JPH08502506A - ペクチナタス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）細菌のタンパク断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、抗原決定基が、Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ ＳｅｒＡｓｐ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ ＴｙｒＡｓｐ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ ＡｓｐＡｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ；Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ ＡｓｎＡｓｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｅｕ ＡｓｎＩｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｓｎ ＬｅｕＡｌａ；または、Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ ＡｓｐＧｌｎ Ｘａａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｕ：あるいはこれらの配列の部分配列または誘導体であるペプチドに関する。さらに本発明は、このペプチドの抗原としての使用、このペプチドに対して産生させた抗体、およびこの抗体を用いてペクチナタス細菌を検出する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ペクチナタス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）細菌のタンパク断片 発明の分野 本発明は、ペクチナタス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）細菌の検出と同定に有用な 、ペクチナタス細菌のタンパク断片すなわちペプチドに関する。本発明はまた、 このペプチドに対して産生させた抗体、この抗体を用いるペクチナタス細菌の検 出方法、および本発明によるペプチドの抗原としての使用に関する。 技術的背景 ペクチナタスは、１９７８年に初めて記載された（リー・エス・ワイ（Ｌｅｅ Ｓ．Ｙ．）ら、１９７８年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、２ ８、５８２−５９４）、グラム陰性、桿状、嫌気性細菌である。この細菌は、濁 ったビールから単離され、その後、世界の別の地域でもビール醸造所で発見され ている。これは醸造所における恐ろしい、有害な汚染物質である。ペクチナタス の特徴は、細胞の片側だけに鞭毛を持つことである。このペクチナタス細菌は、 ビールの風味を損ねる有機酸（例えばプロピオン酸）やイオウ化合物を産生する 。 混入雑菌を一掃してその出所をつきとめるためには、汚染物を検出して同定で きることが重要である。この目的のために、特にペクチナタス細菌のタンパクの 型が研究されてきた。この細菌細胞を希塩酸溶液で抽出して細胞の表面層を取り 除き、次にこの抽出物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥ）にかけた。２２ｋＤａのタンパクの有無を基に、このペクチナタス細菌は ２つの大きなグループに分類された。他の主要なタンパクに基づいて、これらの グループはさらに少なくとも５つのサブグループに分類された。見掛け分子量、 約４８から５３ｋＤａおよび約１６ｋＤａを有するタンパクのような、全てのグ ループに共通のタンパクも存在する（ハカレート・イー（Ｈａｋａｌｅｈｔｏ Ｅ．）ら、１９８４年、Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１、２０９−２ １６）。 ペクチナタスの主要なグループは、最近２つの種、すなわちペクチナタス・フ リシンジエンシス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｆｒｉｓｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）とペ クチナタス・セレビシイフィラス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉｉ ｐｈｉｌｕｓ）に分類された（シュライファー・ケー・エィチ（Ｓｃｈｌｅｉｆ ｅｒ Ｋ．Ｈ）ら、１９９０年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４０ 、１９−２７）。 ペクチナタス細菌の表面層の成分の抗原性についても研究検討されている。こ れらの結果に基づいても、ペクチナタス細菌は２つの主要なグループに分類でき る：１つのグループの主要な抗原成分の大きさは、株により約５５から７８ｋＤ ａであり、他方のグループでは約２２から２５ｋＤａである（ハカレート・イー とフィン・ジェイ（Ｈａｋａｌｅｈｔｏ Ｅ．ａｎｄ Ｆｉｎｎｅ Ｊ．）、１ ９９０年、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６７、３０ ７−３１２）。 発明の要約 約４８から５３ｋＤａ、約５５から７８ｋＤａおよび約１６ｋＤａの大きさを 有する上述のタンパクのＮ−末端断片が、全てのペクチナタスの株の検出に有用 な、有効な抗原であることが、予想外に発見された。４８−５３ｋＤａのタンパ クは非変性タンパクとして抗原性が見い出されておらず、５５−７８ｋＤａのタ ンパクはＰ．