JPH08337537A - 細胞間接着阻害ペプチド - Google Patents
細胞間接着阻害ペプチドInfo
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- JPH08337537A JPH08337537A JP7148577A JP14857795A JPH08337537A JP H08337537 A JPH08337537 A JP H08337537A JP 7148577 A JP7148577 A JP 7148577A JP 14857795 A JP14857795 A JP 14857795A JP H08337537 A JPH08337537 A JP H08337537A
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- cell
- leu
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 （１）Leu-Leu-Gly-Tyr-Lys-Ala-Val-Asp-Pr
o 、（２）Lys-Val-Thr-Ala-Ile-Asp-Leu-Asp-Glu-Pro
、（３）Thr-Ile-Ser-Leu-Glu-Asp-Glu-Asn-Asp-Asn
、（４）Arg-Met-Ala-Val-His-Asp-His-Asp-Leu-Pro
、及び（５）Thr-Pro-Phe-Phe-Ile-Ile-Tyr-Ser-Arg-A
la-Leu-Asn-Ser-Met-Gly-Gln-Asp-Leu-Glu-Arg から選
ばれるアミノ酸配列を有するペプチド又はその塩、これ
を有効成分とする細胞間接着阻害剤及び皮膚外用剤。 【効果】 このペプチドは、細胞−細胞間接着装置であ
るデスモゾーム形成を阻害することにより細胞間接着を
阻害し、皮膚創傷、水疱症、角化症、角化不全症、ニキ
ビ、フケ等の皮膚疾患の予防又は治療や角層トラブルの
改善のための外用剤として有用である。
o 、（２）Lys-Val-Thr-Ala-Ile-Asp-Leu-Asp-Glu-Pro
、（３）Thr-Ile-Ser-Leu-Glu-Asp-Glu-Asn-Asp-Asn
、（４）Arg-Met-Ala-Val-His-Asp-His-Asp-Leu-Pro
、及び（５）Thr-Pro-Phe-Phe-Ile-Ile-Tyr-Ser-Arg-A
la-Leu-Asn-Ser-Met-Gly-Gln-Asp-Leu-Glu-Arg から選
ばれるアミノ酸配列を有するペプチド又はその塩、これ
を有効成分とする細胞間接着阻害剤及び皮膚外用剤。 【効果】 このペプチドは、細胞−細胞間接着装置であ
るデスモゾーム形成を阻害することにより細胞間接着を
阻害し、皮膚創傷、水疱症、角化症、角化不全症、ニキ
ビ、フケ等の皮膚疾患の予防又は治療や角層トラブルの
改善のための外用剤として有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は細胞−細胞間接着を阻害
するペプチド及びこれを含有する皮膚外用剤に関する。
するペプチド及びこれを含有する皮膚外用剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】表皮は様々な種類の細胞によって構成さ
れているが、大部分を占めるのは角化細胞（ケラチノサ
イト）である。このケラチノサイトが増殖し、上層に移
行するに従い、分化過程により最終的に角質層を形成す
る。このような表皮の正常な分化及び角質層の維持には
表皮細胞による接着が重要な役割を果たしている。ま
た、皮膚創傷治癒過程において細胞遊走性の亢進、創傷
部位への定着などの点からも細胞接着は重要な機能であ
る。
れているが、大部分を占めるのは角化細胞（ケラチノサ
イト）である。このケラチノサイトが増殖し、上層に移
行するに従い、分化過程により最終的に角質層を形成す
る。このような表皮の正常な分化及び角質層の維持には
表皮細胞による接着が重要な役割を果たしている。ま
た、皮膚創傷治癒過程において細胞遊走性の亢進、創傷
部位への定着などの点からも細胞接着は重要な機能であ
る。
【０００３】このような表皮細胞に関わる細胞接着には
