JPH08325292A - C型肝炎ウイルス関連合成ペプチド - Google Patents

C型肝炎ウイルス関連合成ペプチド

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JPH08325292A
JPH08325292A JP8056112A JP5611296A JPH08325292A JP H08325292 A JPH08325292 A JP H08325292A JP 8056112 A JP8056112 A JP 8056112A JP 5611296 A JP5611296 A JP 5611296A JP H08325292 A JPH08325292 A JP H08325292A
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mer
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Muneo Aoyama
宗夫 青山
Takashi Obara
隆 小原
Junichi Fujimatsu
順一 藤松
Takashi Sawada
高志 沢田
Terumasa Arima
暉勝 有馬
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Eisai Co Ltd
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Eisai Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 C型肝炎ウイルス(HCV)の感染を防止す
るため、従来の抗HCV抗体検出試薬では検出できなか
ったHCV感染血液を正確に陽性と判定し得る抗HCV
抗体測定試薬を提供することにある。 【解決手段】 免疫化学的測定系において、抗HCV抗
体のトラップ用抗原として、単なるペプチド(1量体)
ではなく、多量体(n量体、nは2以上の整数)を用い
ることにより従来の検査法では見落とされたHCV感染
検体を以前より効率よく判定できることを確認した。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明はC型肝炎ウイルス
(HCV)に関連する合成ペプチドの多量体、並びにそ
れを用いる抗C型肝炎ウイルス抗体の検出試薬および抗
C型肝炎ウイルス抗体の測定方法に関する。
【0002】
【従来の技術】C型肝炎は一度罹患すると容易に完治し
がたく、罹患後、長い年月を経て、肝硬変、肝癌へと進
展する可能性の高い極めて深刻な疾患である。C型肝炎
の原因ウイルスであるC型肝炎ウイルスの重要な感染経
路の1つとして輸血があると考えられている。近年、Ho
ughtonらは、該ウイルス遺伝子を分離したと発表(特開
平2-500880号)し、該ウイルス抗原を用いた EIA法によ
る抗体検出試薬を販売するに至っている。この抗体検出
試薬を用いて抗C型肝炎ウイルス抗体を検出することに
より、輸血用血液からC型肝炎ウイルスを含むものを除
去する試みがなされているが、輸血後肝炎の発生は減少
しているものの、まだ、無視できる頻度にまで減少して
いるとは言えない。また、既存の検査薬を用いて非A非
B非C型肝炎と診断された肝炎患者の中から、C型肝炎
ウイルス遺伝子RNA(HCV-RNA)が検出される例がしばしば
報告されている。
【0003】その原因として、該ウイルス感染と抗体産
生の関係がまだ明らかになっていないこともさることな
がら、該ウイルスゲノムの核酸配列にかなりの異質性が
あることが考えられる。この点については、Houghtonら
の発表した核酸配列をもとに、PCR 法やプライマーエク
ステンション法などにより該ウイルスゲノム c-DNAをク
ローニングした多数の実験の結果から明らかである (Ku
bo et al., Nucleic Acid Research 17, 10367-10372,
1989, Kato et al., Proc. Japan Acad., 65B,219-223,
1989, Maeno et al., Nucleic Acid Research, 18, 26
8, 5-2689, 1990, Kato et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 87, 9524-9528, 1990)。このように、既存の
