JPH08506417A

JPH08506417A - 糖尿病及び前糖尿症状の診断のための方法

Info

Publication number: JPH08506417A
Application number: JP6517448A
Authority: JP
Inventors: リーマッケイ，イアン; ジョイローレイ，メリル; ゼブジメット，ポール
Original assignee: モナシュユニバーシティ
Priority date: 1993-02-09
Filing date: 1994-02-09
Publication date: 1996-07-09
Anticipated expiration: 2019-03-29
Also published as: CA2155677A1; US5770381A; IL108587A; TW305936B; EP0686262A1; IL108587A0; EP0686262B1; NZ261541A; SG45161A1; WO1994018568A1; DE69431874D1; ZA94845B; EP0686262A4; ATE229650T1; JP3510889B2

Abstract

(57)【要約】患者における糖尿病又は前糖尿症状の診断としての、患者の血清中のグルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）に対する自己抗体を検出するための方法であって、前記患者由来の血清サンプルをGAD抗原と接触させ、そして前記サンプル中のGADに対する自己抗体の結合を前記GAD抗原により検出することを含んで成り、前記GAD抗原は増量した量のGADの65kD及び／又は67kDの（１又は複数種の）二量体又は（１又は複数種の）オリゴマーを含むGAD調製品を含んで成ることを特徴とする方法。診断キットも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】糖尿病及び前糖尿症状の診断のための方法発明の分野本発明は糖尿病又は前糖尿症状を有する者の特定のための方法、そして詳しくは、大集団の個体の糖尿病及び前糖尿病（臨床的障害の発症以前の糖尿病の初期段階）の両方を検査するための簡単、且つ有効なスクリーニング手段を提供するであろう診断アッセイに向けられる。発明の背景真性糖尿病は雑多な起源の病気である。インスリン依存性（IDDM）及びインスリン非依存性真性糖尿病（NIDDM）は、生存にとってのインスリンによる処置に対する患者の依存性に生理学的に関連してサブタイプされる¹。IDDMは、IDDMとH LAとのリンケージの動物モデルに類似して、病気の関係、膵臓イスレット細胞抗原に対する自己抗体の理由により自己免疫に属する²。IDDMにおけるその病気関連自己抗原又は抗原は、膵臓イスレットからの免疫沈殿により示されることの可能な64,000Mrタンパク質を含むが³、それはその量の少なさ及びアッセイの困難性を理由に現在まで同定されていない。64,000−Mr抗原に対する抗体についてのイムノアッセイは、それがIDDMに対する特異的なマーカーであり、そして病気の症状の発症に先行して存在していることを示唆する⁴。Stiff Man症候群の場合における共存するIDDMと、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）として同定された64,000〜65,000−Mrニューラル抗原の認識は、Baekkeskovら⁵に、それらの6 4,000−Mr抗原及びGADの一致を樹立させた。近年、Rowleyら⁶はIDDM血清及びブタの脳由来のGAD調製品によるラジオ免疫沈殿による高頻度陽性結果を述べ、そしてGADに対する抗体の検出が、IDDMにかかわる自己免疫マーカーと同じように、有用な診断試験であると提唱している。インスリン依存性真性糖尿病は15才未満の若い個体に優先的にかかる頻繁に生ずる病気である。しかしながら、この病気は青年又は中年の時期において発症することもあり、それ故子供及び成人の両者においてIDDMについて診断及び予想の能力を有する試験について必要とされる。IDDMの病気自体は世界中の発展した及び経済的に発達した国々において最も高い頻度で生ずる。初期段階においてIDDM が診断できる、そして更には病気が通常の実験室検査により認識されうる以前の前臨床段階においてIDDMが診断できることの要望が高い。日常の有用な、高感度な、そして特異的なイムノアッセイキットによるGADに対する抗体の認識はこの要望を満足せしめるであろう。更に、初期又は前臨床認識についての要望が、ID DMの基礎となるイスレット細胞崩壊の進行を止める特異的な免疫治療処置が開発されつつある傾向により高まっている。かかる処置はマウスのIDDMモデルにおいて既に有効に適用されていることに注目すべきである。IDDMの自然進行の停止は患者に数年にも及ぶインスリンの注射をなしですませる。IDDMのための診断手順としてのGADに対する抗体についての有効なイムノアッセイの開発及び利用は、世界中で年間百万人を超える数のアッセイキットの概算利用をもたらすであろう。これとは別に、糖尿病を示す成人の５〜10％はインスリン非依存性型（NIDDM ）を有しているものとして最初に診断され、しかしながら数ケ月から数年に及ぶ期間を経て、彼らはIDDMに変換する。これらの患者は成人における遅延型自己免疫糖尿病（LADA）と呼ばれるカテゴリーに属する。このグループの患者の75〜80％はGADに対する検出可能レベルの抗体を有することが示されている。この試験は診断においてこれらの患者を区別するのに幅広く利用されるようになる傾向にあり、その後のひどい合併症の危険性を伴う糖尿病のコントロールができなくなることをもたらしうる不適切な治療（即ち、ダイエット及び錠剤）から彼らを守る。更に、GADに対する抗体についての試験は、遺伝的素因の理由により危険な個体に適用したとき、予想値を有しうる。初期段階でのインスリン治療の開始は、GADに対する抗体の実証に基づき、このシナリオを転じるであろう。 IDDMの発症には、イスレット細胞抗体（ICAs）に対する自己抗体に血清学的にかかわる自己免疫プロセス^2,7を通常介する膵臓β−細胞の臨床的サイレント崩壊が先行する。