JPH0833473A - 付着性動物細胞の培養基体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 素材として安価であると共に物性的に安定か
つ耐熱性も大きく、しかも実際の動物細胞の培養に際し
ては、動物細胞を極めて高い効率で付着、伸展させ、高
密度に増殖させることができ、所望の代謝生成物を効率
よく生産することができる付着性動物細胞の培養基体を
提供することである。 【構成】 繊維集積体である固体床及び該固定床の繊維
表面に設けられた付着性動物細胞の培養床からなり、該
固定床は耐熱性１２０℃以上かつ繊維径２０〜６０μｍ
の繊維からなり、該繊維が繊維表面積１０〜３０ｍ² ／
ｍ³ かつ空隙率９０％以上で互いに絡み合って形成され
ている繊維集積体である付着性動物細胞の培養基体にお
いて、該培養床は、塩基性の第四アンモニウム基、第一
アミノ基、第二アミノ基及び第三アミノ基からなる群か
ら選択された少なくとも１つを有する塩基性合成高分子
を含む層であることを特徴とする付着性動物細胞の培養
基体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、付着性動物細胞の培養
基体に関するものであり、特に付着性動物細胞の高密度
培養を実施し得る培養基体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、各種動物細胞を器内で培養し、そ
の増殖過程において動物細胞が産生する生理活性物質を
取得して医薬品として実用することが行われており、こ
のような生体外における動物細胞の培養による生理活性
物質の生産は、最近特に注目を浴びている。かかる生産
においては、生理活性物質を選択的かつ連続的、効率的
に生産することが重要であり、現在までに多くの培養技
術が開発された。

【０００３】多くの動物細胞培養技術を大別すると、動
物細胞自体を培地の水溶液中に浮遊させた状態で増殖さ
せる“浮遊増殖法”、動物細胞をアクリル酸エステル類
等の重合体やデキストラン、セルローズ、キチン等から
なる皮膜形成物質による多孔性皮膜で被覆、包埋してマ
イクロカプセルとし、これを培地の水溶液中に浮遊させ
た状態で増殖させる“マイクロカプセル増殖法”、動物
細胞をガラスやセラミック等からなる径２００μｍ程度
のマイクロビーズに吸着固定化し、これを懸濁状態で増
殖させる、“マイクロビーズ増殖法”、細胞を固定した
多孔性担体上に付着させ、担持し、この状態で培地の水
溶液を供給して動物細胞を増殖させる“付着担持増殖
法”などがある。

【０００４】このうち、“付着担持増殖法”に属する培
養方法として、例えば特開平４−６３５８４号公報には
「バイオリアクター装置」なる発明について開示されて
いるが、このバイオリアクター装置によれば、生理活性
物質を選択的かつ連続的、効率的に生産することが可能
である。この発明においては、その目的を達成するた
め、装置の構成に工夫を凝らすと共に、この装置内に配
置して動物細胞を付着させる培養基体（担体）にも工夫
がなされている。即ち、その発明においては、例えば不
織布等の網状をなす繊維にアテロコラーゲン、光架橋反
応基を有するポリビニルアルコール、ポリペプチド等の
ごとき動物細胞に対して高い親和性と接着性を示す培養
床の層を設け、これを動物細胞の培養基体としている。
この外、動物細胞培養基体として不織布を用いた例とし
ては、ＷＯ８８／０２３９８号公報、特開昭６４−３４
２７６号公報及び特開平２−１５４６８５号公報等にも
種々開示されたものがあるが、これらの技術では、不織
布は１．０ｄ（約０．６μｍに相当）以下の太さの繊維
のものであって極めて細く、不織布を構成する繊維径や
空隙率及び厚さ等が細胞の付着・培養に不適当であった
り、また不織布素材及び繊維表面の極性や親水性や平滑
性が不適切であるために繊維表面へ細胞を付着・培養す
るための培養床のコーティングが不均一になったりし
て、細胞の高密度培養のための目的を十分に達成するこ
とができなかった。