抗C型肝炎ウイルス抗体検出試薬によるC型肝炎の診
断、並びに輸血によるC型肝炎発症の予防は未だ完全と
言えず、C型肝炎の新たな発症を1例でも少なくするた
め、より検出率の高い検査薬の開発が望まれているのが
現状である。
【0004】また、C型肝炎の最も有効な治療法とし
て、インターフェロン療法が実施されているが、治療効
果を測り、肝炎が完治したかどうかを知ることは容易で
はない。現状では、年余にわたり、PCR を実施してHCV・
RNA を検出する方法が最も信頼性の高い方法であるが、
再発例でも、HCV・RNA 量がいったんRT・PCR法の検出限界
以下まで低下する例が多数あることが知られており、投
入する費用や労力に比して効果的な方法であるとは言い
難い。また、core抗体の抗体価を測定して、治療効果判
定の補助にする方法もあるが、判定までに6ヶ月以上の
期間を要し、判定の困難な例も多数あるなどの問題点が
ある。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来の抗C
型肝炎ウイルス(HCV)抗体を検出するために用いら
れている検査試薬では検出することができないC型肝炎
ウイルス感染者の血液中の抗体を検出し、より検出率の
高いC型肝炎の診断試薬を提供すると共に、C型肝炎の
治療効果判定に有用な、診断試薬を提供することを目的
とする。
【0006】
【課題を解決するための手段】現在知られているHCV
のアミノ酸配列には幾種類かの配列がある。たとえばHC
V-E (特開平 7-135981)、HCV-1、 HCV-J、 HCV-J6、 HCV-J
8などである。これらのHCVのアミノ酸配列の中のど
の部分が抗体のエピトープに当たるのかは、様々な解析
方法を用いて予測することができる。すなわち、スーパ
ーミラー解析(三井情報開発)、二次構造予測(Robson
B., Suzuki E., J.Mol.Biol.、 107, 327-356, 1976)、
親水性プロファイル(Hopp T. P., Woods K. R., Pro
c. Natl.Acad. Sci. USA. 78, 3824-3828, 1981)など
である。本発明者らはこれらの解析方法で予測した抗原
性部位の配列のペプチドを合成し、その抗原性に関し鋭
意研究した。その結果、合成ペプチドのみ、いわゆる1
量体では抗原性があまり強くないか、もしくは抗原性を
示さないにもかかわらず、多量体の合成ペプチドにする
ことにより、はじめて強い抗原性を発揮するエピトープ
を複数見出した。すなわち、生体中の抗HCV抗体検出
用抗原として多量体合成ペプチドを使用することによっ
て、従来法では陰性と判定した患者検体血清を効率よく
陽性と判定し得ることを本発明者らが初めて見いだし本
発明を完成するに至った。
【0007】すなわち本発明は、配列番号1〜13記載
のC型肝炎ウイルス(HCV)関連ペプチドおよびこれ
らと免疫学的に等価な配列ペプチドの多量体(n量体、
nは2以上の整数を意味する。)、およびそれら多量体
を抗HCV抗体検出の抗原として少なくとも1種含むこ
とからなる抗HCV抗体の測定試薬に関する。本発明の
アミノ酸配列の多量体合成ペプチドを抗原として用いた
抗HCV抗体検出試薬により、HCV遺伝子を保有して
いるにも関わらず、従来の抗HCV抗体検出試薬では抗
体を検出できなかった検体血清の中から、該抗体を検出
できる例を多数見出した。さらに、本発明試薬で測定し
た場合、インターフェロン治療著効患者血清で抗体価が
大きく低下し、無効患者血清では抗体価があまり変動し
ないという事実を見いだし、本発明試薬により明確に治
療効果を判定し得ることが判明した。
【0008】本発明において、「免疫学的に等価な配列
ペプチド」とは、各配列番号に記載のアミノ酸配列にお
いて、アミノ酸を付加、置換または削除されたペプチド
でその多量体が抗HCV抗体と反応性を有するペプチド
を意味する。「ペプチドの多量体」とは、ペプチドが複
数個重合している化合物を意味し、重合の様式が架橋体
(骨格、マトリックス)を介する介しないは自由であ
り、共有結合、非共有結合は問わない。
【0009】多量体として好ましくは、アミノ基を反応
基として保有する架橋体を介して目的のペプチドを目的
の数だけ結合させたものが好ましい。架橋体としては、
アミノ酸またはペプチドとの反応基を保有する物質であ
ればいずれも使用できるが、好ましくはβアラニンなど
