JP2944841B2 - コリネ型バクテリア中の挿入配列又はトランスポゾンの発見法及び発見用陽性選択システム、挿入配列のｄｎａ、及びコリネ型バクテリアの突然変異誘発法並びに菌株のゲノム中での更なるコピーの検出法 - Google Patents
コリネ型バクテリア中の挿入配列又はトランスポゾンの発見法及び発見用陽性選択システム、挿入配列のｄｎａ、及びコリネ型バクテリアの突然変異誘発法並びに菌株のゲノム中での更なるコピーの検出法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はコリネ型バクテリア中の
挿入配列（ＩＳ−配列）又はトランスポゾンの発見法、
これに好適な陽性選択システム、こうして見い出された
ＩＳ−配列及びその使用に関する。
挿入配列（ＩＳ−配列）又はトランスポゾンの発見法、
これに好適な陽性選択システム、こうして見い出された
ＩＳ−配列及びその使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】挿入配列（ＩＳ−配列）は原核細胞ゲノ
ム中ではレプリコンの中で、または１つのレプリコンか
ら他のレプリコンに跳ぶ（移子）ことができる、約０．
６〜１．８キロ塩基（ｋｂ）の長さのＤＮＡ−領域であ
る（Ｃｒａｉｇ＆Ｋｌｅｃｋｎｅｒ１９８７、Ｎｅｉｄ
ｈａｒｄｔ等、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａ
ｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，
Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ、第１０５４〜１０７４頁、ＡＳＭ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）。この際、従来の転
位が生じるか、すなわち、配列はその位置を変えるか、
または複製型転位し、この際配列のコピーだけが新しい
挿入部位に統合され、一方オリジナルはもとの場所に残
る。複製型転位の際に供与分子及び受容分子が融合する
ことがある（レプリコン−融合）。この転位の中間段階
は融合点にあるＩＳ−配列のコピーの組換えにより惹起
する。レプリコン−融合に関して好適な選択においてこ
のＩＳ配列は保持される。ＩＳ−配列自体は著しく類似
のトランスポゾンとは異なり選択可能な標識を有さな
い。ＩＳ−配列は多くの場合唯一の遺伝子生成物だけを
コードしており、これはいわゆるトランスポザーゼであ
る。この際、挿入配列の開放読みとり枠１つ又は２つか
ら読みとられ、かついわゆる不当な、すなわち宿主有機
体の組換えシステムとは独立した組換えにより転位が配
列の逆方向反復末端に行なわれる、組換え蛋白質が問題
である。
ム中ではレプリコンの中で、または１つのレプリコンか
ら他のレプリコンに跳ぶ（移子）ことができる、約０．
６〜１．８キロ塩基（ｋｂ）の長さのＤＮＡ−領域であ
る（Ｃｒａｉｇ＆Ｋｌｅｃｋｎｅｒ１９８７、Ｎｅｉｄ
ｈａｒｄｔ等、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａ
ｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，
Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ、第１０５４〜１０７４頁、ＡＳＭ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）。この際、従来の転
位が生じるか、すなわち、配列はその位置を変えるか、
または複製型転位し、この際配列のコピーだけが新しい
挿入部位に統合され、一方オリジナルはもとの場所に残
る。複製型転位の際に供与分子及び受容分子が融合する
ことがある（レプリコン−融合）。この転位の中間段階
は融合点にあるＩＳ−配列のコピーの組換えにより惹起
する。レプリコン−融合に関して好適な選択においてこ
のＩＳ配列は保持される。ＩＳ−配列自体は著しく類似
のトランスポゾンとは異なり選択可能な標識を有さな
い。ＩＳ−配列は多くの場合唯一の遺伝子生成物だけを
コードしており、これはいわゆるトランスポザーゼであ
る。この際、挿入配列の開放読みとり枠１つ又は２つか
ら読みとられ、かついわゆる不当な、すなわち宿主有機
体の組換えシステムとは独立した組換えにより転位が配
列の逆方向反復末端に行なわれる、組換え蛋白質が問題
である。
【０００３】挿入配列のバクテリア遺伝子への転位は通
常これを損傷する、すなわち突然変異が生じる（Ｃｒａ
ｉｇ＆Ｋｌｅｃｋｎｅｒ、１９８７年、前記）。それと
共に極性効果、すなわち前方の遺伝子中への統合による
オペロンの転写の中断により、更に後方にある遺伝子の
発現を阻害することがある。内生挿入配列は天然又は組
換え微生物の遺伝学的不安定性に寄与することがある。
この際ＩＳ−配列の挿入とともに隣接領域の欠失又はＤ
ＮＡの再編成を惹起する。更に、挿入配列が特に生成条
件下に、プラスミドの安定性にマイナスの影響を与える
ことがあることは公知である（Ｋｕｍａｒ等、Ｔｒｅｎ
ｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．第９巻、第２７９〜２８４頁、
１９９１年）。従来、挿入配列はすでに多くの異なる属
のバクテリアにおいて証明された。グラム陽性バクテリ
アにおいては、特にバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ス
タフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、
ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、
ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びス
トレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の属か
らの挿入配列が公知である。
常これを損傷する、すなわち突然変異が生じる（Ｃｒａ
ｉｇ＆Ｋｌｅｃｋｎｅｒ、１９８７年、前記）。それと
共に極性効果、すなわち前方の遺伝子中への統合による
オペロンの転写の中断により、更に後方にある遺伝子の
発現を阻害することがある。内生挿入配列は天然又は組
換え微生物の遺伝学的不安定性に寄与することがある。
この際ＩＳ−配列の挿入とともに隣接領域の欠失又はＤ
ＮＡの再編成を惹起する。更に、挿入配列が特に生成条
件下に、プラスミドの安定性にマイナスの影響を与える
ことがあることは公知である（Ｋｕｍａｒ等、Ｔｒｅｎ
ｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．第９巻、第２７９〜２８４頁、
１９９１年）。従来、挿入配列はすでに多くの異なる属
のバクテリアにおいて証明された。グラム陽性バクテリ
アにおいては、特にバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ス
タフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、
ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、
ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びス
トレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の属か
らの挿入配列が公知である。
【０００４】コリネ型バクテリア、特にアミノ酸生産性
バクテリアからの挿入配列は従来に記載されていなかっ
た。
バクテリアからの挿入配列は従来に記載されていなかっ
た。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題はコリネ
型バクテリア中の挿入配列の発見のための方法及びこれ
に属する陽性選択システムを提供することである。
型バクテリア中の挿入配列の発見のための方法及びこれ
に属する陽性選択システムを提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の課題はコリネ型
バクテリア中の挿入配列（ＩＳ−配列）及びトランスポ
ゾンの発見法もしくはこの種の配列に関しての該バクテ
リアの研究であり、この方法は、 １．１．１ 大腸菌中で機能的なレプリコンを含有する
ＤＮＡ−セグメント、 １．１．２ 移動性機能をコードするＤＮＡ−フラグメ
ントを含有する第２のＤＮＡ−セグメント（ｏｒｉＴを
含有するＭｏｂ−部位）、 １．１．３ グラム陽性菌中で相同組換えをし、かつ／
またはコリネ型バクテリア中で機能的なレプリコンを含
有する第３のＤＮＡ−セグメント、 １．１．４ バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からの、ｓａｃＢ−遺伝子を含有
するＤＮＡ−セグメント、からなる １．１． 大腸菌移動性菌株からの移動性、自己非転位
性ベクターの構造 １．２． 接合移入による該ベクターのコリネ型受容菌
株中への移動、 １．３． 該ベクターを含有する移入接合体の約１０％
蔗糖を含有する栄養培地中での培養、 １．４． 蔗糖耐性クローンの細胞溶解、制限エンドヌ
クレアーゼでのプラスミドの切断及びフラグメントの分
析、を包含する。
バクテリア中の挿入配列（ＩＳ−配列）及びトランスポ
ゾンの発見法もしくはこの種の配列に関しての該バクテ
リアの研究であり、この方法は、 １．１．１ 大腸菌中で機能的なレプリコンを含有する
ＤＮＡ−セグメント、 １．１．２ 移動性機能をコードするＤＮＡ−フラグメ
ントを含有する第２のＤＮＡ−セグメント（ｏｒｉＴを
含有するＭｏｂ−部位）、 １．１．３ グラム陽性菌中で相同組換えをし、かつ／
またはコリネ型バクテリア中で機能的なレプリコンを含
有する第３のＤＮＡ−セグメント、 １．１．４ バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からの、ｓａｃＢ−遺伝子を含有
するＤＮＡ−セグメント、からなる １．１． 大腸菌移動性菌株からの移動性、自己非転位
性ベクターの構造 １．２． 接合移入による該ベクターのコリネ型受容菌
株中への移動、 １．３． 該ベクターを含有する移入接合体の約１０％
蔗糖を含有する栄養培地中での培養、 １．４． 蔗糖耐性クローンの細胞溶解、制限エンドヌ
クレアーゼでのプラスミドの切断及びフラグメントの分
析、を包含する。
【０００７】好適なベクターの構成（しかしながらその
作用は捕獲ベクターとしてではない）は接合移入のため
の方法と同様原則的に西独特許公開第３８４１４５３号
公報中に記載されている。
作用は捕獲ベクターとしてではない）は接合移入のため
の方法と同様原則的に西独特許公開第３８４１４５３号
公報中に記載されている。
【０００８】これは、有利にはグラム陽性菌の制限損傷
細胞を製造し、これを自体公知の交雑法で移動性ベクタ
ーを有する大腸菌移動性菌株と混合することを特徴とす
る。機能性制限システムの欠失もしくは熱ショックは移
入を容易にするが必須の前提ではない。
細胞を製造し、これを自体公知の交雑法で移動性ベクタ
ーを有する大腸菌移動性菌株と混合することを特徴とす
る。機能性制限システムの欠失もしくは熱ショックは移
入を容易にするが必須の前提ではない。
【０００９】供与体が有利に対数増殖期にある時、受容
体の状態は成長停止期にあるのが有利であることが証明
されている。
体の状態は成長停止期にあるのが有利であることが証明
されている。
【００１０】供与細胞及び受容細胞は一般に１：１〜
１：１０、有利に１：１〜１：６の比で使用する。
１：１０、有利に１：１〜１：６の比で使用する。
【００１１】好適な移動性ベクターは自己非転位性では
ない。
ない。
【００１２】１．１は一般的に大腸菌中の独立したすべ
ての再生性プラスミド（ベクター）であり、かつ公知技
術により遺伝子工学的適用に有用であるとして証明され
ているものを示す。
ての再生性プラスミド（ベクター）であり、かつ公知技
術により遺伝子工学的適用に有用であるとして証明され
ているものを示す。
【００１３】そのような大腸菌ベクターの例としてはｐ
ＭＢ９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＫＢ１１１、
ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＣＹＣ１
７７、ｐＳＣ１０１である。
ＭＢ９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＫＢ１１１、
ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＣＹＣ１
７７、ｐＳＣ１０１である。
【００１４】通常の大腸菌ベクター、例えばｐＢＲ３２
５（Ｂｏｌｉｖａｒ，Ｆ．等、Ｇｅｎｅ、第２巻、第９
５頁、１９７７年）又はｐＡＣＹＣ１８４（Ｃｈａｎ
ｇ，Ａ．Ｃ．Ｙ．及びＣｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｊ．Ｂａ
ｃｔ．第１３４巻、第１１４１頁、１９７８年）は自己