細胞・細胞外基質、細胞・細胞の二つのタイプがあり、
表皮細胞に存在する接着分子としてはインテグリン、カ
ドヘリン、デスモゾーム蛋白等が知られている。このう
ち、インテグリンは細胞・細胞外基質接着に機能し、カ
ドヘリンは角質層下の生細胞層で、デスモゾームは角質
層を含む表皮全体において細胞・細胞接着に機能してい
る。
細胞・細胞外基質、細胞・細胞の二つのタイプがあり、
表皮細胞に存在する接着分子としてはインテグリン、カ
ドヘリン、デスモゾーム蛋白等が知られている。このう
ち、インテグリンは細胞・細胞外基質接着に機能し、カ
ドヘリンは角質層下の生細胞層で、デスモゾームは角質
層を含む表皮全体において細胞・細胞接着に機能してい
る。
【０００４】表皮におけるこれらケラチノサイトの細胞
接着の異常は水泡症、ある種の角化症などの皮膚疾患原
因であることが言われている。また、ニキビ、フケとい
った角質層トラブルは細胞接着性の亢進により角質層の
重層化が進むことが原因であることが知られている。故
に、これら皮膚疾患の治療予防、創傷治癒、ニキビ、フ
ケといった角質層トラブル予防改善に細胞接着機能をコ
ントロールすることが有効であると考えられる。
接着の異常は水泡症、ある種の角化症などの皮膚疾患原
因であることが言われている。また、ニキビ、フケとい
った角質層トラブルは細胞接着性の亢進により角質層の
重層化が進むことが原因であることが知られている。故
に、これら皮膚疾患の治療予防、創傷治癒、ニキビ、フ
ケといった角質層トラブル予防改善に細胞接着機能をコ
ントロールすることが有効であると考えられる。
【０００５】これまで細胞接着機能をコントロールする
ものとしては、細胞と細胞外基質接着においてはフィブ
ロネクチン、コラーゲン等の細胞外基質の部分配列ペプ
チドを用いてケラチノサイトと細胞外基質との接着阻害
亢進することによる創傷治癒等の治療方法が報告されて
いる（特開平６−１１６２８８号、特開平５−９７６９
８号公報）。また、角質層に関しては蓄積したデスモゾ
ーム蛋白をプロテアーゼにより分解し、ニキビ、フケ、
落屑を改善する方法が報告されている（ＷＯ９３／１９
７３２、ＷＯ９５／０７６８７、ＷＯ９５／０７６８
８）。
ものとしては、細胞と細胞外基質接着においてはフィブ
ロネクチン、コラーゲン等の細胞外基質の部分配列ペプ
チドを用いてケラチノサイトと細胞外基質との接着阻害
亢進することによる創傷治癒等の治療方法が報告されて
いる（特開平６−１１６２８８号、特開平５−９７６９
８号公報）。また、角質層に関しては蓄積したデスモゾ
ーム蛋白をプロテアーゼにより分解し、ニキビ、フケ、
落屑を改善する方法が報告されている（ＷＯ９３／１９
７３２、ＷＯ９５／０７６８７、ＷＯ９５／０７６８
８）。
【０００６】しかしながら、細胞−細胞間接着を有効に
阻害し、これら皮膚疾患の治療及び角層トラブルの改善
に用いることのできる物質は未だ報告されていない。
阻害し、これら皮膚疾患の治療及び角層トラブルの改善
に用いることのできる物質は未だ報告されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、各種皮膚疾患の発症に関与している細胞−細胞間接
着を抑制する物質及び当該物質を含有し各種皮膚疾患の
予防治療、創傷治癒、ニキビ、フケなどの角質のトラブ
ルの予防改善に有効な皮膚外用剤を提供することにあ
る。
は、各種皮膚疾患の発症に関与している細胞−細胞間接
着を抑制する物質及び当該物質を含有し各種皮膚疾患の
予防治療、創傷治癒、ニキビ、フケなどの角質のトラブ
ルの予防改善に有効な皮膚外用剤を提供することにあ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは細胞
間接着装置として知られているデスモゾームのカドヘリ
ンファミリー接着分子であるデスモグレイン、デスモコ
リンに着目し、これらを抑制するペプチドの合成を行っ
た結果、下記（１）〜（５）で示されるアミノ酸配列を
有するペプチドが、デスモゾーム形成を抑制することに
より細胞−細胞間接着を抑制すること、さらに優れた皮
膚創傷などの皮膚疾患治療作用及び角層トラブルの改善
作用を有することを見出し、本発明を完成するに至っ
た。
間接着装置として知られているデスモゾームのカドヘリ
