＤＰＡＰ−ＣＯＯＨである宿主細胞。２２．請求の範囲２０記載の形質転換された宿主細胞において、ペプチドがＨ₂ Ｎ−ＹＤＰＡＰＰＰＰ−ＣＯＯＨである宿主細胞。２３．請求の範囲２０記載の形質転換された宿主細胞において、前記細胞が植物細胞である宿主細胞。