に目的に応じた数のリジンを結合させたもの、ポリリジ
ン体などが好ましい。一つの多量体を構成する抗原ペプ
チドは同一である必要はない。例えば、8-branch保有
(8個のアミノ基を保有)の架橋体を用いた8量体ペプ
チドの場合、そのうちの4-branchに一種のペプチド、残
り4-branchに別種のペプチドを結合させたヘテロ8量体
を使用することもできる。この場合各構成ペプチドは少
なくとも2個以上含むことが必要である。合成は、例え
ば各ペプチドの多量体同志、例えば4量体と4量体とを
結合させる方法など公知の方法に準じてヘテロ多量体を
調製することができる。
【0010】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を詳細
に説明する。本発明のHCV関連ペプチドを合成するに
は、これまで知られているHCV構成蛋白質のアミノ酸
配列をもとにしてエピトープ部位を予測し合成する。ペ
プチドを合成する方法としては一般的なペプチド合成法
が適用でき、活性化エステル法、混合酸無水物法、アジ
ド法等のC端活性化法、カルボジイミド等のカップリン
グ剤を用いるカップリング法、N−カルボキシ無水物
(NCA)法、酸化還元法、酵素法あるいは固層合成法等が
ある。多量体ペプチドの合成は、例えばTam の方法が挙
げられる(James P. Tam., Proc. Natl. Acad. Sci. US
A., 85、 5409-5413, 1988 )。公知の合成法により、β
アラニンを固定した樹脂にリジンをステップワイズに反
応結合させることにより目的とする架橋体を調製するこ
とができる。すなわち、βアラニンにリジンひとつの結
合体は2量体の架橋体として、さらにリジンを反応させ
て得られるリジン3個結合体は4量体の架橋体として、
さらにリジンを反応させて得られるリジン7個の結合体
は8量体の架橋体として使用することができる。これら
架橋体に目的とするペプチドの構成アミノ酸を通常の方
法により順次反応結合させることにより多量体ペプチド
を合成することができる。n量体のnは2以上の整数を
意味しとくに制限されないが、実用性の点からnは2〜
8が好ましく、さらに好ましくはnは8である。
【0011】抗HCV抗体を検出するための抗原ペプチ
ドの構成アミノ酸の数に関し、6個のアミノ酸で構成さ
れるペプチドが抗体と結合することは公知である(公表
特許公報60-500684 号)。ゆえに抗原ペプチドとして使
用し得る構成アミノ酸の数は少なくとも6個のアミノ酸
から構成され、好ましくは8個のアミノ酸、さらに好ま
しくは10個のアミノ酸、さらに好ましくは13〜20
個のアミノ酸から構成される。本発明のHCV関連ペプ
チド多量体において、一量体ペプチドの構成アミノ酸の
数は配列表に記載されたアミノ酸配列の少なくとも8個
のアミノ酸を含むものからなるペプチドを使用すること
もできる。また構成アミノ酸をひとつまたは複数個、欠
失、付加または置換させたペプチドで抗HCV抗体と反
応性を有するものも本発明に含まれ、これらペプチドの
多量体を抗HCV抗体検出用抗原として用いることが本
発明の特徴である。
【0012】多量体の合成ペプチドを作る方法として、
ここで用いたMAP 法(Multi-Antigen-Peptide 法)は、
他のキャリアータンパクとコンジュゲートにすることな
く免疫効果を上げるワクチン用抗原を提供する目的でTa
m らにより開発された方法であるが、本発明者等が初め
て、この多量体を抗HCV抗体測定用に使用し得るこ
と、抗原性の弱いペプチドも多量体とすることにより強
い抗原性を発揮し、抗HCV抗体測定に使用し得るこ
と、さらにこれまでの測定法では陽性と判定されなかっ
た検体を正確に陽性と判定し得るという優れた効果を発
揮することを見いだした。ゆえに本発明は、各種HCV
の構成蛋白質の部分ペプチド多量体を抗HCV抗体検出
試薬に使用することを特徴とする。部分ペプチドのアミ
ノ酸の数は前記と同様に、少なくとも6個のアミノ酸か
ら構成され、好ましくは8個のアミノ酸、さらに好まし
くは10個のアミノ酸、さらに好ましくは13〜20個
のアミノ酸から構成される。
【0013】多量体ペプチドを用いる抗HCV抗体の免
疫化学的測定法としては公知の方法を用いることがで
き、例えばELISA 法、ウエスタンブロット法、凝集法な
どがあげられる。簡便性、実用性の観点からELISA 法が
