JPH08504560A

JPH08504560A - フミコラ・インソレンスからのセルラーゼ及び酵母におけるタンパク質のクローニング方法

Info

Publication number: JPH08504560A
Application number: JP5509731A
Authority: JP
Inventors: ダルベーゲ，ヘンリク; ペテルヘルト−ハンセン，ハンス; ラスムッセン，グレーテ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1991-12-04
Filing date: 1992-12-02
Publication date: 1996-05-21
Also published as: FI942644A0; FI942644A; WO1993011249A1; MX9206979A; EP0618974A1; BR9206866A; CA2124939A1

Abstract

(57)【要約】問題のタンパク質をコードするDNA配列についてスクリーニングする方法において、ａ）適切なベクター内で、問題の単数又は複数のタンパク質を産生する疑いのある生体からDNAライブラリをクローニングする段階；ｂ）前記ベクターを用いて適切な酵母宿主細胞を形質転換する段階；ｃ）DNAライブラリ内でクローンによりコードされる問題のタンパク質を全て発現するため適切な条件下で宿主細胞を培養する段階；及びｄ）段階ｃ）において発現されたタンパク質のあらゆる活性を決定することにより陽性クローンについてスクリーニングする段階を含む方法。セルラーゼ活性を示し、HumicolainsolensのDNAライブラリから分離された酵素。この酵素はセルロース結合ドメインを有し、線状アルキルベンゼンスルフォン酸塩の存在下でエンドセルラーゼ活性を示す。

Description

【発明の詳細な説明】フミコラ・インソレンスからのセルラーゼ及び酵母におけるタンパク質のクローニング方法発明の分野本発明は、注目のタンパク質をコードするDNA配列をスクリーニングする方法ならびに、このような注目のタンパク質を製造するための方法に関する。発明の背景組換えDNA技術の到来により、有利な特性をもつ単一のタンパク質成分を選択しそれらを大規模に製造することが可能となった。これは、天然から分離された微生物を用い、そのままの状態で使用するか又は産生段階の後分離されるタンパク質の混合物を製造する従来使用されてきた製造方法に比べ１つの改良を成すものである。しかしながら、従来のクローニング技術には、ハイブリダイセーション実験のための合成オリゴヌクレオチドプローブを調製できるようになる前に各タンパク質成分を精製しその（部分的）アミノ酸配列により特徴づけしなければならないという欠点がある。これはむしろ時間を消費するプロセスであることから、望まれるタンパク質活性を発現するクローンの選択が関与するスクリーニング方法を用いることにより、新しいタンパク質のクローニングは著しくはかどる可能性がある。このようなスクリーニング方法は以前に、バシルス（Bacillus）における原核性遺伝子産物のクローニングについて考案されてきた。US4,469,791；P．Cornel isetal，Mol，Gen，Genet 186，1982， P507〜511；I．Palva，Gene（遺伝子）19,1982，P81〜87；S．A．Ortlepp Gene 23， 1983，P267〜276；H．Yamazaki et al，J．Bacterial 156，1983，P327〜33 7；N．Tsukagoshi et al，Mol，Gen, Genet 193，1984，P58〜63；M．Sibakov及びI．Palva，Eur．J．Biochem 145，1984，P567〜572；及びJ．R．Mielens Proc，Natl，Acad Sci U．S．A．80， 1983，P5975〜5979を参照のこと。哺乳類細胞における真核遺伝子の発現クローニングに基づくスクリーニング方法が、例えば D．P．Gearing et al，The EMBOJ，8，1989，P3667〜3676；N．Harada et al，Proc．Natl，Acad Sci，USA 87，1990 P857〜861及びR．Fukunaga et al，Cell（細胞）61， 1990，P341〜350の中で記述されている。発明の要約今や、単一のタンパク質成分をコードするDNAを分離する目的で注目のタンパク質活性を発現する酵母クローンについてスクリーニングすることが可能であることが見出された。従って本発明は、注目のタンパク質をコードするDNA配列についてスクリーニングするための方法において、（ａ）適切なベクター内で、注目の１又は複数のタンパク質を産生する可能性のある生体からDNAライブラリをクローニングする段階；（ｂ）前記ベクターを用いて適切な酵母宿主細胞を形質転換する段階；（ｃ）DNAライブラリ内でクローンによりコードされる注目のタンパク質を発現するための適切な条件下で宿主細胞を培養する段階；及び（ｄ）段階（ｃ）において発現されたタンパク質のなんらかの活性を決定することにより陽性クローンについてスクリーニングする段階；を含む方法に関する。上述のとおり、バシルス（Bacillus）における原核性遺伝子の発現については以前に記述されてきた。しかしながら、発現クローニングのために考案された原核システムは、一般にバシルス（Bacillus）内での発現がむずかしい真核性遺伝子のクローニングのために作用不能である。哺乳動物内の真核性遺伝子の発現クローニングについて記述されてきたものの、哺乳類の細胞の場合よりもはるかに高い形質転換頻度を得ることが可能でしかもはるかに容易に培養できることから、宿主生物として酵母を用いることがより有利である。その上、上述の参考文献で記述された哺乳類の発現クローニングシステムがCOS細胞内の一過性発現に基づいているのに対して酵母クローンは安定している。哺乳類の系とは異なり、酵母の系は、最初のスクリーニングの後純粋クローンをもたらし、従って、哺乳類の系におけようにプール及びサブプール内でスクリーニングする必要がない。この従来の選択以外に、酵母形質転換体を選択するのにもこの系を使用することができる。本発明に従うと、驚くべきことに、酵母細胞は、スクリーニングを目的として充分である量で異種分泌シグナルを用いて細胞外で異種遺伝子を発現することができると思われることが発見された。酵母内のいくつかのタンパク質の発現クローニングが以前に記述されてきたが（G．L．McKnight及びB．L．McConaughy，Pr oc．Nat，AcadSci，USA 80 1983 P4412〜4416）、これは、必須遺伝子の補完に基づくものであり従って、突然変異をしてこれらの必須遺伝子が欠如した酵母宿主菌株に依存していることから、一般的に有用なものではなかった。本発明のスクリーニング方法では、この方法で使用すべき酵母宿主に対するこのような必要条件は全く必要でない。その上、以前に記述された方法の遺伝子産物は、本発明の方法におけるように細胞外ではなくむしろ細胞内にある。本発明のスクリーニング方法が示す利点は、まず第１に、注目のタンパク質の構造を予め知っておく必要がないということにある。このことはすなわち、新規な遺伝子を分離できる速度をひいては新規な産物を開発することのできる速度が大幅に増大できるということを意味している。その上、この方法は、多数のタンパク質活性についてのスクリーニングを可能にし、同じタイプのタンパク質をコードするいくつかの異なる遺伝子の分離という結果さえもたらしうる。