DE69230043T2

DE69230043T2 - Materialien und methoden zur schädlingsbekämpfung

Info

Publication number: DE69230043T2
Application number: DE69230043T
Authority: DE
Inventors: Dov Borovsky; David A. Carslon
Original assignee: University of Florida
Current assignee: University of Florida
Priority date: 1992-12-11
Filing date: 1992-12-11
Publication date: 2000-01-27
Anticipated expiration: 2012-12-12
Also published as: US5358934A; CA2150371C; EP0673387B1; JPH08506806A; ATE184882T1; EP0945504A2; EP0673387A1; CA2150371A1; WO1994013698A1; JP3401005B2; EP0945504A3; DE69230043D1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Existenz von Antigonadotropinen oder Hormonen, die die Ei-Entwicklung hemmen, wurde an der Küchenschabe, Schnake, Schalentieren, der Stubenfliege und Stechmücken demonstriert. Derartige Hormone können allgemein als oostatische Hormone charakterisiert werden. 1985 reinigte Borovsky ein oostatisches Hormon 7000-fach und offenbarte, daß eine Injektion eines Hormonpräparats in die Körperhöhle blutsaugender Insekten die Hemmung der Ei- Entwicklung und Sterilität der Insekten bewirkte (Borovsky, D. [1985], Aroh. Insect Biochem. Physiol. 2 : 333-349). Im Anschluß an diese Beobachtungen offenbarte Borovsky, D. (1988) Arch. Ins. Biochem. Physiol. 7 : 187-210, daß die Injektion oder das Einleiten eines Peptid-Hormonpräparats in blutsaugende Insekten eine Hemmung der Biosynthese von Serinesterase, Trypsin-ähnlichen und Chymotrypsinähnlichen Enzymen in den Epithelzellen des Darms, bewirkte. Da Trypsin das hauptsächliche proteolytische Enzym ist, das in diesem Insekt synthetisiert wird (etwa 70-80%), wird die Blutmahlzeit nicht ausreichend verdaut und demzufolge werden keine freien Aminosäuren, die zur Synthese des Dotterproteins in dem Fettkörper benötigt werden, in das Hämolymph freigesetzt. Dotterprotein wird nicht synthetisiert und Dotter lagert sich nicht in den Eierstöcken ab. Die Folge ist eine zum Stillstand gebrachte Ei-Entwicklung in dem behandelten Insekt. Die oostatischen Hormonpeptide haben im Inneren des Darms oder anderer Teile des Verdauungsapparats keine Wirkung (Borovsky, D. [1988], s.o.).
Trotz der von Borovsky 1985 beschriebenen 7000-fachen Reinigung wurde das oostatische Hormon nicht in im wesentlichen reiner Form erhalten und es wurde keine Aminosäuresequenz erhalten bzw. konnte keine erhalten werden. Im Anschluß wurden das isolierte Peptid, Trypsin-modulierender oostatischer Faktor (TMOF), und zwei Analoga dieses Peptids in US-A-5,011,909 und 5,130,253 und in einer Veröffentlichung von Borovsky et al., FASEB J. 4 : 3015-3020, aus dem Jahre 1995 offenbart.
TMOF ist ein Decapeptid (H&sub2;N-YDPAP6-COOH). TMOF, zwei hierin als P1 (das Pentapeptid H&sub2;N-YDPAP-COOH) und P4 (das Octapeptid H&sub2;N-YDPAP&sub4;-COOH) bezeichnete Fragmente und Poly-L-lysin wurden gegen in Kaninchen gezüchtete polyklonale Antikörper gegen ein TMOF-Konjugat getestet. Dies wird von Borovsky et al. [1992], Arch. Insect Biochem. Physiol. 21 : 13-21, beschrieben.
Man nimmt an, daß TMOF durch die Wirkung von Enzymen schnell im Darm einer Stechmücke inaktiviert werden kann. Es wurde nachgewiesen, daß eine aus Pseudomonas fragi isolierte Endopeptidase (Charbonneau, H. [1989] A Practical Guide to Proteins and Peptide Purification for Microsequencing (P. T. Matsudaira, Hsg.), Academic Press, Inc., San Diego, CA, S. 15-30) Peptid-Bindungen an dem N- Terminus von Asp (D) hydrolysierte. Ein solches Enzym kann bei der Stechmücke bei der Regulierung von TMOF oder seiner Analoga durch Hydrolyse des N- Terminus (Tyr) aus dem Rest des Moleküls, wodurch das Hormon inaktiviert wird, eine Rolle spielen. Eine andere Möglichkeit ist, daß das Hormon nach der Spaltung des Hormons durch ein Proliniminopeptidase-ähnliches Enzym oder durch ein Pronase-ähnliches Enzym, das Polymere von L-Prolin verdauen kann, hydrolysiert werden kann (Sober, H. A. [1968] Handbook of Biochem., The Chemical Rubber Co., Cleveland, OH, S. C70). Da die N- und C-Termini von TMOF beide unblockiert sind, könnten TMOF und seine Analoga sowohl durch Amino- als auch Carboxypeptide oder durch Endopeptidasen, die erwiesenermaßen beim Stoffwechsel von Peptidhormonen bei Insekten und Säugetieren eine wichtige Rolle spielen, hydrolysiert werden; siehe Rayne und O'Shea [1992], Insect Biochem. Mol. Biol. 22 : 24-34; und Schwartz et al. [1981], Life Sciences 29 : 1715-1740.
