JPH0829094B2 - Ｅ．コリ運動菌株から可動性ベクターをグラム陽性菌中に接合転移させる方法，可動性非自己伝達ベクター，グラム陽性菌の挿入突然変異法及びｄｎａセグメント中に含まれるレプリコンの宿主域の測定法 - Google Patents
Ｅ．コリ運動菌株から可動性ベクターをグラム陽性菌中に接合転移させる方法，可動性非自己伝達ベクター，グラム陽性菌の挿入突然変異法及びｄｎａセグメント中に含まれるレプリコンの宿主域の測定法Info
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- JPH0829094B2 JPH0829094B2 JP1319064A JP31906489A JPH0829094B2 JP H0829094 B2 JPH0829094 B2 JP H0829094B2 JP 1319064 A JP1319064 A JP 1319064A JP 31906489 A JP31906489 A JP 31906489A JP H0829094 B2 JPH0829094 B2 JP H0829094B2
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は可動性ベクターをE.コリ（E.coli）からグラ
ム陽性菌中に接合転移させる方法及び該方法に好適なベ
クターに関する。
ム陽性菌中に接合転移させる方法及び該方法に好適なベ
クターに関する。
従来の技術 突然変異、遺伝子の単離及び分析のためのトランスポ
ゾンの使用は、従来殆んどグラム陰性菌に限定されてい
た。これに関連して、トランスポゾンTn917によるバチ
ルス スブチリス（Bacillus Subtilis）のトランスポ
ゾン突然変異は例外と見なすことができ〔Youngman及び
その他共著、“PNAS80"、４巻、2305〜2309（1983
年）〕、これはB.スブチリスが周囲の培地からプラスミ
ド−DNAを採取するのに十分に高い天然の反応能をいつ
でも使えることにより可能である。
ゾンの使用は、従来殆んどグラム陰性菌に限定されてい
た。これに関連して、トランスポゾンTn917によるバチ
ルス スブチリス（Bacillus Subtilis）のトランスポ
ゾン突然変異は例外と見なすことができ〔Youngman及び
その他共著、“PNAS80"、４巻、2305〜2309（1983
年）〕、これはB.スブチリスが周囲の培地からプラスミ
ド−DNAを採取するのに十分に高い天然の反応能をいつ
でも使えることにより可能である。
接合により行なわれる特定のグラム陽性菌中へのE.コ
リのプラスミド転移は記載〔P.Trieu−Cuot及びその他
共著、“FEMS Microbiology Letters"、48巻、289〜294
頁（1987年）〕されているが、10-7〜10-8の転移頻度で
は全く不十分な値いしか達成されない。
リのプラスミド転移は記載〔P.Trieu−Cuot及びその他
共著、“FEMS Microbiology Letters"、48巻、289〜294
頁（1987年）〕されているが、10-7〜10-8の転移頻度で
は全く不十分な値いしか達成されない。
更に、独自の実験では前記文献に記載の系ではコリネ
バクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutam
icum）中への転移を立証し得ないことが認められた。
バクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutam
icum）中への転移を立証し得ないことが認められた。
米国特許第4626506号明細書、同第4680264号明細書及
び同第4686184号明細書（Ｐhler及びその他）から並
びにサイモン及びその他〔Simon etal.“Biotechnolog
y"、1983年11月及び“Methods in Enzymology"、118
巻、640〜659頁〕により可動性E.コリベクターを用いて
グラム陰性菌中で突然変異を行なうことは知られてい
る。
び同第4686184号明細書（Ｐhler及びその他）から並
びにサイモン及びその他〔Simon etal.“Biotechnolog
y"、1983年11月及び“Methods in Enzymology"、118
巻、640〜659頁〕により可動性E.コリベクターを用いて
グラム陰性菌中で突然変異を行なうことは知られてい
る。
発明が解決しようとする課題 本発明の課題は、E.コリからの高頻度の可動性ベクタ
ープラスミドをグラム陽性菌、特にコリネ型細菌中に転
移させることのできる交雑法（接合転移）を開示するこ
とである。
ープラスミドをグラム陽性菌、特にコリネ型細菌中に転
移させることのできる交雑法（接合転移）を開示するこ
とである。
課題を解決するための手段 本発明の目的はE.コリからの可動性ベクターを接合転
移するための方法であり、これはグラム陽性菌の制限系
を欠失する細胞を製造しかつ該細胞を公知の交雑法によ
り、可動性ベクターを担持するE.コリ運動菌株（Mobili
satorstamm:mobilizing strain）と混合することを包含
する。この運動菌株とは可動性ベクターを転移すること
のできる菌株を意味する。
移するための方法であり、これはグラム陽性菌の制限系
を欠失する細胞を製造しかつ該細胞を公知の交雑法によ
り、可動性ベクターを担持するE.コリ運動菌株（Mobili
satorstamm:mobilizing strain）と混合することを包含
する。この運動菌株とは可動性ベクターを転移すること
のできる菌株を意味する。
供与菌の成長が有利に対数期にある場合、受容菌が定
常期であると有利であることが明らかになつた。
常期であると有利であることが明らかになつた。
一般に、供与菌細胞及び受容菌細胞を比1:2〜1:10、
殊に1:4〜1:6、特に1:5で使用する。
殊に1:4〜1:6、特に1:5で使用する。
好適な可動性E.コリベクターは非自己伝達性である。
一般に、E.コリベクターとは、E.コリ菌株中でのみ独
自に複製するすべてのプラスミドであり、これは技術水
準により遺伝子工学的用途に有用であることが明らかに
なつた。
自に複製するすべてのプラスミドであり、これは技術水
準により遺伝子工学的用途に有用であることが明らかに
なつた。
このようなE.コリベクターの例はpMB9、pBR322、pBR3
25、pKB111、pUC8、pUC9、pACYC184、pACYC177、pSC101
である。
25、pKB111、pUC8、pUC9、pACYC184、pACYC177、pSC101
である。
pBR325〔Bolivar,F及びその他共著、“Gene",2,95（1
977年）〕又はpACYC184〔Chang,AC.Y.及びCohen.S.N.共
著、“J.Bact."、134,1141（1978年）〕のような通常の
E.コリベクターは自己伝達性でもないしまた十分に可動
性でもない。
977年）〕又はpACYC184〔Chang,AC.Y.及びCohen.S.N.共
著、“J.Bact."、134,1141（1978年）〕のような通常の
E.コリベクターは自己伝達性でもないしまた十分に可動
性でもない。
E.コリ群の菌株中でのみ複製するこれらのベクターや
他のベクターは、広い宿主域を有するプラスミドの可動
性機能を有するフラグメント（Mob−サイト）をグラム
陰性菌中で挿入することにより変更される。
他のベクターは、広い宿主域を有するプラスミドの可動
性機能を有するフラグメント（Mob−サイト）をグラム
陰性菌中で挿入することにより変更される。
このためにプラスミドRP4を使用すると優れている。R
P4の1.9kbのフラグメント（Mob−サイト）を有するE.コ
リベクターを本発明方法で有利に使用することができ
る。
P4の1.9kbのフラグメント（Mob−サイト）を有するE.コ
リベクターを本発明方法で有利に使用することができ
る。
運動菌株としては、可動性に必要な機能を与えること
のできるプラスミドを染色体中に挿入されて含有するか
又は遊離して含有する変更されたE.コリ菌株が好適であ
る。
のできるプラスミドを染色体中に挿入されて含有するか
又は遊離して含有する変更されたE.コリ菌株が好適であ
る。
特に、転移機能をトランス型で前記のベクターのMob
−サイトに及ぼすRP4誘導体が染色体中に組み込まれて
いる菌株が好適である。
−サイトに及ぼすRP4誘導体が染色体中に組み込まれて
いる菌株が好適である。
好適なベクター及びE.コリ運動菌株は米国特許第4626
504号明細書から公知であり、ノーザン・リージョナル
・リサーチ・センター（Northern Regional Research C