もう１つの態様において、本発明は、異種宿主細胞内で注目のタンパク質を産生する方法において、本発明のスクリーニング方法により分離された注目のタンパク質をコードするDNA配列を用いて適当な異種宿主細胞を形質転換する段階、タンパク質を発現するため適切な条件下で形質転換された細胞を培養する段階及び培養から発現されたタンパク質を回収する段階を含む方法に関する。さらにもう１つの態様においては、本発明は、セルラーゼ活性を示ししかも、（ａ）酵素をコードするDNA配列がフミコラ・インソレンス（Humi-cola insolen s）のDNAライブラリから分離されたものであること、（ｂ）前記DNA配列が（配列番号：１）（配列番号：２）（配列番号：３）（配列番号：４）（配列番号：５）（配列番号：６）という部分配列のうちの少なくとも１つを含むこと（ｃ）セルロース結合ドメインを含むこと、及び（ｄ）線状アルキルベンゼンスルフオン酸塩の存在下でエンドセルラーゼ活性を示すこと、を特徴とする酵素に関する。本発明の酵素は、本発明の方法によって単離されうる。本書中、「セルロース結合ドメイン」という語は、セルロース基質に対する酵素の結合を行うことのできるアミノ酸配列を表わす。セルロース結合ドメインは、基質上のセルロース分解酵素のエンドグルカナーゼ活性にとって重要であることがわかっている（c．f．PCT／DK91／00124内の記述）。「エンドセルラーゼ活性」という話は、以下に規定する条件下でのカルボギシメチルセルロース（CMC ）ゲル内の透明化ゾーンの形成により決定されるように、セルロースをグルコース、セロビオース、トリオース及びそのタンパク質のセロオリゴ糖へと分解する酵素の能力のことを言う。PCT／DK91／00123 に記されているエンドセルラーゼとは異なり、本発明の酵素は、線状アルキルベンゼンスルフオン酸塩の存在下で実質的に変化のない安定性を示す。このことは、線状アルキルベンゼンスルフオン酸塩が洗浄剤組成物の中で一般に使用されていることからみて、重要な利点である。発明の詳細な開示本発明に従うと、DNAライブラリは好ましくは、注目の１又は複数のタンパク質を産生する可能性のある生物のmRNAから調製されるcDNAライブラリである。この要領でゲノミックライブラリをスクリーニングすることも可能であるが、少なくともいくつかの潜在的酵母宿主は、真核ゲノミックDNAを適正にスプライシングできない可能性があり、従って、スクリーニングの陽性結果は、代りにcDNAを用いることによって得られることの方が多い可能性がある。より正確な結果を確保するためには、当該方法の段階（ｄ）において分離された陽性クローンを再スクリーニング、再分離及び再クローニングに付すことが有利であるかもしれない。注目の１又は複数のタンパク質を産生する可能性ある生物は、典型的には真核生物、特に真菌である。なぜなら、真菌は、各タンパク質を当初別々に精製することにより特定のタンパク質産物をコードする遺伝子を単離する伝統的なプロセスを特に煩しいものにする多数の異なるタンパク質を産生するものであることが知られているからである。このため、同じライブラリを用いて比較的短かい時間内で多数の異なるタンパク質活性（及びそれらをコードするDNA）を同定することができることから、本発明の方法により真菌DNAライブラリをスクリーニングすることが特に有利とする。この点に関して、異なるタンパク質活性についての酵母のコロニーのスクリーニングは、各プレート上で１プレートにつき10〜50の糸状真菌に比べて多数の（約500〜1000）酵母コロニーを成長させることができるため、糸状真菌のスクリーニングよりもはるかに効率が良い。現在真菌から得られている工業的に有用な１つのタイプのタンパク質は酵素である。従って、適切な検定を用いて１又は複数の酵素活性の発現について本発明の方法により酵母クローンをスクリーニングすることが可能である。この方法によって同定できる酵素の例としては、カルボヒドラーゼ例えばエンドセルラーゼ、セロビオヒドラーゼ、β−グルカナーゼ又はβ−グルコシターゼといったセルロース分解酵素、ヘミセルラーゼ又はガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、キシロシダーセ、アラバナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ又はアミラーゼといったペクチン分解酵素；エステラーゼ例えばリパーゼといった脂肪分解酵素；プロテアーゼ；オキシドレダクターゼ例えばペルオキシダーゼ；オキシダーゼ又はラッカーゼ；又はイソメラーゼ例えばグルコースイソメラーゼがある。異なるタイプの酵素のための広範な指示薬系を、寒天平板上の酵母コロニーのスクリーニングのために使用することができる。例えば、コンゴーレッドでの染色の後カルボキシメチルセルロース内の透明化ゾーンによりエンドセルラーゼを同定することが可能である；グルカナーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼを検出するために類似の方法を使用することもできる。アズリン架橋結合したアラバンの溶解の後得られる青色ゾーンによりエンドアラバナーゼを同定することが可能である。この原則は一般的なものであり、例えばマンナナーゼ、キシラナーゼ及びセルラーゼを検出するためにも使用できる。ペクチナーゼ（ポリガラクツロナーゼ及びペクチンリアーゼ）は、第四アンモニウムイオンを用いた沈降の後のペクチン内の透明化ゾーンによって同定できる。アミラーゼは、ヨウ素での視覚化後のでんぷん内の透明化ゾーンによって同定されうる。α−ガラグトシダーゼは、ｐ−ニトロフェニル−α−ガラクトピラノシドからのｐ−ニトロフェノール（黄）の放出によって、又は、例えば１−ナフトール−α−ガラクトピラノシドからの放出されるナフトール又はナフトール誘導体をアゾ色素にカップリングすることにより検出することができる；β−ガラクトシダーゼ、α−及びβ−グリコシダーゼ、β− キシロシダーゼ及びβ−ｐ−マンノシダーゼを検出するためにも類似の方法を用いることができる。プロテアーゼの検出のためには、トリクロロ酢酸での沈降後のカゼイン内の透明化ゾーンなどの数多くの方法が利用可能である。ペルオキシダーゼ及びオキシダーゼは、過酸化水素（紫色を発生させる）の存在下でESBT（Ｎ−エチル−Ｎ−スルフォブチル−ｍ−トルイジン）との４−アミノアンチピリンの反応によって検出できる。リパーゼはトリブチリンエマルジョン内の透明化ゾーンの形成によって検出可能である。 DNAライブラリのための宿主細胞となるべく選択される酵母菌株は、従来異種D NA配列のクローニングのために用いられたあらゆる酵母菌株であってよい。従って、酵母はサッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces Cerevisiae）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces Kluyveri）、サッカロミセス・ウバルム（Saccha-romyces uvarum）又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccha-romyces pombe）といったサッカロミセス（Saccharomyces）属の種、ハンゼヌラ（Hansenula）の種、ピヒア（Pichia）の種、ヤロウイア・リポリティカ（Yarro wia Lipolvtica ）などのヤロウイア（Yarrowia）の種、又はクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）といってクルイベロミセス（Kluyveromyces ）の種の中から適切にも選択することができる。 