転位性でもないし、十分な移動性でもない。
５（Ｂｏｌｉｖａｒ，Ｆ．等、Ｇｅｎｅ、第２巻、第９
５頁、１９７７年）又はｐＡＣＹＣ１８４（Ｃｈａｎ
ｇ，Ａ．Ｃ．Ｙ．及びＣｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｊ．Ｂａ
ｃｔ．第１３４巻、第１１４１頁、１９７８年）は自己
転位性でもないし、十分な移動性でもない。
【００１５】大腸菌群のバクテリア株中でのみ複製する
これら及び他のベクターはグラム陰性バクテリア中の広
い宿主域を有するプラスミドのＭｏｂ−部位の挿入によ
り変性される。この目的のためにはプラスミドＲＰ４を
使用するのが有利である。ＲＰ４の約１．９ｋｂの大き
さのフラグメント（Ｍｏｂ−部位）を有するこの種のベ
クターは本発明方法において有利に使用される。移動性
菌株として好適であるのは、移動のために必要な機能を
用意することのできるプラスミドを染色体中に統合して
又は遊離して含有する変性大腸菌株である。
これら及び他のベクターはグラム陰性バクテリア中の広
い宿主域を有するプラスミドのＭｏｂ−部位の挿入によ
り変性される。この目的のためにはプラスミドＲＰ４を
使用するのが有利である。ＲＰ４の約１．９ｋｂの大き
さのフラグメント（Ｍｏｂ−部位）を有するこの種のベ
クターは本発明方法において有利に使用される。移動性
菌株として好適であるのは、移動のために必要な機能を
用意することのできるプラスミドを染色体中に統合して
又は遊離して含有する変性大腸菌株である。
【００１６】その染色体中にＲＰ４−誘導体を統合して
おり、かつその移動機能が前記ベクターのＭｏｂ−部位
上への移動に作用する菌株が特に好適である。
おり、かつその移動機能が前記ベクターのＭｏｂ−部位
上への移動に作用する菌株が特に好適である。
【００１７】好適なベクター及び大腸菌移動菌株、例え
ばＳＭ−１０、Ｓ６８−７及びＳ１７−１は米国特許第
４，６２６，５０４号明細書から公知である。移動を容
易にする制限欠陥は遺伝学的な条件によってもよいし、
例えば突然変異誘発試薬（例えばＮＴＧ：メチルニトロ
ニトロソグアニジン）により惹起されるが、物理的な条
件、例えば加熱ショックによってもよい。特に効果的で
あるのは交雑の直前に受容体を熱処理することであるこ
とが証明されている。この際、完全であるか又はスフェ
ロプラスト化細胞を使用すべきである。こうしてはじめ
て、グラム陽性バクテリア中の所定の挿入配列を見い出
すことが達せられる。この目的に使用される、コリネ型
バクテリア中の挿入配列を見いだすための陽性選択シス
テム（ｓａｃＢ−システム）は移動性で、非自己転位性
ベクターを包含し、これは ａ）大腸菌中で機能的なレプリコンを含有するＤＮＡ−
セグメント、 ｂ）移動性機能をコードするＤＮＡ−フラグメントを含
有する第２のＤＮＡ−セグメント（ｏｒｉＴを含有する
Ｍｏｂ−部位） ｃ）グラム陽性菌中で相同組換えをし、かつ／またはコ
リネ型バクテリア中で機能的なレプリコンを含有する第
３のＤＮＡ−セグメント、 ｄ）バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ）からの、ｓａｃＢ−遺伝子を含有するＤＮ
Ａ−セグメント、からなっている。
ばＳＭ−１０、Ｓ６８−７及びＳ１７−１は米国特許第
４，６２６，５０４号明細書から公知である。移動を容
易にする制限欠陥は遺伝学的な条件によってもよいし、
例えば突然変異誘発試薬（例えばＮＴＧ：メチルニトロ
ニトロソグアニジン）により惹起されるが、物理的な条
件、例えば加熱ショックによってもよい。特に効果的で
あるのは交雑の直前に受容体を熱処理することであるこ
とが証明されている。この際、完全であるか又はスフェ
ロプラスト化細胞を使用すべきである。こうしてはじめ
て、グラム陽性バクテリア中の所定の挿入配列を見い出
すことが達せられる。この目的に使用される、コリネ型
バクテリア中の挿入配列を見いだすための陽性選択シス
テム（ｓａｃＢ−システム）は移動性で、非自己転位性
ベクターを包含し、これは ａ）大腸菌中で機能的なレプリコンを含有するＤＮＡ−
セグメント、 ｂ）移動性機能をコードするＤＮＡ−フラグメントを含
有する第２のＤＮＡ−セグメント（ｏｒｉＴを含有する
Ｍｏｂ−部位） ｃ）グラム陽性菌中で相同組換えをし、かつ／またはコ
リネ型バクテリア中で機能的なレプリコンを含有する第
３のＤＮＡ−セグメント、 ｄ）バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ）からの、ｓａｃＢ−遺伝子を含有するＤＮ
Ａ−セグメント、からなっている。
【００１８】挿入配列（ＩＳ−配列）又はトランスポゾ
ンの本発明による単離のために、バシラス・ズブチリス
からのｓａｃＢ−遺伝子を使用する（Ｇａｙ等、Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．第１５３巻、第１４２４〜１４３１
頁、１９８３年）。この遺伝子は蔗糖加水分解及びレバ
ン合成を触媒する外来酵素、レバンスクラーゼ（Ｌｅｖ
ａｎｓｕｃｒａｓｅ）をコードする（Ｄｅｄｏｎｄｅｒ
等、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第８巻、
第５００〜５０５頁、１９６６年）。大腸菌中でのｓａ
ｃＢの発現は酵素のペリプラズム中への搬送に導びき
（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ等、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．第１９１頁、第１３８〜１４４頁、１９８３年）、
かつ大腸菌及び他のグラム陰性バクテリアにとって蔗糖
を５％を越えて含有する培地において死に到る（Ｇａｙ
等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１６４巻、第９１８
〜９２１頁）。
ンの本発明による単離のために、バシラス・ズブチリス
からのｓａｃＢ−遺伝子を使用する（Ｇａｙ等、Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．第１５３巻、第１４２４〜１４３１
頁、１９８３年）。この遺伝子は蔗糖加水分解及びレバ
ン合成を触媒する外来酵素、レバンスクラーゼ（Ｌｅｖ
ａｎｓｕｃｒａｓｅ）をコードする（Ｄｅｄｏｎｄｅｒ
等、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第８巻、
第５００〜５０５頁、１９６６年）。大腸菌中でのｓａ
ｃＢの発現は酵素のペリプラズム中への搬送に導びき