enter）に寄託されている： 菌 株 NRRL寄託番号 E.コリCSH52/pSUP101 Ｂ−15484 E.コリCSH52/pSUP201 Ｂ−15487 E.コリCSH52/pSUP202 Ｂ−15488 E.コリCSH52/pSUP203 Ｂ−15489 E.コリCSH52/pSUP301 Ｂ−15492 E.コリCSH52/pSUP401 Ｂ−15494 E.コリSM10 Ｂ−15481 E.コリS68−７ Ｂ−15482 E.コリS17−１ Ｂ−15483表 １ pSUP102又はpSUP205のような他のベクターは文献から
公知でありかつ同様の方法で公知のベクターから得られ
る〔Simon及びその他共著、“Methods of Enzymolog
y"、118,640頁以下（1986年）及び“Biotechnology"、1
983年11月〕。
504号明細書から公知であり、ノーザン・リージョナル
・リサーチ・センター（Northern Regional Research C
enter）に寄託されている： 菌 株 NRRL寄託番号 E.コリCSH52/pSUP101 Ｂ−15484 E.コリCSH52/pSUP201 Ｂ−15487 E.コリCSH52/pSUP202 Ｂ−15488 E.コリCSH52/pSUP203 Ｂ−15489 E.コリCSH52/pSUP301 Ｂ−15492 E.コリCSH52/pSUP401 Ｂ−15494 E.コリSM10 Ｂ−15481 E.コリS68−７ Ｂ−15482 E.コリS17−１ Ｂ−15483表 １ pSUP102又はpSUP205のような他のベクターは文献から
公知でありかつ同様の方法で公知のベクターから得られ
る〔Simon及びその他共著、“Methods of Enzymolog
y"、118,640頁以下（1986年）及び“Biotechnology"、1
983年11月〕。
制限系の欠失は遺伝学的に行なつてもよく、例えば突
然変異誘発性抗原（例えばNTG:メチルニトロ−ニトロソ
グアニジン）により形成してよく、しかしまた生理学的
に誘発されていてもよく、例えばヒートシヨツクにより
行なつてよい。
然変異誘発性抗原（例えばNTG:メチルニトロ−ニトロソ
グアニジン）により形成してよく、しかしまた生理学的
に誘発されていてもよく、例えばヒートシヨツクにより
行なつてよい。
受容菌の熱処理を交雑の直前に行なうと特に効果的で
あることが明らかである。その際に完全細胞又はスフエ
ロプラスト細胞を使用する。１〜30分間、殊に約９分間
45〜55℃、殊に約49℃で行なうヒートシヨツクが、これ
に引続く転移頻度の上昇により本発明の課題を解決する
ことを可能にする。
あることが明らかである。その際に完全細胞又はスフエ
ロプラスト細胞を使用する。１〜30分間、殊に約９分間
45〜55℃、殊に約49℃で行なうヒートシヨツクが、これ
に引続く転移頻度の上昇により本発明の課題を解決する
ことを可能にする。
表１に挙げたようなベクターは自殺ベクター（Suizid
−Vektor）とも表わされる。それというのもグラム陽性
菌株中への転移後にそこではもはや複製し得ないからで
ある。しかしそれらはグラム陽性菌株の挿入突然変異誘
発に好適である。つまりクローン化された、例えばグラ
ム陽性菌株中で酵素活性をコード付けする遺伝子（フラ
グメント）を本発明により使用し得る可動性ベクター中
に公知方法により挿入しかつ生成ベクターをE.コリ運動
菌株の接合によりグラム陽性菌株中に転移させ、この菌
株中で存在する相応する完全遺伝子との相同の組み換え
を行なうことができる。
−Vektor）とも表わされる。それというのもグラム陽性
菌株中への転移後にそこではもはや複製し得ないからで
ある。しかしそれらはグラム陽性菌株の挿入突然変異誘
発に好適である。つまりクローン化された、例えばグラ
ム陽性菌株中で酵素活性をコード付けする遺伝子（フラ
グメント）を本発明により使用し得る可動性ベクター中
に公知方法により挿入しかつ生成ベクターをE.コリ運動
菌株の接合によりグラム陽性菌株中に転移させ、この菌
株中で存在する相応する完全遺伝子との相同の組み換え
を行なうことができる。
相同の組み換えは、生成ベクター全体の挿入（単一乗
換）に案内するか又は導入された遺伝子フラグメントと
受容菌の完全遺伝子中の相同の配列との交換に（二重乗
換）案内する。
換）に案内するか又は導入された遺伝子フラグメントと
受容菌の完全遺伝子中の相同の配列との交換に（二重乗
換）案内する。
本発明方法は可動性の非自己伝達性ベクターを使つて
も実施することができ、このベクターは、 （ａ）E.コリ中で機能的なレプリコンを含有するDNAセ
グメント、 （ｂ）可動性−及び転移機能をコード付けするDNAフラ
グメント（Mob−サイト及びOri Ｔ）を含有する第２の
DNAセグメント、 （ｃ）グラム陽性菌中で相同的に組み換わりかつ／又は
グラム陽性菌中で機能的なレプリコンを含有する第３の
DNAフラグメント及び （ｄ）場合により（ｃ）の代りに又は（ｃ）中に含まれ
ているトランスポゾン より成る。
も実施することができ、このベクターは、 （ａ）E.コリ中で機能的なレプリコンを含有するDNAセ
グメント、 （ｂ）可動性−及び転移機能をコード付けするDNAフラ
グメント（Mob−サイト及びOri Ｔ）を含有する第２の
DNAセグメント、 （ｃ）グラム陽性菌中で相同的に組み換わりかつ／又は
グラム陽性菌中で機能的なレプリコンを含有する第３の
DNAフラグメント及び （ｄ）場合により（ｃ）の代りに又は（ｃ）中に含まれ
ているトランスポゾン より成る。
これらのベクターもまた本発明の目的である。第３の
DNAセグメント（ｃ）がコリネ型細菌、特にコリネバク
テリウム・グルタミクム中で複製するベクターから誘導
されるベクターが優れている。
DNAセグメント（ｃ）がコリネ型細菌、特にコリネバク
テリウム・グルタミクム中で複製するベクターから誘導
されるベクターが優れている。
特に、本発明によるベクターはブダペスト条約により
ドイツ微生物保存機関（DSM）に寄託されたpECM1（DSM4
982）である。
ドイツ微生物保存機関（DSM）に寄託されたpECM1（DSM4
982）である。
これに関連して、本明細書中のベクターとは表わすべ
き要素の由来に応じてプラスミドベクター、フアージベ
クター又はプラスミドを表わすことに注意すべきであ
る。
き要素の由来に応じてプラスミドベクター、フアージベ
クター又はプラスミドを表わすことに注意すべきであ
る。
グラム陽性菌のためのベクターの開発をベースとして
レプリコンの発見及び縮小も簡便である。
レプリコンの発見及び縮小も簡便である。
この交雑法により、E.コリ運動菌株からの可動性シヤ
トルベクターを細胞壁の完全な又はスフエロプラストの
グラム陽性菌中に、供与菌力価に対して約10-1〜10-3の
頻度で接合転移することができる。
トルベクターを細胞壁の完全な又はスフエロプラストの
グラム陽性菌中に、供与菌力価に対して約10-1〜10-3の
頻度で接合転移することができる。
ベクターの転移は特徴的な抗生物質耐性マーカーに基
いて、並びに転移接合体を溶菌し、引続いてプラスミド
含量をアガロース−ゲル電気泳動により分析することに
より検査することができる。転移工程の結果としてのベ
クターの変化は記録されない。転移機構としての天然の
形質転換は調節交雑により排除することができる。
いて、並びに転移接合体を溶菌し、引続いてプラスミド
含量をアガロース−ゲル電気泳動により分析することに
より検査することができる。転移工程の結果としてのベ
クターの変化は記録されない。転移機構としての天然の
形質転換は調節交雑により排除することができる。
接合転移により達成される高い接合配列は、天然の形
質転換系が従来は明らかにされなかつたようなグラム陽
性菌でもトランスポゾンの有意な使用を可能にする。
質転換系が従来は明らかにされなかつたようなグラム陽
性菌でもトランスポゾンの有意な使用を可能にする。
DNAセグメント（ａ）及び（ｂ）がpSUP101、pSUP10
2、pSUP201、pSUP202、pSUP203、pSUP205、pSUP301、pS
UP401の群からのベクターの１つから誘導される他のベ
クターが優れている。
2、pSUP201、pSUP202、pSUP203、pSUP205、pSUP301、pS
UP401の群からのベクターの１つから誘導される他のベ
クターが優れている。
これらの優れた特徴を有するベクターはpECM1及びpEC
M3であり、それらの制限地図は第１図及び第２図に図示
されている。
M3であり、それらの制限地図は第１図及び第２図に図示
されている。
これらのベクターの宿主域はコリネバクテリウム属及
びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属のアミノ酸
切断菌株、特に コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム（Coryneba
cterium acetoacidophilum） コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium
glutamicum） コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium
glutamicum）ATCC13032 コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium
glutamicum）ATCC13058 コリネバクテリウム・ヒフロカルボクラストウム（Cory
nebacterium hyfrocarboclastum） コリネバクテリウム・イリチス（Cornyebacterium ilic
is） コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lili
um） コリネバクテリウムsp.（Corynebacterium sp.）DSM201
40 ブレビバクテリウム・フラブム（Brevibacterium flavu
m） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメントウム（Brevib
acterium lactofermentum） ブレビバクテリウム・リチクム（Brevibacterium lytic
um） ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseu
m） ミクロコツクス・ソドネンセ（Micrococcus sodonens
e） を包含する。
びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属のアミノ酸
切断菌株、特に コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム（Coryneba
cterium acetoacidophilum） コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium
glutamicum） コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium
glutamicum）ATCC13032 コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium
glutamicum）ATCC13058 コリネバクテリウム・ヒフロカルボクラストウム（Cory
nebacterium hyfrocarboclastum） コリネバクテリウム・イリチス（Cornyebacterium ilic
is） コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lili
um） コリネバクテリウムsp.（Corynebacterium sp.）DSM201
40 ブレビバクテリウム・フラブム（Brevibacterium flavu
m） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメントウム（Brevib
acterium lactofermentum） ブレビバクテリウム・リチクム（Brevibacterium lytic
um） ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseu
m） ミクロコツクス・ソドネンセ（Micrococcus sodonens
e） を包含する。
本発明による接合転移法によりレプリコン、特に例え
ばpHM1519のような公知のプラスミドの宿主域の迅速な
測定も可能となる。
ばpHM1519のような公知のプラスミドの宿主域の迅速な
測定も可能となる。
実施例 例１ 可動性シヤトルベクターの構成 可動性シヤトルベクターpECM1（第１図） を可動性E.コリベクターpSUP102〔第１図;R.Simon et a
l.,Plasmid Vectors for the Genetik Analysis and Ma
nipulation of Rhizobia and Other Gram−Negative Ba
cteria Methods in Enzymology,Vol.118,641−658（198
6）〕コリネバクテリウム・グルタミクム−プラスミドp
CV35（第１図）と融合することにより構成した。
l.,Plasmid Vectors for the Genetik Analysis and Ma
nipulation of Rhizobia and Other Gram−Negative Ba
cteria Methods in Enzymology,Vol.118,641−658（198
6）〕コリネバクテリウム・グルタミクム−プラスミドp
CV35（第１図）と融合することにより構成した。
pSUP102DNA0.5μｇ及びpCV35DNA1μｇを切断緩衝液リ
アクト（React）３（製造者:BRL−Gibco,Karlsruhe在）
中、Bam HI制限酵素（BRL−Gibco,Karlsruhe在）各1uの
存在において１時間37℃で恒温保持する。
アクト（React）３（製造者:BRL−Gibco,Karlsruhe在）
中、Bam HI制限酵素（BRL−Gibco,Karlsruhe在）各1uの
存在において１時間37℃で恒温保持する。
完全に切断したpSUP102DNAに切断緩衝液中で直線状pC
V35DNAを添加しかつこの混合物を70℃で５分間恒保持す
る。連結緩衝液（BRL−Gibco）及びATPを用いて連結条
件を調節する。T4DNAリガーゼ1uの存在で16時間14℃で
連結させる。
V35DNAを添加しかつこの混合物を70℃で５分間恒保持す
る。連結緩衝液（BRL−Gibco）及びATPを用いて連結条
件を調節する。T4DNAリガーゼ1uの存在で16時間14℃で
連結させる。
この連結混合物を形質転換〔Maniatis et al.Molecul
ar cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Publicati
ons（1982）〕によりCaCl2処理の結果プラスミド−DNA
を取り込むことのできる菌株E.コリS17−１の細胞に導
入する。
ar cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Publicati
ons（1982）〕によりCaCl2処理の結果プラスミド−DNA
を取り込むことのできる菌株E.コリS17−１の細胞に導
入する。
pECM1を含む細胞は抗生物質カナマイシン及びクロラ
ムフエニコール（50μg/ml）に対して耐性であるが、テ
トラサイクリン（５μg/ml）に対しては敏感である。
ムフエニコール（50μg/ml）に対して耐性であるが、テ
トラサイクリン（５μg/ml）に対しては敏感である。
pECM1はE.コリ及びC.グルタミクム中で複製しかつ運
動菌株E.コリS17−１の染色体中に組み込まれたRP4誘導
体の転移機能により可動性である。
動菌株E.コリS17−１の染色体中に組み込まれたRP4誘導
体の転移機能により可動性である。
pECM1はE.コリS17−１中でドイツ微生物保存機関にDS
M4982で寄託されている。
M4982で寄託されている。
pCV34のBglIIの突然変異及びプラスミドpCV35の生成 DSM5025として寄託されたプラスミドpCV34を単離し
〔G.Thierbach,A.Schwarzer,A.Puhler,Transformation
of sphaeroplasts and protoplasts of C. glutamicum
Appl. Microbiol.Biotechnol.,29（1988）,356−362〕かつ酵
素BglIIで切断した。突然変異バツチは、TE緩衝液60μ
ｌ中のプラスミド−DNA約２μｇ、EDTA25mM中の1.5Mヒ
ドロキシルアミン−HCl180μｌ、0.25M EDTA5μｌ及び1
Mトリス−HCl（pH8.0）13μｌより成る。このバツチを
混合しかつ60℃で20分間恒温保持した。プラスミド−DN
Aのフエノール処理及びエタノール沈殿〔Maniatis et a
l Molecular cloning,Cold Spring Harbor Laboratory
Publications1982〕後、DNAペレツトをTE20μｌ中に取
りかつT4−DNA−リガーゼで処理した。C.グルタミクムA
TCC13032をこのプラスミド−DNAで形質転換した後で両
方のBglII切断部位の１方を失つた形質転換体を単離し
た。pCV35は新規でありかつpCV33と同じ水準のカナマイ
シン耐性を有している（平行出願の西ドイツ国特許出願
第3841454号参照）。
〔G.Thierbach,A.Schwarzer,A.Puhler,Transformation
of sphaeroplasts and protoplasts of C. glutamicum
Appl. Microbiol.Biotechnol.,29（1988）,356−362〕かつ酵
素BglIIで切断した。突然変異バツチは、TE緩衝液60μ