DNAライブラリをクローニングするために用いられるベクターは、有利にも、組換えDNA法を受けることのできるあらゆるベクターであってよい。各々のベクターにおいて、ライブラリに由来するDNA配列は適切なプロモータ配列に対し作用可能に結合されていなくてはならない。プロモーターは酵母細胞内で転写活性を示すあらゆるDNA配列であってよい。酵母宿主細胞内で使用するための適切なプロモーターの例としては、酵母解糖系遺伝子（Hitzemanら、J．Biol，Chem 25 5，1980，P12073〜12080；Alber and Kawasaki，J．Mol，Appl，Gen．1，1982， P419〜434）又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Youngら、「化学製品用の微生物遺伝子工学」（Hollaenderら編）、Plenum Press，New York，1983）からのプロモーター、又はTD11（米国特許No．4,599,311）、又はADH2−4c（Russell ら、Nature 304，1983，P652〜654）プロモーターが含まれる。各々のDNAライブラリ配列は同様に、TPI1（Alber and Kawasaki，前掲）又はA DH3 （McKnight et al；前掲）ターミネーターといった適切なターミネーターに対し作用可能に結合されていてもよい。ベクターにはさらに、酵母細胞内でベクターが複製できるようにするDNA配列が含まれていてよい。このような配列の一例としては、酵母プラスミド２μ複製遺伝子REP1〜3及び複製起点がある。ベクターが酵母／（大腸菌）シャットルベクターである場合、これには、（大腸菌）内で機能的なものである複製起点領域も含まれる。ベクターは同様に、その産物がURA3といったような宿主細胞内での欠損を補完する遺伝子、又は例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリンなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子、又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharom-yces，pombe）TPI遺伝子（P．R． Russell，Gene40，1985，P125〜130で記述されているもの）といった選択可能な標識も含んでいてもよい。 DNAライブラリ配列、プロモーター及びターミネーターをそれぞれ連結するため、及び複製に必要な情報を含む適切なベクター内にそれらを導入するために用いられる手順は、当業者にとっては周知のものである（例えばSambrookら、「分子クローニング；実験室マニュアル」、Cold Spring Harbor，New York，1989参照）、酵母細胞の形質転換は、例えば原形質体の形成とそれに続く形質転換又はそれ自体既知の要領でのLiAC法にて行なうことができる。注目のタンパク質をコードするDNAを上述のスクリーニング方法により単離した後、このタンパク質を製造する本発明の方法においては：単離されたDNA配列で形質転換された異種宿主細胞は、糸状真菌例えばアスペルギルス（Aspergillus）、トリコデルマ（Tri choderma）：ペニシリウム（Penicillium）、フザリウム（Fusarium）又はフミコーラ（Humicola）属といったヒポミセーテス（Hyphomycetes）を含む不完全菌類、藻菌類（Phycomycetes）、接合菌類（Zygomycetes）：子のう菌類（Ascomyc etes）、担子菌（Basidiomycetes）類に属する真菌の一菌株であることが考えられる。糸状真菌宿主生体は有利には、組換えタンパク質を産生するため宿主として以前に使用されたもの例えばアスペルギルス・ニガー（A．Niger，）、アスペルギルス・ニドランス（A.nidulans）又はアスペルギルス・オリゼー（A.oryzae）といったアスペルギルス（Aspergillus）の種の菌株でありうる。組換え型タンパク質の産生におけるＡ．オリゼー（A．oryzae)の使用については、例えばEP233, 023の中で記述されている。特に、宿主生体がＡ．オリゼー（A．oryzae）である場合、本発明の方法において用いるための好ましいプロモーターは、Ａ．オリゼー（A．oryzae）中で強い転写活性を示すことからＡ．オリゼー（A．oryzae）TAKAアミラーゼプロモーターである。TAKAアミラーゼプロモーターの配列は、EP238023から明らかである。終結及びポリアデニル化配列は、適切にはプロモーターと同じ供給源に由来する。真菌宿主細胞は形質転換するのに用いられる技術は、適切にはEP238,023に記述されているとおりでありうる。形質転換された宿主細胞を培養するのに用いられる培地は、アスペルギルス（ Aspergillus）の細胞を増殖させるのに適切な従来のいかなる培地であってもよい。宿主細胞から分泌された成熟タンパク質は、有利には、遠心分解又はろ過により培地から細胞を分離すること、及び硫酸アンモニウムなどの塩を用いて培地のタンパク様成分を沈降させその後イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィなどのクロマトグラフィ手順に付すことを含む周知の手順によって、培地から回収される。本発明に従った好ましいエンドセルラーゼ酵素は、その粗抽出液（15μｌ）を 0.15％の線状アルキルベンゼンスルフオン酸塩で希釈し、0.15％の線状アルキルスルフオン酸塩と混合した50mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH７中１％のカルボキシメチルセルロースを含む２％のアガロースゲルに付加したとき、18時間のインキュベーションの後このアガロースゲル内に透明化ゾーンが形成され、抽出液中の酵素の濃度が前記条件下でカルボキシメチルセルラーゼゲル中で（線状アルキルベンゼンスルフオン酸塩無しで）少なくとも10mmの透明化ゾーンが形成されるようなものであることを条件として、この透明化ゾーンが、いかなる線状アルキルベンゼンスルフオン酸塩も含まない類似のカルボキシルメチルセルロースゲル中で形成される透明化ゾーンに等しい（３mm少ない）ものである酵素である。酵素をコードするDNA配列は例えば、ブタペスト条約の規定に従ってDeutsche Sammlung von Mikroorganismenに1981年10月１日に寄託された例えばDSM 1800菌株といったフミコラ・インソレンス（Humicola insolens）のcDN Aライブラリをスクリーニングし適当な酵素活性（すなわち上述のようなエンドセルラーゼ活性）を発現するクローンについす選択することにより単離されうる。適切なDNA配列は、このとき、例えば例１に記述されているような標準的手順によってクローンから分離できる。もう１つの態様においては、本発明は、本発明の酵素を含む洗浄剤添加剤に関する。洗浄剤添加剤は、適切には、粉化しない顆粒の、安定化した液体の、又は保護された酵素の形をしていてよい。粉化しない顆粒は米国特許4,106,991及び4 ,661452（両者ともNovo Ind-ustri Ａ／Ｓに対するもの）に従って製造でき、又は任意には当該技術分野における既知の方法によりコーティングすることができる。液体の酵素調製物は、例えば、プロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸といった多価アルコールを立証済の方法に従って付加することにより安定化されうる。