Die rasch zunehmende Pestizid-Resistenz von Krankheiten in sich tragenden Gliederfüßlern läßt einen hormonellen Ansatz gegenüber einem chemischen Ansatz, z. B. unter Verwendung synthetischer Pyrethroide, Organochlor-Verbindungen oder Organophosphaten, zu einer sichereren Alternative werden. Die Nützlichkeit von TMOF ist jedoch durch die rasche Inaktivierung dieses Hormons durch verdauungsfördernde Enzyme in gewissem Maße eingeschränkt.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Bekämpfung von Schädlingen durch Hemmung der Verdauung oder Ei-Entwicklung die Verwendung eines Peptids mit der Formel
H&sub2;N-YDPAPn-COOH
worin n = 1 bis 4; oder eines Salzes, am C-Terminus amidierten, am N-Terminus acetylierten oder Lipid-gebundenen Derivats.
Die neuen Peptide haben die angegebene Formel, worin der C-Terminus amidiert ist, der N-Terminus acetyliert ist, oder das Peptid an ein Lipid gebunden ist.
Das Peptid, das verwendet wird, ist vorzugsweise P1 oder P4.
Beide Verbindungen besitzen biologische Wirksamkeit gegen, z. B., Aedes aegypti. Die in der Erfindung verwendeten Peptide sind besonders wirksam gegen blutsaugende Insekten, insbesondere gegen Stechmücken-Arten wie Aedes aegypti, die potentielle Überträger viraler Krankheiten (Arboviren), die Gliederfüßler in sich tragen, sind. Diese Insekten-Art verwendet Serinesterasen (Trypsin- und Chymotrypsin-ähnliche Enzyme) als primäre, die Verdauung von Blut fördernde Enzyme.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Peptide sind weiße Pulver, die in Wasser stark löslich sind. Sie können auf einem kommerziellen Peptid- Syntheseapparat hergestellt werden. Diese Peptide sind in wässriger Lösung bei unterschiedlichen pHs (5-9) äußerst stabil. Peptid (1) wurde bei Raumtemperatur in einer Lösung von Stechmückenhomogenat (einschließlich ihrer verdauungs fördernden Enzyme) zwei Wochen lang ohne Verlust der Wirksamkeit stehengelassen. Somit sind diese Peptide für die Bekämpfung von Stechmücken und anderen Schädlingen besonders attraktiv. Ein weiterer Vorteil der Penta- und Octapeptide der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß sie schneller im Insektendarm absorbiert werden. Überraschenderweise sind diese kurzen Peptide äußerst wirksam. Somit zeigen die neuen Peptide eine schnellere Wirkung, eine verringerte Wahrscheinlichkeit der Proteolyse des Peptids durch Insektenmagen- Enzyme, und hohe Wirksamkeit. Die Peptide wurden durch 1% Trifluoressigsäure nicht angegriffen und wurden routinemäßig unter Verwendung dieser Säure bei der HPLC gereinigt.
Diese Erfindung beeinhaltet außerdem Additionssalze, Komplexe oder Prodrugs, wie z. B. Ester der Peptide, insbesondere die nicht-toxischen pharmazeutisch und landwirtschaftlich annehmbaren Säureadditionssalze. Die Säureadditionssalze werden auf herkömmliche Weise in einem geeigneten Lösungsmittel aus der Stammverbindung und einem Überschuß einer Säure, z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Ethandisulfonsäure oder Methandisulfonsäuren, hergestellt. Die Peptide besitzen zwei schwach saure Gruppen (Carboxylgruppen) an der Aspartamsäure (D) und an dem Prolin (P) am Carboxyl-Ende. Somit kann die Veresterung an diesen Gruppen zur Bildung von Derivaten, wie z. B. den Methyl- oder Ethylestern, mit Hilfe herkömmlicher Verfahren erfolgen.
Der N-Terminus und C-Terminus der Peptide können blockiert werden, um die Proteolyse durch Stoffwechsel-Enzyme weiter zu hemmen. Die Derivatisierung von Peptiden zur Blockierung des N-Terminus oder C-Terminus ist in der Technik bekannt. Z. B. kann der N-Terminus mit Hilfe von Verfahren, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind, acetyliert werden; der C-Terminus kann amidiert werden, wie in der Technik wohlbekannt ist.