あげられ、例えば一つまたは複数種のペプチドの多量体
を固相化したウエルに検体試料を加えて反応させ、洗浄
後、酵素標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応させる。
洗浄後結合した酵素量を発色基質を用いて測定すればよ
い。また、ペプチド多量体の特性から、酵素標識抗ヒト
免疫グロブリン抗体の代わりに標識ペプチド多量体を使
用することも期待される。
【0014】抗ヒト免疫グロブリン抗体の標識物質とし
ては、酵素、蛍光物質、放射性物質、生物または化学発
光物質、電気化学発光物質などがあげられる。多量体ペ
プチドの固相化担体としては、マイクロタイタープレー
ト、プラスチックビーズ、赤血球、ゼラチン粒子、ラテ
ックス粒子、磁気粒子などいずれの担体も用いることが
できる。
【0015】ELISA 法に基づく本発明試薬の具体的態様
の一例を示せば次のごとくになる。即ちHCV関連ペプ
チドの多量体を必須の構成成分とし、固相体、標準抗H
CV抗体、酵素標識抗ヒト免疫グロブリン抗体及び酵素
基質よりなるセットである。測定の実施の便益のために
適当なる抗体希釈液、反応用溶液、基質溶解液、反応停
止液、洗浄液などがセット中に添付されることは自由で
あり、これらは本発明を限定するものではない。
【0016】本発明試薬中、抗原として使用するペプチ
ドの多量体の種類はひとつとは限られず、必要に応じて
複数種のペプチド多量体を組み合わせて、試薬構成成分
として使用することもできる。また多量体のみの使用だ
けでなく、他のペプチド一量体と組み合わせて使用する
ことも可能であり、本発明に含まれる。例えば、配列番
号11、12および13記載の3種のペプチド多量体を
抗原として使用する抗HCV抗体検出試薬は、現在臨床
の場で用いられている第二世代検出試薬と比較して、同
等以上の効果を発揮することを確認している。
【0017】
【実施例】以下の実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されない。 実施例1 EIA法による血清中の抗C型肝炎ウイルス
抗体の測定方法 合成ペプチド溶液(1量体または多量体、5 μg/ml) を
マイクロプレートのウエルに各100 μl 注入し、25℃で
一夜静置した後、PBS/0.05% Tween20 にて3回洗浄し、
合成ペプチドをウエルに固定した。このプレートに反応
用溶液を各ウエルに100 μl 注入し、そこへ被験者血漿
を20μl 注入する。プレートを37℃ 60分間保温し、被
験者血漿中の抗HCV抗体を固定化された合成ペプチド
と反応結合させる。PBS/0.05% Tween20 で5回洗浄し、
アルカリフォスファターゼ標識抗ヒト免疫グロブリン抗
体を各ウエルに100 μl 加え、37℃ 60 分間保温し前記
固定化合成ペプチドに結合したHCV抗体と反応させ
る。PBS/0.05% Tween20 で5回洗浄し、基質溶液(パラ
ニトロフェニルフォスフェイト、1mg/ml) を各ウエルに
100 μl 加え、37℃で30分間保温後、1N水酸化ナトリ
ウム溶液を100 μl 加え反応を停止した後405nm におけ
る吸光度を測定した。
【0018】実施例2 電気化学発光法(ECLIA法)によ
る血清中の抗C型肝炎ウイルス抗体の検出 磁気ビーズ(ダイナビーズM-450 tosyl activated )溶
液1ml を取り、水分を除きホウ酸バッファー(pH9.5) を
1ml 、合成ペプチド溶液(1mg/ml)50μl を加え、室温
で撹拌し磁気ビーズに合成ペプチドを結合させる。その
後、0.1Mトリス緩衝液(pH8.0 )を1ml 加え1時間撹拌
する。その後、トリス緩衝液で5回洗浄後、ビーズ浮遊
バッファー(50mM Tris HCl pH8.0、 0.01% Tween 20
、 0.1%NaN3)に1mg/mlとなるよう懸濁する。ポリプロ
ピレン製チューブに反応用溶液 200μl 、合成ペプチド
が結合した磁気ビーズ25μl 、被験者血漿 20 μl を
加え、室温で8分間反応させる。洗浄液(10mM Tris HC
l (pH 7.5)、 0.15M NaCl,0.05% NaN3, 0.001% Tween 2
0 )で3回洗浄後、ルテニウム標識抗ヒト免疫グロブ
リンモノクローナル抗体 200μl を加え、室温で8分間
反応させる。洗浄液で 3回洗浄後、アッセイバッファー