その他の酵素安定化剤は、当該技術分野において周知のものである。保護された酵素は、EP238216に開示されている方法に従って調製することができる。洗浄剤添加剤にはさらに、従来洗浄剤添加剤の中に含まれているプロテアーゼ、リパーゼ、ぺルオキシダーゼ又はアミラーゼといったその他の単数又は複数の酵素が含まれうるということもわかるだろう。さらにもう１つの態様においては、本発明は、本発明の酵素を含む洗浄剤組成物にも関する。本発明の洗浄剤組成物は、例えば粉末、顆粒又は液体といった便利なあらゆる形態のものであってよい。液体洗浄剤は、水性で標準的には最高90 ％の水と０〜20％の有機溶剤を含んでいる。洗浄剤組成物は、陰イオン、非イオン、陽イオン、両性のものであってもよいし、或いはこれらのタイプの混合物であっもよい界面活性剤を含む。洗浄剤は、線状アルキルベンゼンスルフオン酸塩（LAS）、アルファーオレフィンスルフオン酸塩（AOS）、アルキル硫酸塩（AS）、アルコールエトキシ硫酸塩（AES）又は石けんといった陰イオン界面活性剤を通常０〜50％含むことになる。同様に、これには、ノニルフェノールエトキシレ又はアルコールエトキシレートといった非イオン界面活性剤が０〜40％含まれいてもよい。さらに、これにはポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤が含まれていてもよい。（例えばW092／06154に記述されているとおり）。洗浄剤組成物は付加的に、アミラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、又はプロテアーゼといった単数又は複数のその他の酵素を含んでいてもよい。 pH（洗浄剤水溶液中で測定したもの）は、通常中性又はアルカリ性、例えば７〜11となる。洗浄剤は、ゼオライト、リン酸塩、ホスフオン酸塩、クエン酸塩、 NTA、EDTA又はDTPA、アルケニル無水こはく酸又はケイ酸塩などの洗浄剤ビルダーを１〜40％含んでいてもよいし、或いはビルダーで増進されていなくてもよい（すなわち基本的に洗浄剤ビルダーを含まない）。洗浄剤には又、その他の従来の洗浄剤成分例えば布軟化剤、起泡増進剤、漂白剤例えば過ホウ酸塩、過炭酸塩、テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）、又はノナノイルオキシベンゼンスルフオン酸塩（NOBS）、腐食防止剤、土壌懸濁剤、沈殿防止剤、土壌再堆積防止剤、酵素用安定化剤、気泡抑制剤、染料、殺菌剤、蛍光漂白剤又は香料が含まれていてよい。本発明の範囲内に入る洗浄剤組成物の特定の態様には、以下のものが含まれる：ａ）リン酸塩ビルダー、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、ケイ酸塩、望ましい使用中のpHに調整するためのアルカリ及び中性無機塩を含む粉末洗浄剤として処方された洗浄剤組成物。ｂ）ゼオライトビルダー、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、アクリル又は同等の重合体、ケイ酸塩、望ましい使用中のpHに調整するためのアルカリ及び中性無機塩を含む粉末洗浄剤として処方された洗浄剤組成物。ｃ）陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、湿潤剤、有機酸、苛性アルカリを含み、使用中のpHが７と10.5の間の値に調整された水性液体洗浄剤として処方された洗浄剤組成物。ｄ）基本的に線状アルコキシル化第一アルコールから成る非イオン液体界面活性剤、リン酸塩ビルダー、苛性アルカリを含み、使用中のpHが約７〜10.5の間の値に調整されている非水性液体洗浄剤として処方された洗浄剤組成物。ｅ）陰イオン界面活性剤及び非イオン界面活性剤、低い又は実質的にゼロの中性無機塩、リン酸塩ビルダー及びケイ酸ナトリウムを含む、かさ密度が少なくとも 600ｇ／ｌの顆粒の形をした粉末洗浄剤として処方された洗浄剤組成物。ｆ）陰イオン界面活性剤及び非イオン界面活性剤、低い又は実質的にゼロの中性無機塩、ゼオライトビルダー及びケイ酸ナトリウムを含む少なくとも600ｇ／ｌのかさ密度をもつ顆粒の形をした粉末洗浄剤として処方された洗浄剤組成物。ｇ）陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、アクリル重合体、脂肪酸石けん、炭酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、粘土粒子、及びケイ酸ナトリウムを含む粉末洗浄剤として処方された洗浄剤組成物。ｈ）５〜65重量％の界面活性剤、０〜50重量％のビルダー及び０〜30重量％の電解液を含む液体コンパクト洗浄剤。これらの成分の他に、洗浄剤組成物ａ）−ｈ）は本発明のセルラーゼ及び任意には上述のような単数又は複数のその他の酵素を含んでいる。本発明の酵素を用いて得ることのできる軟化、土壌除去及び色清澄化効果は一般に、洗浄溶液中の酵素の濃度として１リットルにつき0.0001〜100好ましくは0 .0005〜60、最も好ましくは0.01〜20mgの酵素タンパク質を必要とする。本発明の洗浄剤組成物は標準的に、洗浄溶液中で１リットルにつぎ0.5〜20gの濃度で利用される。一般に、洗浄剤組成物の0.1〜５％Ｗ／Ｗ又は好ましくは0.2〜２％の量で洗浄剤添加剤を付加することが最も有利である。図面の簡単な説明図１は、プラスミドpYHD17の地図であり、ここで「TPIプロモーター」はＳ．セルビシェー（S．cerevisiae）の三炭糖リン酸イソメラーゼプロモーターを示し、「ターミネーター」はＳ．セルビシェー（S．cerevisiae）の三炭糖リン酸イソメラーゼターミネーターを、「Amp」は遺伝子媒介アンピシリン耐性を、「２μori」は酵母プラスミドの２μの複製起点を、「URA3」は、宿主細胞菌株内のウラシル欠失を補完する選択マーカーをコードする遺伝子に表わしている；及び図２は、プラスミドpHD414の地図であり、ここで「AMGターミネーター」はＡ．ニガー（A．niger）グルコアミラーゼターミネーターを、及び「TAKAプロモーター」はＡ．オリゼー（A．oryzae）TAKAアミラーゼプロモーターを表わす。本発明について、いかなる形であれ請求の範囲にある本発明の範囲を制限する意味をもたない以下の例において、さらに説明する。実施例材料と方法ドナー生物、mRNAは、以下の生物から単離された；すなわち充分な通気を確保するため撹伴を伴ってセルロースの豊富な発酵培地の中で増殖させられたＨ．インソレンス（H．insolens），DSM1800。発現プラスミドの構築：市販のプラスミドpYESII（Invitrogen）をSpeIで切断し、クレノウDNAポリメラーゼtdNTPを用いてフィルインし、ClaIで切断した。DN Aをアガロースゲル上でサイズ分画し、約2000bpのフラグメントを電気溶出により精製した。同じプラスミドをClaI／PunIIで切断し、約3400bpのフラグメントを電気溶出により精製した。酵母TPIプロモーターを含む平滑末端のSphI／EcoRI フラグメントに、このフラグメントを連結した。このフラグメントを、Ｓ．セルビシェー（S．cerevisiae）からのTPIプロモーター（T．Albers及びG．Kawasaki のJ．Mol，Appl，Genet 1，1982 P419〜434参照）がわずかに修正されたプラスミドから単離した。内部SphI部位のコアを構成する４bpを欠失させることによりこの部位を除去した。さらに、プロモーターの上流の冗長な配列をBaIIエキソヌクレアーゼ処理とそれに続くSphIリンカーの付加により除去した。最終的に、位置−10でEcoRエリンカーを付加した。