【０００５】さらに、従来動物細胞の培養床としては、
一般にコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミ
ニン、レクチン、フィブリンあるいはフィブリノーゲン
等の天然のポリペプチド系高分子を固定床に塗布した
後、不溶化処理を施すことによって形成させていたが、
これらの天然のポリペプチド系高分子による培養床は、
物理化学的に安定性が乏しくて変成し易く、耐熱性も悪
くてオートクレーブ滅菌に適していないだけでなく、極
めて高価であった。従って、工業的に安価であり、かつ
優れた動物細胞培養床を供給することが要求されてい
た。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記従
来技術のもつ問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結
果、下記のごとき動物細胞を高密度に培養することが可
能な基体を作成することに成功し、従来の静置培養や多
孔性担体による培養に比べて数倍乃至数１０倍の高効率
な生物化学的反応を行わせることを実現し、本発明をな
すに至ったものである。即ち、本発明は、繊維集積体で
ある固定床及び該固定床の繊維表面に設けられた付着性
動物細胞の培養床からなり、該固定床は耐熱性１２０℃
以上かつ繊維径２０〜６０μｍの繊維からなり、該繊維
が繊維表面積１０〜３０ｍ² ／ｍ³ かつ空隙率９０％以
上に互いに絡み合って形成されている繊維集積体である
付着性動物細胞の培養基体において、該培養床は、塩酸
性の第四アンモニウム基、第一アミノ基、第二アミノ基
及び第三アミノ基からなる群から選択された少なくとも
１つを有する塩基性合成高分子を含む層であることを特
徴とする付着性動物細胞の培養基体である。

【０００７】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明の付着性動物細胞の培養基体は、基本的には繊維集
積体からなる固定床及び各繊維の表面に塗設された培養
床からなる。培養の対象である各種動物細胞は、数ミク
ロンの大きさであり、この動物細胞が培養床に付着し、
固定、伸展するに適した繊維径は、約２０〜８０μｍで
あり、かつ表面が平滑な単繊維から構成され、繊維充填
密度が１０％以下で厚さ１０ｍｍ以内、繊維表面積１０
〜３０ｍ² ／ｍ³ の物性を有する繊維集積体（例えばそ
のような不織布）を付着性動物細胞の固定床とする。こ
の繊維集積体の素材としては、上記物性を有しかつオー
トクレーブ滅菌可能な耐熱性を有し、かつ表面に塗設す
る培養床と親和性を有し、均一に塗布できるものであ
る。合成高分子としては、ポリエステル、ポリアミド、
ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリアクリロニ
トリル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、
レーヨン、メチルメタクリレート、ポリスルホン、ポリ
フェニレンスルフィド、ポリフェニレンスルホキシド、
ポリカーボネート、ポリフォスファゼン、ポリアセター
ル、ポリ塩化ビニル及び親水性ポリオレフィン等の素材
で、これらをプラズマ処理するか、陰イオン性の親水性
を付与した合成繊維系不織布などがある。また、天然高
分子としては、不溶化処理して耐熱性をもたせたコラー
ゲン、キトサン、キチン、セルローズ系繊維からなる不
織布も使用される。しかしながら、その特性と価格の点
を考慮すれば、好ましくはポリエステル系合成高分子あ
るいはポリアミド系合成高分子の不織布が挙げられる。

【０００８】これらの繊維集積体の繊維の全表面には、
培養床として塩酸性の第四アンモニウム基、第一アミノ
基、第二アミノ基及び第三アミノ基からなる群から選択
された少なくとも１つを有する塩基性合成高分子の薄層
を塗設し、不溶化する。この塩基性合成高分子は、線状
の高分子電解質であり、それらの置換基を有する脂肪族
のアクリル系アミノ誘導体、アクリルアミド系アミノ誘
導体、芳香族系アミノ誘導体、異節環系アミノ誘導体等
が挙げられる。これらの高分子電解質の分子量は１万以
上で、水や有機溶剤に可溶であり、架橋反応によって不
溶化し、それ自体の薄膜を形成することができるもので
ある。