Die Peptide können auch synthetisiert werden, wobei mindestens eine der Aminosäuren in D-Konformation vorliegt, im Gegensatz zu der natürlich vorkommenden L-Rotationskonformation. Das Vorhandensein von Aminosäuren mit D-Konformation kann die Fähigkeit von Proteasen, die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Peptide abzubauen, hemmen.
Die Derivatisierung dieser Verbindungen mit langkettigen Kohlenwasserstoffen erleichtert das Hindurchleiten durch die Cuticula in die Körperhöhle des Schädlings. Deshalb können die Peptide an Lipide oder andere Träger gebunden sein.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1. Dosierungs-Ansprechkurven zu Injektionen von TMOF und seinen Analoga P1 und P4 in ligierte Hinterleiber weiblicher A. aegypti. Jeder Punkt ist ein Mittel aus 3-7 Bestimmungen ± Standardabweichung des Mittelwerts.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Eine Ausführungsform der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Peptide ist das Octapeptid, genannt P4, welches ein Fragment von TMOF ist, bei dem zwei Proline aus dem C-Terminus entfernt wurden. Diese Entfernung von 2 Prolinen macht eine Verkürzung des TMOF-Hormons um 20% aus. Trotz dieser erheblichen Verkürzung behält das Peptid seine biologische Wirksamkeit bei und hat wichtige praktische Vorteile, da es rasch absorbiert wird und weniger empfänglich für Proteolyse ist. Ein zweites Peptid, P1, ist ein Fragment aus nur 5 Aminosäuren des TMOF-Hormons. Bei diesem Fragment wurden verglichen mit TMOF 5 Proline entfernt und es beträgt somit nur 50% des Hormons mit voller Länge. Wie hierin ausführlicher beschrieben, besitzt dieses kleine Peptid überraschenderweise sogar höhere Wirksamkeit als das Octapeptid P4. Die vorliegende Erfindung umfaßt weiter die Peptide mit sechs und sieben Aminosäuren, P2 und P3, bei denen 4 bzw. 3 Proline entfernt wurden.
Die in der Erfindung verwendeten Peptide können durch wohlbekannte Syntheseverfahren hergestellt werden. Z. B. können die Peptide durch das wohlbekannte Merrifield-Verfahren mit festem Träger hergestellt werden. Siehe Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85 : 2149-2154 und Merrifield (1965) Science 150 : 178-185. Obwohl dieses Verfahren viele der gleichen chemischen Reaktionen und Blockierungsgruppen der klassischen Peptid-Synthese verwendet, liefert es eine wachsende Peptidkette, die mit ihrem Carboxyl-Terminus an einem festen Träger, gewöhnlich vernetztem Polystyrol oder Styroldivinylbenzol-Copolymer, verankert ist. Dieses Verfahren vereinfacht bequemerweise die Anzahl an Verfahrensschritten, da die Entfernung der überschüssigen Reagenzien in jeder Stufe einfach durch Waschen des Polymers erfolgt.
Alternativ können diese Peptide durch Verwendung wohlbekannter molekularbiologischer Verfahren hergestellt werden. Für die Peptide kodierende DNA-Sequenzen können leicht synthetisiert werden, da die Aminosäure-Sequenzen hierin offenbart sind. Diese Gene können verwendet werden, um z. B. Bakterien, Insektenviren, Pflanzenzellen oder Pilze zur Synthese der Peptide der Erfindung gentechnisch zu verändern.
Die Insekten-Zellinie Sf9 (Spodoptera frugiperda), Hinterlegungsnummer ATCC CRL 1711, ist von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA erhältlich. Der Polyhedrosekern-Virus Baculovirus Autographa californica (AcNPV) ist von Texas A&M University, Texas Agricultural Experiment Station, College Station, TX 77843 erhältlich und wurde in Smith, G., M. D. Summers (1978) Virology 89 : 517-527; und (1979) J. Virology 30 : 828-838 beschrieben.
Andere Polyhedrosekern-Viren (siehe World Health Organization Technical Report Nr. 531), wie z. B. Spodoptera frugiperda (Sf MNPV), Choristoneura fumiferana (Cf MNPV) (Smith, G., M. D. Summers [1981] JJ Virol. 39 : 125-137) oder Spodoptera littoralis (S1 NPV) (Harrap, K. A., C. C. Payne, J. S. Robertson [1977] Virology 79 : 14- 31) können anstelle von Autographa californica NPV verwendet werden. Andere Insekten-Zellinien können ebenfalls als Ersatz für Spodoptera frugiperda (Sf9) verwendet werden, z. B Trichoplusia ni (Volkman, L. E., M. D. Summers [1975] J. Virol. 16 : 1630-1637), Spodoptera exigua, Choristoneura fumiferana (Smith, G., M. D. Summers [1981] J. Virol. 39 : 125-137) und Spodoptera littoralis (Harrap, K. A. et al. [1977] Virology 79 : 14-31).