(0.2Mリン酸カリウム(pH7.5) 、0.1M TPA、0.5% Trito
n X100、0.5% Tween20、0.5% NaN3 )300 μl を加え、
測光器で電気化学発光を測定した。
【0019】実施例3 多量体ペプチド(MAP、Multiple
Antigen Peptide)の合成 Tam の方法に準じて合成した。NovaSyn KA 125 resin
(0.08mmol/g, NOVA biochem 社製)の3/8 モル等量の F
moc-βAla-OHを DCM(dichloromethane) に懸濁し、氷中
で Fmoc-βAla-OHと等モルの1,3-diisopropylcarbodiim
ide を滴下し、攪拌しながら反応させた。この溶液とDM
AP(4-dimethylaminopyridine、樹脂の1/8モル等量)/DM
F(dimethylformamide) 溶液を混合した溶液中で、 DMF
で膨潤させた樹脂を攪拌反応させた。反応後、樹脂を D
CM、メタノール、ジエチルエーテルの順で洗浄した後、
樹脂10mg(0.1mmol/gの樹脂の場合)を20%ピペリジン/D
MFで脱保護して、290nm での吸光度を測定、Fmoc解離率
を算出しβAla の取り込み率を調べた。20%無水酢酸/D
MF溶液で残りの樹脂の反応基をアセチル化した後、20%
ピペリジン/DMF溶液で脱保護し樹脂にβAla を導入し
た。次いで Lysの導入は以下のごとく操作した。各々、
導入されたβAla の 4:3:3倍量のFmoc-Lys(Fmoc)-OH、 P
yBOP、 HoBt/DMF溶液にNMM(N-Methylmorpholine) を滴下
した後、βAla 導入済の Lysの導入をFmoc基の解離率よ
り検定した。 Lysの導入確認後、βAla と同様にアセチ
ル化、脱保護を行った。2回目(4-branch)の Lysを同
様の方法で導入、アセチル化、脱保護を行った。Fmoc-L
ys(Fmoc)-OH、PyBOP、 HoBtは、導入された2-branch目の
Lysの 4:3:3倍量とした。3回目(8-branch)の Lysも
同様の方法で導入し、8量体ペプチド合成の架橋体とし
た。この樹脂を用いて、ペプチド合成機Biolynx 4170(P
harmacia LKB)で8-branchのFmoc基を脱保護した後、通
常の合成法により順次アミノ酸を反応させて目的とする
8量体ペプチドを合成した。 Lysを1回反応させた架橋
体は2量体ペプチド合成用に、2回反応させた架橋体は
4量体ペプチド合成用に使用した。
【0020】実施例4 多量体ペプチド使用による抗体
検出感度の比較(EIA法) 抗原として配列番号11記載のペプチドを用い、EIA 法に
より1量体ペプチドと8量体ペプチドの抗体検出感度の
比較実験を行った。8量体はTam の方法に従い、実施例
3に記載の方法で合成した。検出感度検定の結果を図1
に示した。図1において、黒棒は8量体、斜線棒は1量
体を抗原とした場合で、横軸No.1-19 はC型肝炎患者血
漿検体、No.20-24は健常人血漿検体である。C型肝炎患
者血漿19検体すべてにおいて、1量体ペプチドに比較し
て8量体ペプチドを抗原とした場合、発色値(OD405)が
約1.7 倍〜20倍の範囲で増強され、健常人血清では5検
体すべてにおいて発色値の低下が見られた。
【0021】実施例5 1量体、2量体、4量体、8量
体合成ペプチドを抗原として用いた血清中の抗C型肝炎
ウイルス抗体の検出 抗原として配列番号2記載のペプチドを、1量体、2量
体、4量体および8量体を用い、第2世代抗体検出試薬
陰性かつHCV・RNA 陽性検体をEIA 法で測定した。多量体
は実施例3に記載した方法により、リジン残基が3残基
結合したβ−アラニンを架橋体として4量体が、またリ
ジン残基が1残基結合したβ−アラニンを架橋体として
2量体を合成した。その結果、表1に示されるごとく、
1量体では反応していないが、2量体、4量体、8量体
の順に反応性が高くなっていることが判明した。また多
量体ペプチドの骨格であるリジン体はいずれの検体とも
反応しなかった。このことから、ペプチドを多量体にす
ることによりはじめてHCV抗体を検出することがで
き、今までの検査法では見落とされてしまったHCV感
染検体を検出することにより、HCVの輸血による感染
を減少させることが出来る。
【0022】
【表1】
【0023】実施例6 多量体ペプチド使用による抗体