これらには、現在GAD^3,4として認識されている64,000−Mrタンパク質、イムノフルオレセンスにより実証できるサイトプラズマICA⁸及びインスリン自己抗体⁹が含まれる。64,000−Mr分子に対する抗体はアッセイするのが非常に困難であり、その理由は大量のイスレット細胞調製品からの抗原の調製の必要性にある。しかしながら、Rowleyら⁶は、ブタの脳から調製した放射性ヨウ素ラベル化GADにより、抗体は免疫沈殿アッセイにより容易に、且つ特異的に検出されうることを示した。64,000−Mr抗原は、様々なその他の病気−関連自己抗原、最も顕著には自己免疫甲状腺炎における甲状腺ペルオキシダーゼ¹⁴、自己免疫胃炎におけるＨ⁺Ｋ⁺ATPase、及び原発性胆汁性肝硬変におけるピルベートデヒドロゲナーゼと同様に酵素分子である。GADは種特異的でなく、そして事実上、ヒト¹ ³ 、ラット¹⁴及びネコ¹⁵由来の脳GADは、いづれの哺乳動物GAD調製品との抗体反応が予期できうるほどの近縁相同性を有する。また、自己抗原は明らかに器官特異的でなく、その理由はRowleyら⁶により使用された起源が脳であるからである。脳と膵臓イスレット由来のGAD配列、即ち、GADが示される主要部位は、アレル変異^16,1 ⁷ によってのみ相違するようである。GADは少なくとも２つのアイソフォームとして存在し¹⁸、そしてRowleyら⁶の調製品は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（P AGE）によるデーターによって示される通り、両方の代表物を含んでいた。 GADはγ−アミノ酪酸（GABA）、即ち、脳における主要阻害性神経伝達物質及び膵臓イスレットにおける推定パラクリンシグナル分子を合成する。この酵素は限定された組織分布を有し、且つGABA分泌性ニューロン及び膵臓β−細胞のサイトプラズマの中で高度に実現される。GADの２つのアイソフォームはその相対的な分子量に従ってGAD65及びGAD67と呼ばれている。これらのアイソフォームは２つの異なる遺伝子の生成物であり、そしてそのアミノ酸末端領域においてのみ実質的に相違する。更に、GADの疎水特性を有する結合型膜タンパク質として存在しており、そしてMW96,600の非共有結合二量体として存在する²⁰。GADのこの精製された膜形態はIDDM血清と反応性であることがわかっているが、しかしながらこの一体型膜タンパク質についての配列データーはまだ得られていない²⁰。抗−GADについての簡単なアッセイの開発は糖尿病検索にとっての有用な手段を担い、特に抗−GADは一過性反応性でないため、膵臓イスレットサイトプラズマ抗原に対する感受性とは異なっている。莫大な数の研究は、抗−GADの頻度がI DDMにおいて高いだけでなく（そして発症し始めの場合はほぼ70〜80％である）、抗−GADの安定性が数年間維持される⁶ことを確証する。事実、非常に長期間存続するIDDMでも、抗−GADの頻度は高く、約60％に保たれる²¹。 GADに対する自己抗体は糖尿病の臨床的徴候が事実上生ずるはるか前に血流中に認められることを研究は示している。遺伝の理由及び膵臓のβ− イスレット細胞に対する抗体についての陽性の理由によりIDDMの危険性のある者として選ばれた個体に基づく本発明による研究において、血清中の抗−GADの存在はIDDMの後期の外観に強く相関していた²²。本発明者による更なる研究において、抗−GADは前糖尿個体のうちの80％に由来する最初に入手した血清サンプルの中に存在し、そして糖尿病の明確なる発症の10年前においても存在する²³。それは糖尿病の発症の数年前に存在しているため、GADオートラジオグラフィーは病気の有用な推定マーカーであり、そして見かけ上健康であるがその後にIDDMを発症した妊婦より獲得した血清サンプルに基づく Finland²³における研究において、抗GADについての陽性試験のIDDMに関する推定能力は驚くべきほど高く、抗GADについての陰性試験に対しての相対的危険率は800倍であった。メルボルン市において、妊娠性糖尿病（妊娠中に現われる糖尿病）を有する女性由来の貯蔵血清に基づく研究は同様に、抗GADについての陽性試験が、かかる女性におけるI DDMの後期における発生の予測法であることを示した。国際特許明細書第PCT／US91／06438（公開番号WO92／04632）は、患者血清サンプルを、膵臓β−細胞上に存在している64kDの自己抗原に特異的な自己抗体に反応できる精製リガンドに曝露することを頼とする糖尿病又は前糖尿症状の検査のためのアッセイを開示する。本発明に至る研究は、GADが抗原として機能し、それ故糖尿病又は糖尿病の前臨床段階についてのイムノアッセイにおいて自己抗体に効率的、且つ有効に結合する分子形態を同定した。GADのモノマー形態は、稀なる例外を除き、IDDM血清に対する抗原にはほとんど反応せず、そしてGADとの反応性を示す有効なアッセイにとって、その調製品は二量体又はオリゴマー形態の一定比率のGADを含まなければならないことが明らかとなった。その結果、糖尿病又は前糖尿症状の検査のためのアッセイにおいて増強した感度をもたらす、GADに対する自己抗体の検査において使用する抗原の形態の最適化がこの度可能となった。発明の概要本発明に従い、患者の血清中のグルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）に対する自己抗体を検出するための方法であって、患者由来の血清サンプルをGAD抗原と接触させ、次いで前記サンプル中のGADに対する自己抗体の結合を前記GAD抗原により検出することを含んで成り、ここで前記GAD抗原は増量した量のGADの65 kD及び／又は67kDの（１又は複数の）二量体又は（１又は複数の）オリゴマーを含むGAD調製品を含んで成ることを特徴とする方法を提供する。本発明の本詳細は血清サンプル中のGADに対する抗体の検出を特に意味してはいるが、「血清」なる語は非限定的な用語として用いているものであり、そして本発明は血清及び血漿を一般に含む「血液」サンプル中のGADに対する自己抗体の検出にも及んでいることが理解されるであろう。本発明の特に好適な特徴として、本発明の方法は、GADの二量体又はオリゴマー形態が保持され、しかもモノマーGADに分解しない条件のもとで実施する。従って、好ましくは、本発明は非変性条件、そして特に非還元条件のもとで実施する。