ンファミリー接着分子であるデスモグレイン、デスモコ
リンに着目し、これらを抑制するペプチドの合成を行っ
た結果、下記（１）〜（５）で示されるアミノ酸配列を
有するペプチドが、デスモゾーム形成を抑制することに
より細胞−細胞間接着を抑制すること、さらに優れた皮
膚創傷などの皮膚疾患治療作用及び角層トラブルの改善
作用を有することを見出し、本発明を完成するに至っ
た。
【０００９】すなわち、本発明は次式（１）〜（５）：
【００１０】
【化２】 （１）Leu-Leu-Gly-Tyr-Lys-Ala-Val-Asp-Pro （２）Lys-Val-Thr-Ala-Ile-Asp-Leu-Asp-Glu-Pro （３）Thr-Ile-Ser-Leu-Glu-Asp-Glu-Asn-Asp-Asn （４）Arg-Met-Ala-Val-His-Asp-His-Asp-Leu-Pro （５）Thr-Pro-Phe-Phe-Ile-Ile-Tyr-Ser-Arg-Ala-Leu-
Asn-Ser-Met-Gly-Gln-Asp-Leu-Glu-Arg
Asn-Ser-Met-Gly-Gln-Asp-Leu-Glu-Arg
【００１１】から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチ
ド又はその塩を提供するものである。
ド又はその塩を提供するものである。
【００１２】また、本発明は上記ペプチド又はその塩を
有効成分とする細胞間接着抑制剤を提供するものであ
る。
有効成分とする細胞間接着抑制剤を提供するものであ
る。
【００１３】さらにまた、本発明は上記ペプチド又はそ
の塩を含有する皮膚外用剤を提供するものである。
の塩を含有する皮膚外用剤を提供するものである。
【００１４】本発明のペプチドのうち、前記式（１）〜
（４）から選ばれるアミノ酸配列は、デスモコリンのア
ミノ酸配列の部分配列に相当するものであり、前記式
（５）で示されるアミノ酸配列はデスモグレインのアミ
ノ酸配列の部分配列に相当するものである。従来、これ
らデスモコリン及びデスモグレインのアミノ酸配列の部
分配列の生理作用についての報告は全く存在しない。
（４）から選ばれるアミノ酸配列は、デスモコリンのア
ミノ酸配列の部分配列に相当するものであり、前記式
（５）で示されるアミノ酸配列はデスモグレインのアミ
ノ酸配列の部分配列に相当するものである。従来、これ
らデスモコリン及びデスモグレインのアミノ酸配列の部
分配列の生理作用についての報告は全く存在しない。
【００１５】本発明のペプチドは、前記式（１）〜
（５）から選ばれるアミノ酸配列を有し、細胞間接着抑
制作用を有するものであれば、特に制限されないが、前
記式（１）〜（５）から選ばれるアミノ酸配列からなる
ものが好ましい。また、本発明のペプチドの遊離アミノ
基はアセチル基等のアルカノイル基で保護されていても
よく、また遊離カルボキシル基はアルキルエステル残基
で保護されていてもよい。また、本発明のペプチドの好
ましい塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのア
ルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのア
ルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、
硝酸塩などの酸付加塩が挙げられる。さらに、ペプチド
を構成するアミノ酸はＤ体、Ｌ体、ＤＬ体のいずれでも
よい。
（５）から選ばれるアミノ酸配列を有し、細胞間接着抑
制作用を有するものであれば、特に制限されないが、前
記式（１）〜（５）から選ばれるアミノ酸配列からなる
ものが好ましい。また、本発明のペプチドの遊離アミノ
基はアセチル基等のアルカノイル基で保護されていても
よく、また遊離カルボキシル基はアルキルエステル残基
で保護されていてもよい。また、本発明のペプチドの好
ましい塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのア
ルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのア
ルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、