ｌ中のプラスミド−DNA約２μｇ、EDTA25mM中の1.5Mヒ
ドロキシルアミン−HCl180μｌ、0.25M EDTA5μｌ及び1
Mトリス−HCl（pH8.0）13μｌより成る。このバツチを
混合しかつ60℃で20分間恒温保持した。プラスミド−DN
Aのフエノール処理及びエタノール沈殿〔Maniatis et a
l Molecular cloning,Cold Spring Harbor Laboratory
Publications1982〕後、DNAペレツトをTE20μｌ中に取
りかつT4−DNA−リガーゼで処理した。C.グルタミクムA
TCC13032をこのプラスミド−DNAで形質転換した後で両
方のBglII切断部位の１方を失つた形質転換体を単離し
た。pCV35は新規でありかつpCV33と同じ水準のカナマイ
シン耐性を有している（平行出願の西ドイツ国特許出願
第3841454号参照）。
シヤトルベクターpECM3の構成 pECM3（第２図）はpECM1から、0.3kbのSalIフラグメ
ント及びカナマイシン耐性の情報を有するBam HI/BglII
−フラグメントの欠失により生成する。
ント及びカナマイシン耐性の情報を有するBam HI/BglII
−フラグメントの欠失により生成する。
このベクターの構成は一般的に公知の方法により寄託
ベクターpECM1から行なう。
ベクターpECM1から行なう。
例２ 詳細な交雑記録 簡単にするために、次にE.コリS17−１からのシヤト
ルベクターpECM1のC.グルタミクムATCC13032への運動に
基いて本発明を記載する。相応するレプリコンを使う
と、他の微生物へも移動し得る（これについては例３も
参照）。
ルベクターpECM1のC.グルタミクムATCC13032への運動に
基いて本発明を記載する。相応するレプリコンを使う
と、他の微生物へも移動し得る（これについては例３も
参照）。
E.コリS17−１からのpECM1を細胞壁の完全なC.グルタ
ミクムATCC13032細胞中に接合転移させるために次の交
雑法を適用する： カナマイシン50μg/mlを含有するルリアブイヨン培地
10mlに試験管中でpECM1を有する運動菌株E.コリS17−１
の細胞を接種しかつ回転器中37℃で一晩恒温保持する
（供与菌予備培地）。
ミクムATCC13032細胞中に接合転移させるために次の交
雑法を適用する： カナマイシン50μg/mlを含有するルリアブイヨン培地
10mlに試験管中でpECM1を有する運動菌株E.コリS17−１
の細胞を接種しかつ回転器中37℃で一晩恒温保持する
（供与菌予備培地）。
受容菌の培養に関しては交雑バツチ当りルリアブイヨ
ン−グルコース培地（ナリジキシン酸:NalidixinSure
50μg/mlを含有）10mlに試験管中でC.グルタミクムATCC
13032を接種し、かつ波長580nmで光学密度３〜４が達成
されるまで回転器中、30℃で恒温保持する（約20時
間）。
ン−グルコース培地（ナリジキシン酸:NalidixinSure
50μg/mlを含有）10mlに試験管中でC.グルタミクムATCC
13032を接種し、かつ波長580nmで光学密度３〜４が達成
されるまで回転器中、30℃で恒温保持する（約20時
間）。
交雑するためにバツチ当り試験管中の10mlのルリアブ
イヨン培地（カナマイシン50μg/ml含有）に供与菌予備
培地100μｌを接種し、かつ回転器中37℃で恒温保持し
て光学密度（580nmで）0.6〜0.7を達成する。
イヨン培地（カナマイシン50μg/ml含有）に供与菌予備
培地100μｌを接種し、かつ回転器中37℃で恒温保持し
て光学密度（580nmで）0.6〜0.7を達成する。
試験管中の受容菌培養物を13分間温度49℃の水浴中で
処理する（ヒートシヨツク）。
処理する（ヒートシヨツク）。
熱処理した受容菌培養物を滅菌PE試験管中に移しかつ
3000rpmで８分間遠心分離する。上澄みを捨て、ペレッ
トを還流して再懸濁させる。
3000rpmで８分間遠心分離する。上澄みを捨て、ペレッ
トを還流して再懸濁させる。
供与菌細胞及び受容菌細胞を比1:5で交雑に使用す
る。相応する量の供与菌培養物を滅菌PE試験管中に移
し、かつ3000rpmで８分間遠心分離する。上澄みを完全
に捨てる。引続いて再懸濁した受容菌細胞を供与菌ペレ
ツトにピペツト添加する。懸濁液を再び3000rpmで８分
間遠心処理しかつ上澄みを最高500μｌにする。細胞を
非常に注意深く再懸濁しかつルリアブイヨン−グリコー
ス固体培地上に置いたセルロースアセテートフイルター
（孔径0.45μｍ）上に滴加する。
る。相応する量の供与菌培養物を滅菌PE試験管中に移
し、かつ3000rpmで８分間遠心分離する。上澄みを完全
に捨てる。引続いて再懸濁した受容菌細胞を供与菌ペレ
ツトにピペツト添加する。懸濁液を再び3000rpmで８分
間遠心処理しかつ上澄みを最高500μｌにする。細胞を
非常に注意深く再懸濁しかつルリアブイヨン−グリコー
ス固体培地上に置いたセルロースアセテートフイルター
（孔径0.45μｍ）上に滴加する。
この平面体を30℃で18時間恒温保持し、かつ引続いて
フイルターをルリアブイヨン培地0.8mlで懸濁させる。
転移接合体の選択は、カナマイシン（25μg/ml）及びナ
リジキシン酸（50μg/ml）を含有するルリアブイヨン−
グリコース固体培地上、30℃で行なう。
フイルターをルリアブイヨン培地0.8mlで懸濁させる。
転移接合体の選択は、カナマイシン（25μg/ml）及びナ
リジキシン酸（50μg/ml）を含有するルリアブイヨン−
グリコース固体培地上、30℃で行なう。
pECM1をスフエロプラスト受容菌細胞中に接合転移さ
せる場合は、次の変更に注意すべきである： スフエロプラストバツチ（約330μｌ）を熱処理の実
施前にTSMC*緩衝液10ml中に懸濁させかつ少なくとも３
時間30℃で恒温保持する。
せる場合は、次の変更に注意すべきである： スフエロプラストバツチ（約330μｌ）を熱処理の実
施前にTSMC*緩衝液10ml中に懸濁させかつ少なくとも３
時間30℃で恒温保持する。
受容菌細胞及び交雑混合物を遠心処理後、ルリアブイ
ヨン培地中ではなく、TSMC*緩衝液中に再懸濁する。
ヨン培地中ではなく、TSMC*緩衝液中に再懸濁する。
転移接合体の選択は、カナマイシン（17.5μg/ml）及
びナリジキシン酸（50μg/ml）を含有する浸透安定なソ
ルビトール（SB）再生平板上で行なう。
びナリジキシン酸（50μg/ml）を含有する浸透安定なソ
ルビトール（SB）再生平板上で行なう。
可動性シヤトルベクターpECM1をE.コリS17−１からコ
リネバクテリウム・グルタミクムATCC13032への接合転
移 前記の交雑法に従つて可動性シヤトルベクターpECM1
（例１）をE.コリS17−１からC.グルタミクムに転移さ
せる。
リネバクテリウム・グルタミクムATCC13032への接合転
移 前記の交雑法に従つて可動性シヤトルベクターpECM1
（例１）をE.コリS17−１からC.グルタミクムに転移さ
せる。
受容菌としてはスフエロプラストのC.グルタミクム細
胞も、細胞壁の完全なその細胞を使用する。付加的に、
制限系をNTGによる突然変異により切断したC.グルタミ
クム突然変異体を使用する（res−突然変異体＊）。
胞も、細胞壁の完全なその細胞を使用する。付加的に、
制限系をNTGによる突然変異により切断したC.グルタミ
クム突然変異体を使用する（res−突然変異体＊）。
接合によるpECM1の転移には次の頻度が明らかにな
る： 測定した頻度は３つの相互に独立して行なつた交雑の
平均値でありかつその都度供与菌力価に関する。
る： 測定した頻度は３つの相互に独立して行なつた交雑の
平均値でありかつその都度供与菌力価に関する。
本例は、時間的に限定された熱処理（49℃、13分間）
が受容菌細胞の制限系を欠損しかつ係数104〜105高い転
移頻度をもたらすことを明らかに示している。
が受容菌細胞の制限系を欠損しかつ係数104〜105高い転
移頻度をもたらすことを明らかに示している。
ヒートシヨツクによるpECM1の効率的な転移は細胞壁
の完全なC.グルタミクム細胞でも、またスフエロプラス
トのその細胞でも可能である。認められる転移頻度にお
ける僅かな差異は、細胞壁の失欠により高められたスフ
エロプラスト細胞の溶菌傾向を表わす。
の完全なC.グルタミクム細胞でも、またスフエロプラス
トのその細胞でも可能である。認められる転移頻度にお
ける僅かな差異は、細胞壁の失欠により高められたスフ
エロプラスト細胞の溶菌傾向を表わす。
熱処理した受容菌を使つて達成された転移頻度は、熱
処理しないでC.グルタミクムの制限欠失突然変異体（re
s-突然変異体＊）を使用する際にのみ達成される。
処理しないでC.グルタミクムの制限欠失突然変異体（re
s-突然変異体＊）を使用する際にのみ達成される。
例３ コリネ型細菌中にpECM1の接合転移−PHM1519の宿主域
の測定 PHM1519は、C.グルタミクムATCC13058から単離した3k