これらの修正の後、プロモーターをSphI− EcoRIフラグメント内に含み入れる。もとのプロモーターに比較してその効率は修正によって影響を受けていないように思われる。得られるプラスミドpYHD17は図１に示されている。 mRNAの単離：約７ｇの菌糸から全RNAを分離した。菌糸を液体窒素内で凍結し、小麦粉のコンシステンシーになるまで、１ｇの珪砂を伴う乳ばち内で粉砕した。RNAをチオシアン酸グアニジウムで抽出し、基本的にSambrook et al，1989，前掲中に記述されている通りにCaClを用いて遠心分離した。Poly A RNAを、オリゴdTセルロース上のクロマトグラフィにより全RNAから単離した。 cDNA合成：InvitrogenのcDNA合成キットを用いてメーカーの仕様書に従ってcD NA合成を行なった。BstxIリンカー（Invitrogen）を付加することによりDNAを発現ベクターに適合させ、アガロースゲル上でサイズ分画した。５〜600bpより大きいDNAのみをライブラリー構築において用いた。適合させたcDNAをBstxIで切断した適切なベクターへと連結した。試験的連結（ライブラリのサイズを決定するため）の後、ライブラリを50の寒天平板上に平板固定した。約500〜5000の個々のクローン（ライブラリサイズによって異なる）を含む各々のプレートに対し、３mlの培地を付加した。細菌を削り取り、１mlのグリセロールを付加し，50のプールとして−80℃で保管した。DNA分離のため残りの２mlを使用した。DNAの量が望ましい数の酵母形質転換体を与えるのに不充分なものであった場合（以下参照）、一晩中増殖させた50μ１の−80℃の保存細菌を接種した500mlの培地（TB）から大規模DNAを調製した。酵母ライブラリの構築：１又は複数のプールからのDNAを以下に記述したとおり酵母へと形質転換させた。酵母内で全ての細菌クローンがテストされたことを確認するため、もとのプール内の細菌クローンの数よりも５培多い数の酵母形質転換体を限界として設定した。酵母の形質転換：使用された酵母菌株はyNG231であった（MATalpha，leu2，ur a352，his4−539，pep4−delta 1，cirt）。10mlのYPD中で一晩30℃で１つのコロニーを増殖させた（この培養は５℃で数日間保存できる）。この培養を10μｌ、30μｌ及び60μｌ、100mlのYPDを含む３つの振とうフラスコに付加し、振とうしながら30℃で一晩インキュベートした。0.3〜0.4に最も近いOD₆₀₀をもつ培養物を選択した。Beckman遠心分離機内で50ml入り管の中に細胞を収穫し（速度６、10分間）、細胞を２×５mlのH₂ O中で再懸濁させ、上述のとおり遠心分解し、0.1ＭのLiAc、10mMのトリス−Cl、１mMのEDTA，pH7.5を含む５mlの緩衝液中に再懸濁し、再度遠心分離した。細胞を上述の緩衝液500μｌの中で再懸濁し、30℃で60分間インキュベートした。250 μｇの担体DNA（無菌サケ精子DNA10mg／ml）を付加し、100μｌのアリコートを調製した。形質転換すべきDNA（約５μｇを100μｌのアリコートに付加し、穏やかに混合し、30℃で30分間インキュベートした。700μｌの40％PEG4000、0.1ＭのLiAC、10mMのトリス−Cl，１mMのEDTA，pH7.5を付加し、30℃で60分間インキュベーションを続行した。42℃で５分間、形質転換混合物を熱ショックに付し、マイクロ遠心分離機内で短かく回転させ、100〜200μｌのH₂O内で再懸濁させ、ウラシル無しでSCプレート上で平板固定し、その後３日間30℃でインキュベートした。担体DNAの調製；100mgのサケ精子DNAを計り分け、10mlの10mMトリス−Cl，１m MのEDTA、pH7.5（TE）の中で一晩溶解させた。次に溶液を、粘性でなくなるまで、氷水内でプラスチック容器の中で音波処理した。次に、溶液をフェノールで抽出し、EtOHで沈降させ、ペレットを洗い５mlのTE中で再懸濁させた。懸濁液をEt OHで沈降させ、ペレットを洗い５mlのTE内で再懸濁させた。OD₂₆₀を測定し、懸濁液を、10mg／mlになるまでTEで希釈した。培地： YPD：10ｇの酵母抽出液、20ｇのペプトン、H₂O810mlまで加圧蒸気滅菌し、90m lの20％グルコース（無菌、ろ過済み）を付加。 10×基礎塩：66.8ｇの酵母窒素原基礎培地、100ｇのコハク酸160ｇのNaCl、H₂ O 1000mlまで、無菌、ろ過済み。 SC−URA ：90mlの10×基礎塩、22.5mlの20％カザミノ酸、９mlの１％トリプトファン、H₂O806mlまで、加圧蒸気滅菌、3.6mlの５％トレニチン及び90mlの20％のグルコース付加。 SC−H寒天：アミノ酸無しの7.5ｇ／の酵母窒素原基礎培地、11.3ｇ／ｌのコハク酸、6.8ｇ／ｌのNaOH、ビタミン無しの5.6ｇ／ｌのカザミノ酸、0.1ｇ／ｌのトリプトファン及び20ｇ／ｌの寒天（Bacto）、121℃で20分間高圧蒸気滅菌、高圧蒸気滅菌の後、450mlの寒天あたり55mlの22％ガラクトース溶液及び1.8mlの５％トレオニン溶液を付加した。 SC−Ｈ肉汁：アミノ酸無しの7.5g／ｌの酵母窒素原基礎培地。11.3ｇ／ｌのコハク酸6.8ｇ／ｌのNaOH、ビタミン無しの5.6ｇ／ｌのカザミノ酸、0.1ｇ／ｌのトリプトファン。20分間121℃で高圧蒸気滅菌、高圧蒸気滅菌の後、100mlの培地あたり、10mlの30％ガラクトース溶液、５mlの30％のグルコース溶液及び0.4ml の５％のトレオニ溶液を付加した。 YNB−１寒天：3.3ｇ／ｌのKH₂PO₄、16.7ｇ／ｌの寒天、pHは７に調整。121℃ で20分間高圧蒸気滅菌。高圧蒸気滅菌の後、450mlの寒天あたり、25mlのアミノ酸無しの13.6％酵母窒素原基礎培地、25mlの40％のグルコース溶液、1.5mlの１％Ｌ−ロイシン溶液及び1.5mlの１％のヒスチジン溶液を付加した。 YNB−１肉汁：YNB−１寒天と同じ組成。但し寒天は含まず。 CMCオーバーレイヤーゲル：トリスーリンゴ酸塩緩衝液中１％のカルボキシメチルセルロース、１％のアガロース、pH7％。ゲルを沸とうさせ、次に55℃まで冷却してからオーバーレイヤーを寒天平板上に注ぎ込んだ。エンバクスペルト小麦キシレンオーバーレイヤーゲル、トリス−リンゴ酸塩緩衝液中１％のエンバクスペルト小麦キシレイ（Sigma Chemical Company）、１％のアガロース、pH7。ゲルを沸とうさせ、次にオーバーレイヤーを寒天平板上に注ぎ込む前に55℃まで冷却させた。 Aspergillus発現ベクターの構築：ベクターpHD414はプラスミド P775（EP2380 23中に記述されている）の誘導体である。このプラスミドとは対照的に、pHD414 は、プロモーターとターミネーターの間に一連のユニーク制限部位を有している。プラスミドは、ターミネーターの３′未満の約200bpの長さのフラグメント（望ましくないRE部位を含む）の除去及びそれに続く、同様に望ましくない部位を含むプロモーターの５′未満での約250bpの長さのフラグメントの除去によって構築された。200bpの領域は、NarI（pUCベクター内に位置づけられたもの）及び XbaI（ターミネーターに対してちょうど３′のところ）での分割、それに続く生成された末端におけるクレノウDNAポリメラーゼ＋dNTPによるフィルイン、ゲル上のベクターフラグメントの精製及びベクターフラグメントの再連結によって除去された。StuZ（プロモーターの５′末端内にある）及びPvuII（pUCベクター内）でpHD4を切断し、ゲル上で分画し、再連結した。プラスミドpHD414は、図２に示されている。