（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ等、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．第１９１頁、第１３８〜１４４頁、１９８３年）、
かつ大腸菌及び他のグラム陰性バクテリアにとって蔗糖
を５％を越えて含有する培地において死に到る（Ｇａｙ
等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１６４巻、第９１８
〜９２１頁）。
【００１９】完全なｓａｃＢ−遺伝子の発現がグラム陽
性バクテリア、例えばＣ．グルタミクム（ｇｌｕｔａｍ
ｉｃｕｍ）及び他のコリネ型バクテリア中でも蔗糖１０
％を含有する培地上で致死に導びくということが見い出
された。
性バクテリア、例えばＣ．グルタミクム（ｇｌｕｔａｍ
ｉｃｕｍ）及び他のコリネ型バクテリア中でも蔗糖１０
％を含有する培地上で致死に導びくということが見い出
された。
【００２０】従って、不活性化ｓａｃＢ−遺伝子を有す
るコロニーはこの種の培地上で陽性で選択される、それ
というのもこの場合ｓａｃＢ中に挿入される挿入配列に
より不活性化がひき起こされるためである。次いで、こ
れは制限分析により位置ぎめされる。
るコロニーはこの種の培地上で陽性で選択される、それ
というのもこの場合ｓａｃＢ中に挿入される挿入配列に
より不活性化がひき起こされるためである。次いで、こ
れは制限分析により位置ぎめされる。
【００２１】ｓａｃＢ−遺伝子を含有する捕獲ベクター
ｐＷＪ５を使用するのが有利である。その制限地図を図
４に示す。このベクターはプラスミドｐＥＣＭ１（西独
特許公開第３８４１４５３号公報）及びｐＵＭ２４（Ｒ
ｉｅｄ及びＣｏｌｌｍｅｒ．Ｇｅｎｅ、第５７巻、１９
８７年、第２３９〜２４６頁）から誘導される。
ｐＷＪ５を使用するのが有利である。その制限地図を図
４に示す。このベクターはプラスミドｐＥＣＭ１（西独
特許公開第３８４１４５３号公報）及びｐＵＭ２４（Ｒ
ｉｅｄ及びＣｏｌｌｍｅｒ．Ｇｅｎｅ、第５７巻、１９
８７年、第２３９〜２４６頁）から誘導される。
【００２２】プラスミドｐＵＭ２４を酵素ＢａｍＨＩ及
びＥｃｏＲＶで切断した後、ｓａｃＢ−遺伝子を有し、
かつ有利に使用される約１．９ｋｂの大きさのＤＮＡ−
フラグメントが生じる。
びＥｃｏＲＶで切断した後、ｓａｃＢ−遺伝子を有し、
かつ有利に使用される約１．９ｋｂの大きさのＤＮＡ−
フラグメントが生じる。
【００２３】このような方法で３種の異なるそれぞれの
バクテリアの属に明らかに特徴的なＩＳ−配列が一連の
コリネ型バクテリア中に見い出され、これらをその由来
からＩＳＣｇ１、ＩＳＢｌ１及びＩＳＲｆ１と名付ける
（表１及び表２）。この際、宿主領域はその中にそれぞ
れのＩＳ−配列か見い出されたバクテリアの属を越える
ことができる。
バクテリアの属に明らかに特徴的なＩＳ−配列が一連の
コリネ型バクテリア中に見い出され、これらをその由来
からＩＳＣｇ１、ＩＳＢｌ１及びＩＳＲｆ１と名付ける
（表１及び表２）。この際、宿主領域はその中にそれぞ
れのＩＳ−配列か見い出されたバクテリアの属を越える
ことができる。
【００２４】本発明方法により同定された、ジゴキシゲ
ニン−ｄ−ＵＴＰで標識したＩＳ−配列のＤＮＡを、例
えばＥｃｏＲＩ又は他の好適なエンドヌクレアーゼで切
断した検査すべき微生物からの総−ＤＮＡとハイブリッ
ド形成することにより、この菌株のゲノム中に場合によ
り存在するこのＩＳ−配列の更なるコピーが検出され
た。
ニン−ｄ−ＵＴＰで標識したＩＳ−配列のＤＮＡを、例
えばＥｃｏＲＩ又は他の好適なエンドヌクレアーゼで切
断した検査すべき微生物からの総−ＤＮＡとハイブリッ
ド形成することにより、この菌株のゲノム中に場合によ
り存在するこのＩＳ−配列の更なるコピーが検出され
た。
【００２５】こうして本発明の課題は特に表２にあげた
ＩＳ−配列であり、これらに特に特徴的であるのは総
長、逆方向反復末端（ＩＲ）の長さ及び直接反復目標配
列（ＤＲ）の長さである。
ＩＳ−配列であり、これらに特に特徴的であるのは総
長、逆方向反復末端（ＩＲ）の長さ及び直接反復目標配
列（ＤＲ）の長さである。
【００２６】逆方向反復末端の配列中で天然塩基を専門
家に常用の方法で、作用を変えることなく、同等のもの
に変えることができる。このことは同定したＩＳＣｇ１
のヌクレオチド配列にも言える（図２、図３）。
家に常用の方法で、作用を変えることなく、同等のもの
に変えることができる。このことは同定したＩＳＣｇ１
のヌクレオチド配列にも言える（図２、図３）。
【００２７】
【００２８】 表２ 見い出されたＩＳ−配列の特性 名 称 ＩＳＣｇ１ ＩＳＢｌ１ ＩＳＲｆ１ 有機体 コリネバクテリウム・ ブレビバクテリウム・ ロドコックス・ グルタミクム ラクトフェルメンツム ファシアンス 総長 約１．４５ｋｂ 約１．４５ｋｂ 約１．３ｋｂ ＩＲの長さ ２４ｂｐ ２６ｂｐ １８ｂｐ ＤＲの長さ ８ｂｐ ８ｂｐ ３ｂｐ 宿主中のコピー ４〜７ ４ ３ 宿主領域 Ｃ．ヘルクリス（ｈｅｒｃｕｌｉｓ） Ｂ．フラブム（ｆｌａｖｕｍ） Ｒ．ファシアンス（ｆａｓｃｉａｎｓ） ＩＲ：逆方向反復末端 ＤＲ：直接反復目標配列 ｋｂ：キロ塩基対 ｂｐ：塩基対 逆方向反復末端の配列＊）＊＊） ＩＲ−Ｌ ＧＧＣｃＣＴＴＣＣｇＧＴＴＴＴｇＧｇＧＴａＣＡＴｃａ ＩＳＣｇ１ ＩＲ−Ｒ ＧＧＣｔＣＴＴＣＣｔＧＴＴＴＴａＧａＧＴｇＣＡＴｔｇ ＩＲ−Ｌ ＧＧＣＴＣＴＴＣＣＧＴＴｔＴＴＡＧＡＧＴＧＣＡＴＴＧ ＩＳＢｌ１ ＩＲ−Ｒ ＧＧＣＴＣＴＴＣＣＧＴＴｇＴＴＡＧＡＧＴＧＣＡＴＴＧ ＩＲ−１ ＧＧａＣＣｔＧＡＣＣＣＣｃＡＴｔＴＧ ＩＳＲｆ１ ＩＲ−２ ＧＧｇＣＣｃＧＡＣＣＣＣｇＡＴａＴＧ ＊） 小文字は非相同塩基対を示す。
【００２９】＊＊）ＩＳＣｇ１及びＩＳＢｌ１は約７５
％の配列相同を有する。
％の配列相同を有する。
【００３０】コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）
ＡＴＣＣ１３０３２の突然変異体についてＩＳ−配列の
作用を示すことが可能である。
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）
ＡＴＣＣ１３０３２の突然変異体についてＩＳ−配列の
作用を示すことが可能である。
【００３１】Ｃ．グルタミクム突然変異体ＬＴ５．５は
Ｃ．グルタミクム野生型−菌株ＡＴＣＣ１３０３２から
直接誘導された自然に生じたＳ−（２−アミノエチル）
−システィン（ＡＥＣ）耐性突然変異体であり、これは
リジン取り込みにおける欠陥を示す。このｌｙｓＩ−遺
伝子はＣ．グルタミクムにおいてリジン取り込みに関与
する遺伝子である。この遺伝子及び隣接するＤＮＡ−領