bの隠性のプラスミドである〔K.Miwa et al.,Cryptic p
lasmids in glutamic acid−producing bacteria,Agri
c.Biol.Chem.,48,2901−2903（1984）〕。
の測定 PHM1519は、C.グルタミクムATCC13058から単離した3k
bの隠性のプラスミドである〔K.Miwa et al.,Cryptic p
lasmids in glutamic acid−producing bacteria,Agri
c.Biol.Chem.,48,2901−2903（1984）〕。
pHM1519は、可動性E.コリ−C.グルタミクムシヤトル
ベクターpECM1（例１）の構成に使用したC.グルタミク
ム−ベクターPCV35の基本レプリコンである。
ベクターpECM1（例１）の構成に使用したC.グルタミク
ム−ベクターPCV35の基本レプリコンである。
pHM1519の宿主域の測定には、pECM1をE.コリS17−１
からコリネ型細菌の群類からの代表的な細菌中に移動さ
せる。
からコリネ型細菌の群類からの代表的な細菌中に移動さ
せる。
交雑は既に記載した方法で行なう。転移接合体の選択
はLBKm25NX50培地上で行ない、その際にコリネ型細菌内
で広がつた、抗生物質ナリジキシン酸に対する天然耐性
を供与菌に対する選択に利用する。
はLBKm25NX50培地上で行ない、その際にコリネ型細菌内
で広がつた、抗生物質ナリジキシン酸に対する天然耐性
を供与菌に対する選択に利用する。
pECM1の転移は、ベクターは仲介する抗生物質のカナ
マイシン及びクロラムフエニコールに対する耐性に基い
て並びに転移接合体の溶菌〔Birnboim et al.Nucl.Acid
s Res.,7:1513−1523、変更した）及び引続いてプラス
ミド含量をアガロース−ゲル電気泳動により分析するこ
とにより立証する。
マイシン及びクロラムフエニコールに対する耐性に基い
て並びに転移接合体の溶菌〔Birnboim et al.Nucl.Acid
s Res.,7:1513−1523、変更した）及び引続いてプラス
ミド含量をアガロース−ゲル電気泳動により分析するこ
とにより立証する。
この実験の結果は、pHM1519の宿主域がコリネ型細菌
の群類からの一連の代表的なものを包含することを示
し、これらの一部のものは市場で著しく重要である： コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム（Coryneba
cterium acetoacidophilum） コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium
glutamicum）ATCC13032 コリネバクテリウム・グルタミクム）（Corynebacteriu
m glutamicum）ATCC13058 コリネバクテリウム・ヒドロカルボクラストウム（Cory
nebacterium hydrocarboclastum） コリネバクテリウム・イリチス（Corynebacterium ilic
is） コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lili
um） コリネバクテリウムsp.（Corynebacterium sp.）DSM201
40 ブレビバクテリウム・ジバリカトウム（Brevibacterium
divaricatum） ブレビバクテリウム・フラブム（Brevibacterium flavu
m） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメントウム（Brevib
acterium lactofermentum） ブレビバクテリウム・リチウム（Brevibacterium lytic
um） ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseu
m） ブレビバクテリウム・スタチオニス（Brevibacterium s
tationis） ミクロコツクス・ソドネンセ（Micrococcus sodonens
e） コリネバクテリウム・カルネ（Corynebacterium callun
ae）DSM20147 コリネバクテリウム・ピロスム（Corynebacterium pilo
sum）DSM20521 コリネバクテリウム・フアシアンス（Corynebacterium
fascians）DSM20131 コリネバクテリウム・ヘルクリス（Corynebacterium he
rculis）DSM20301 コリネバクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium me
lassecola）ATCC17965 コリネバクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium me
lassecola）ATCC17966 アルトロバクタ・アルビドウス（Arthrobacter albidu
s）DSM20128 ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacteri
um ammoniagenes）20305 同じ試験により、以下の菌株がPHM1519レプリコンの宿
主域に包含されないことが明らかになつた。
の群類からの一連の代表的なものを包含することを示
し、これらの一部のものは市場で著しく重要である： コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム（Coryneba
cterium acetoacidophilum） コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium
glutamicum）ATCC13032 コリネバクテリウム・グルタミクム）（Corynebacteriu
m glutamicum）ATCC13058 コリネバクテリウム・ヒドロカルボクラストウム（Cory
nebacterium hydrocarboclastum） コリネバクテリウム・イリチス（Corynebacterium ilic
is） コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lili
um） コリネバクテリウムsp.（Corynebacterium sp.）DSM201
40 ブレビバクテリウム・ジバリカトウム（Brevibacterium
divaricatum） ブレビバクテリウム・フラブム（Brevibacterium flavu
m） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメントウム（Brevib
acterium lactofermentum） ブレビバクテリウム・リチウム（Brevibacterium lytic
um） ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseu
m） ブレビバクテリウム・スタチオニス（Brevibacterium s
tationis） ミクロコツクス・ソドネンセ（Micrococcus sodonens
e） コリネバクテリウム・カルネ（Corynebacterium callun
ae）DSM20147 コリネバクテリウム・ピロスム（Corynebacterium pilo
sum）DSM20521 コリネバクテリウム・フアシアンス（Corynebacterium
fascians）DSM20131 コリネバクテリウム・ヘルクリス（Corynebacterium he
rculis）DSM20301 コリネバクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium me
lassecola）ATCC17965 コリネバクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium me
lassecola）ATCC17966 アルトロバクタ・アルビドウス（Arthrobacter albidu
s）DSM20128 ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacteri
um ammoniagenes）20305 同じ試験により、以下の菌株がPHM1519レプリコンの宿
主域に包含されないことが明らかになつた。
クラビバクタ・ミシガネネンセ（Clavibacter michigan
enense） クラビバクタ・ネブラスケンセ（Clavibacter nebraske
nse） コリネバクテリウム・フラクムフアチエンス（Coryneba
cterium flaccumfaciens） バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis） ブレビバクテリウム・リネンス（Brevibacterium linen