むろん、自己抗体とGAD抗原との結合の検出は血清サンプル中の自己抗体の存在の指標であり、それ故患者における糖尿病又は前糖尿症状の診断であることが理解されるであろう。更なる別の態様において、本発明は増量した量のGADの65kD及び／又は67kDの（１又は複数の）二量体又は（１又は複数の）オリゴマーを含む、 GAD抗原の非天然調製品を提供する。本発明は更に、患者の血清中のGADに対する自己抗体の検出のための診断キットであって、GAD抗原と、このGAD抗原により患者由来の血清サンプル中のGADに対する自己抗体の結合を検出するための手段とを含んで成り、前記GAD抗原が増量した量のGADの65kD及び／又は67kDの（１又は複数の）二量体又は（１又は複数の）オリゴマーを含むGAD調製品を構成していることを特徴とする、キットを提供する。 GAD調製品における「増量した量の」（１又は複数の）二量体又は（１又は複数の）オリゴマーについての本明細書における言及は、このGAD調製品中の（１又は複数の）二量体又は（１又は複数の）オリゴマーの量が、天然GADの調製品中の（１又は複数の）二量体又は（１又は複数の）オリゴマーの量より多いことを示している。かかる多い量は、天然GADを「増量した量の」（１又は複数の）二量体又は（１又は複数の）オリゴマーを有する画分に、例えばSDS-PAGEゲルに基づく電気泳動分離により、又はサイズ排除クロマトグラフィーにより、分離することによって達成されうる。他方、かかる「増量した量の」（１又は複数の）二量体又は（１又は複数の）オリゴマーは、天然GAD中の二量又はオリゴマーGAD の含有量を補助することにより達せられうる。増量した量の（１又は複数の）二量体又は（１又は複数の）オリゴマーを有するGAD調製品についての本明細書における言及は、50重量％より多い、より詳しくは70重量％より多い、又は90重量％よりさえも多いGADの二量体又はオリゴマー形態と、残りのモノマーGADとを有する「実質的に純粋な」GADの調製品をも含む。かかる「実質的に純粋な」二量体又はオリゴマーGADは、既知の分離技術を利用して天然のGADから適量のモノマーGADを除去することにより製造できうる。しかしながら、他方、この二量体又はオリゴマーGADは、例えば天然又は組換製造をモノマーGADのジスルフィド結合又はその他の手段により適当に架橋することによって合成できうる。従って、一の特定の観点において、本発明は、実質的に純粋なGADの65kD及び／又は67kDの（１又は複数の）二量体又は（１又は複数の）オリゴマーを含んで成るGAD調製品、そして特に実質的に純粋なGADの65kD及び67kDアイソフォームのヘテロ二量体又はヘテロオリゴマーを含んで成るGAD調製品を提供する。本発明において抗原として使用するGAD調製品における（１又は複数の）二量体又は（１又は複数の）オリゴマーは、GADの２つのアイソフォームの一方又は他方の凝集体であるか、又はGADの両アイソフォーム（65kD又は67kD）のヘテロ二量体又はヘテロオリゴマーでありうる。同様に、GADはヒト又は非ヒト哺乳動物、天然又は組換体のいづれかであってよく、そして膵臓又は脳（又はその他の CNS）GADのいづれかであってよい。天然GADの単離のための方法は公知であり、そして例えば国際特許明細書PCT／ US91／06438（WO92／04632）に記載されている。この国際明細書は組換GADの調製のための様々な方法も述べている。これらの方法の全ての開示内容を引用することで本明細書に組入れる。本明細書及び添付の請求の範囲にわたり、何らかのことわりのない限り、「含んで成る」なる語は、記載の要件又は要件の群を含むが、任意の他の要件又は要件の群を排除するわけではないものと理解されるであろう。発明の詳細な説明本発明に係る研究において利用するGAD調製品はブタ脳から獲得し、そしてRow leyら⁶に記載の通りにして、哺乳動物GAD¹⁴と反応性であるモノクローナル抗体G AD１を含むアフィニティーカラムに基づいて精製した。この調製品は優先的にモノマーGAD（65kD及び67kD）を含むが、若干の二量及びオリゴマーGADを含んでいた。前記の通り、この調製品は例えば電気泳動により増量した量の二量体又はオリゴマーGADを含む調製品を提供するように更に処理することができうる。 GADを天然起源から単離するとき、その主要成分は架橋していないモノマーGAD である。本発明に至る研究において、それが、「抗原性」成分であると証明された天然GADにおける主要でない二量体／オリゴマー画分であることが発見された。従って、糖尿病又は前糖尿患者の血清中に存在している自己抗体と効果的に結合するため、このGADは二量体又はオリゴマー形態において存在していなくてはならず、そしてほとんどの糖尿病血清に関して、モノマーGADとはほとんど又は全く反応性がないことが見い出されている。この発見は予測も推定もできないものであった。分子の自然コンホメーションを保つ未変性条件下でのゲル中のGADの分子分離の手順を利用し、IDDMにおける自己抗体に結合するGAD分子の分子量は、「糖尿病自己抗原」であると現在まで信じられていたGAD分子のモノマー形態のそれのほぼ２倍である。今まで試験した糖尿病血清のほとんど全てに関し、モノマーは、たとえ20倍又はそれより過剰のモノマーGADの存在下においてさえも自己抗体とほとんど又は全く結合しないことを強調しておく。従って、GAD分子の二量形態は自己抗体反応にとって最適な抗原決定基を供することに従う。更に、モノマーGADに対する二量体GADの量を増量する任意の手順は、このアッセイの感度を大いに高め、且つ自己免疫インスリン依存性真性糖尿病についての血清に基づく診断試験のためのGADの調製品の利用を最適化する。 GADの二量及び多量形態は身体において自然に存在しているという事前の認識があり、そして化学的手順により安定化されたかかる二量及び多量形態は糖尿病を有する者の血清中に存在する自己抗体と反応しうることが報告されている²⁵。ところで、ジスルフィド結合及び／又は静電もしくは疎水性相互作用を崩壊する還元剤の存在下で実施するこの血清反応性を検出する標準の方法は、完全に安定化された二量体及びオリゴマーの破壊をもたらす。それ故、モノマーGADは今日までGADの主要自己抗原形態と考えられていた。