フリシンジエンシスでのみ抗原として作用するため、これは特に驚 くべきことである。これに引き換えＮ−末端断片は、両方のペクチナタスの種に 共通な抗原として作用する。さらに、４８−５３ｋＤａのタンパクのＮ−末端断 片は、別のビール損傷性細菌すなわちメガスファエラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ）の４０−５０ｋＤａのタンパクのＮ−末端配列と非常に似ているため、交差反 応性抗体が生じることが見い出された。配列表において、４８−５３ｋＤａのタ ンパクの決定されたＮ−末端配列は配列番号１、５５−７８ｋＤａのタンパクの Ｎ−末端配列は配列番号２、そして１６ｋＤａのタンパクのＮ−末端配列は配列 番号６である。 本発明によるペプチドの特徴は、その抗原決定基が、Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ （配列番号１）、またはそ の部分配列または誘導体；または、Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ （配列番号２）、またはその部分配列または誘導体；または、 Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｘａａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｕ （配列番号６）、またはそ の部分配列または誘導体であることである。本明細書中で使用されるアミノ酸の ３文字略語は、以下のように読む： Ａｌａ＝アラニン Ａｓｎ＝アスパラギン Ａｓｐ＝アスパラギン酸 Ｃｙｓ＝システイン Ｇｌｎ＝グルタミン Ｇｌｕ＝グルタミン酸 Ｇｌｙ＝グリシン Ｉｌｅ＝イソロイシン Ｌｅｕ＝ロイシン Ｌｙｓ＝リジン Ｍｅｔ＝メチオニン Ｐｈｅ＝フエニルアラニン Ｐｒｏ＝プロリン Ｓｅｒ＝セリン Ｔｈｒ＝スレオニン Ｔｙｒ＝チロシン Ｖａｌ＝バリン Ｘａａ＝バリンまたはイソロイシン 抗原決定基として上述の配列を有するペプチドに付け加えて、本発明はさらに 抗原決定基として上記配列の抗原的に活性な部分配列を有するペプチドに関する 。 最初の約１５個のＮ−末端アミノ酸よりなる部分配列が有用である。上記アミノ 酸配列またはその部分配列中の少数のアミノ酸が、同じ型のアミノ酸または化学 的誘導体により欠失、付加または置換されても、このペプチドの抗原性に必ずし も影響しないことは明白なため、本発明はさらに抗原決定基として上記配列また はその部分配列の抗原的に活性な誘導体を有するペプチドに関する。抗原的に活 性という用語は、抗体を産生させることのできる化合物を意味する。抗原決定基 は、抗体と反応する分子の部分である。 上述のペプチドは、抗原として使用でき、従ってペクチナタス細菌の免疫学的 検出に有用な抗体を得ることができる。次に分析される試料を抗体と反応させて 、直接にあるいは抗体または抗体結合性分子を用いて従来法で、反応性抗体の量 を測定する。抗体の結合は、細菌の存在を示す。すなわち本発明はまた、抗原と してのペプチドの使用、このペプチドに対して産生される抗体、およびペクチナ タスを含有することが疑われる試料をこの抗体と反応させることによりペクチナ タス細菌を検出する方法に関する。配列番号１およびその部分配列と誘導体に関 しては、さらにメガスファエラ細菌を検出することが可能である。目的の抗体は 、本発明によるペプチドを担体分子に結合させて、次に得られた複合体を用いて 免疫して抗体を産生させることができる。ペプチド Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ （配列番号４）、あるいはその部分配列または誘導体 も、そのままこのような免疫原の担体分子として使用することができる。本発明 は、以下にさらに詳細に記載される。 発明の詳細な説明 ペクチナタスの株を嫌気的に増殖させて、細胞を回収し、洗浄し、ＨＣＩで抽 出して表面層を取り除いた。この細胞破砕物を分離して、ハカレート・イーとフ ィン・ジエイ（Ｈａｋａｌｅｈｔｏ Ｅ．ａｎｄ Ｆｉｎｎｅ Ｊ．）、１９９ ０年、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６７、３０７− ３１２に記載されたように、この抽出物にＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。４８か ら５３ｋＤａ（平均で約５１ｋＤａ）、５５から７８ｋＤａ（平均で約６３ｋＤ ａ）および１６ｋＤａのタンパクを同定して、これらのＮ−末端配列を自動 シーケンサーにより決定した。１６ｋＤａタンパクのサイト９を除いて、検討し た全ての株が同一の配列であった。次にＮ−末端配列によるペプチドを、固相法 により合成した。当然ながら、液相合成または組み換えＤＮＡ技術などの別の従 来法によって、このペプチドを合成することも可能である。このペプチドをこの まま、またはキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍ ｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）と結合させてウサギに注射することにより、抗 血清の産生のために使用した。免疫後、この血清を回収した。 異なるペクチナタスの株を用いてイムノブロット法により、得られた抗体の反 応性を検討した（ハカレート・イーとフィン・ジェイ（Ｈａｋａｌｅｈｔｏ Ｅ ．ａｎｄ Ｆｉｎｎｅ Ｊ．）、１９９０年、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ ｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６７、３０７−３１２）。