硝酸塩などの酸付加塩が挙げられる。さらに、ペプチド
を構成するアミノ酸はＤ体、Ｌ体、ＤＬ体のいずれでも
よい。
【００１６】本発明のペプチドは公知のペプチド合成法
により製造することができ、ペプチド合成法としては特
に限定されないが、固相法、液相法によるものが挙げら
れ、及びこれらを自動化した合成装置を用いて合成する
ことができる。この際、必要に応じてアミノ基及び側鎖
官能基を保護することができる。これら合成法の詳細に
ついては、〔ペプチド合成の基礎と実験〕（丸善株式会
社）、〔生化学実験講座・第１巻 蛋白質の化学〕（東
京化学同人）、〔続生化学実験講座タンパク質の化学
（下）〕（東京化学同人）などに記載されている。
により製造することができ、ペプチド合成法としては特
に限定されないが、固相法、液相法によるものが挙げら
れ、及びこれらを自動化した合成装置を用いて合成する
ことができる。この際、必要に応じてアミノ基及び側鎖
官能基を保護することができる。これら合成法の詳細に
ついては、〔ペプチド合成の基礎と実験〕（丸善株式会
社）、〔生化学実験講座・第１巻 蛋白質の化学〕（東
京化学同人）、〔続生化学実験講座タンパク質の化学
（下）〕（東京化学同人）などに記載されている。
【００１７】本発明のペプチドは、細胞−細胞間、特に
ヒト表皮角化細胞間接着を阻害する作用を有する。従っ
て、皮膚創傷、水疱症、角化症、角化不全症、ニキビ、
フケ等の各種皮膚疾患の予防又は治療や角層トラブルの
改善の目的で皮膚外用剤として使用することができる。
ヒト表皮角化細胞間接着を阻害する作用を有する。従っ
て、皮膚創傷、水疱症、角化症、角化不全症、ニキビ、
フケ等の各種皮膚疾患の予防又は治療や角層トラブルの
改善の目的で皮膚外用剤として使用することができる。
【００１８】本発明のペプチドは、皮膚外用剤中に０．
００１〜５０重量％、特に０．０１〜３０重量％配合す
るのが好ましい。
００１〜５０重量％、特に０．０１〜３０重量％配合す
るのが好ましい。
【００１９】本発明の皮膚外用剤は、上記ペプチドを外
用剤基剤に混合・分散して軟膏剤、クリーム剤、ゲル
剤、液剤、ローション剤等とすることができ、これらは
化粧料及び医薬品のいずれとしても使用することができ
る。
用剤基剤に混合・分散して軟膏剤、クリーム剤、ゲル
剤、液剤、ローション剤等とすることができ、これらは
化粧料及び医薬品のいずれとしても使用することができ
る。
【００２０】本発明の皮膚外用剤の調製に用いられる外
用剤基剤としては、ワセリン、パラフィン、シリコーン
油、動植物油等の油脂性基剤；ポリエチレングリコー
ル、プロピレングリコール等の水溶性基剤；水等が挙げ
られる。また、本発明の皮膚外用剤には、さらに必要に
応じて乳化剤、懸濁剤、ゲル化剤、保存剤、安定化剤、
芳香剤等を、本発明の効果を損なわない範囲で配合する
ことができる。
用剤基剤としては、ワセリン、パラフィン、シリコーン
油、動植物油等の油脂性基剤；ポリエチレングリコー
ル、プロピレングリコール等の水溶性基剤；水等が挙げ
られる。また、本発明の皮膚外用剤には、さらに必要に
応じて乳化剤、懸濁剤、ゲル化剤、保存剤、安定化剤、
芳香剤等を、本発明の効果を損なわない範囲で配合する
ことができる。
【００２１】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるもの
ではない。
明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるもの
ではない。
【００２２】実施例１ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの方法によるペプチド合成機を用
いて合成を行った。α−アミノ基の保護にはｔ−ブチル
オキシカルボニル（Ｂｏｃ）基を用いた。まず、Ｂｏｃ
でアミノ基を保護したＰｒｏが結合したポリスチレン樹
脂（固相）を用い、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）にてＢ
ｏｃ基を除去し、フリーのアミノ基とする。これにＣ末
端２番目のアミノ残基Ａｓｐのアミノ基をＢｏｃ、側鎖