域はクローン化されており、かつｌｙｓＩ−遺伝子のヌ
クレオチド配列は公知である（Ｓｅｅｐ−Ｆｅｌｄｈａ
ｕｓ，Ａ．−Ｈ．，Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．及びＰ
ｕｅｈｌｅｒ，Ａ．（１９９１）、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．第５巻：第２９９５〜３００５頁）。
Ｃ．グルタミクム野生型−菌株ＡＴＣＣ１３０３２から
直接誘導された自然に生じたＳ−（２−アミノエチル）
−システィン（ＡＥＣ）耐性突然変異体であり、これは
リジン取り込みにおける欠陥を示す。このｌｙｓＩ−遺
伝子はＣ．グルタミクムにおいてリジン取り込みに関与
する遺伝子である。この遺伝子及び隣接するＤＮＡ−領
域はクローン化されており、かつｌｙｓＩ−遺伝子のヌ
クレオチド配列は公知である（Ｓｅｅｐ−Ｆｅｌｄｈａ
ｕｓ，Ａ．−Ｈ．，Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．及びＰ
ｕｅｈｌｅｒ，Ａ．（１９９１）、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．第５巻：第２９９５〜３００５頁）。
【００３２】ジオキシゲニン−ｄ−ＵＴＰ標識した、ｌ
ｙｓＩコード領域からの５０５ｂｐＳｓｔＩ−ＰｓｔＩ
ＤＮＡ−フラグメントをＣ．グルタミクム野生型菌株
ＡＴＣＣ１３０３２及び突然変異体ＬＴ５．５とハイブ
リッド形成すると、野生型中に５ｋｂの大きさのＥｃｏ
ＲＩ ＤＮＡ−フラグメントが見い出され、一方突然変
異体ＬＴ５．５中には約６．５ｋｂの大きさのＥｃｏＲ
Ｉ ＤＮＡ−フラグメントがハイブリッド形成されてい
る。突然変異体ＬＴ５．５のｌｙｓＩ−遺伝子中の突然
変異は、この結果により塩基配列が明確にされた（図
２、図３）、大きさ約１．４５ｋｂの挿入ＤＮＡ−フラ
グメントＩＳＣｇ１の挿入に帰せられる。
ｙｓＩコード領域からの５０５ｂｐＳｓｔＩ−ＰｓｔＩ
ＤＮＡ−フラグメントをＣ．グルタミクム野生型菌株
ＡＴＣＣ１３０３２及び突然変異体ＬＴ５．５とハイブ
リッド形成すると、野生型中に５ｋｂの大きさのＥｃｏ
ＲＩ ＤＮＡ−フラグメントが見い出され、一方突然変
異体ＬＴ５．５中には約６．５ｋｂの大きさのＥｃｏＲ
Ｉ ＤＮＡ−フラグメントがハイブリッド形成されてい
る。突然変異体ＬＴ５．５のｌｙｓＩ−遺伝子中の突然
変異は、この結果により塩基配列が明確にされた（図
２、図３）、大きさ約１．４５ｋｂの挿入ＤＮＡ−フラ
グメントＩＳＣｇ１の挿入に帰せられる。
【００３３】本発明による方法を用いて、この従来の方
法で見い出されたＩＳ−配列ＩＳＣｇ１の存在の確認が
達せられた。同時に、Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０
３２中に５つのＩＳ−配列が見い出され、これはジゴキ
シゲニン−ｄ−ＵＴＰ標識ＩＳＣｇ１−ＤＮＡをハイブ
リッド化したのでＩＳＣｇ１型のＩＳ−配列として示
す。
法で見い出されたＩＳ−配列ＩＳＣｇ１の存在の確認が
達せられた。同時に、Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０
３２中に５つのＩＳ−配列が見い出され、これはジゴキ
シゲニン−ｄ−ＵＴＰ標識ＩＳＣｇ１−ＤＮＡをハイブ
リッド化したのでＩＳＣｇ１型のＩＳ−配列として示
す。
【００３４】本発明により見い出されたＩＳ−配列の使
用下に存在するいくつかの問題は解決する：従来、バク
テリアにおいて使用した、化学薬品を用いて突然変異誘
発を惹起させる方法は、しばしば所望の突然変異の他に
他の多くの突然変異を細胞中で生ぜしめ、場合によりこ
れは不利な作用を及ぼす。更に、突然変異した遺伝子は
物理的に標識されていない、それというのも化学薬品は
使用する条件下に多くの場合点突然変異（塩基交換）だ
けに作用するからである。
用下に存在するいくつかの問題は解決する：従来、バク
テリアにおいて使用した、化学薬品を用いて突然変異誘
発を惹起させる方法は、しばしば所望の突然変異の他に
他の多くの突然変異を細胞中で生ぜしめ、場合によりこ
れは不利な作用を及ぼす。更に、突然変異した遺伝子は
物理的に標識されていない、それというのも化学薬品は
使用する条件下に多くの場合点突然変異（塩基交換）だ
けに作用するからである。
【００３５】そのような１つの塩基交換又は多くの塩基
交換は一般に個々の遺伝子を阻害するが、しかし全部の
転写単位を阻害するわけではない。
交換は一般に個々の遺伝子を阻害するが、しかし全部の
転写単位を阻害するわけではない。
【００３６】トランスポゾン及び挿入配列はこの際細胞
あたり一般に唯一の突然変異現象を生じ、そのように生
じた突然変異は物理的に標識されている。この標識はト
ランスポゾン上で選択可能なマーカー中にまたは挿入配
列のかたわらにまたはそのように構成されていない挿入
配列において、少なくとも突然変異誘発領域のＤＮＡ−
ハイブリッド化により同定することのできる公知配列に
よる明らかな延長中に存在する。
あたり一般に唯一の突然変異現象を生じ、そのように生
じた突然変異は物理的に標識されている。この標識はト
ランスポゾン上で選択可能なマーカー中にまたは挿入配
列のかたわらにまたはそのように構成されていない挿入
配列において、少なくとも突然変異誘発領域のＤＮＡ−
ハイブリッド化により同定することのできる公知配列に
よる明らかな延長中に存在する。
【００３７】ＩＳ−配列の突然変異誘発活性を利用する
ことができるが、この際選択可能な遺伝子（例えば抗生
物質耐性遺伝子）を公知法によりクローン化することに
よりＩＳ−配列の２つのコピー中又はコピー間に配置す
る。このように生じた（複合）トランスポゾンは突然変
異誘発に利用され、この際突然変異遺伝子は選択可能な
遺伝子により物理的に標識されている。こうして、トラ
ンスポゾン突然変異誘発はその使用範囲を広げる。
ことができるが、この際選択可能な遺伝子（例えば抗生
物質耐性遺伝子）を公知法によりクローン化することに
よりＩＳ−配列の２つのコピー中又はコピー間に配置す
る。このように生じた（複合）トランスポゾンは突然変
異誘発に利用され、この際突然変異遺伝子は選択可能な
遺伝子により物理的に標識されている。こうして、トラ
ンスポゾン突然変異誘発はその使用範囲を広げる。
【００３８】公知Ｃ．グルタミクムのトランスポゾン−
突然変異体の詳細な分析において、多くの場合内生ＩＳ
−配列がＣ．グルタミクムのゲノム中でその場所を交換
したことが明らかになる。従って、トランスポゾン又は
挿入配列が表現型において観察されるべき突然変異を生