検出感度の比較(ECLIA法) 抗原として配列番号11、12および13に記載のペプチドを
用い、ECL 法により1量体ペプチドと8量体ペプチドの
抗体検出感度の比較実験を行った。8量体はTam の方法
に従い、実施例3に記載の方法で合成した。検出感度検
定の結果を表2に示した。これらペプチドの1量体で
は、HCV抗体陽性検体に対しほとんど反応しないか、
もしくはわずかな反応しかしないにもかかわらず、8量
体は非常に強く反応し強い抗原性を発揮した。なお、健
常人血清には反応しないことが判明した。
【0024】
【表2】
【0025】実施例7 第2世代抗HCV抗体検出試薬
で陰性の検体の検定 市販の第2世代抗HCV抗体検出試薬である HCV・PHA
「ダイナボット」(ダイナボット)、イムチェックHCV
Ab(国際試薬)、シンペップHCV-EIA (極東製薬)のい
ずれでも陰性で、HCV-RNA 陽性の血清22検体を用い、配
列番号2記載のペプチドの8量体を抗原としたEIA 法お
よびECL 法による抗HCV抗体の検出を実験した。その
結果、22検体中11検体で抗HCV抗体を検出することが
可能であった。表3に、抗HCV抗体を検出しえた11例
の実測値を示した。このように従来の抗HCV抗体検出
試薬で検出しえなかった血清検体に対して、本発明の測
定試薬は陽性と判定し、抗HCV抗体検出精度において
優れていることが確認された。なお、配列番号1に記載
のペプチド(配列番号2に記載のペプチドのN端アミノ
酸 Argを削除したもの)の8量体も配列番号2に記載の
ペプチド8量体と同様の効果が確認された。
【0026】
【表3】
【0027】実施例8 インターフェロン治療経過観察 C型肝炎患者のインターフェロン治療における著効例5
例、無効例5例について、配列番号12記載のペプチドの
8量体を抗原としたECL 法により、抗HCV抗体の血漿
中含量の推移を検定した。結果を図2に示す。図2にお
いて、○印が著効例、△印が無効例の結果である。対照
として用いた抗HCV抗体検出試薬ケモセロ EIA「JCC-
2 」(オーソ)と比較して、本発明試薬では著効例にお
いて、より早く抗体価が低下していることが観察され、
より早い時期に治療効果を判定できることが明らかにな
った。一方、「JCC-2 」ではこの相関は弱かった。
【0028】
【発明の効果】本発明の合成多量体ペプチドを用いるこ
とにより、従来の抗原を利用した抗HCV抗体検査法で
は検出不可能なC型肝炎の診断が可能となり、輸血など
による該肝炎ウイルスの感染の予防が可能となる。ま
た、インターフェロン治療効果の予測および判定を従来
より早期にかつ、簡便に行うことが可能となる。
【0029】
【配列表】
配列番号:1 配列の長さ:12 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド
【0030】配列番号:2 配列の長さ:13 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ala His Gly Ile Glu Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg 1 5 10 。
【0031】配列番号:3 配列の長さ:13 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg 1 5 10 。
【0032】配列番号:4 配列の長さ:13 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ala His Gly Ile Asn Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg 1 5 10 。
【0033】配列番号:5 配列の長さ:13 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Thr Arg Thr Gly Val Arg 1 5 10 。
【0034】配列番号:6 配列の長さ:13 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Val Arg Thr Gly Val Arg 1 5 10 。
【0035】配列番号:7 配列の長さ:13 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Leu Arg Thr Gly Val Arg 1 5 10 。