例１ 50のプール内の約300000個の個々のクローンから成るＨ．インソレンス（H．i nsolens）からのライブラリを構築した。ライブラリからの20の個々のクローンからDNAを分離し、cDNA挿入のための分析に付した。挿入頻度は90％より大きいことがわかり、平均挿入サイズは約1400 bpであった。フミコラ（Humicola）ライブラリからの10のプールからDNAを分離した（もとのプレートから２ml）。cDNAインサートを切除するため制限酵素を用いてアリュートを消化し、43KDのセルラーゼcDNAプローブ（43KD 酵素はPCT／DK91／00123内に開示されている）及びCBH2のcDNAプローブ（酵素は PCT／DK91／00124に開示されている）を用いてサザンブロットにより分析した。フミコラ（Humicola）ライブラリからの10のプール内で低ストリンジェンシー洗浄（２×SSC，65℃）の後、いくつかのバンドが43KDセルラーゼプローブとハイブリッド形成することがわかった。より高いストリンジェンシー（0.1×SSC，75 ℃）では43KDセルラーゼの予想サイズに相応する１つのバンドが、10のプールのうち５つにおいて検出された。CBH2プローブでも類似の結果が得られた。ここでは、10のプールのうち10が、CBH2の予想サイズに相応するバンドを有することがわかった。さらに、４つのプールがより高い分子量をもつバンドを含んでいた。これらのバンドはストリンジェント条件下でされ見られ、このことはライブラリが適切に高い品質ものであることを示していた。フミコラ（Humicola）ライブラリからのDNA、プール１〜10を酵母内に形質転換させ、20〜25,000コロニーを含むプレートを各プールから得た。コロニーを削り取り、−80℃でグリセロール内に保管した。ライブラリからの酵母細胞を、合計約400,000コロニーとなるまでYNB寒天上に伸展させた。１プレートあたりのコロニー数は、50〜500まで変動した。４日又は５日の成長の後、寒天平板を２組のSC−H寒天平板上にレプリカ平板固定した。次に30℃で２−４日間これらのプレートをインキュベートしてから、２組の寒天平板にセルラーゼ活性の検出のためにCMCインジケーターゲルを上に置き、キシラーゼ及びセルラーゼの検出のためにエンバクスペルト小麦キシランインジケーターゲルを上に置いた。40℃で一晩インキュベートした後、酵素反応をコンゴーレットで視覚化した。10〜15mlのコンゴーレットの0.1％溶液をオーバーレイヤー上に注ぎ込み、10〜20分後に除去した。次に、２ＭのNaClを10〜15ml上に注ぎ込むことにより、プレートを１回か２回洗った。 NaCl溶液を15〜25分後に除去した。赤色バックグラウンド上の無色の又はうすい赤色透明化ゾーンを伴うコロニーとして、CMCオーバーレイヤーを用いてプレート上にセルラーゼ陽性コロニーが同定された。赤色バックグラウンド上の無色の又はうすい赤色の透明化ゾーンとしてエンバクスペルト小麦キシランオーバーレイヤーを用いてキシラナーゼ陽性コロニーがプレート上に同定された。セルラーゼ陽性コロニーも同様に、赤色バックグラウンド上のうすい赤色又は青色の透明化ゾーンとして、エンバクスペルト小麦キシランオーバーレイヤーを用いてプレート上に同定された。酵素陽性コロニーからの細胞を、寒天上の単一のコロニー分離のために伸展させ、同定されたセルラーゼ又はキシラーゼ産生コロニーの各々について酵素産生単一コロニーを選択した。 133のセルラーゼ産生コロニーと147のキシラーゼ産生コロニーの各々を分離した。こられのコロニーのいくつかを50mlのガラス製試験管内で20mlのYNB−１肉汁に接種した。試験管を30℃で２日間振とうさせた。3000rpm、10分間の遠心分離により細胞を収穫した。１mlの0.9Ｍのソルビトール、0.1ＭのEDTA、pH7.5の中に細胞を再懸濁させた。ペレットをEppendort管に移送し、全速力で30秒間回転させた。細胞を0.4mlの 0.9Ｍのソルビトール、0.1ＭのEDTA、14mMのβ-メルカプトエタノール中に再懸濁させた。100μｌの２mg／mlチモラーゼを付加し、30分間37℃で懸濁液をインキュベートし、30秒間回転させた。0.4mlのTE内でペレット（スフェロプラスト）を再懸濁させた。90μｌの（1.5mlの0.5Ｍ EDTA pH．8.0、0.6mlの２Ｍトリス−Cl pH8.0、0.6ml 10％SDS）を付加し、65℃で30 分間懸濁液をインキュベートした。80μｌの５ＭKOAcを付加し、少なくとも60分間氷上で懸濁液をインキュベートさせ、15分間全速力で回転させた。上清を新しい管に移し、この管をEtoHで充てんし（室温）、ひきつづき穏やかではあるが徹底的に混合し30秒間回転させた。ペレットを低温の70％ETOHで洗浄し、30秒間回転させ、室温で乾燥させた。ペレットを50μｌのTEで再懸濁させ、15分間回転させた。上清を新しい管へ移した。25μｌの10mg／mlのRNアーゼを付加し、その後 30分間37℃でインキュベートし、穏やかに混合しながら、500μｌのイソプロパノールを付加した。混合物を30秒間回転させ、上清を除去した。ペレットを低温 96％EtOHで洗い、室温で乾燥させた。最終濃度約100μｌ／mlとなるまで50μｌの水の中にDNAを溶解させた。標準的な手順によりDNAを大腸菌（E．coli）へ形質転換させた。各々の形質転換から２つの大腸菌（E．coli）コロニーを分離し、制限酵素HindIII及びXbaIを用いて分析し、これらの制限酵素がDNAインサートを切除した。これらのクローンの１つからのDNAをＳ．セルビシェー（S．cerevisiae）菌株JG169に形質転換させ（MAT α；ura3−52；leu2−3，112；his3−D200；pep4−113；prcl：HIS3 ；prbl：LEU2）、酵素活性について再スクリーニングした。陽性クローンのいくつかのDNA配列を部分的に決定した。部分的なDNA配列は、配列表の配列番号：７〜15に示されている。DNA配列に基づいて、クローンを以下のとおりに分類した。アスペルギルス（Aspergillus）内で遺伝子を発現させるためには、cDNAインサートを、各族の単数又は複数の代表から分離し、ベクタ−pHD414にクローニングさせ、このベクターを以下の一般的手順に従ってＡ．オリゼー（A．oryzae）又はＡ．ニガー（A．niger）内に転質転換させる。アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzer）又はアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の形質転換（一般的手順） 100mlのYPD（Shermanら、酵素遺伝学諸法、Cold Spring Harkor Laboratory， 1981）にＡ．オリゼー（A．oryzae）又はＡ．ニガー（A．niger）の胞子を接種し、撹伴しながら約２日間37℃でインキュベートする。ミラクロスを通してのろ過により菌糸体を収穫し、200mlの0.6Ｍ MgSO₄で洗う。菌糸体を15mlの1.2Ｍ MgSO₄、10mMのNaH₂PO₄、pH＝5.8内で懸濁させる。氷上で懸濁液を冷却させ、５分後に、1mlの12mg／ml Ｂ５Ａ（SigmaH 25型）を付加し、顕微鏡で検査した試料中に多数の原形質体が見えるまで37℃で1.5〜2.5時間穏やかに撹伴しながらインキュベーションを続行させる。ミラクロスを通して懸濁液をろ過し、ろ液を無菌管へ移し、５mlの0.6Ｍソルビトール、100mMのトリス−HCl、pH＝7.0を上に置く。100ｇで15分間遠心分離を行ない、MgSO₄クッションの頂部から原形質体を収集する。