前述の通り、本発明に従うGADに対する自己抗体についての診断アッセイの本質的な特徴は、モノマーGADの代わりに増量した量の二量又はオリゴマーGADを含む抗原調製品の、この二量体又はオリゴマーの破壊を回避する適当な反応条件での利用にある。本発明に至る研究において、全体的に異なる手順により誘導された２種類の個別のGAD調製品を試験し、そしてそれぞれについて、IDDMを有する患者由来の血清と反応性は二量体／オリゴマー形態におけるGADとのみである。即ち、IDDMにおける主要膵臓イスレット自己抗原は、今日まで64kDの反応体として信じられていたものとして存在しているのではなく、分子の二量／オリゴマー形態と推定できる120〜130kD（及びそれより大きい）GADの反応体として存在しているという確たる証拠がある。全体的に、以下の実施例１〜８に記載の結果は、GADがIDDM 血清中のGADに対する自己抗体と反応性となるにはこの二量又はオリゴマー形態である必要があるということを明確に確立する。従って、GAD調製品中の二量又はオリゴマーGADの量を増量する任意の手順は、今まで利用されてきた調製品と比較してIDDM血清中に存在する抗GADとより強く、且つ、より特異的に結合するであろう抗原性調製品をもたらすであろう。このことは換言すれば、大いに向上した診断用途を有するより高感度なアッセイを提供する。 GADの二量／オリゴマー画分の濃縮はタンパク質生物学における当業者に自明な数多くの方法により達成できる。これらの手順には、ゲル濾過、HPLC、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等を含む数多くの方法により達成できるGADの二量／オリゴマー形態の精製を含む。この濃縮は共有分子間及び分子タンパク質−タンパク質間会合を形成せしめることで知られるヘテロ−二価又はホモ−二価試験を用いるモノマーGADの古典的な架橋結合によっても達成できうる。増量した量の二量又はオリゴマーGAD65及び／又はGAD67を含む抗原調製品の利用の本質的な特徴とは別に、本発明のアッセイはイムノアッセイにとって慣用のプロトコール、例えば競合イムノアッセイ、ラジオ−イムノアッセイ、酵素結合型免疫収着アッセイ等を利用して実施できる。本発明に係る適当なアッセイプロトコールの更なる詳細は例えばその開示内容を引用することで本明細書に組入れる国際特許明細書PCT／US91／06438（WO92／04632）に記載されている。本発明のこの詳細は、IDDM血清が分子GADの二量又はオリゴマー形態に優先的に反応することを示す。従って、二量／オリゴマーGADの量又は比率が増量している調製品を提供する任意の方法又は手順は、IDDMの血清学的診断にとってより有効な反応体をもたらすであろう。GADの単離のためのかかる方法には、化学的方法及び免疫化学的分離、例えばアフィニティークロマトグラフィー手順であってより高収量の二量体を供するように改良されうる方法が含まれる。同様に、モノマーGAD（組換又は天然）からの適当な架橋、又はジスルフィド結合の形成、又はその他の手段による二量又はオリゴマー分子の生成又は安定化をもたらす方法又は手順は、IDDM血清との強められた反応能力を有する二量体GA Dを含む調製品をもたらすであろう。本明細書において、二量形態のGAD分子はIDDM血清と最適に反応であるエピトープをもたらす適切な「折りたたみ」を必要としうる。最適な細胞輸送及び機能のためと適切に折りたたまれている分子を提供するタンパク質と反応する酵素があり、その一例はタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDI）である。組換分子又は天然モノマーのいづれかのモノマー形態におけるGADはPDIの如くの酵素の折りたたみ作用に対して感受性であることがあり、従ってIDDM血清に対する強められた反応体をもたらす。GAD65及びGAD67のホモ二量体及びヘテロ二量体の両者が調製でき、そしてGAD65−GAD67のヘテロ二量体の調製は血清学的検査にとって極めて有用な反応体を供しうることに更に注目すべきである。本発明の更なる詳細は、例示のために含ませており、本発明を限定するのではない以下の実施例及び図面より明らかとなるであろう。図面の簡単な説明図１は３種の代表的なIDDM血清で沈殿され、そして還元又は非還元条件の下で SDS-PAGEにより分析した（テキスト参照）¹²⁵Ｉ−GADのオートラジオグラフィーによる結果を示す。レーン１及び５は免疫沈殿させていない¹²⁵Ｉ−GADを含み、そしてレーン２，３，４及び６，７，８はIDDMを有する患者由来の３種の代表的な血清で沈殿させた¹²⁵Ｉ−GADを含む。還元条件下では、〜64kDで強いシグナルが、そして110〜130kDで弱いシグナルがあり、一方、非還元条件下では、64 kDで弱いシグナルが、そして110〜130kDで強いシグナルがあることがはっきりと認められる。図２は、Stiff Man症候群（SMS）を有するものを１つ含む68種のIDDM血清についてのエンドポイント力価検定を示し、１：２の希釈率での同一の血清についての対照ユニットの値に対してプロットしている。平均値のプロットは添加した全 GADの５〜10％に対応してプラトーに達していることに注目すべきであり、調製品中の全GADが、高力価により判定される高ポテンシー血清でさえも沈殿できるのではないことを示唆している。図３は３種の異常血清で沈殿させ、そして還元及び非還元条件下でのSDS-PAGE により分析した¹²⁵Ｉ−GADのオートラジオグラフィーによる結果を示す。ここで、及び図１に対する特定の対比において、沈殿した¹²⁵Ｉ−GADは〜64kD成分としてのみ泳動する。レーン１−３及び５−７は異常血清である。レーン４及び８は典型的なIDDM血清である。典型的なIDDM血清（レーン８）は予想通り、非還元条件下で110〜130kDの成分とのみ反応性であり、このオートラジオグラフィーのために利用した曝露時間において弱いシグナルが伴った（矢印）。図４は、実験的に（Ａ）及びヒトにおいて（Ｂ）高揚させた１：20の血清希釈率でのGADに対する抗体を利用したGADのSDS-PAGE電気泳動後のウェスタンブロッティングによる結果を示す。（Ａ）GAD65に対して高揚させたモノクローナルマウス抗体GAD−６、そしてGAD67に対して高揚させたポリクローナルウサギ抗体Ｋ２；（Ｂ）レーン１、健康人；レーン２、SDS及びIDDMを有する患者；レーン３ −10、IDDMを有する患者。