４８−５３ｋＤａのタンパク 、５５−７８ｋＤａのタンパクおよび１６ｋＤａのタンパクのＮ−末端断片は有 効な抗原として作用し、これらの抗原がＰ．フリシンジ工ンシスとＰ．セレビシ イフィラスの株の両方に存在することが見い出された。 本発明は、以下の制限されることのない実施例により説明される。 本特許出願に引用される全ての刊行物は、参考のため本明細書中に引用されて いる。 実施例１ Ｐ．フリシンジエンシスの株のＡＴＣＣ ３３３３２、ＶＴＴ−Ｅ−８１１４ Ｉ、ＶＴＴ−Ｅ−８０１２１、ＶＴＴ−Ｅ−８３１７０、ＶＴＴ−Ｅ−８７２０ ５、ＶＴＴ−Ｅ−８８３１０およびＶＴＴ−Ｅ−８７２９５、およびＰ．セレビ シイフィラスの株のＤＳＭ ２０４６６およびＡＴＣＣ ２９３５９を、嫌気性 ガス・パック・ジャー（Ｇａｓ Ｐａｋ ｊａｒｓ）中のＰＹＧブロス（１％の ペプトン、１％の酵母抽出物および２％のグルコース）で３０℃で３から４日間 増殖させた。インキュベーションの前に、煮沸によりブロスから酸素を除去した 。ハカレート・イー（Ｈａｋａｌｅｈｔｏ Ｅ．）ら、１９８４年、Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１、２０９−２１６に記載されるように、遠心分離 により細胞を回収し、０．０５Ｍの塩酸で処理して表面層を剥がして除去した。 ０．０５ＭのＮａＯＨで中和後、試料を電気泳動試料緩衝液中で１０分間煮沸し て、次にラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）に記載される（ラエムリ、英国、１９７０ 年、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２２７、６８０−６８５）ように、８−１２ ％のポリアクリルアミドゲルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。クマシ ー・ブリリアント青（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）に より染色されたＰＶＤＦ膜（インモビロンＰ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ）（登録 商標）、ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））にゲルをブロットして、４８−５ ３ｋＤａ、５５−７８ｋＤａおよび１６ｋＤａのタンパクを切り抜き、配列決定 用にアセトニトリルに溶解した。 実施例２ アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） のペプチドシーケンサーを使用して、エドマン分解（Ｅｄｍａｎ ｄｅｇｒａｄ ａｔｉｏｎ）により、実施例１で単離したタンパクのＮ−末端配列を決定した。 ＡＴＣＣ ３３３３２株の４８−５３ｋＤａのタンパクの、最初の２７個のＮ− 末端アミノ酸を決定した。これらは以下のとおりであった：Ａｌａ Ａｌａ Ａ ｓｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓ ｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌ ｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ （配列番号１）。Ｖ ＴＴ−Ｅ−８０１２１、ＤＳＭ ２０４６６、ＶＴＴ−Ｅ−８７２９５およびＶ ＴＴ−Ｅ−８８３１０株の、最初の２０個のＮ−末端アミノ酸は、 ＡＴＣＣ ３３３３２株の最初の２０個のアミノ酸と同一であり、ＶＴＴ−Ｅ−８３１７０ 株の最初の１０個のＮ−末端アミノ酸もまた、上記株のものと同一であった。 ＡＴＣＣ ３３３３２株の５５−７８ｋＤａのタンパクの、最初の２５個のＮ −末端アミノ酸を決定した。これらは以下のとおりであった：Ａ１ａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ （配列番号２）。ＤＳＭ ２０４６ ６とＶＴＴ−Ｅ−８１１４１株の最初の２０個のアミノ酸、ＶＴＴ−Ｅ−８０１ ２１とＶＴＴ−Ｅ−８３１７０株の最初の１５個のアミノ酸、ＶＴＴ−Ｅ−８８ ３１０株の最初の１１個のアミノ酸、およびＶＴＴ−Ｅ−８７２９５とＡＴＣＣ ２９３５９株の最初の１０個のアミノ酸は、ＡＴＣＣ ３３３３２株のそれぞ れのアミノ酸と同一であった。 Ｐ．セレビシイフィラスの株ＡＴＣＣ ２９３５９とＤＳＭ ２０４６６の１ ６ｋＤａのタンパクの最初の１５個のＮ−末端アミノ酸は、Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｌ ｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇ ｌｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｕ （配列番号７）であって、そしてＰ．フリシン ジエンシスの株ＶＴＴ−Ｅ−８０１２１、ＶＴＴ−Ｅ−８３１７０、ＶＴＴ−Ｅ −８７２０５およびＶＴＴ−Ｅ−８８３１０の同一タンパクの、最初の１０個の Ｎ−末端アミノ酸は、サイト９（ここでは種に依存して差異があった、すなわち このアミノ酸はＶａｌの代わりにＩｌｅであった）を除いては同一であった。 