s） ブレビバクテリウム・ケトグルタミクム（Brevibacteri
um ketoglutamicum） ブレビバクテリウム・プシルム（Brevibacterium pusil
lum） ブレビバクテリウム・テスタセウム（Brevibacterium t
estaceum） 例４ lys A遺伝子を例にしてC.グルタミクムの挿入突然変
異 lys A遺伝子は、リシン生合成の最終工程を触媒する
酵素メソ−ジアミノピメラート−デカルボキシラーゼを
コード付けする。E.コリlys A−突然変異体W7〔F.B.Wie
ntjes,E.Pas,P.E.M.Taschner ＆ C.L.Woldringh,Kineti
cs of uptake and incorporation of mesodiaminopimel
ic acid in different Escherichia coli strains,J.Ba
cteriol.,164（1985）:331−337〕と、ヨーロツパ特許
出願第89114632.6号明細書に記載されている、C.グルタ
ミクムATCC13032からのE.コリ−ベクターPUC18中の遺伝
子バンクとの相補性により、ATCC13032−DNAの5.8kbの
挿入体を有するハイブリツドプラスミドpTG1225が単離
した。
enense） クラビバクタ・ネブラスケンセ（Clavibacter nebraske
nse） コリネバクテリウム・フラクムフアチエンス（Coryneba
cterium flaccumfaciens） バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis） ブレビバクテリウム・リネンス（Brevibacterium linen
s） ブレビバクテリウム・ケトグルタミクム（Brevibacteri
um ketoglutamicum） ブレビバクテリウム・プシルム（Brevibacterium pusil
lum） ブレビバクテリウム・テスタセウム（Brevibacterium t
estaceum） 例４ lys A遺伝子を例にしてC.グルタミクムの挿入突然変
異 lys A遺伝子は、リシン生合成の最終工程を触媒する
酵素メソ−ジアミノピメラート−デカルボキシラーゼを
コード付けする。E.コリlys A−突然変異体W7〔F.B.Wie
ntjes,E.Pas,P.E.M.Taschner ＆ C.L.Woldringh,Kineti
cs of uptake and incorporation of mesodiaminopimel
ic acid in different Escherichia coli strains,J.Ba
cteriol.,164（1985）:331−337〕と、ヨーロツパ特許
出願第89114632.6号明細書に記載されている、C.グルタ
ミクムATCC13032からのE.コリ−ベクターPUC18中の遺伝
子バンクとの相補性により、ATCC13032−DNAの5.8kbの
挿入体を有するハイブリツドプラスミドpTG1225が単離
した。
C.グルタミクムのlys A遺伝子の公表された配列〔P.Y
eh,A.M.Sicard ＆ A.J.Sinskey,Nucleotide sequence o
f the IysA gene of Corynebacterium glutamicum and
possible mechanisms for modulation of its expressi
on Mol.Gen.Genet.212（1988）:112−119〕に基いて、l
ys A−コード付け領域の内部領域を有するプラスミドpT
G1225の1kbのBclI−SalI−フラグメントが選択された。
染色体中への相同組み換えの際に染色体の遺伝子がベク
ターの組み込により不活性化される（第３図）。
eh,A.M.Sicard ＆ A.J.Sinskey,Nucleotide sequence o
f the IysA gene of Corynebacterium glutamicum and
possible mechanisms for modulation of its expressi
on Mol.Gen.Genet.212（1988）:112−119〕に基いて、l
ys A−コード付け領域の内部領域を有するプラスミドpT
G1225の1kbのBclI−SalI−フラグメントが選択された。
染色体中への相同組み換えの際に染色体の遺伝子がベク
ターの組み込により不活性化される（第３図）。
組み込みによる突然変異には、可動性の非自己伝達性
ベクターpEM lys2を構成した。このベクターは、 ａ）E.コリ中で機能的なレプリコン及びMob領域を有す
るプラスミドpSUP102〔R.Simon et al.Plasmid Vectors
for the Genetik Analysis and Manipulation of Rhiz
obia and Other Gram−Negative Bactereria Methods i
n Enzymology,Vol.118,1986S.641−658〕、 ｂ）C.グルタミクムからのlys A遺伝子の内部フラグメ
ント、及び ｃ）C.グルタミクム中で選択可能なトランスポゾンTn90
3のカナマイシン耐性決定遺伝子〔J.Veira ＆ J.Messin
g The pUC plasmids,an M 13mp7−derived system for
insertion mutagenesis and sequencing with syntheti
c universal primers Gene 19（1982）:259−268〕 より成る。
ベクターpEM lys2を構成した。このベクターは、 ａ）E.コリ中で機能的なレプリコン及びMob領域を有す
るプラスミドpSUP102〔R.Simon et al.Plasmid Vectors
for the Genetik Analysis and Manipulation of Rhiz
obia and Other Gram−Negative Bactereria Methods i
n Enzymology,Vol.118,1986S.641−658〕、 ｂ）C.グルタミクムからのlys A遺伝子の内部フラグメ
ント、及び ｃ）C.グルタミクム中で選択可能なトランスポゾンTn90
3のカナマイシン耐性決定遺伝子〔J.Veira ＆ J.Messin
g The pUC plasmids,an M 13mp7−derived system for
insertion mutagenesis and sequencing with syntheti
c universal primers Gene 19（1982）:259−268〕 より成る。
ベクターpEM lys2の構成（第４図〜第６図）は公知の
組み換えDNA技術により行なつた。
組み換えDNA技術により行なつた。
lys A−遺伝子（1.1kb）の内部フラグメントはプラス
ミドpTG1225から制限酵素SalI及びSacIにより切断し、
かつ同様に切断されたベクターpK18〔R.D.Pridmore New
and versatile cloning vectors with Kanamycinresis
tance marker Gene 56（1987）:309−312〕 と連結した。
ミドpTG1225から制限酵素SalI及びSacIにより切断し、
かつ同様に切断されたベクターpK18〔R.D.Pridmore New
and versatile cloning vectors with Kanamycinresis
tance marker Gene 56（1987）:309−312〕 と連結した。
生成したプラスミドpK18lys（3.7kb）から、制限酵素
BclI及びHind IIIで切断することによりlys A−コード
付け領域の内部フラグメントを単離し、かつBam HI及び
Hind IIIで制限されたベクターpSUP102と融合した。
BclI及びHind IIIで切断することによりlys A−コード
付け領域の内部フラグメントを単離し、かつBam HI及び
Hind IIIで制限されたベクターpSUP102と融合した。
生成ベクターpEM lys1（6.7kb）中でトランスポゾンT
n903のカナマイシン耐性遺伝子をクローン化した。この
ためにpEM lys1をPst Iで消化させて線状化しかつベク
ターpUC4Kの1.4kbのPstIフラグメントと連結させた。
n903のカナマイシン耐性遺伝子をクローン化した。この
ためにpEM lys1をPst Iで消化させて線状化しかつベク
ターpUC4Kの1.4kbのPstIフラグメントと連結させた。
このようにして生成したベクターpEM lys2（8.1kb）
を運動菌株E.コリS17−１中に転移させた。例２に詳説
した方法により、このプラスミドをE.コリからC.グルタ