Die verschiedenen bei der Herstellung der Plasmide und Transformation von Wirtsorganismen verwendeten Verfahren sind in der Technik wohlbekannt und sind z. B. in US-A-5,011,909 und 5,130,253 beschrieben. Diese Verfahren sind auch in Maniatis, T., E. F. Fritsch, J. Sambrook (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, beschrieben. Somit sind Fachleute auf dem Gebiet der Gentechnik in der Lage, DNA aus mikrobiellen Zellen zu extrahieren, Restriktionsenzym-Verdauungen durchzuführen, eine Elektrophorese von DNA-Fragmenten durchzuführen, Plasmid zu verlängern und zu rekombinieren und DNA einzufügen, DNA zu ligieren, Zellen, z. B. E. coli oder Pflanzenzellen, zu transformieren; Plasmid-DNA herzustellen, eine Protein-Elektrophorese durchzuführen und eine DNA zu sequenzieren.
Die erfindungsgemäße Behandlung durch Injektion der Peptide in erwachsene weibliche Stechmücken nach einer Blutmahlzeit stoppt die Ei-Entwicklung, wodurch die weibliche Stechmücke steril wird und sich nicht fortpflanzen kann. Unter Verwendung bekannter molekularbiologischer Verfahren können Stechmückenlarven auch gentechnisch veränderte Bakterien verabreicht werden, die oostatisches Hormon produzieren und andere Insektenlarven mit Bakterien oder Viren, die das oostatische Gen enthalten, infizieren, so daß diese ihre Nahrung nicht verdauen können und anschließend verhungern. Eine Vielzahl von Insektenviren, einschließlich Baculoviren und Entomopoxviren, sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Die Produktion der beanspruchten Peptid-Verbindungen durch Bakterien oder Viren wäre für die Wirksamkeit des Verhungerns von Larven und die Sterilisation von erwachsenen Tieren verantwortlich. Diese Art der Behandlung von blutaufnehmenden Insektenlarven ist analog zur Verwendung von Bakterien zur Bekämpfung von Insektenpopulationen.
Bei Anwendung auf die Umgebung des Ziel-Schädlings kann der transformierende Stamm auf den natürlichen Lebensraum des Schädlings aufgebracht werden. Der transformierende Stamm wächst nach der Aufnahme in dem Schädling, während er das/die Peptid(e) produziert, das/die eine schädliche Wirkung auf die proteolytische Enzym-Biosynthese und die Eizellen hat/haben. Der Organismus kann durch Sprühen, Tränken, Einspritzen in den Boden, Auftrag auf Saatgut, Auftrag oder Aufsprühen auf Sämlinge oder dergleichen aufgebracht werden. Bei Verabreichung in der Umgebung betragen die Konzentrationen des Organismus im allgemeinen 106 bis 10¹&sup0; Zellen/ml und das pro Hektar aufgebrachte Volumen beträgt im allgemeinen 30 bis 900 g (0,1 Unzen bis 2 brit. Pfund) oder mehr.
Bei Verabreichung an einen von dem Ziel-Insekt bewohnten Pflanzenteil beträgt die Konzentration des Organismus gewöhnlich 10³ bis 10&sup6; Zellen/cm².
Bei in Wasser befindlicher Umgebung kann die Insektenbekämpfung unterhalb der Oberfläche erreicht werden, indem man den Lipidgehalt des transformierenden Mikroorganismus-Stamms verändert. Es ist bekannt, daß einheimische im Wasser lebende Algen aufgrund ihres Lipidgehalts schwimmen. Eine Änderung des Lipidgehalts erlaubt eine Verteilung des transformierenden Stamms in gewünschten Tiefen unterhalb der Wasseroberfläche.
Für kommerzielle Formulierungen können die Organismen in einem Nährmedium aufbewahrt werden, welches Selektivität beibehält und eine niedrige Vermehrungsrate zur Folge hat. Vielfältige Medien können verwendet werden, wie z. B. Hefeextrakt oder L-Nährlösung. Sobald der Organismus im Feld verwendet werden soll, kann das vermehrungshemmende Konzentrat in ein geeignetes selektives Nährmedium eingeführt, in hoher Konzentration, im allgemeinen von etwa 10&sup5; bis 10&sup9; Zellen/ml, gezüchtet und dann zum Einführen in die Umgebung des blutaufnehmenden Insekts verwendet werden.
Das genetische Material kann auch verwendet werden, um Pflanzen zu transformieren, wodurch diesen Pflanzen Pflanzenresistenz verliehen wird. Materialien und Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen sind Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt.