【0036】配列番号:8 配列の長さ:13 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ala His Gly Ile Glu Pro Asn Thr Arg Thr Gly Val Arg 1 5 10 。
【0037】配列番号:9 配列の長さ:13 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ala His Gly Ile Glu Pro Asn Val Arg Thr Gly Val Arg 1 5 10 。
【0038】配列番号:10 配列の長さ:13 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ala His Gly Ile Glu Pro Asn Leu Arg Thr Gly Val Arg 1 5 10 。
【0039】配列番号:11 配列の長さ:15 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg 1 5 10 15 。
【0040】配列番号:12 配列の長さ:17 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Pro Asp Lys Glu Ile Leu Tyr Glu Ala Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys 1 5 10 15 Ala 。
【0041】配列番号:13 配列の長さ:15 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu 1 5 10 15
【図面の簡単な説明】
【図1】 抗原として1量体または8量体を用いること
による抗体検出感度を比較した図である。黒棒:8量
体、斜線棒:1量体、No. 1-19:C型肝炎患者血漿、N
o.20-24:健常人血漿。
【図2】 C型肝炎患者のインターフェロン治療におけ
る著効例及び無効例の血中抗HCV抗体量の推移を示す
図である。ケモセロ EIA「JCC-2 」と本発明試薬との比
較。○印:著効例、△印:無効例
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C07K 16/10 C07K 16/10 (72)発明者 藤松 順一 茨城県土浦市中高津2−10−26 (72)発明者 沢田 高志 茨城県つくば市千現2−9−17 (72)発明者 有馬 暉勝 鹿児島市平之町5−1−403号

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 試料中の抗C型肝炎ウイルス抗体の検出
    用抗原であって、C型肝炎ウイルスの構成蛋白質のアミ
    ノ酸配列の少なくとも8個の連続してなるアミノ酸から
    なるC型肝炎ウイルス関連ペプチドの多量体(n量体、
    nは2以上の整数を意味する)。
  2. 【請求項2】 n量体のnが2〜8の整数である、請求
    項1に記載のC型肝炎ウイルス関連ペプチドの多量体。
  3. 【請求項3】 n量体のnが8である、請求項1に記載
    のC型肝炎ウイルス関連ペプチドの多量体。
  4. 【請求項4】 試料中の抗C型肝炎ウイルス抗体の検出
    用抗原であって、配列番号1ないし13に記載のC型肝
    炎ウイルス関連ペプチドおよびこれらと免疫学的に等価
    な配列ペプチドからなる群から選ばれる、請求項1に記
    載のC型肝炎ウイルス関連ペプチドの多量体(n量体、
    nは2以上の整数を意味する)。
  5. 【請求項5】 試料中の抗C型肝炎ウイルス抗体の検出
    用抗原であって、配列番号1に記載のC型肝炎ウイルス
    関連ペプチドおよびこれらと免疫学的に等価な配列ペプ
    チドからなる、請求項4に記載のC型肝炎ウイルス関連
    ペプチドの多量体(n量体、nは2以上の整数を意味す
    る)。
  6. 【請求項6】 試料中の抗C型肝炎ウイルス抗体の検出
    用抗原であって、配列番号11に記載のC型肝炎ウイル
    ス関連ペプチドおよびこれらと免疫学的に等価な配列ペ
    プチドからなる、請求項4に記載のC型肝炎ウイルス関
    連ペプチドの多量体(n量体、nは2以上の整数を意味