じたかどうかは明らかに確認されない。すなわち、内生
ＩＳ−配列はトランスポゾン−突然変異誘発において阻
害のバックグランドを形成することがある。
突然変異体の詳細な分析において、多くの場合内生ＩＳ
−配列がＣ．グルタミクムのゲノム中でその場所を交換
したことが明らかになる。従って、トランスポゾン又は
挿入配列が表現型において観察されるべき突然変異を生
じたかどうかは明らかに確認されない。すなわち、内生
ＩＳ−配列はトランスポゾン−突然変異誘発において阻
害のバックグランドを形成することがある。
【００３９】本発明による方法は、ＩＳ−配列を迅速に
同定し、トランスポゾン−突然変異菌株中の総−ＤＮＡ
とＤＮＡ−ハイブリッド形成することにより、挿入配列
−パターンが変化し、これにより観察された突然変異が
挿入配列により解除されるという危険があるかどうか確
認することを可能にした。
同定し、トランスポゾン−突然変異菌株中の総−ＤＮＡ
とＤＮＡ−ハイブリッド形成することにより、挿入配列
−パターンが変化し、これにより観察された突然変異が
挿入配列により解除されるという危険があるかどうか確
認することを可能にした。
【００４０】同様に、内生挿入配列の完全な除去は“遺
伝子置換”操作により、表現型突然変異を明らかに挿入
トランスポゾンに関係ずけることのできる挿入配列不含
菌株を保証する。同定した挿入配列をＩＳ−配列の同定
のためのハイブリッド形成ゾンデもしくはｓａｃＢ−操
作として使用することにより、トランスポゾン−突然変
異誘発により好適であるＩＳ−配列不含菌株を見い出す
ことができる。最適な増殖条件下にＩＳ−配列の転位速
度は通常世代あたり１×１０-7より低い。しかしなが
ら、微生物を外部環境を変えることにより、又は内部代
謝平衡を不安定にすることによりストレスをかける時、
この転位速度は明らかに高められる。外部ストレス因子
は例えば加熱、冷却、栄養分欠損又は抗生の物質、例え
ばアミノ酸−類似物質である（Ｃｒａｉｇ＆Ｋｌｅｃｋ
ｎｅｒ、１９８７）。
伝子置換”操作により、表現型突然変異を明らかに挿入
トランスポゾンに関係ずけることのできる挿入配列不含
菌株を保証する。同定した挿入配列をＩＳ−配列の同定
のためのハイブリッド形成ゾンデもしくはｓａｃＢ−操
作として使用することにより、トランスポゾン−突然変
異誘発により好適であるＩＳ−配列不含菌株を見い出す
ことができる。最適な増殖条件下にＩＳ−配列の転位速
度は通常世代あたり１×１０-7より低い。しかしなが
ら、微生物を外部環境を変えることにより、又は内部代
謝平衡を不安定にすることによりストレスをかける時、
この転位速度は明らかに高められる。外部ストレス因子
は例えば加熱、冷却、栄養分欠損又は抗生の物質、例え
ばアミノ酸−類似物質である（Ｃｒａｉｇ＆Ｋｌｅｃｋ
ｎｅｒ、１９８７）。
【００４１】組換え微生物又は栄養要求突然変異体もし
くは高生産性に選択された突然変異体がまさに不安定な
内部環境を示し、この理由からこれらは高められた転位
頻度である。
くは高生産性に選択された突然変異体がまさに不安定な
内部環境を示し、この理由からこれらは高められた転位
頻度である。
【００４２】この機構をプラスに使用することもでき
る：本発明方法により見い出された挿入配列の適用によ
り、例えば隣接するＤＮＡ−領域を複写することができ
る。
る：本発明方法により見い出された挿入配列の適用によ
り、例えば隣接するＤＮＡ−領域を複写することができ
る。
【００４３】ＩＳ−配列をレプリコン融合によっても突
然変異誘発に使用することができる。レプリコン融合が
これにより生じた突然変異をこの融合に関する選択によ
り安定化する。バクテリア染色体と、ＩＳ−配列を有す
るが複製能力のない耐性プラスミドとの間の融合の場合
は、プラスミドの耐性が安定なレプリコン融合に関する
選択に役だつ。
然変異誘発に使用することができる。レプリコン融合が
これにより生じた突然変異をこの融合に関する選択によ
り安定化する。バクテリア染色体と、ＩＳ−配列を有す
るが複製能力のない耐性プラスミドとの間の融合の場合
は、プラスミドの耐性が安定なレプリコン融合に関する
選択に役だつ。
【００４４】本発明方法による内生ＩＳ−配列の除去に
より、前記の生産菌株における、もしくは生産条件下で
の不安定性を著しく減少させることができる。
より、前記の生産菌株における、もしくは生産条件下で
の不安定性を著しく減少させることができる。
【００４５】突然変異誘発及び内生ＩＳ−配列の除去は
原則的に西独特許第４０２７４５３号明細書から公知の
方法において生じ、この方法においては移動可能な大腸
菌ベクターを接合移入により大腸菌移動菌株から所望の
コリネ型バクテリアに転位する。この大腸菌ベクターは
例えば本発明の請求項１中で特徴部１．１．１〜１．
１．３に記載されており、かつ特徴部１．１．４として
相応するＩＳ−配列を含有するＤＮＡ−フラグメントを
備えている。
原則的に西独特許第４０２７４５３号明細書から公知の
方法において生じ、この方法においては移動可能な大腸
菌ベクターを接合移入により大腸菌移動菌株から所望の
コリネ型バクテリアに転位する。この大腸菌ベクターは
例えば本発明の請求項１中で特徴部１．１．１〜１．
１．３に記載されており、かつ特徴部１．１．４として
相応するＩＳ−配列を含有するＤＮＡ−フラグメントを
備えている。
【００４６】例１ コリネバクテリウム・グルタミクム中のＩＳ−配列によ
る突然変異惹起：突然変異体ＬＴ５．５のＬｙｓＩ−遺
伝子からのＩＳ−配列の検出及び単離 Ｃ．グルタミクム突然変異体ＬＴ５．５は直接Ｃ．グル
タミクム野生型ＡＴＣＣ１３０３２から誘導され、自然
に生じたｓ−（２−アミノエチル）−システィン（ＡＥ
Ｃ）耐性突然変異体であり、これはリジン取り込みにお
いて欠陥を有する。ｌｙｓＩ−遺伝子はＣ．グルタミク
ム中へのリジン取り込みに関係する遺伝子である。この
ｌｙｓＩ−遺伝子及びこれに隣接するＤＮＡ領域はクロ
ーン化されており、かつこのｌｙｓＩ−遺伝子のヌクレ
オチド配列は公知である（Ｓｅｅｐ−Ｆｅｌｄｈａｕ
ｓ，Ａ．Ｈ．等、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第５
（１２）巻：第２９９５〜３００５頁、１９９１年）。
る突然変異惹起：突然変異体ＬＴ５．５のＬｙｓＩ−遺
伝子からのＩＳ−配列の検出及び単離 Ｃ．グルタミクム突然変異体ＬＴ５．５は直接Ｃ．グル
タミクム野生型ＡＴＣＣ１３０３２から誘導され、自然
に生じたｓ−（２−アミノエチル）−システィン（ＡＥ
Ｃ）耐性突然変異体であり、これはリジン取り込みにお
いて欠陥を有する。ｌｙｓＩ−遺伝子はＣ．グルタミク
ム中へのリジン取り込みに関係する遺伝子である。この
ｌｙｓＩ−遺伝子及びこれに隣接するＤＮＡ領域はクロ