ミクムATCC13032に接合した。カナマイシン耐性のコロ
ニーが供与菌力価に対して頻度２×10-7で生じた。
を運動菌株E.コリS17−１中に転移させた。例２に詳説
した方法により、このプラスミドをE.コリからC.グルタ
ミクムATCC13032に接合した。カナマイシン耐性のコロ
ニーが供与菌力価に対して頻度２×10-7で生じた。
カナマイシン耐性の転移接合体を最小寒天〔H.Kaneko
＆ K.Sakaguchi,Fusion of protoplasts and genetic
recombination of Brevibacterium flavum Agric.Biol.
Chem.43（1979）:1007−1013〕に、かつＬ−リシンを追
加した最小寒天にスタンピングした。このように試験し
た転移接合体はpEM lys2の組み込みによる染色体lys A
−遺伝子の挿入不活性化に相応してリシン栄養要求性野
性型を有する。
＆ K.Sakaguchi,Fusion of protoplasts and genetic
recombination of Brevibacterium flavum Agric.Biol.
Chem.43（1979）:1007−1013〕に、かつＬ−リシンを追
加した最小寒天にスタンピングした。このように試験し
た転移接合体はpEM lys2の組み込みによる染色体lys A
−遺伝子の挿入不活性化に相応してリシン栄養要求性野
性型を有する。
転移接合体の溶菌（Birnboim et al.Nucl.Acids Res.
7:1513−1523〕及び引き続いて行なつたアガロース−ゲ
ル電気泳動による分析で、細胞中に遊離プラスミドは検
出されなかつた。
7:1513−1523〕及び引き続いて行なつたアガロース−ゲ
ル電気泳動による分析で、細胞中に遊離プラスミドは検
出されなかつた。
特異的組み込みの検出により、C.グルタミクム野性型
細胞及び転移接合体から単離した全DNAに対する、標識
E.コリベクターpSUP102のジゴキシゲニンハイブリツド
化〔E.W.Khandjian Bio/Technology5（1987）:165〕が
明らかになり、その際転移接合体からのDNAだけがE.コ
リベクタのDNAとハイブリツド化した。
細胞及び転移接合体から単離した全DNAに対する、標識
E.コリベクターpSUP102のジゴキシゲニンハイブリツド
化〔E.W.Khandjian Bio/Technology5（1987）:165〕が
明らかになり、その際転移接合体からのDNAだけがE.コ
リベクタのDNAとハイブリツド化した。
【図面の簡単な説明】 第１図はベクターpCV35、pSUP102及びpECM1の制限地図
を示す図、第２図は可動性E.コリ−C.グルタミクム−シ
ヤトルベクターpECM3の制限地図を示す図、第３図は遺
伝子切断による染色体DNAの突然変異を示す図、第４図
はベクターpK18lysの構成を示す図、第５図はベクターp
EM lys1の構成を示す図、第６図はベクターpEM lys2の
構成を示す図である。
を示す図、第２図は可動性E.コリ−C.グルタミクム−シ
ヤトルベクターpECM3の制限地図を示す図、第３図は遺
伝子切断による染色体DNAの突然変異を示す図、第４図
はベクターpK18lysの構成を示す図、第５図はベクターp
EM lys1の構成を示す図、第６図はベクターpEM lys2の
構成を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (54)【発明の名称】 Ｅ．コリ運動菌株から可動性ベクターをグラム陽性菌中に接合転移させる方法，可動性非自己伝 達ベクター，グラム陽性菌の挿入突然変異法及びＤＮＡセグメント中に含まれるレプリコンの宿 主域の測定法
Claims (18)
- 【請求項１】グラム陽性菌の制限系を欠失した細胞を製
造し、かつ該細胞を （ａ）E.コリ中で機能的なレプリコンを含有するDNAセ
グメント、 （ｂ）可動性−及び転移機能をコードするDNAフラグメ
ントを含有する第２のDNAセグメント、 （ｃ）グラム陽性菌中で相同的に組み換わりかつ／又は
グラム陽性菌中で機能的なレプリコンを含有する第３の
DNAセグメント及び （ｄ）場合により（ｃ）の代わりに又は（ｃ）中に含ま
れているトランスポゾン より成る可動性の非伝達性ベクターを有するE.コリ菌株
と公知法により交雑させることを特徴とする、E.コリ運
動菌株から可動性ベクターをグラム陽性菌中に接合転移
させる方法。 - 【請求項２】ベクターが可動性機能をコードするDNA領
域を有しかつE.コリ運動菌株が、可動に必要な機能を与
えることのできるプラスミドを染色体中に組み込まれて
含有するか又は遊離して含有することを特徴とする、請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】ベクターがプラスミドRP4の大きさ1.9kbの
可動性機能を有するDNAフラグメントを有しかつE.コリ
運動菌株の染色体中に、転移機能がトランス型で前記ベ
クターの可動性機能をコードする領域に作用するRP4誘
導体が組み込まれていることを特徴とする、請求項２記
載の方法。 - 【請求項４】E.コリ菌株をE.コリS17−１、E.コリSM10
又はE.コリS68−７の群類から選択することを特徴とす
る、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】E.コリベクターをpSUP101、pSUP102、pSUP
201、pSUP202、pSUP203、pSUP205、pSUP301、pSUP401の
群類から選択することを特徴とする、請求項２から４ま
でのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】使用するグラム陽性菌の制限系を交雑の直
前にヒート・ショックにより欠失させることを特徴とす
る、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】受容菌の完全細胞を使用することを特徴と
する、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】受容菌のスフェロプラスト細胞を使用する
ことを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項
記載の方法。 - 【請求項９】グラム陽性菌中で活性な、この形質転換す
べき細菌中で相応する遺伝子と相同的に組み換わる遺伝
子が挿入されている可動性ベクターを使用することを特
徴とする、請求項１から８までのいずれか１項記載の方
法。 - 【請求項１０】トランスポゾンが挿入されており、かつ
E.コリ又はグラム陽性菌中の酵素活性をコードする遺伝
子が挿入されていてもよい可動性ベクターを使用するこ
とを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項記
載の方法。 - 【請求項１１】受容菌中で複製するプラスミドまたはベ
クターとシャトルベクターに融合している可動性ベクタ
ーを使用することを特徴とする、請求項１から８までの
いずれか１項記載の方法。 - 【請求項１２】（ａ）E.コリ中で機能的なレプリコンを
含有するDNAセグメント、 （ｂ）可動性−及び転移機能をコードするDNAフラグメ
ントを含有する第２のDNAセグメント、 （ｃ）グラム陽性菌中で相同的に組み換わりかつ／又は
グラム陽性菌中で機能的なレプリコンを含有する第３の
DNAセグメント及び （ｄ）場合により（ｃ）の代わりに又は（ｃ）中に含ま
れているトランスポゾン より成る可動性の非伝達性ベクター。 - 【請求項１３】第３のDNAセグメント（ｃ）が次の制限
酵素地図： を有するベクターpCV35から誘導されることを特徴とす
る、請求項12記載のベクター。 - 【請求項１４】DNAセグメント（ａ）及び（ｂ）が群類p
SUP101、pSUP102、pSUP201、pSUP202、pSUP203、pSUP20
5、pSUP301又はpSUP401からのベクターの１つから誘導
されることを特徴とする、請求項12又は13記載のベクタ
ー。 - 【請求項１５】E.コリS17−１、DSM4982で寄託された、
次の制限地図： を有するベクターpECM1であることを特徴とする、請求
項12から14までのいずれか１項記載のベクター。 - 【請求項１６】次の制限地図： を有するベクターpECM3であることを特徴とする、請求
項12記載のベクター。 - 【請求項１７】請求項12から16までのいずれか１項記載
のベクターを使用することを特徴とする、グラム陽性菌
の挿入突然変異法。 - 【請求項１８】請求項12から16までのいずれか１項記載
のベクターを使用することを特徴とする、DNAセグメン
ト（ｃ）中に含まれるレプリコンの宿主域の測定法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3841453.8 | 1988-12-09 | ||