実施例３ 固相法を利用したペプチド合成機（アプライド・バイオシステムズ４３１Ａ自 動ペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａａｕｔｏ ｍａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ））とＦｍｏｃ戦略を使 用して、４８−５３ｋＤａのタンパク、５５−７８ｋＤａのタンパク、および１ ６ｋＤａのタンパク中の最初の１５個のＮ−末端アミノ酸を含有するタンパク断 片、すなわち以下のペプチドを合成した：以下でペプチドＡ、ペプチドＢおよび ペプチドＣとして呼ばれる、Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｙｒ （配列番号３）、Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ （配列 番号４）、および Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｕ （配列 番号７）。 実施例４ 実施例３で合成し、キーホール・リンペット・ヘモシアニンと結合させたペプ チド（Ａ，ＢおよびＣ）を、すでに記載されたように（リウ・エフ・ティー（Ｌ ｉｕ，Ｆ．Ｔ．）ら、１９７９年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８、６９ ０−６９７）、ウサギの皮下と筋肉内に注射した。複合体生成のため、固相ペプ チド合成機によりペプチドのＣ−末端にシステインを１つ結合させた。ペプチド Ｂは、このように複合体化せず、そのままで注射した。約０．５から１ｍｇのペ プチド／ウサギで、２週間の間隔で４から５回、ウサギを免疫した。最初の注射 から１から４ケ月後に、血清を回収した。 驚くべきことに、Ｃａ²⁺−およびＭｇ²⁺−非含有のリン酸緩衝化食塩水溶液（ ＣＭＦ−ＰＢＳ）中で、ペプチドＢは急速に沈殿することが見い出された。この 沈殿物は、極めて不溶性であった。電子顕微鏡写真で観察すると、沈殿物がフィ ブリルであることが見い出され、これはアルツハイマー病の患者の脳内に検出さ れるβＡ４−アミロイドペプチドの断片により形成されるフィブリルの外観と似 ていた（フレーザー・ピー（Ｆｒａｓｅｒ，Ｐ．）ら、１９９２年、Ｊ．Ｎｅｕ ｒｏｃｈｅｍ．、５９、１５３１−１５４０）。このペプチドＢの調製物も、担 体なしにそのまま免疫原として使用されて、これがキーホール・リンペット・ヘ モシアニンに結合したペプチドＢと同じ型の抗体を産生させることが見い出され た。ペプチドＢが他の抗原の担体として作用できることは明白である。 実施例５ 実施例４で得られた抗体を、ウェスタンブロット法による免疫ブロットに使用 した。実施例１で述べたように、表１に示す株の塩酸抽出物についてＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥを実施した。バイオ−ラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のトランス−ブロット セル装置（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標） Ｃｅｌｌ ａｐｐａｒａｔｕｓ ）にゲルを移行させ、ここでゲルに含有されるタンパクは、電流（９０ｍＡ）に より緩衝液中でイモビロン−Ｐ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）−Ｐ）膜（ミ リポア社（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ））に移行した。約６０分間流した後、プレインキ ュベーションのために、この膜を０．５％のツイン２０および１％の粉末ミルク を含有するｐＨ７．４のカルシウム−およびマグネシウム−非含有のリン酸緩衝 化食塩水（ＣＭＦ−ＰＢＳ）に移行させた。この膜を、０．０５％のツイン２０ および１％の粉末ミルクを含有するＣＭＦ−ＰＢＳ中で洗浄し、次に実施例４で 得られ、上記のＣＭＦ−ＰＢＳで希釈した抗体と一緒に８０分間インキュベート し、続いてこの膜を上記のように再洗浄した。この膜を２次 抗体溶液（Ｐ２１７、ダコーイムノグロブリン（Ｄａｋｏ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏ ｂｕｌｉｎｓ））中に６０分間移行させ、洗浄を繰り返した。過酸化水素（１５ μｌの３０％過酸化水素／３０ｍｌ）の存在下で、ジアミノベンジジン（１５ｍ ｇ／３０ｍｌ）で染色した。ペプチドＡとＢの結果を表１に示す。比較のため、 この表には細胞全体により産生させた抗体についての、非変性タンパクの抗体反 応も示す。これらの抗体は、上述のように調製された（ハカレート・イーとフィ ン・ジエイ（Ｈａｋａｌｅｈｔｏ Ｅ．ａｎｄ Ｆｉｎｎｅ Ｊ．）、１９９０ 年、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６７、３０７−３ １２）。 表１の結果は、試験した全ての株でペプチドＡとＢの両方とも抗原性を有し、 このペプチドの抗体が、ペプチドが断片化したもとのタンパクと特異的に反応す ることを示す。たとえ非変性タンパク自体は、Ｐ．フリシンジエンシス株の抗体 を分析するときだけ抗原として作用する（５５−７８ｋＤａ）か、または抗原と して全然作用しない（４８−５３ｋＤａ）としても、このことはＰ．フリシンジ エンシスとＰ．セレビシイフィラス株の両方の天然タンパクについて事実である 。 ペプチドＣで免疫されたウサギから得られた抗血清は、各々１：５，０００と １：５００に希釈したときでさえ、Ｐ．セレビシイフィラスＤＳＭ ２０４６６ の１６ｋＤａバンド、およびＰ．フリシンジエンシスＡＴＣＣ ３３３３２のそ のバンドと強い特異的な反応をした。これらの結果は、ペプチドＣが両方のペク チナタスの株の検出に有用であることを示す。 実施例６ メガスファエラ・セレビシア（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ）ＡＴＣＣ ４３２５４をＰＹＧブロス中で増殖させて、回収した細胞の表面 層を除去して、実施例１で記載したようにゲル電気泳動を行った。約４０−５０ ｋＤａ（平均で約４６．