図５はニトロセルロースフィルター上にスポットし、次いで検査血清に曝露せしめたGADによるドットブロッティングによる結果を示す。上列（スポット２−10）はIDDM血清とGADとの非変性条件下（テキスト参照）での反応を示し、ここで全ての血清が強い反応性を示し、そして一方、下列（スポット２〜10）はMEで処理した及び煮沸したGADとの同一のIDDM血清の反応を示し、ここでは血清２及び血清３（弱い）のみが反応性を示した。スポット１は正常な血清を示している。ここに示す血清は図４に示すものと同じである。図６はウサギ網状赤血球溶解物（RRL）を用いての発現により天然GADの正常構造を保持するように調製した生合成ラベル化組換GAD（²⁵Ｓ−GAD）のオートラジオグラフィーによる結果を示す。沈殿は代表的な陽性IDDM血清及び陰性血清で行い、そして還元及び非還元条件下でのSDS-PAGEにより分析した。各ケースにおいて、レーン１はRRL組換GAD（19時間曝露）を含み、レーン２はIDDM血清で沈殿させたRRL−発現化GAD（７日曝露）を含み、そしてレーン３は正常血清で沈殿させたRRL発現GAD（７日曝露）を含む。非還元条件下で分析した沈殿RRL−発現GADでは、主要シグナルが110〜130kDのM.W.に相当し、GADの二量体を示唆していることに注目すべきである。実施例１本実施例は、IDDMを有する患者由来の血清中の自己抗体が、SDS−ポリアクリルアミドゲルにおける免疫沈殿物のオートラジオグラフィーにより示される通り、ブタ脳GADの二量／オリゴマー形態と反応することを実証する。 Rowleyら⁶に記載のラジオ免疫沈殿アッセイにおいて反応性であるGAD抗原の性質は以下のようにして調べた。Sepharose−プロテインＡによる免疫沈殿後に蓄積した抗原及び抗体より成るペレットをドデシル硫酸ナトリウムの存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）にかけ、そしてそのゲルをオートラジオグラフィーにより調べた。この沈殿物中の¹²⁵Ｉ−GAD抗原を、アッセイに最初に加えた¹²⁵ ＩでラベルしたGADと対比させた。電気泳動に関し、サンプルを、64mMのTris-HCl、pH6.8、２％のSDS及び10％のグリセロールを含み、５％の２−メルカプトエタノールを有する又は有さないバッファーの中に溶かした。電気泳動を10％の分離用ゲルで行った。ゲルを乾かし、そして２週間に至るまでオートラジオグラフィーにより調べた。オートラジオグラフィーにより得られる典型的な結果を図１に示す。¹²⁵Ｉ−G ADをIDDM血清で免疫沈殿させ、そしてその沈渣を還元剤、２−メルカプトエタノールを伴って、又は伴わないで、即ち、還元又は非還元条件での電気泳動により分析した。このゲルをオートラジオグラフィーに２週間曝露した。この図において、レーン１及び５は免疫沈殿させていない¹²⁵Ｉ−GADを含み、そしてレーン２，３，４及び６，７，８はIDDMを有する患者由来の３つの代表的な血清で沈殿させた¹²⁵Ｉ−GADを含む。還元条件下で（レーン１−４）、沈殿させていないGAD 及び免疫沈殿させたGADは〜64kDのMWに相当する類似の泳動度を有していた。しかしながら、非還元条件下では（レーン５−８）、沈殿させていないGADは〜64k D及び〜110−130kDのMWに相当する泳動度を有し、一方、沈殿させたGADは〜110 −130kDのMWに相当する成分としての独占的な泳動度を有していた。 GADに対する抗体について陽性の結果を示す血清からの免疫沈殿に関し、明確なシグナルを供するためのオートラジオグラフィーにとって必要な時間は１〜２週間であった。還元条件下で、即ち、２−メルカプトエタノールの存在下で、GA Dに対する抗体を含むIDDM血清により沈殿したヨウ素化タンパク質は〜64kDの分子量を有していた。二量体及びオリゴマーの分子形態が変化しない非還元条件下では、〜64kDの分子量を有する無視できるほどの量のヨウ素化タンパク質しか沈殿せず、一方、〜110−130kDの分子量を有するヨウ素化タンパク質に対応する強力なシグナルが、おそらくは〜64kDの物質のオリゴマー凝集物である200kDより大きい分子量の成分に対応する弱めのシグナルと共にあった。他方、免疫沈殿混合物に加えられた同一の¹²⁵Ｉ−GAD調製品を還元又は非還元条件のいづれかのもとでの電気泳動を利用して直接調べたとき、分子量〜64kDのヨウ素化タンパク質の存在に対応する強力なシグナルがあった。実施例２本実施例は、糖尿病血清が、免疫沈殿のために利用した血清の量又はポテンシーとは無関係に、アフィニティー精製ブタ脳GADの試験調製品において全量のヨウ素化GADのごく一部のみを免疫沈殿させることを示す。ブタ脳GADのアフィニティー精製調製品において、ごく一部のみがIDDM血清との反応にとって適当な自己抗原形態をとっており、それはラジオイムノアッセイにおける全¹²⁵Ｉ−GADの５〜10％より多くを免疫沈殿させることができないという一貫した繰り返しの発見により示される（本発明者の研究室において試験した 1000より多くのIDDM血清に基づいて観察）。実際、任意のIDDM血清により免疫沈殿させた放射性ヨウ素ラベル化ブタ脳GADの全量は加えた放射能の総カウント数の５〜10％のみに相当するレベルにおいてプラトーに達し、更なる量のIDDM血清の添加により増大は認められなかった（図２）。更に、ラジオ免疫沈殿アッセイにおいて陽性の反応を供するIDDM血清を通常の１：２の初期希釈率から力価検定したとき、エンドポイント力価はほとんどのケースにおいて１：1000の血清希釈率を超え（図２）、調製品中の¹²⁵Ｉ−GADのほとんどを免疫沈殿できないことは沈殿用血清中のポテンシーの任意の欠落によらないことを示唆する。実施例３本実施例は、GAD調製品からのGADの二量体及びオリゴマー形態の除去がIDDM血清とGADとの反応をなくさせることを示す。ラジオ免疫沈殿アッセイにおいて、IDDM血清による¹²⁵Ｉ−GADの免疫沈殿後の残留上清液は、通常加えた初期放射能のほとんどを含む（上記参照）。電気泳動後の残留¹²⁵Ｉ−GADのオートラジオグラフィーは〜64kDの成分に対応するシグナルを示し、これはもとのGAD調製品中の〜64kDのシグナルにまさに匹敵する。