ーン化されており、かつこのｌｙｓＩ−遺伝子のヌクレ
オチド配列は公知である（Ｓｅｅｐ−Ｆｅｌｄｈａｕ
ｓ，Ａ．Ｈ．等、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第５
（１２）巻：第２９９５〜３００５頁、１９９１年）。
【００４７】ジオキシゲニン−ｄ−ＵＴＰ標識した、ｌ
ｙｓＩコード領域からのＳｓｔＩ−ＰｓｔＩ ＤＮＡ５
０５ｂｐ（図１）をＣ．グルタミクム野生型菌株ＡＴＣ
Ｃ１３０３２及び突然変異体ＬＴ５．５からの総ＤＮＡ
とハイブリッド形成した。アルテンブ−フナ−（Ａｌｔ
ｅｎｂｕｃｈｎｅｒ）及びクルム（Ｃｕｌｌｕｍ）の方
法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第１９５巻：第１
３４〜１３８頁、１９８４年）により単離した総ＤＮＡ
をこの目的のために制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した。引
き続き、この切断配合物を０．８％アガロースゲル中で
分離した。ナイロン膜上へのＤＮＡ−フラグメントの転
写（ＨｙｂｏｎｄＮ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｒａｕｎｓ
ｃｈｗｅｉｇ）はサザン法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、
第９８巻、第５０３〜５１７頁、１９７５年）により行
なわれた。ハイブリッド形成を“ＤＮＡ標識及び検出キ
ットで非放射性”で（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ）実施した。ハイブリッド形成ゾンデとして使
用したＳｓｔＩ−ＰｓｔＩＤＮＡフラグメントをＣ．グ
ルタミクム野生型菌株ＡＴＣＣ１３０３２中で５ｋｂの
大きさのＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントとハイブリッ
ド形成し、一方突然変異体ＬＴ５．５中で約６．５ｋｂ
の大きさのＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントとハイブリ
ッド形成する。突然変異体ＬＴ５．５のｌｙｓＩ−遺伝
子中での突然変異はこの結果によれば約１．５ｋｂの大
きさのＤＮＡ−フラグメントの挿入に起因する。突然変
異体ＬＴ５．５のｌｙｓＩ遺伝子中に挿入されたＤＮＡ
フラグメントの挿入部位の決定のためには、Ｃ．グルタ
ミクム野生型菌株ＡＴＣＣ１３０３２及び突然変異体Ｌ
Ｔ５．５の総ＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩ及びＳｓｔＩ
で平行して同時に切断した。引き続き切断配合物を０．
８％アガロースゲル中で分離した。ＤＮＡフラグメント
の転位及びｌｙｓＩコード領域からのジゴキシゲニン−
ｄ−ＵＴＰ−標識ＳｓｔＩ−ＰｓｔＩ ＤＮＡフラグメ
ントとのハイブリッド形成を前記のように行なった。こ
のハイブリッド形成は、突然変異体ＬＴ５．５中では
２．８ｋｂ ＰｖｕＩＩ ＤＮＡフラグメントも０．９
ｋｂ ＳｓｔＩ ＤＮＡフラグメント（図１）も約１．
５ｋｂ延長していることを示す。ハイブリッド形成か
ら、挿入がｌｙｓＩコード領域の２８３ｂｐ ＰｖｕＩ
Ｉ−ＰｓｔＩ ＤＮＡフラグメント上に局在しているこ
とが結論として得られる（図１）。
ｙｓＩコード領域からのＳｓｔＩ−ＰｓｔＩ ＤＮＡ５
０５ｂｐ（図１）をＣ．グルタミクム野生型菌株ＡＴＣ
Ｃ１３０３２及び突然変異体ＬＴ５．５からの総ＤＮＡ
とハイブリッド形成した。アルテンブ−フナ−（Ａｌｔ
ｅｎｂｕｃｈｎｅｒ）及びクルム（Ｃｕｌｌｕｍ）の方
法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第１９５巻：第１
３４〜１３８頁、１９８４年）により単離した総ＤＮＡ
をこの目的のために制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した。引
き続き、この切断配合物を０．８％アガロースゲル中で
分離した。ナイロン膜上へのＤＮＡ−フラグメントの転
写（ＨｙｂｏｎｄＮ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｒａｕｎｓ
ｃｈｗｅｉｇ）はサザン法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、
第９８巻、第５０３〜５１７頁、１９７５年）により行
なわれた。ハイブリッド形成を“ＤＮＡ標識及び検出キ
ットで非放射性”で（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ）実施した。ハイブリッド形成ゾンデとして使
用したＳｓｔＩ−ＰｓｔＩＤＮＡフラグメントをＣ．グ
ルタミクム野生型菌株ＡＴＣＣ１３０３２中で５ｋｂの
大きさのＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントとハイブリッ
ド形成し、一方突然変異体ＬＴ５．５中で約６．５ｋｂ
の大きさのＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントとハイブリ
ッド形成する。突然変異体ＬＴ５．５のｌｙｓＩ−遺伝
子中での突然変異はこの結果によれば約１．５ｋｂの大
きさのＤＮＡ−フラグメントの挿入に起因する。突然変
異体ＬＴ５．５のｌｙｓＩ遺伝子中に挿入されたＤＮＡ
フラグメントの挿入部位の決定のためには、Ｃ．グルタ
ミクム野生型菌株ＡＴＣＣ１３０３２及び突然変異体Ｌ
Ｔ５．５の総ＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩ及びＳｓｔＩ
で平行して同時に切断した。引き続き切断配合物を０．
８％アガロースゲル中で分離した。ＤＮＡフラグメント
の転位及びｌｙｓＩコード領域からのジゴキシゲニン−
ｄ−ＵＴＰ−標識ＳｓｔＩ−ＰｓｔＩ ＤＮＡフラグメ
ントとのハイブリッド形成を前記のように行なった。こ
のハイブリッド形成は、突然変異体ＬＴ５．５中では
２．８ｋｂ ＰｖｕＩＩ ＤＮＡフラグメントも０．９
ｋｂ ＳｓｔＩ ＤＮＡフラグメント（図１）も約１．
５ｋｂ延長していることを示す。ハイブリッド形成か
ら、挿入がｌｙｓＩコード領域の２８３ｂｐ ＰｖｕＩ
Ｉ−ＰｓｔＩ ＤＮＡフラグメント上に局在しているこ
とが結論として得られる（図１）。
【００４８】挿入物のクローン化のためには、突然変異
体ＬＴ５．５中の大きくなったＰｖｕＩＩ−ＰｓｔＩ
ＤＮＡフラグメントをまず“ポリメラーゼ・チェーン・