をベンジル（Ｂｚｌ）で保護したものをジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いて縮合させる。再び
ＴＦＡによりＢｏｃ基を除去し、同様に順次Ｖａｌ、Ａ
ｌａと縮合させる。最終的に反応性側鎖がすべて保護さ
れたペプチドのポリスチレン樹脂を得る。側鎖の脱保護
と固相からの切り出しはアニソール、メチルエチルスル
フィドをスカベンジャーとして、フッ化水素酸（ＨＦ）
処理を行う。過剰のスカベンジャー等をエーテル、クロ
ロホルムで洗浄し、酢酸、水、アセトニトリル混合溶剤
で抽出後、得られたものを逆相系のＨＰＬＣにて精製し
単一ピークを示す前記式（１）からなるペプチドを得た
（収率６７％）。
いて合成を行った。α−アミノ基の保護にはｔ−ブチル
オキシカルボニル（Ｂｏｃ）基を用いた。まず、Ｂｏｃ
でアミノ基を保護したＰｒｏが結合したポリスチレン樹
脂（固相）を用い、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）にてＢ
ｏｃ基を除去し、フリーのアミノ基とする。これにＣ末
端２番目のアミノ残基Ａｓｐのアミノ基をＢｏｃ、側鎖
をベンジル（Ｂｚｌ）で保護したものをジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いて縮合させる。再び
ＴＦＡによりＢｏｃ基を除去し、同様に順次Ｖａｌ、Ａ
ｌａと縮合させる。最終的に反応性側鎖がすべて保護さ
れたペプチドのポリスチレン樹脂を得る。側鎖の脱保護
と固相からの切り出しはアニソール、メチルエチルスル
フィドをスカベンジャーとして、フッ化水素酸（ＨＦ）
処理を行う。過剰のスカベンジャー等をエーテル、クロ
ロホルムで洗浄し、酢酸、水、アセトニトリル混合溶剤
で抽出後、得られたものを逆相系のＨＰＬＣにて精製し
単一ピークを示す前記式（１）からなるペプチドを得た
（収率６７％）。
【００２３】実施例２〜５ 実施例１と同様にペプチド合成機を用いて、式（２）か
らなるペプチド（収率８７％）、式（３）からなるペプ
チド（収率２６％）、式（４）からなるペプチド（収率
５８％）及び式（５）からなるペプチド（収率１３％）
を得た。
らなるペプチド（収率８７％）、式（３）からなるペプ
チド（収率２６％）、式（４）からなるペプチド（収率
５８％）及び式（５）からなるペプチド（収率１３％）
を得た。
【００２４】実施例６ 培地中のカルシウム濃度を上昇させることで培養表皮細
胞は分化を開始し、デスモゾームを細胞間の細胞膜上に
形成する。この性質を用いて、以下の方法に従い、合成
ペプチドのデスモゾームの形成阻害をペプチド未添加の
コントロールと比較し、細胞間接着阻害活性評価を行っ
た。
胞は分化を開始し、デスモゾームを細胞間の細胞膜上に
形成する。この性質を用いて、以下の方法に従い、合成
ペプチドのデスモゾームの形成阻害をペプチド未添加の
コントロールと比較し、細胞間接着阻害活性評価を行っ
た。
【００２５】ヒト表皮角化細胞（極東製薬）をラブテッ
クチャンバースライド（ｎｕｎｃ）上に継代し、３７
℃、５％ＣＯ2 条件のインキュベイターにて培養した。
このとき、培地としてカルシウム濃度０．１mMのＢＳＬ
Ｋ−１００（極東製薬）を用いた。細胞がコンフルエ
ントに達する直前で培地をカルシウム濃度０．０３mMの
１mMの被験ペプチドを溶解したＢＳＬ Ｋ−１００に交
換した。３７℃、５％ＣＯ2 条件で１２時間培養し、塩
化カルシウム溶液を加えることによって培地中のカルシ
ウム濃度を０．０３mMから１．５mMに上昇させた。カル
シウム濃度スイッチ６時間後にチャンバースライドを−
２０℃に冷却したメタノールに１０分間浸漬すること
で、細胞を固定した。細胞間のデスモゾーム形成を一次
抗体にモノクローナル抗デスモグレイン抗体（ＰＲＯＧ
ＥＮ）、二次抗体にＦＩＴＣラベル抗マウスＩｇを用い
た免疫蛍光染色後、蛍光顕微鏡にて観察し、ペプチド未
添加群と比較することで判定した。
クチャンバースライド（ｎｕｎｃ）上に継代し、３７
℃、５％ＣＯ2 条件のインキュベイターにて培養した。
このとき、培地としてカルシウム濃度０．１mMのＢＳＬ
Ｋ−１００（極東製薬）を用いた。細胞がコンフルエ
ントに達する直前で培地をカルシウム濃度０．０３mMの
１mMの被験ペプチドを溶解したＢＳＬ Ｋ−１００に交