しかしながら、高分子量の成分に対応する他のシグナルはなくなり、これらの成分は第一免疫沈殿により完全に除去されたものである。 ¹²⁵Ｉ−GADの初期沈殿からのGADの二量体／オリゴマー形態のどの程度の除去がIDDM血清との反応能力をなくしてしまうであろうかを決定する実験を行った。従って、¹²⁵Ｉ−GADの調製品を４℃で一夜、強力に陽性なIDDM血清と、又はプールした正常血清のいづれかに反応（即ち、吸収させ）、次いで¹²⁵Ｉ−GAD−抗− GADの免疫複合体を全て除去するためにプロテインＡ−Sepharoseにより免疫沈殿を行った。吸収させた上清液を次にIDDM血清又は正常ヒト血清のいづれかを用いる標準免疫沈殿アッセイにおいて抗原として用いた。その結果、強力に陽性なID DM血清による免疫沈殿（吸収）を経て誘導された上清液は一般にこの標準ラジオ免疫沈殿アッセイにおいて抗原として機能できなかった（しかしながら、実施例４に述べる通り、３つの異常を除く）。典型的な結果を表１に示す。IDDM血清による¹²⁵Ｉ−GADの初期沈殿（吸収）を経て、IDDM血清による更なる沈殿は正常血清により沈殿されうる放射能をもはや免疫沈殿させなかった。他方、正常血清による初期沈殿（吸収）を経て、IDDM血清により¹²⁵Ｉ−GAD調製品から沈殿しうる放射能のカウント数は、全く同一の条件下で試験した¹²⁵Ｉ−GADの新鮮な未吸収調製品を用いて沈殿させた放射能のカウント数とまさに同等であつた。本実施例において、¹²⁵Ｉ−GADの初期沈殿を、IDDM血清又は正常血清のいづれかにより行い、同様に第二沈殿を行い、その結果を初期沈殿なし（Nil）のものと比較した。結果は、IDDM血清による初期沈殿はGADの反応能力を排し、一方、正常血清による初期沈殿後は、IDDM血清に対するGADの反応能力は変化しなかった。実施例４本実施例は、IDDMのケース由来の非常に例外的な血清が精製脳GADのモノマー形態と反応することを示す。これらの異常反応性血清の同定及び特定はIDDMの診断におけるGADの二量体又はオリゴマー形態の重要性から逸脱しない。事実、二量体又はオリゴマー形態でなく、モノマーのGADとのこれらの血清の非常に例外的な免疫沈殿反応性は、免疫沈殿アッセイにおいて、IDDM血清が二量体／オリゴマー形態におけるGADと通常、且つ典型的に反応するという本発明のデーターの強力な確認を供する。前述の通り、ほとんどのIDDM血清に関し、¹²⁵Ｉ−GADによるラジオ免疫沈殿アッセイを、過剰抗体の条件下であって、これらの血清が1：100もしくは1：1000 又はそれより高い希釈率においても反応性であり続け、しかもほとんどのIDDM血清が調製品中の全ヨウ素化GADの〜５〜10％しか反応しないという条件のもとで実施する。ところで、これは試験したIDDM血清の圧倒的大多数、事実上は99％を超えるものについて観察された反応性パターンであるにもかかわらず、異常な反応性パターンが３種の血清に観察された。これら３種の血清はそれぞれ１：２の希釈率においての標準免疫沈殿において、全ヨウ素化GADの10％より高く30％に至るまでを沈殿させた。にもかかわらず、そしてこれら３種の血清の見かけ上のポテンシーと関係なく、各ケースにおいて、免疫沈殿アッセイにおける反応性は血清の希釈の後に直ちに低下し、それ故力価に関するポテンシーは事実上低かった。上記の通りの非還元条件下でのオートラジオグラフィー後の免疫沈殿を、これらの血清が二量体／オリゴマーと反応するかを検定するために適用した。その結果、これらの３種の異常血清による免疫沈殿により得られたペレットはモノマー GADについてのMWに相当する成分との強い反応性を示したが、GADの二量体／オリゴマー形態との見かけ上の反応性は示さなかった（図３）。調製品からのGADの二量体／オリゴマー形態の除去がこれらの異常血清の反応性に影響を及ぼすであろうかを決定するため、¹²⁵Ｉ−GADの起源として、上記の通りIDDM血清による初期免疫沈殿（即ち、吸収）を経て得られた上清液を用いて免疫沈殿を繰り返した（実施例３参照のこと）。この実験において、IDDM血清による¹²⁵Ｉ−GAD調製品の初期吸収はこれら３種の血清との¹²⁵Ｉ−GADの反応性を排除しなかったが、予想通り、そして先に示した通り、それは全ての典型的な反応性IDDM血清との反応性を有意に低下させなかった。この実験の結果を表２に示す。本実施例において、モノマーGADと反応する３種の異常血液についてのIDDM血清による又は血清抜き（nil）によるGADの初期沈殿後の結果を示す。これらの血清に関し、反応能力は初期沈殿後保持されていた。反対に、典型的なIDDM血清についてのGADの反応性能力は初期沈殿後に有意に低下した。実施例５本実施例は、GAD65及びGAD67の両者を含むGADの二量体／オリゴマー形態はIDD Mを有する患者由来の血清と反応することを示す。ブタ脳由来のGAD調製品はGAD65及びGAD67の両方を含む。このことは、ブタ脳G AD調製品中に大量のGADのヘテロ二量形態GAD65−GAD67があるであろうことを示唆しており、アフィニティー精製に用いられるモノクローナル抗体GAD１がGAD65 とのみ反応するという報告を供する。即ち、GAD67はGAD65との連結のみを介してアフィニティーカラムに結合しうる。 GAD65及びGAD67のヘテロ二量体がIDDMを有する患者由来の血清と反応性であるという証拠は、抗原材料が、GAD65¹⁹と反応するモノクローナル抗体GAD６を用いるか、又はGAD67²⁶とのみ反応すると言われるウサギの中で高揚させたポリクローナル抗体Ｋ２のいづれかを用いる免疫沈殿を最初に行った後に得られた上清液である免疫沈殿研究から入手できる。その結果を表３に示す。GAD67を除去するためにＫ２による初期沈殿を行った後、IDDM血清と上清液との反応性は、初期免疫沈殿なしで得られる2600cpmから1 300cpmへと、即ち約50％低下した。一方、GAD65と反応するモノクローナル抗体G AD６による初期沈殿又は潜在IDDM血清による初期免疫沈殿後、事実上100％の、即ち、健康な血液ドナー由来の血清を用いて認められるレベルに至るまでの反応性の低下があった。