５ｋＤａ）に、強いタンパクのバンドが得られた。実施 例５によるウェスタンブロットで、驚くべきことにそのバンドは、ペプチドＡ（ 配列番号３）に対して調製した抗体と強く交差反応することが見い出された。こ のタンパクを単離して精製し、実施例２によりＮ−末端配列を以下のように決定 した： Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ （配列番 号５）。 この配列は、４つの部位のみが異なる、配列番号１の部分配列である。 実施例３に記載したように、配列番号５を有するペプチドを合成して、これを キーホール・リンペット・ヘモシアニンに結合する前に、ペプチドのＣ−末端に システインを結合させた。実施例４に記載したように、このペプチドに対する抗 体を調製して、１：１００−１：１０００の血清希釈をして、実施例５のように イムノブロットを行った。この抗体は、この配列のもとになったメガスファエラ 株ＡＴＣＣ ４３２５４の４０−５０ｋＤａのタンパクとだけでなく、ペクチナ タス株ＡＴＣＣ ３３３３２とＤＳＭ ２０４６６の４８−５３ｋＤａのタンパ クとも強く特異的に反応した。 配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名前：エリアス・ハカレート（Ｅｌｉａｓ Ｈａｋａｌｅｈｔｏ） （Ｂ）通り：カサルミカツ １２ Ｃ １（Ｋａｓａｒｍｉｋａｔｕ １ ２ Ｃ １） （Ｃ）市：クオピオ（ＫＵＯＰＩＯ） （Ｅ）国：フィンランド （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：７０１１０ クオピオ （Ａ）名前：ジュッカ・フィン（Ｊｕｋｋａ Ｆｉｎｎｅ） （Ｂ）通り：カタジャノカンランタ ３ Ａ ５（Ｋａｔａｊａｎｏｋａ ｎｒａｎｔａ ３ Ａ ５） （Ｃ）市：ヘルシンキ （Ｅ）国：フィンランド （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：００１６０ ヘルシンキ （ｉｉ）発明の名称：ペクチナタス細菌のタンパク断片 （ｉｉｉ）配列の数：７ （ｉｖ）コンピューターで読める形式： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル （Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエア：パテントイン・リリース＃１．０、バージョン＃１ ．２５（Ｐａｔｅｎｔｌｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ♯１．０，Ｖｅｒｓｉｏｎ ♯１ ．２５）（ＥＰＯ） （ｖ）現出願データ： 出願番号：ＦＩ ９２４８３５ （２）配列ＩＤ番号：１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２７アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｉｉ）分子の型：タンパク （ｖ）断片の型：Ｎ−末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：ペクチナタス・フリシンジエンシス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕ ｓ ｆｒｉｓｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） （Ｂ）株名：ＡＴＣＣ ３３３３２ （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１： （２）配列ＩＤ番号：２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２５アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｉｉ）分子の型：タンパク （ｖ）断片の型：Ｎ−末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：ペクチナタス・フリシンジエンシス （Ｂ）株名：ＡＴＣＣ ３３３３２ （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２： （２）配列ＩＤ番号：３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３： （２）配列ＩＤ番号：４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：４： （２）配列ＩＤ番号：５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｉｉ）分子の型：タンパク （ｖ）断片の型：Ｎ−末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：メガスファエラ・セレビシア（Ｍｅｇａｓｐｈａｅ ｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） （Ｂ）株名：ＡＴＣＣ ４３２５４ （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５： （２）配列ＩＤ番号：６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６： （２）配列ＩＤ番号：７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：未知 （ｉｉ）分子の型：タンパク （ｖ）断片の型：Ｎ−末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：ペクチナタス・セレビシイフィラス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕ ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｕｓ） （Ｂ）株名：ＡＴＣＣ ２９３５９とＤＳＭ ２０４６６ （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 フインネ ユッカ フィンランド国エフアイエヌ ― 00160 ヘルシンキ，カタヤノカンランタ ３ エー ５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 抗原決定基が、Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａ ｓｐ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａ ｓｐ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ａ ｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ （配列番号１）；Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌ ｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌ ｅｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａ ｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ （配列番号２）；または Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐ ｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｘａａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａ ｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｕ （配列番号６）；あるいはこれらの配列の部分配列また は誘導体であるペプチド。 ２． 抗原決定基が、Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａ ｓｐ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｙｒ （ 配列番号３）；または Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａ ｓｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ （ 配列番号４）：あるいはこれらの配列の部分配列または誘導体である、請求項１ に記載のペプチド。 ３． アミノ酸配列、Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａ ｓｐ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｙｒ （ 配列番号３）、または抗原的に活性なこれの誘導体を有する、請求項１に記載の ペプチド。 ４． アミノ酸配列、Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａ ｓｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ （ 配列番号４）、またはその抗原的に活性な誘導体を有する、請求項ｌに記載のペ プチド。 ５． アミノ酸配列、Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｖ ａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓ ｅｒ Ａｓｐ （配列番号５）、またはその抗原的に活性な誘導体を有する、 請求項１に記載のペプチド。 ６． アミノ酸配列、Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａ ｓｐ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｕ （ 配列番号７）、またはその抗原的に活性な誘導体を有する、請求項１に記載のペ プチド。 ７． 請求項１から６のいずれか１項に記載のペプチドに対する抗体。 ８． 請求項１から６のいずれか１項に記載のペプチドを担体分子と結合させ て、抗体を産生させるために、得られた複合体を免疫感作に使用することにより 調製される、請求項７に記載の抗体。 ９． ペクチナタス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）細菌の含有が疑われる試料を、 請求項７に記載の抗体と反応させることからなる、ペクチナタス細菌を検出する 方法。 １０． ペクチナタスおよび／またはメガスファエラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅ ｒａ）細菌を検出する方法であって、これらの細菌の含有が疑われる試料を、請 求項３または５のペプチドに対して産生させた抗体と反応させる、上記方法。 １１． 請求項１から６のいずれか１項に記載のペプチドの、抗原としての使 用。 １２． ペプチド、Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｓ ｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ （配 列番号４）、あるいはその部分配列または誘導体の、免疫原性担体分子としての 使用。