換した。３７℃、５％ＣＯ2 条件で１２時間培養し、塩
化カルシウム溶液を加えることによって培地中のカルシ
ウム濃度を０．０３mMから１．５mMに上昇させた。カル
シウム濃度スイッチ６時間後にチャンバースライドを−
２０℃に冷却したメタノールに１０分間浸漬すること
で、細胞を固定した。細胞間のデスモゾーム形成を一次
抗体にモノクローナル抗デスモグレイン抗体（ＰＲＯＧ
ＥＮ）、二次抗体にＦＩＴＣラベル抗マウスＩｇを用い
た免疫蛍光染色後、蛍光顕微鏡にて観察し、ペプチド未
添加群と比較することで判定した。
【００２６】その結果、カルシウム濃度スイッチ６時間
後及び１２時間後において、ペプチド未添加群ではデス
モゾーム形成を示す蛍光が細胞間に局在していることが
観察されたのに対し、実施例１〜５で得られた本発明ペ
プチド添加群ではデスモゾーム形成を示す蛍光が細胞間
に局在せず、コントロール群と同様であった。従って、
本発明ペプチドは、ヒト表皮角化細胞間のデスモゾーム
形成を強く阻害し、細胞間接着を阻害することが判明し
た。
後及び１２時間後において、ペプチド未添加群ではデス
モゾーム形成を示す蛍光が細胞間に局在していることが
観察されたのに対し、実施例１〜５で得られた本発明ペ
プチド添加群ではデスモゾーム形成を示す蛍光が細胞間
に局在せず、コントロール群と同様であった。従って、
本発明ペプチドは、ヒト表皮角化細胞間のデスモゾーム
形成を強く阻害し、細胞間接着を阻害することが判明し
た。
【００２７】実施例７ デスモゾーム形成阻害の試験として、培地中のカルシウ
ム濃度を上昇させた後、細胞膜上に存在するデスモグレ
イン量を以下の方法に従い測定した。２５cm2 フラスコ
にヒト表皮角化細胞を実施例６の条件にて継代培養す
る。細胞がコンフルエントに達する直前で０．０３mMカ
ルシウム濃度の１mMの被験ペプチドを溶解した培地に交
換した。１２時間インキュベイション後、培地のカルシ
ウム濃度を０．０３mMから１．５mMに上昇させる。カル
シウム濃度上昇後、６時間後フラスコ中の培地を除き、
ＰＢＳにて洗浄し、以下に示す緩衝液１を加え、氷上で
２０分間緩やかに振とうし、細胞質蛋白を抽出する。抽
出緩衝液１を除いた後、セルスクレイパーにて細胞をか
き取り、以下に示す緩衝液２を加え、細胞膜蛋白画分を
抽出する。得られた膜画分蛋白抽出液を常法に従いＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦメンブランに転写後、抗
デスモグレイン抗体を用いたイムノブロッティングを行
う。二次抗体にＩ−１２５ラベルした抗マウスＩｇ抗体
を用いて、デスモグレイン量はイメージングアナライザ
ーＢＡＳ−２０００（富士フィルム）を用いて、単位抽
出蛋白量あたりのアイソトープ量（単位：ＰＳＬ）で求
め、ペプチド未添加群と比較した。
ム濃度を上昇させた後、細胞膜上に存在するデスモグレ
イン量を以下の方法に従い測定した。２５cm2 フラスコ
にヒト表皮角化細胞を実施例６の条件にて継代培養す
る。細胞がコンフルエントに達する直前で０．０３mMカ
ルシウム濃度の１mMの被験ペプチドを溶解した培地に交
換した。１２時間インキュベイション後、培地のカルシ
ウム濃度を０．０３mMから１．５mMに上昇させる。カル
シウム濃度上昇後、６時間後フラスコ中の培地を除き、
ＰＢＳにて洗浄し、以下に示す緩衝液１を加え、氷上で
２０分間緩やかに振とうし、細胞質蛋白を抽出する。抽
出緩衝液１を除いた後、セルスクレイパーにて細胞をか
き取り、以下に示す緩衝液２を加え、細胞膜蛋白画分を
抽出する。得られた膜画分蛋白抽出液を常法に従いＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦメンブランに転写後、抗
デスモグレイン抗体を用いたイムノブロッティングを行
う。二次抗体にＩ−１２５ラベルした抗マウスＩｇ抗体
を用いて、デスモグレイン量はイメージングアナライザ
ーＢＡＳ−２０００（富士フィルム）を用いて、単位抽
出蛋白量あたりのアイソトープ量（単位：ＰＳＬ）で求
め、ペプチド未添加群と比較した。
【００２８】緩衝液１：０．５％トリトンＸ−１００、
０．１mMジチオスレイトールを含む１０mMトリス塩酸緩