Materialien und Verfahren

Peptid-Synthese. Die neuen Peptide können unter Verwendung herkömmlicher automatisierter Festphasen-Peptid-Syntheseverfahren (Barany, G., R. B. Merrifield [1979] in The Peptides, Band 2, Gross, E. et al., Hsg., Academic Press, New York, S. 1-284) synthetisiert, anhand von C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-HPLC gereinigt und mit Hilfe von Fourier-Transformations-Massenspektrometrie-Analyse (Hunt, D. F., J. R. Yates, III, J. Shabanowitz, S. Winston, C. R. Hauer [1986] Proc. Nett Acad. Soli USA 83 : 6233-6237) sequenziert werden.
Massenspektrometrie. Massenspektren wurden auf einem Fourier-Transformations- Massenspektrometer aufgezeichnet, der wie früher beschrieben betrieben wurde (Hunt, D. F., J. Shabanowitz, J. R. Yates, III, N. Z. Zhu, D. H. Russell, M. E. Castro [1987] Proc. Natl. Acad. Soli USA 84 : 620-623). Proben für die Massenanalyse wurden durch Lösen lyophilisierter HPLC-Fraktionen in 5-20 ul 5%iger Essigsäure hergestellt. Ein Aliquot von 0,5 bis 1,0 ul dieser Lösung (5-30 pMol Peptid) wurde dann zu 1 ul Matrix, die aus 1/1 Glycerin/Monothioglycerin bestand, auf einer vergoldeten Edelstahl-Sondenspitze mit 2 mm Durchmesser gegeben. Peptide, größtenteils in Form von (M+H)&spplus;-Ionen, wurden aus dieser flüssigen Matrix zur Massenanalyse in die Gasphase gesputtert, indem man die Probenmatrix mit 6-10 KeV Cs&spplus;-Ionen-Projektilen bombardierte. Letztere wurden aus einer Cäsium- Ionenkanone (Antek, Palo Alto, CA) erzeugt, die direkt auf der Ionenquelle des Spektrometers montiert war.
Methylester-Bildung. Eine Standard-Lösung von 2 N HCl in Methanol wurde durch Zutropfen von 800 ul Acetylchlorid zu 5 ml Methanol unter Rühren hergestellt. Nach 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde ein Aliquot von 100 ul des Reagens zu der lyophilisierten Peptid-Probe gegeben. Die Probe wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur verestert und das Lösungsmittel durch Lyophilisierung entfernt.
Peptid-N-Acetylierung. Das Peptid wurde in 50 ul 50 mM Ammoniumbicarbonat (pH 8,0) gelöst und 50 ul frisch hergestelltes Acetylierungs-Reagens wurden dieser Lösung zugegeben. Das Acetylierungs-Reagens wurde durch Zugabe von 100 ul Essigsäureanhydrid zu 300 ul trockenem Methanol und Lyophilisieren der Mischung, nachdem man sie 15 Minuten lang stehengelassen hatte, hergestellt. Acetyliertes Peptid wurde direkt ohne weitere Reinigung analysiert.
Manueller Edman-Abbau. Manuelle Edman-Abbauvorgänge wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Tarr, G. A. [1977] in Methods in Enzymol, Enzyme Structure, Teil E (Hirs, C. H. W., S. N. Timashef, Hsg.), Band 47, S. 335, 357) und zur Verwendung mit Massenspektrometrie modifiziert (Hunt et al., [1986], s.o.).