原形質体懸濁液に対し、２体積のSTC（1.2Ｍのソルビトール、10mMのトリス−HCl、pH＝7.5、10mM C aCl₂）を、原形質体懸濁液に付加し、1000gで５分間混合物を遠心分離する。原形質体ペレットを３mlのSTC中に再懸濁させ、再度ペレット化する。これをくり返す。最終的に0.2〜１mlのSTC中に原形質体を再懸濁させる。 100μｌの原形質体懸濁液を、10μｌのSTC中の５〜25μｇの適切なDNAと混合させる。原形質をp3SR2（Ａ．ニドランス（A．nid-ulans）andＳ遺伝子を支持するプラスミド）と混合する。混合物を25分間室温に放置する。0.2mlの60％のPEG 4000（BDH29576）、10mMのCaCl₂及び10mMのトリス−HCl、pH＝7.5を付加し、入念に混合し（２度）最終的に0.85mlの同じ溶液を付加し入念に混合する。混合物を25分間室温に放置し、2500ｇで15分間回転させ、２mlの1.2Ｍソルビトール内でペレットを再懸濁させる。もう一度遠心沈降させた後、原形質体を適切なプレート上に伸展させる。原形質体を1.0Ｍのスクロース、pH＝7.0、窒素供給源としての10mM のアセトアミド及びバックグラウンド成長を阻害するための20mMのCsClを含む最小プレート（Cove Biochem，Biophys Acta113（1966）51〜56）上に伸展させる。37℃で４〜７日間インキュベートした後、胞子を採取し、単一のコロニーになるように伸展させる。この手順を反復し、第２の再分離後、単一のコロニーの胞子を規定の形質転換体として保管する。例２セルラーゼ４型のクローンＣ46及びＣ51及び43KDのセルラーゼ対照クローン（〔PCT／DK91／00123に記述されたとおりに分離された〕43KDのセルラーゼをコードするDNA配列を支持するpYHD17を用いて酵母菌株JG169を形質転換することによって得られたもの）を、15mlのYNB−１肉汁を伴う100mlの試験管の中で接種した。２日間30℃で管を撹伴した。次に、100mlのSC−Ｈを肉汁を含む振とうフラスコのための種材料として、各管からの５mlの肉汁を使用した。30℃で４日間振とうフラスコの撹伴した。遠心分離により20mlの肉汁からの細胞を収集し、１〜２ mlの0.1Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液pH7及び3.3ｇのガラス球（直径420〜500μ ｍ）と10ml入りのガラス製試験管の中で混合した。細胞粗抽出液を、IKA vibrax VXR（IKA Labortechnik）から入手可能）を用いて、約８分間の撹伴後に収集した。酵母クローンＣ46，Ｃ51及び43KDからの細胞粗抽出液のセルラーゼ活性を、CM Cを含むゲル内で形成された透明化ゾーンのサイズにより異なる条件下で測定した。 CMCゲル：上述のとおりのCMCオーバーレイヤーゲル。 CMC LAS ゲル：50mMのリン酸ナトリウム緩衝液中の１％のCMC、pH7。沸とうさせ0.12％のLAS−体積と混合。ゲル内の４mm（直径）の穴に15μｌの細胞粗抽出液を付加することによりセルラーゼ活性を測定した。CMC LAS ゲルへの付加の前に0.12％のLAS １体積で、又はCMCゲルへの付加前に水１体積で、細胞粗抽出液を希釈させた。次に、上述のとおりコンゴーレッドでの染色により40℃で18時間のインキュベーション後、透明化ゾーンを視覚化した。以下の表に結果を示す。表からＣ46／Ｃ51により産生された酵素はLAS耐性をもつものと思われる。配列表（１）一般情報（ｉ）出願人（Ａ）名称：ノボノルディスクＡ／Ｓ（Ｂ）町：ノボアレ（Ｃ）市：バグスバード（Ｅ）国：デンマーク（Ｆ）郵便番号（ZIP）：KD−2880 （Ｇ）電話番号：＋45 4444 8888 （Ｈ）テレファックス：＋45 4449 3256 （Ｉ）テレックス：37304 （ii）発明の名称：酵母における蛋白質のクローニング方法（iii）配列の数：15 （iv）コンピューター11−ダブルフォーム：（Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：IBM PCコンパーティブル（Ｃ）オペレーティングシステム：PC-DOS／MS-DOS （Ｄ）ソフトウエアー：Patent In Release ＃1.0 version ＃1.25 EPO （２）配列番号：１の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：93塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：cDNA （vi）由来：（Ａ）生物：フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）（xi）配列の記載：配列番号：１：（２）配列番号：２の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：92塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：cDNA （vi）由来：（Ａ）生物：フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）（xi）配列の記載：配列番号：２：（２）配列番号：３の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：132塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：cDNA （vi）由来：（Ａ）生物：フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）（xi）配列の記載：配列番号：３：（２）配列番号：４の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：69塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：cDNA （vi）由来：（Ａ）生物：フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）（xi）配列の記載：配列番号：４：（２）配列番号：５の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：120塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：cDNA （vi）由来：（Ａ）生物：フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）（xi）配列の記載：配列番号：５：（２）配列番号：６の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：120塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：cDNA （vi）由来：（Ａ）生物：フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）（xi）配列の記載：配列番号：６：（２）配列番号：７の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：1027塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：cDNA （vi）由来：（Ａ）生物：フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）（xi）配列の記載：配列番号：７：（２）配列番号：８の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：872塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：cDNA （vi）由来：（Ａ）生物：フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）（xi）配列の記載：配列番号：８：（２）配列番号：９の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：368塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：cDNA （vi）由来：（Ａ）生物：フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）（xi）配列の記載：配列番号：９：（２）配列番号：10の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：720塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：cDNA （vi）由来：（Ａ）生物：フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）（xi）配列の記載：配列番号：10：（２）配列番号：11の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：724塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：cDNA （vi）由来：（Ａ）生物：フミコラ・インソレンス（Humicola 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:685）Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＢＲ，ＣＡ，ＦＩ，ＪＰ，ＫＲ，ＵＳ (72)発明者ラスムッセン，グレーテデンマーク国、デーコー―2400 ケーベンハウンエンベー，エステー．テーベー．, テクラバイ 15

Claims

【特許請求の範囲】１．注目のタンパク質をコードするDNA配列についてスクリーニングするための方法において、（ａ）適切なベクター内で、注目の１又は複数のタンパク質を産生する可能性のある生物からDNAライブラリをクローニングする段階、（ｂ）前記ベクターを用いて適切な酵母宿主細胞を形質転換する段階；（ｃ）DNAライブラリ内でクローンによりコードされる注目のタンパク質を全て発現するため適切な条件下で宿主細胞を培養する段階；及び、（ｄ）段階（ｃ）において発現されたタンパク質のあらゆる活性を決定することにより陽性クローンについてスクリーニングする段階を含む方法。２．DNAライブラリが、注目の１又は複数のタンパク質を産生する可能性のある生物のmRNAから調製されるcDNAライブラリである、請求項１に記載の方法。３．段階（ｄ）で単離された陽性クローンが、再スクリーニング、再分離及び再クローニングを受ける、請求項１又は２に記載の方法。４．注目の１又は複数のタンパク質を産生する可能性のある生物が真核生物である、請求項１又は２に記載の方法。５．真核生物が真菌である、請求項４に記載の方法。６．真核生物が植物である、請求項４に記載の方法。７．注目のタンパク質が酵素である、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。８．酵母宿主細胞がサッカロミセス・セレビシエー（Saccharo-myces cerevis iae ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharo- myces pombe）、ハンゼヌラ（Hansenula）、ピヒア（Pichia）、ヤラウィア・リポリティカ（Yarrawia lipolytica）又はクルイレオミセス・ラクチス（Kluyrer omyces lactis）の菌株である、請求項１に記載の方法。９．異種宿主細胞内で注目のタンパク質を産生する方法において、請求項１に記載の方法によって単離された注目のタンパク質をコードするDNA配列を用いて適切な異種宿主細胞を形質転換する段階、タンパク質を発現するため適切な条件下で形質転換された細胞を培養する段階及び培養から発現されたタンパク質を回収する段階を含む方法。 10．注目のタンパク質をコードするDNA配列が請求項３に記載の方法によって分離されたものである、請求項９に記載の方法。 11．注目のタンパク質が酵素である、請求項９又は10に記載の方法。 12．宿主細胞がアスペルギルス（Aspergillus）の菌株例えばアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）又はアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）の菌株である、請求項９乃至11のいずれか１項に記載の方法。 13．セルラーゼ活性を示し、（ａ）酵素をコードずるDNA配列がフミコラ・インソレンス（Humi-cola insolen s ）のDNAライブラリから単離されたものであること、（ｂ）前記DNA配列が、（配列番号：１）（配列番号：２）（配列番号：３）（配列番号：４）（配列番号：５）（配列番号：６）という部分配列のうちの少なくとも１つを含むこと、（ｃ）セルロース結合ドメインを含むこと、及び（ｄ）線状アルキルベンゼンスルフォン酸塩の存在下でエンドセルラーゼ活性を示すことを特徴とする酵素。 14．その粗抽出液（１５μｌ）を0.15％の線状アルキルベンゼンスルフォン酸塩で希釈し、0.15％の線状アルキルスルフォン酸塩と混合した50mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH７中１％のカルボキシメチルセルロースを含む２％のアガロースゲルに付加したとき、18時間のインキュベーションの後このアガロースゲル内に透明化ゾーンが形成され、抽出液中の酵素の濃度が前記条件下でカルボキシメチルセルロースゲル中で（線状アルキルベンゼンスルフォン酸塩無しで）少なくとも10mmの透明化ゾーンが形成されるようなものであることを条件として、この透明化ゾーンが、いかなる線状アルキルベンゼンスルフォン酸塩も含まない類似のカルボキシルメチルセルロースゲルの中で形成される透明化ゾーンに等しい（３mm少ない）ものである、請求項13に記載の酵素。 15．好ましくは、粉化しない粒状の、又は安定化した液体の又は保護された酵素の形をしている、請求項13乃至14のいずれか１項に記載のセルラーゼ活性を示す酵素を含む洗浄剤添加剤。 16．さらにプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ又はペルオキシダーゼといった１又は複数のその他の酵素をさらに含む、請求項15に記載の洗浄剤添加剤。 17．請求項13乃至14のいずれか１項に記載のセルラーゼ活性を示す酵素を含む洗浄剤組成物。 18．線状アルキルベンゼンスルフォン酸塩界面活性剤をさらに含む、請求項17 に記載の洗浄剤組成物。 19．プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ又はペルオキシダーゼといったその他の単数又は複数の酵素をさらに含む、請求項17又は18に記載の洗浄剤組成物。