【０００９】培養基体の固定床である繊維集積体の繊維
表面に培養床としてこれらの高分子の薄層を形成させる
には、例えばこれらの高分子電解質を水あるいは有機溶
剤による濃度０．１〜１０重量％の溶液を塗布液とし、
通常は、固定床である繊維集積体を上記の塗布液中に浸
積した後、被塗物を減圧下に１時間程放置して繊維内部
の気泡を完全に除去して繊維の全表面に塗布液が塗られ
るようにし、高分子の均一な薄層を形成するようにす
る。その後、過剰な塗布液を搾りとって除去し、電離性
放射線や紫外線等を照射して分子間で縮合させる物理的
方法、加熱して分子間で縮合させる熱処理方法、あるい
はアミノ基の反応性を利用して分子間で縮合反応を行わ
せる化学的方法を施して薄膜を不溶化することにより、
固定床表面上に培養床を形成させる。培養層の厚さは、
約数μｍ〜数１０μｍが好ましい。

【００１０】本発明の培養基体を用いて培養される動物
細胞としては、目的とする代謝生成物によって自由に選
択することができ、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、キラー細
胞、ヒト腫瘍細胞、繊維芽細胞、リンパ球、リンパ芽細
胞、ＥＢウイルス変異細胞、肝細胞、腎細胞、表皮細
胞、骨髄細胞、マクロファージ、血管内皮細胞、平滑筋
細胞、肝実質細胞、膵β細胞、上皮細胞、小腸細胞、乳
腺細胞、乳腺上皮細胞、唾液腺細胞、甲状腺細胞、生体
由来骨格筋細胞、ヒト皮膚細胞等がある。これらの細胞
は、水等の溶媒に対して１０³ 〜１０⁵ セル／ｍｌ程度
の濃度に混合、分散して、前記培養基体の培養床に付着
させる。

【００１１】さらに培養する動物細胞に供給する培養液
の例としては、各種の必須アミノ酸、各種ビタミン類、
グルコース等の糖類、牛脂児血清培地、無血清培地、ヒ
ト血清培地等の血清の成分が挙げられる。これらは、１
〜１００ｇ／ｌ程度の濃度の水溶液の形態で供給するこ
とが好ましい。さらに、動物細胞に供給する基質は、目
的とする代謝生成物によって自由に選択することができ
るが、例えば各種の必須アミノ酸、各種ビタミン類、グ
ルコース等の糖類、血清の成分が挙げられ、これらも、
１〜１００ｇ／ｌ程度の濃度の水溶液の形態で供給する
ことが好ましい。これら培養成分と基質とは同一物質を
使用することがあるが培養成分は動物細胞を増殖させる
ためのものであり、他方基質は、動物細胞から目的に応
じた代謝生成物を得るものである点が異なる。

【００１２】このようにして培養床から生成することが
できる代謝生成物の例としては、治療用ワクチン、イン
シュリン、レニン、イムノグロブリンＭ、フィブリノー
ゲン、アルブミン、リンホカイン、インターフェロン、
ウロキナーゼ、成長ホルモン、モノクロナール抗体、癌
抗体、ホルモン、細胞増殖因子、各種の酵素などの生理
活性物質が挙げられ、これらは代謝生成液から抽出され
て精製される。

【００１３】繊維径２０〜６０μｍの均一でかつ表面が
平滑な単繊維から構成された繊維集積体を固定床に使用
した場合には、繊維表面の曲率が細胞の付着、増殖、伸
展に適していて、細胞は、まず繊維の左右両端に接着固
定化された後、培養の進行と共に次第に繊維表面に沿っ
て中央部に伸展し、繊維周辺に巻きつくような形にな
り、やがて繊維全面が増殖した細胞で覆われるようにな
る。そしてさらに増殖が進展すると細胞が幾重にも積層
した状態で増殖が認められるようになる。また不織布の
空隙率が９０％以上で繊維表面積として１０〜３０ｍ²
／ｍ³ 、厚さ１０ｍｍ以下の場合には新鮮な培地や酸素
の基体内部までの均一な供給と拡散に適していて、かつ
細胞の高密度培養に丁度適切な多孔性構造を提供する。