Mikromanipulationen. Die neuen Peptide wurden eine Stunde nach der Blutmahlzeit mit Hilfe eines feingezogenen Kapillarröhrchens in den Rücken, zwischen das vierte und das fünfte Hinterleibssegment, injiziert. Weiblichen Stechmücken wurde eine Blutmahlzeit verabreicht und sie wurden sofort enthauptet, ihre Hinterleiber innerhalb einer Stunde mit einem feinen Faden ligiert, um den Mitteldarm und die Eierstöcke von dem Hirn, dem Brustkorb und den corpora allata abzutrennen. Diese Hinterleiber synthetisierten keine Dotterproteine und die Eier reiften nicht heran. Der in dieser Untersuchung zur Berechnung der Peptid-Konzentrationen (M) verwendete Hämolymph-Gehalt der verschiedenen Insekten war wie folgt: A. aegypti 1 Stunde nach der Blutmahlzeit, 3 ul; ligierte Hinterleiber 1 Stunde nach der Blutmahlzeit, 1,5 ul: S. calcitrans, 10 ul; L. anthophora, C. felis und C. variipennis, je 0,5 ul. Zur Berechnung der End-Molarität injizierter Peptide wurden diese Volumina jedem injizierten Volumen (0,25 ul bis 0,5 ul) zugegeben.

Herstellung und Quantifizierung von proteolytischen Enzymen aus dem Mitteldarm.

Weibliche Insekten und ligierte Hinterleiber wurden seziert und die hinteren Mitteldärme entfernt, in Salzlösung gewaschen und mit einem Glas- Homogenisierapparat in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,9), der 8 mM TPCK (Chymotrypsin-Hemmstoff) enthielt, homogenisiert. Bei dieser TPCK-Konzentration wurde in den Proben keine Chymotrypsin-Wirksamkeit nachgewiesen. Das Homogenat wurde 5 Minuten lang bei 4ºC bei 10000 g zentrifugiert, dann wurde der Überstand gesammelt und mit [1,3-³H]DFP (SuCl, spez. Akt. 35 Ci/mMol, Amersham, Arlington Heigths, IL) 18 Stunden lang bei 4ºC inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden [1,3-³H]DIP-Trypsin-ähnliche Derivate analysiert und die synthetisierte Trypsin-Menge wurde quantitativ bestimmt (Borovsky, D., Y. Schlein [1988] Arch. Insect. Biochem. Physiol. 8 : 249-260). Die Chymotrypsin-Wirksamkeit wurde nicht verfolgt, da sie 7% der gesamten proteolytischen Wirksamkeit in dem Mitteldarm ausmachte (Borovsky und Schlein [1988], s.o.). Jede Gruppe von Versuchstieren bestand aus 4 Gruppen: (a) Blut verabreicht, neues Peptid injiziert und sofort analysiert; (b) Blut verabreicht, nicht injiziert (Kontrolle); (c) Blut verabreicht, Salzlösung injiziert und 24 Stunden später analysiert; und (d) Blut verabreicht, neues Peptid injiziert und 24 Stunden später analysiert. Die anhand von Gruppe (a) erhaltenen Ergebnisse wurden als Hintergrund erachtet und wurden von den Versuchs- und Kontrollgruppen (b), (c) und (d) subtrahiert und wie folgt ausgedrückt:
prozentuale Hemmung =
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Erfindung. Soweit nicht anders angegeben, beziehen sich alle Prozentsätze auf das Gewicht und alle Lösungsmittel- Mischverhältnisse auf das Volumen.