衝液pH７．５ 緩衝液２：９Ｍ尿素、２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリ
ウム）、５％２−メルカプトエタノール、５mM ＰＭＳ
Ｆ（フェニルメチルスルフォニルフルオリド）、１５μ
Ｍアプロチニンを含む５０mMトリス塩酸緩衝液pH９．０
０．１mMジチオスレイトールを含む１０mMトリス塩酸緩
衝液pH７．５ 緩衝液２：９Ｍ尿素、２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリ
ウム）、５％２−メルカプトエタノール、５mM ＰＭＳ
Ｆ（フェニルメチルスルフォニルフルオリド）、１５μ
Ｍアプロチニンを含む５０mMトリス塩酸緩衝液pH９．０
【００２９】その結果、図１に示すように、実施例１で
得たペプチドは、コントロール群に比較して明らかに細
胞膜上のデスモグレイン量を低下させることが判明し
た。
得たペプチドは、コントロール群に比較して明らかに細
胞膜上のデスモグレイン量を低下させることが判明し
た。
【００３０】実施例８ 創傷治癒効果試験 ５〜６週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラットを１週間予備飼
育し、体重１５０〜１６０ｇの健康な個体を選び、１群
２匹として実験に供した。バルビタール麻酔下ラットの
背部をバリカンとシェイバーにより除毛し、背部中央に
直径１５mmの正円１個をマジックインクで描いた。この
円に沿って皮膚を切除し、筋膜に達する円形皮膚欠損傷
を作製した。欠損傷作製の１日後にエーテル麻酔下に欠
損傷の長径と短径をノギスで測定し長径×短径を欠損傷
面積とした。治療は欠損傷作製１日後から１日２回（午
前、午後）欠損傷部に１mlの０．２％被験ペプチド水溶
液を３日間連日塗布した。欠損傷治癒の評価は塗布３日
後の欠損傷の面積を上記の方法により測定し、塗布前の
面積から差し引くことで治癒面積を求め、治癒効果を陰
性対照群の蒸留水塗布群と比較した。
育し、体重１５０〜１６０ｇの健康な個体を選び、１群
２匹として実験に供した。バルビタール麻酔下ラットの
背部をバリカンとシェイバーにより除毛し、背部中央に
直径１５mmの正円１個をマジックインクで描いた。この
円に沿って皮膚を切除し、筋膜に達する円形皮膚欠損傷
を作製した。欠損傷作製の１日後にエーテル麻酔下に欠
損傷の長径と短径をノギスで測定し長径×短径を欠損傷
面積とした。治療は欠損傷作製１日後から１日２回（午
前、午後）欠損傷部に１mlの０．２％被験ペプチド水溶
液を３日間連日塗布した。欠損傷治癒の評価は塗布３日
後の欠損傷の面積を上記の方法により測定し、塗布前の
面積から差し引くことで治癒面積を求め、治癒効果を陰
性対照群の蒸留水塗布群と比較した。
【００３１】
【表１】
【００３２】表１より、本発明ペプチドは、皮膚創傷の
治癒を促進する作用を有することがわかる。
治癒を促進する作用を有することがわかる。
【００３３】
【発明の効果】本発明ペプチドは、細胞−細胞間接着装
置であるデスモゾーム形成を阻害することにより細胞間
接着を阻害し、皮膚創傷、水疱症、角化症、角化不全
症、ニキビ、フケ等の皮膚疾患の予防又は治療や角層ト
ラブルの改善のための外用剤として有用である。
置であるデスモゾーム形成を阻害することにより細胞間
接着を阻害し、皮膚創傷、水疱症、角化症、角化不全
症、ニキビ、フケ等の皮膚疾患の予防又は治療や角層ト
ラブルの改善のための外用剤として有用である。
【図１】細胞膜上におけるデスモグレイン量に及ぼす本
発明ペプチドの添加効果を示す図である。
発明ペプチドの添加効果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 7/08 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＡ (72)発明者 吉田 栄作 茨城県つくば市春日４丁目25−８ パール ハイツ206号
Claims (3)
- 【請求項１】 次式（１）〜（５）： 【化１】 （１）Leu-Leu-Gly-Tyr-Lys-Ala-Val-Asp-Pro （２）Lys-Val-Thr-Ala-Ile-Asp-Leu-Asp-Glu-Pro （３）Thr-Ile-Ser-Leu-Glu-Asp-Glu-Asn-Asp-Asn （４）Arg-Met-Ala-Val-His-Asp-His-Asp-Leu-Pro （５）Thr-Pro-Phe-Phe-Ile-Ile-Tyr-Ser-Arg-Ala-Leu-