    する)。
  7. 【請求項7】 試料中の抗C型肝炎ウイルス抗体の検出
    用抗原であって、配列番号12に記載のC型肝炎ウイル
    ス関連ペプチドおよびこれらと免疫学的に等価な配列ペ
    プチドからなる、請求項4に記載のC型肝炎ウイルス関
    連ペプチドの多量体(n量体、nは2以上の整数を意味
    する)。
  8. 【請求項8】 試料中の抗C型肝炎ウイルス抗体の検出
    用抗原であって、配列番号13に記載のC型肝炎ウイル
    ス関連ペプチドおよびこれらと免疫学的に等価な配列ペ
    プチドからなる、請求項4に記載のC型肝炎ウイルス関
    連ペプチドの多量体(n量体、nは2以上の整数を意味
    する)。
  9. 【請求項9】 n量体のnが2〜8の整数である、請求
    項4、5、6、7または8に記載のC型肝炎ウイルス関
    連ペプチドの多量体。
  10. 【請求項10】 n量体のnが8である、請求項4、
    5、6、7または8に記載のC型肝炎ウイルス関連ペプ
    チドの多量体。
  11. 【請求項11】 C型肝炎ウイルスの構成蛋白質のアミ
    ノ酸配列の少なくとも8個の連続してなるアミノ酸から
    なるC型肝炎ウイルス関連ペプチドの多量体(n量体、
    nは2以上の整数を意味する。)を抗C型肝炎ウイルス
    抗体検出用抗原として含有することを特徴とする、抗C
    型肝炎ウイルス抗体の測定試薬。
  12. 【請求項12】 n量体のnが2〜8の整数である、請
    求項11に記載の抗C型肝炎ウイルス抗体の測定試薬。
  13. 【請求項13】 n量体のnが8である、請求項11に
    記載の抗C型肝炎ウイルス抗体の測定試薬。
  14. 【請求項14】 配列番号1ないし13に記載のC型肝
    炎ウイルス関連ペプチドおよびこれらと免疫学的に等価
    な配列ペプチド、からなる群から選ばれるC型肝炎ウイ
    ルス関連ペプチドの多量体(n量体、nは2以上の整数
    を意味する)を抗C型肝炎ウイルス抗体検出用抗原とし
    て少なくとも1種、含有することを特徴とする、請求項
    11に記載の抗C型肝炎ウイルス抗体の測定試薬。
  15. 【請求項15】 配列番号1、11、12および13に
    記載のC型肝炎ウイルス関連ペプチドおよびこれらと免
    疫学的に等価な配列ペプチド、からなる群から選ばれる
    C型肝炎ウイルス関連ペプチドの多量体(n量体、nは
    2以上の整数を意味する)を抗C型肝炎ウイルス抗体検
    出用抗原として少なくとも1種、含有することを特徴と
    する、請求項14に記載の抗C型肝炎ウイルス抗体の測
    定試薬。
  16. 【請求項16】 配列番号11、12および13に記載
    のC型肝炎ウイルス関連ペプチドおよびこれらと免疫学
    的に等価な配列ペプチド、からなる群から選ばれるC型
    肝炎ウイルス関連ペプチドの多量体(n量体、nは2以
    上の整数を意味する)を抗C型肝炎ウイルス抗体検出用
    抗原として少なくとも1種、含有することを特徴とす
    る、請求項14に記載の抗C型肝炎ウイルス抗体の測定
    試薬。
  17. 【請求項17】 n量体のnが2〜8の整数である、請
    求項14、15または16に記載の抗C型肝炎ウイルス
    抗体の測定試薬。
  18. 【請求項18】 n量体のnが8である、請求項14、
    15または16に記載の抗C型肝炎ウイルス抗体の測定
    試薬。
  19. 【請求項19】 試料中の抗C型肝炎ウイルス抗体を検
    出する免疫化学的測定法であって、C型肝炎ウイルスの
    構成蛋白質のアミノ酸配列の少なくとも8個の連続して
    なるアミノ酸からなるC型肝炎ウイルス関連ペプチドの
    多量体(n量体、nは2〜8の整数を意味する。)を固
    定した固相体と検体試料を反応させる工程、洗浄後、標
    識化抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応させる工程、洗浄
    後、結合した標識化抗ヒト免疫グロブリン抗体の量を測
    定する工程からなる、抗C型肝炎ウイルス抗体の測定方
    法。
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