【００１４】

【作用】このような多孔性の繊維集積体を用いる固定床
と共に、特に本発明において特徴的な酸性基を含有する
酸性の合成高分子電解質の薄層を培養床とする場合に
は、動物細胞は、培養床に強く接着し固定するので、培
養時の培地等の液の流動による細胞への影響や細胞相互
の接触による細胞の失活も少なくかつ還流培養法により
絶えず新鮮な培地や酸素が細胞に供給されると共に生成
する細胞増殖阻害物質を連続的に系外に取り除きつつ目
的の最終生理活性物質を取得できる。本発明の培養基体
は、所望の強度と熱安定性を有し、かつ安価な合成高分
子を素材としながらも、このように付着性動物細胞を高
密度に培養することが可能である。

【００１５】

【実施例】次に本発明の方法を実施例に基づき具体的か
つ詳細に説明する。しかし、本発明の内容がこれらに限
定されるものではない。 実施例 （１）培養基体（試料）の作成 繊維径５５μｍの高融点ポリエステル繊維（融点２２０
℃）を９０重量％と繊維径３９μｍの低融点ポリエステ
ル繊維（融点１２０℃）を１０重量％含有する繊維集積
体からなり、空隙率９０％以上で繊維表面積３０ｍ² ／
ｍ³ 、厚さ６ｍｍに形成したポリエステル不織布を蒸留
水（水温６０℃）を用いて不織布から溶出物質が認めら
れなくなるまで洗浄し、その後温度８０℃の下で６時間
乾燥させた。

【００１６】このようにして作成されたポリエステル不
織布をポリエチレンイミン（分子量：１５，０００）の
０．３重量％水溶液中に浸積し、減圧下に約４時間放置
して不織布内部の気泡を完全に除去し、繊維の全表面に
上記高分子の溶液を均一に塗布した。しかる後、塗布し
た不織布を取り出し、余分な溶液を搾り取り、温度５０
℃で約１７時間放置し、乾燥させた。次いで、ジイソシ
アン酸ヘキサメチレンのｎ−ヘキサン１重量％溶液中に
室温で約３時間浸積した。その後溶液を搾り取り約１１
０℃のもと約１時間熱処理してアミノ基とイソシアネー
ト基間で分子間架橋を生ぜしめて不溶化した。反応後、
メタノールにより５回洗浄を行い、未反応分を完全に除
去し、温度５０℃のもと約２時間乾燥させた。このよう
にして、不織布の繊維の全表面に塩基性合成高分子の薄
層を均一に形成させた培養基体（試料１）を作成した。

【００１７】さらに、前述の洗浄、乾燥した不織布の他
の部分をスチルバゾリウム基を有する光架橋ポリビニル
アルコール（スチルバゾリウム基含有量：１０モル％以
下）の０．３重量％水溶液中に浸積し、減圧下に約４時
間放置して不織布内部の気泡を完全に除去し、繊維の全
表面に上記高分子の溶液を均一に塗布した。しかる後、
塗布した不織布を取り出し、余分な溶液を搾りとり、温
度５０℃で約１７時間放置し、乾燥させた。次いで紫外
線照射装置（ウシオ電気（株）製”ハンディキュア型Ｕ
Ｖ−８００”）を用いて、３ｃｍの至近距離から不織布
全面に均一に片面１０分間づつ紫外線照射を行ってスチ
ルバゾリウム基の光架橋反応を行わせて不溶化させ、培
養基体（試料２）を作成した。