Asn-Ser-Met-Gly-Gln-Asp-Leu-Glu-Arg から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチド又はその
塩。 - 【請求項２】 請求項１記載のペプチド又はその塩を有
効成分とする細胞間接着阻害剤。 - 【請求項３】 請求項１記載のペプチド又はその塩を含
有する皮膚外用剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7148577A JPH08337537A (ja) | 1995-06-15 | 1995-06-15 | 細胞間接着阻害ペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7148577A JPH08337537A (ja) | 1995-06-15 | 1995-06-15 | 細胞間接着阻害ペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08337537A true JPH08337537A (ja) | 1996-12-24 |
Family
ID=15455861
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7148577A Pending JPH08337537A (ja) | 1995-06-15 | 1995-06-15 | 細胞間接着阻害ペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08337537A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997035557A1 (en) * | 1996-03-22 | 1997-10-02 | Kao Corporation | External skin-care composition |
| FR2925312A1 (fr) * | 2007-12-19 | 2009-06-26 | Oreal | Utilisation cosmetique de proteines de type desmogleine i |
| JP2013241433A (ja) * | 2005-11-03 | 2013-12-05 | Cognis Ip Management Gmbh | オリゴペプチドおよびその使用 |
-
1995
- 1995-06-15 JP JP7148577A patent/JPH08337537A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997035557A1 (en) * | 1996-03-22 | 1997-10-02 | Kao Corporation | External skin-care composition |
| JP2013241433A (ja) * | 2005-11-03 | 2013-12-05 | Cognis Ip Management Gmbh | オリゴペプチドおよびその使用 |
| FR2925312A1 (fr) * | 2007-12-19 | 2009-06-26 | Oreal | Utilisation cosmetique de proteines de type desmogleine i |
| WO2009081368A2 (en) * | 2007-12-19 | 2009-07-02 | L'oreal | Cosmetic use desmoglein i-type proteins |
| WO2009081368A3 (en) * | 2007-12-19 | 2010-04-29 | L'oreal | Cosmetic use desmoglein i-type proteins |
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