| DE3841453A DE3841453A1 (de) | 1988-12-09 | 1988-12-09 | Verfahren zum konjugativen transfer von mobilisierbaren vektoren aus e.coli in gram-positive bakterien und dafuer geeignete vektoren |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02273188A JPH02273188A (ja) | 1990-11-07 |
| JPH0829094B2 true JPH0829094B2 (ja) | 1996-03-27 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1319064A Expired - Lifetime JPH0829094B2 (ja) | 1988-12-09 | 1989-12-11 | Ｅ．コリ運動菌株から可動性ベクターをグラム陽性菌中に接合転移させる方法，可動性非自己伝達ベクター，グラム陽性菌の挿入突然変異法及びｄｎａセグメント中に含まれるレプリコンの宿主域の測定法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5346818A (ja) |
| EP (1) | EP0372230B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0829094B2 (ja) |
| AU (1) | AU626953B2 (ja) |
| DE (2) | DE3841453A1 (ja) |
| ES (1) | ES2057061T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| DK0501921T3 (da) * | 1991-03-01 | 2001-10-15 | Syngenta Participations Ag | Fremgangsmåde til genetisk manipulering af myxobakterier |
| WO1993004169A1 (en) * | 1991-08-20 | 1993-03-04 | Genpharm International, Inc. | Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs |
| DE4208785A1 (de) * | 1992-03-19 | 1993-09-23 | Degussa | Verfahren zum auffinden von insertionselementen (is-elemente) oder transposonen |
| EP0817856A1 (en) * | 1995-03-22 | 1998-01-14 | Novo Nordisk A/S | Introduction of dna into bacillus strains by conjugation |
| JP2001508282A (ja) * | 1996-01-19 | 2001-06-26 | ノボ ノルディスク バイオテック，インコーポレイティド | 接合において有用な細菌ドナー細胞 |
| US5763187A (en) * | 1997-01-17 | 1998-06-09 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Bacterial donor cell useful in conjugation |
| US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| DE10137815A1 (de) * | 2001-08-06 | 2003-02-27 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung eines marker-freien mutierten Zielorganismus sowie dafür geeignete Plasmidvektoren |
| US6524147B1 (en) * | 2001-09-28 | 2003-02-25 | Mark X Steering Systems, Llc | Power assist marine steering system |
| WO2005010144A2 (en) * | 2003-04-21 | 2005-02-03 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Displacing a plasmid in a bacterial population |
| ATE469984T1 (de) | 2003-12-01 | 2010-06-15 | Life Technologies Corp | Rekombinationsstellen enthaltende nukleinsäuremoleküle und verfahren zur verwendung davon |
| FR3099769B1 (fr) | 2019-08-05 | 2021-11-05 | Bgene Genetics | Mutagénèse bactérienne par conjugaison en milieu liquide |
| CN117280036A (zh) * | 2021-05-25 | 2023-12-22 | 丝芭博株式会社 | 质粒的制备方法及质粒 |
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|---|---|---|---|---|
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| JPS60192586A (ja) * | 1984-03-12 | 1985-10-01 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 制限欠損変異株 |
-
1988
- 1988-12-09 DE DE3841453A patent/DE3841453A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-11-01 NO NO89894345A patent/NO894345L/no unknown
- 1989-11-06 EP EP89120473A patent/EP0372230B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-06 DE DE8989120473T patent/DE58904497D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-06 ES ES89120473T patent/ES2057061T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-08 AU AU46086/89A patent/AU626953B2/en not_active Ceased
- 1989-12-08 US US07/447,139 patent/US5346818A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-11 JP JP1319064A patent/JPH0829094B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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|---|---|
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| NO894345D0 (no) | 1989-11-01 |
| JPH02273188A (ja) | 1990-11-07 |
| EP0372230A3 (de) | 1991-09-04 |
| EP0372230A2 (de) | 1990-06-13 |
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| ES2057061T3 (es) | 1994-10-16 |
| AU626953B2 (en) | 1992-08-13 |
| EP0372230B1 (de) | 1993-05-26 |
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| AU4608689A (en) | 1990-06-14 |
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