【００１８】（２）培養基体の滅菌処理 上記のごとく作成した培養基体の各試料について、蒸留
水で３回、燐酸緩衝液及びエタノールで２回づつ洗浄
し、乾燥器（温度６０℃）中にて１時間乾燥させた。そ
れぞれ試料を平板型バイオリアクターに充填セットし、
燐酸緩衝液を満たしてそのままオートクレーブ（温度１
２１℃、圧力２ｋｇ／ｃｍ² ）により１５分間滅菌処理
を施した。

【００１９】（３）培養基体への動物細胞の付着と培養 次いでバイオリアクターから燐酸緩衝液を出来るだけ除
去した後、子牛血清１０重量％を含むＤＭＥＭ培地で１
日予備処理を行い、その後この培地を除去したのち、ヒ
トレニン産生γ−ＣＨＯ−Ａｒ２細胞を３×１０⁵ セル
／ｍｌ含む細胞接種溶液をバイオリアクターの下部より
セル内に導入して培養基体を細胞接種溶液に完全に浸漬
し、１２時間静置して細胞を培養床に付着させた。

【００２０】細胞を付着させた後、予め用意した培地タ
ンクから１ｇ／ｌのグルコースを含む子牛血清の５重量
％水溶液（培地）を１１ｃｍ／時間の流速で循環させ
た。循環中、細胞培養と増殖によるグルコース濃度の低
下に伴って２０〜３０時間毎に新鮮な培地４０ｍｌを添
加して培地の交換を行いながら細胞培養を１８８時間行
った。

【００２１】（４）細胞培養後の測定 細胞培養後、各試料について糖消費速度と培養床におけ
る細胞濃度を測定したところ、次のごとき結果が得られ
た。試料１（培養床：塩基性ポリエチレンイミン系高分
子の薄膜）の培養基体では、細胞濃度は２．３３×１０
⁵ セル／ｍｌ担体、最終糖消費速度は、１．４８×１０
^-4Ｍ／時間であった。また、試料２（培養床：塩基性光
架橋ポリビニルアルコール系高分子の薄膜）では、細胞
濃度は１．６２×１０⁵ セル／ｍｌ担体、最終糖消費速
度は１．５０×１０^-4Ｍ／時間であった。これらの培養
基体の培養床は、いずれも従来から使用されてきたアテ
ロコラーゲン系培養担体膜（その最終糖消費速度は２．
６４×１０^-4Ｍ／時間）と比較すると、これに匹敵する
か又は上回る効果を示した。以上の結果から、本発明に
基づく合成高分子からなる培養床は、細胞の付着、伸
展、培養に適していて、細胞の高密度の培養ができるこ
とが確認された。

【００２２】

【発明の効果】本発明によれば、培養基体の固定床とし
ての繊維集積体の繊維表面に塩基性の第四アンモニウム
基、第一アミノ基、第二アミノ基及び第三アミノ基から
なる群から選択された少なくとも１つを有する塩基性合
成高分子物質を塗布し、不溶化することにより得られる
培養基体は、素材として安価であると共に物性的に安定
かつ耐熱性も大きく、しかも実際の動物細胞の培養に際
しては、動物細胞を極めて高い効率で付着、伸展させ、
高密度に増殖させることができるので、所望の代謝生成
物を効率よく生産することができるという有用な効果が
奏せられる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 繊維集積体である固定床及び該固定床の
   繊維表面に設けられた付着性動物細胞の培養床からな
   り、該固定床は耐熱性１２０℃以上かつ繊維径２０〜６
   ０μｍの繊維からなり、該繊維が繊維表面積１０〜３０
   ｍ² ／ｍ³ かつ空隙率９０％以上で互いに絡み合って形
   成されている繊維集積体である付着性動物細胞の培養基
   体において、該培養床は塩酸性の第四アンモニウム基、
   第一アミノ基、第二アミノ基及び第三アミノ基からなる
   群から選択された少なくとも１つを有する塩基性合成高
   分子を含む層であることを特徴とする付着性動物細胞の
   培養基体。