本実施例において、GAD調製品の初期沈殿を様々な反応体、即ち、GAD65に対するモノクローナル抗体GAD６、GAD67に対するポリクローナルウサギ抗体Ｋ２、ID DM血清又は正常血清により行い、そしてIDDM血清又は正常血清による第二沈殿を続けた。その結果は、IDDMと反応するGADの能力が、血清Ｋ２により中程度に、そしてGAD６及びIDDM血清によりめざましく影響されることを示した。GAD６及びＫ２は完全に枯渇しているという発見から、その妨害はGAD65／GAD67のホモ二量体及びヘテロ二量体がGAD調製品の中に存在し、そしてホモ−及びヘテロ−二量体が共に反応性であることにある。実施例６本実施例は、自己抗原タンパク質GADの変性がそのIDDM血清との反応性に影響することを示す。「ウェスタン」転写イムノブロッティングは自己免疫血清と、細胞間タンパク質を含むタンパク質成分との反応性を調べるための標準的な手順である。この手順は通常、抗原性タンパク質を熱（煮沸）、還元剤（２−メルカプトエタノール）及び清浄剤ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）に曝露することにより変性させる条件下で行う。このようにして決定されるポリペプチドエピトープは「コンホメーション」であるよりは「線形」として認識されるが、しかしながらゲルからニトロセルロースフィルターへのタンパク質の転写後に多少の再生が生じうる。 IDDMを有する患者からの血清はウェスタンブロッティングにより、64〜65kDの MWに相当する成分を有するGADの調製品と反応する；しかしながら、実際には、本発明者²⁷及び他の者^5,28,29の実験に従い、IDDM血清のごく一部（〜10％）のみが反応する。このことは、IDDM血清が通常、イムノブロッティングの通常の条件下で失われるGAD分子にかかわるコンホメーションエピトープ構造と反応するであろうことを示唆する。このことは、IDDM血清が通常、GAD分子を、２−メルカプトエタノール、加熱及びドデシル硫酸ナトリウム²⁷抜きでの非還元条件下でドットブロットとしてニトロセルロースフィルター上に「スポット」したときにはGAD分子と反応しないことの発見（図５）と一致する。しかしながら、ドットブロッティング手順は反応性タンパク質のゲル中での分子分離を包括しないため、ドットブロッティング手順におけるGAD反応体の分子量についての情報は得られない。ドットブロッティング系において、２−メルカプトエタノールは反応を妨害しないことが見い出され、一方、GAD調製品の煮沸はIDDM血清との反応性を失わせた。前記の通り、ドデシル硫酸ナトリウム及び煮沸に曝露したが、ただし２−メルカプトエタノールの非存在下でのゲル電気泳動後の免疫沈殿ペレットのオートラジオグラフィー（GAD−抗−GAD）は、GADの二量体の分子量に相当する成分（〜1 20kD）を示す。60℃で２分間の温和な加熱に対する曝露はIDDM血清と反応する¹² ⁵ Ｉ−GADの能力の損失をもたらし、一方、２−メルカプトエタノールに対する曝露はIDDM血清との反応能力の損失をもたらさないことが明らかになった。¹²⁵Ｉ −GADを免疫沈殿アッセイにおいて使用する前に２−メルカプトエタノールで処理した後に免疫沈殿させたペレットの非還元条件下でのオートラジオグラフィーは二量構造の保持があることを示し、二量形態の分子は加熱のない還元に対して耐性であることが明らかであることを示唆する。ウェスタンブロッティング及びアフィニティー精製ブタ脳GADを用いる免疫沈殿物のゲル分析由来の結果に関して、ウェスタンブロット手順において、抗原は血清抗体と反応前に変性条件に曝露し、一方、免疫沈殿による分析では、変性条件に対する曝露は抗原−抗体複合体の形成の後とすることに注意する。これらの結果は、GAD分子により示される反応性エピトープはタンパク質のコンホメーション構造により妨害されることを示唆し、そして二量又はオリゴマー形態のGAD分子の構造であるこのエピトープと一致する。実施例７本実施例は、細菌発現系において生産された組換GADが免疫沈殿アッセイにおいて不活性であるが、しかしながらその組換タンパク質は強い酵素活性を示し、それ故天然形態分子のほとんどを保持しているにちがいないことを示す。酵素の作用は分子のコンホメーション構造に非常に依存性であり、なぜならほとんどの酵素の活性はそのコンホメーション構造が失われたときに容易に破壊され、そしてGADは45℃で２時間の加熱により完全に失活するからである²⁰。従って、酵素活性分子は通常その自然コンホメーションにおいて折りたたまれて存在する³⁰。組換GAD65を細菌発現系pMAL（New England Biolabs）³¹の中で調製した。この組換タンパク質はRowleyら⁶に記載の手順に従い、³Ｈでラベルしたグルタミン酸塩からのGABAの生産による測定により強い酵素活性を有することが示され、そして組換タンパク質の比活性は精製ブタ脳GADの比活性よりはるかに高かった。にもかかわらず、組換GAD抗原を¹²⁵Ｉでラベルし、そして標準免疫沈殿アッセイにおいて抗原として使用したとき、それらは弱い反応性であると示された。組換GADは従来、ELISA系において若干の成功を収めて使用されているが、しかし組換GDAを使用するかかるELISAの性能は公開の結果による判断³²及びFirst In ternational GAD Antibody Workshop³³の結果により、天然ブタ脳GADを使用するラジオ免疫沈殿アッセイの性能よりかなり劣る。即ち、IDDMを有する患者由来の血清との反応性についてのGAD分子のコンホメーション上の要件は酵素活性にとってのコンホメーション上の要件とは異なり、免疫沈殿にとっての追加のコンホメーション上の要件がGAD分子の二量／オリゴマー形態に重要に依存していることを示唆する。実施例８本実施例において、ウサギ網状赤血球溶解物由来の組換GADの利用が抗原反応性を担持する分子の二量体−オリゴマー形態を樹立する。実施例１〜６に記載の各実験をブタ脳から免疫化学的手段により調製したGAD を用いて実施した。この調製品中の一部のGADは抽出工程中に損傷することが予測され、そしてこの分子の二量又はオリゴマー構造は天然GADの抗原性の保護であると予測されうる。この予測に基づき、IDDM血清の二量体又はオリゴマーGAD との独占的な反応性はこの調製法の人工物を供しうる。この場合、他の方法により調製されたモノマーGADはIDDM血清と反応するであろう。