Beispiel - Behandlung von Stechmücken mit Peptiden

Um die Wirksamkeit der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Peptide zu zeigen, wurde weiblichen Stechmücken eine Blutmahlzeit verabreicht. Ihre Hinterleiber wurden sofort ligiert und unterschiedliche Mengen TMOF und mehrerer Analoga injiziert (3,3 · 10&supmin;³ M bis 5,4 · 10&supmin;¹³ M). Die Peptide wurde in Gruppen ligierter Hinterleiber (3-7 Gruppen pro Konzentration, 2 Hinterleiber pro Gruppe) injiziert. 24 Stunden später wurden die Hinterleiber auf Trypsin-ähnliche Enzym- Biosynthese analysiert.
Die Hemmung (%) der Trypsin-ähnlichen Enzym-Biosynthese im Mitteldarm wurde unter Verwendung linearer Regressionsanalyse gegen Log (M) aufgetragen: y = 125,7 + 8,8 x, r² = 0,897, df = 9, P < 0,01 für TMOF(A); y = 92 + 12,28 x, r² = 0,875, df = 3, P < 0,05 für P4; y = 84 + 6,48 x, r² = 0,977, df = 4, p < 0,01 für P1 (Fig. 1). Die ED&sub5;&sub0; dieser Peptide waren: TMOF 5 · 10&supmin;&sup9; M, P1 8 · 10&supmin;&sup6; M, und P4 5 · 10&supmin;&sup4; M. Jedes dieser Peptide - TMOF, P1 und P4 - zeigte eine Fähigkeit, die Trypsinähnliche Enzym-Biosynthese zu hemmen. P1 und P4 sind möglicherweise stabiler, wenn sie von Insekten aufgenommen werden, d. h. dringen schneller in den Darm ein und sind somit nicht wie TMOF Angriffen durch Peptidasen ausgesetzt.
Ein CPK-Atommodell von TMOF und eine Computer-simulierte Stereoansicht legen nahe, daß der C-Terminus des Moleküls aufgrund der sechs Prolin-Reste in Lösung eine linksgängige Helix-Konformation aufweisen könnte. Peptide wurden synthetisiert, wodurch die Aminosäuren aus dem C- oder N-Terminus entfernt oder verschoben wurden. Die Zerstörung der linksgängigen Helix am C-Terminus verringerte die ED&sub5;&sub0; der Peptide von 5 · 10&supmin;&sup4; M auf 8 · 10&supmin;&sup6; M. Da in diesen Experimenten ligierte Hinterleiber verwendet wurden, deuten diese Ergebnisse darauf hin, daß die sekundäre Konformation, und nicht die relative Resistenz des Hormons und seiner Analoga gegen Peptidasen, bei der biologischen Wirksamkeit eine wichtige Rolle spielt. Mit 6 Prolinen am C-Terminus erlangt das Hormon vermutlich eine stabile linksgängige Helix und ist voll wirksam. Wenn jedoch 2 Proline entfernt wurden, konnte das Hormon keine stabile linksgängige Helix bilden und die 4 frei rotierenden Proline behinderten die Bindung an den Zellrezeptor.

Claims

1. Verfahren zur Bekämpfung von Schädlingen durch Hemmung der Verdauung oder Ei-Entwicklung, welches umfaßt die Verwendung eines Peptids mit der Formel

H&sub2;N-YDPAPn-COOH

worin n = 1 bis 4; oder eines Salzes, am C-Terminus amidierten, am N- Terminus acetylierten oder Lipid-gebundenen Derivats, wobei das Verfahren ein Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie nicht umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Peptid die Formel H&sub2;N-YDPAP-COOH aufweist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Peptid die Formel H&sub2;N-YDPAPPPP-COOH aufweist.

4. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, worin die Schädlinge Blut als Nahrung aufnehmen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Schädlinge Stechmücken sind.

6. Peptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, worin der C-Terminus amidiert ist, der N-Terminus acetyliert ist, oder das Peptid an ein Lipid gebunden ist.