様々な実験室において、種々の網状赤血球発現系において生産された組換GAD はGADに対する抗体についてアッセイするのに有効に使用されうることを樹立している^29,34,35。もしIDDM血清がGADの二量／オリゴマー形態と反応するのに絶対的な要件があるなら、これらの発現系に由来するGADにより、IDDMを有する患者由来の血清により免疫沈殿した材料は、天然脳GADと同じように、二量／オリゴマー形態にあるであろう。上記の仮定を以下のようにして調べた。³⁵Ｓ−メチオニンにより生合成的にラベルした組換GADをSP６ポリメラーゼによるインビトロ転写、それに続くウサギ網状赤血球溶解物を用いるインビトロ翻訳を利用して調製した。生合成的にラベルした³⁵Ｓ−GADを、還元条件下でのSDS-PAGE、それに続くオートラジオグラフィーにより分析し、そして非常に高純度であり、ほぼ独占的に〜64kDの分子量を有する単独のタンパク質成分より成ることを示した（図６）。この精製された真核系発現³⁵Ｓ−GADを上記のIDDM及び正常血清による免疫沈殿アッセイに抗原として用いた。この結果、アフィニティー精製脳GADと同じように、全放射能のごく一部のみが免疫沈殿できた。免疫沈殿させたペレット（GA D−抗−GAD）を非還元条件下での電気泳動によりタンパク質の分離後オートラジオグラフィーにより調べ、そして前記のように、GADの二量形態のみが免疫沈殿した。この調製品中のほとんどの³⁵Ｓ−GADがモノマー形態であるが、大半が沈殿しないことに注目すべきである。参考文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， (72)発明者ジメット，ポールゼブオーストラリア国，ビクトリア 3142，トゥーラク，リンリスゴーロード 24

Claims

【特許請求の範囲】１．患者の血清中のグルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）に対する自己抗体を検出するための方法であって、前記患者由来の血清サンプルをGAD抗原と接触させ、そして前記サンプル中のGADに対する自己抗体の結合を前記GAD抗原により検出することを含んで成り、前記GAD抗原は増量した量のGADの65kD及び／又は 67kDの（１又は複数種の）二量体又は（１又は複数種の）オリゴマーを含むGAD 調製品を含んで成ることを特徴とする方法。２．患者における糖尿病又は前糖尿症状を診断するための方法であって：（ｉ）この患者から血清サンプルを獲得する；そして（ii）この患者中の糖尿病又は前糖尿症状の診断として前記サンプル中のGAD に対する自己抗体の存在を検出する；ことを含んで成り、ここで：（iii）前記サンプル中の前記自己抗体の存在は、前記サンプルをGAD抗原と接触させ、そして前記サンプル中のGADに対する自己抗体の結合を前記GAD抗原により検出することにより検出するものであり、ここで前記GAD抗原は増量した量のG ADの65kD及び／又は67kDのアイソフォーム（１又は複数種の）二量体又は（１又は複数種の）オリゴマーを含むGAD調製品を含んで成る、方法。３．前記方法を、GADの二量体又はオリゴマー形態が保持される条件下で行う、請求項１又は２記載の方法。４．前記方法を、非変性条件下で行う、請求項３記載の方法。５．前記方法を、非還元条件下で行う、請求項４記載の方法。６．前記GAD抗原が、ヒト又は非ヒト哺乳動物の、天然又は組換体、及び膵臓又は脳もしくはその他のCNS，GADより選ばれる、請求項１又は２記載の方法。７．前記GAD抗原が、50重量％より多いGADの二量体又はオリゴマー形態を含む実質的に純粋なGADを含んで成る、請求項１又は２記載の方法。８．前記GAD抗原が、GADの65kD及び67kDアイソフォームの一方又は他方の（１又は複数種の）二量体もしくは（１又は複数種の）オリゴマー、及び／又は両アイソフォームの（１又は複数種の）ヘテロダイマーもしくは（１又は複数種の）ヘテロオリゴマーを含んで成る、請求項１又は２記載の方法。９．増量した量の、GADの65kD及び／又は67kDのアイソフォーム（１又は複数種の）二量体又は（１又は複数種の）オリゴマーを含むGAD抗原の調製品。 10．前記GAD抗原が、ヒト又は非ヒト哺乳動物の、天然又は組換体、及び膵臓又は脳もしくはその他のCNS，GADより選ばれる、請求項９記載の調製品。 11．前記GAD抗原が、50重量％より多いGADの二量体又はオリゴマー形態を含む実質的に純粋なGADを含んで成る、請求項９記載の調製品。 12．前記GAD抗原が、GADの65kD及び67kDアイソフォームの一方又は他方の（１又は複数種の）二量体もしくは（１又は複数種の）オリゴマー、及び／又は両アイソフォームの（１又は複数種の）ヘテロダイマーもしくは（１又は複数種の）ヘテロオリゴマーを含んで成る、請求項９記載の調製品。 13．GADの65kD及び／又は67kDのアイソフォームの実質的純粋な（１又は複数種の）二量体又は（１又は複数種の）オリゴマーを含んで成るGAD調製品。 14．GADの65kD及び／又は67kDのアイソフォームの実質的に純粋なヘテロ二量体又はヘテロオリゴマーを含んで成るGAD調製品。 15．患者の血清中のGADに対する自己抗体の検出のための診断キットであって、GAD抗原と、このGAD抗原によりこの患者由来の血清サンプル中のGADに対する自己抗体の結合を検出するための手段とを含んで成り、前記抗原が増量した量の GADの65kD及び／又は67kDのアイソフォームの（１又は複数種の）二量体又は（１又は複数種の）オリゴマーを含むGAD調製品を含んで成ることを特徴とする、診断キット。 16．前記GAD抗原が、ヒト又は非ヒト哺乳動物の、天然又は組換体、及び膵臓又は脳もしくはその他のCNS，GADより選ばれる、請求項15記載の診断キット。 17．前記GAD抗原が、50重量％より多いGADの二量体又はオリゴマー形態を含む実質的に純粋なGADを含んで成る、請求項15記載の診断キット。 18．前記GAD抗原が、GADの65kD及び67kDアイソフォームの一方又は他方の（１又は複数種の）二量体もしくは（１又は複数種の）オリゴマー、及び／又は両アイソフォームの（１又は複数種の）ヘテロダイマーもしくは（１又は複数種の）ヘテロオリゴマーを含んで成る、請求項15記載の診断キット。