レアクション”（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．，Ａ等、ＰＣＲ Ｐ
ｒｏｔｏｋｏｌｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１
９９０年）で増量した。ＰＣＲ−反応に使用するプライ
マーは長さ２０塩基のオリゴヌクレオチドであり、ｌｙ
ｓＩ ＤＮＡ配列から誘導された配列を有する： プライマー１：５′ ＣＡＡＡＡＴＣＧＧＧＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡ３′ プライマー２：５′ ＧＡＧＧＡＣＡＡＡＣＴＧＣＧＧＴＴＣＴＧ３′。
体ＬＴ５．５中の大きくなったＰｖｕＩＩ−ＰｓｔＩ
ＤＮＡフラグメントをまず“ポリメラーゼ・チェーン・
レアクション”（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．，Ａ等、ＰＣＲ Ｐ
ｒｏｔｏｋｏｌｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１
９９０年）で増量した。ＰＣＲ−反応に使用するプライ
マーは長さ２０塩基のオリゴヌクレオチドであり、ｌｙ
ｓＩ ＤＮＡ配列から誘導された配列を有する： プライマー１：５′ ＣＡＡＡＡＴＣＧＧＧＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡ３′ プライマー２：５′ ＧＡＧＧＡＣＡＡＡＣＴＧＣＧＧＴＴＣＴＧ３′。
【００４９】ＰＣＲ−反応は次の配合物で実施した：突
然変異体ＬＴ５．５からの総−ＤＮＡ ５００ｎｇ、プ
ライマー１ １４ｎｇ、プライマー２ １４ｎｇ、ｄ−
ＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）２
００μＭをＴａｑ−ポリメラーゼ反応緩衝液（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ）５０μｌの容量中に
溶かした。ＰＣＲ−反応を遺伝子ＡＴＡＱコントローラ
ー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて実施した。この配
合物をまず５分間９６℃で恒温保持した。Ｔａｑ−ポリ
メラーゼ（ベーリンガー社、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）２．５
ユニットの添加後、１．８ｋｂ ＰｖｕＩＩ−ＰｓｔＩ
ＤＮＡフラグメントの増量のために次のサイクルを３０
回実施した： ５３℃ １分１０秒 ７２℃ ２分４０秒 ９２℃ １分１０秒 増量したＤＮＡを０．８％アガロースゲル中で分離し、
かつゲルから単離した（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉａ）。このＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ及びＰｖｕＩＩ
で切断し、かつＰｓｔＩ及びＳｍａＩで切断した大腸菌
プラスミドベクターｐＫ１８ｍｏｂ（特許出願Ｐ４０２
７４５３．５）と連結した。この連結混合物を用いて大
腸菌株ＤＨ５α（Ｗｏｏｄｃｏｃｋ，Ｄ．，Ｍ．等、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第１７巻、第３４
６９〜３４７８頁、１９８９年）を形質転換した。この
形質転換菌からプラスミド、名称ｐＳＦ３を単離するこ
とができ、これはベクターｐＫ１８ｍｏｂ及び１８ｋｂ
の長さの増幅ＤＮＡフラグメントからなる。
然変異体ＬＴ５．５からの総−ＤＮＡ ５００ｎｇ、プ
ライマー１ １４ｎｇ、プライマー２ １４ｎｇ、ｄ−
ＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）２
００μＭをＴａｑ−ポリメラーゼ反応緩衝液（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ）５０μｌの容量中に
溶かした。ＰＣＲ−反応を遺伝子ＡＴＡＱコントローラ
ー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて実施した。この配
合物をまず５分間９６℃で恒温保持した。Ｔａｑ−ポリ
メラーゼ（ベーリンガー社、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）２．５
ユニットの添加後、１．８ｋｂ ＰｖｕＩＩ−ＰｓｔＩ
ＤＮＡフラグメントの増量のために次のサイクルを３０
回実施した： ５３℃ １分１０秒 ７２℃ ２分４０秒 ９２℃ １分１０秒 増量したＤＮＡを０．８％アガロースゲル中で分離し、
かつゲルから単離した（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉａ）。このＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ及びＰｖｕＩＩ
で切断し、かつＰｓｔＩ及びＳｍａＩで切断した大腸菌
プラスミドベクターｐＫ１８ｍｏｂ（特許出願Ｐ４０２
７４５３．５）と連結した。この連結混合物を用いて大
腸菌株ＤＨ５α（Ｗｏｏｄｃｏｃｋ，Ｄ．，Ｍ．等、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第１７巻、第３４
６９〜３４７８頁、１９８９年）を形質転換した。この
形質転換菌からプラスミド、名称ｐＳＦ３を単離するこ
とができ、これはベクターｐＫ１８ｍｏｂ及び１８ｋｂ
の長さの増幅ＤＮＡフラグメントからなる。
【００５０】例２ Ｃ．グルタミクムからのＩＳ−配列の配列分析 プラスミドｐＳＦ３（例１）中でクローン化した、Ｃ．
グルタミクム突然変異体ＬＴ５．５からの大きさ約１．
８ｋｂのＤＮＡフラグメントをザンガー（Ｓａｎｇｅ
ｒ）等の方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、第７４巻、第５４６３〜５４６７頁、１９
７７年）により二本鎖ＤＮＡの配列決定に関する変法
（Ｃｈｅｎ及びＳｅｅｂｕｒｇ，ＤＮＡ、第４巻、第１
６５〜１６８頁、１９８５年）で配列決定した。
グルタミクム突然変異体ＬＴ５．５からの大きさ約１．
８ｋｂのＤＮＡフラグメントをザンガー（Ｓａｎｇｅ
ｒ）等の方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、第７４巻、第５４６３〜５４６７頁、１９
７７年）により二本鎖ＤＮＡの配列決定に関する変法
（Ｃｈｅｎ及びＳｅｅｂｕｒｇ，ＤＮＡ、第４巻、第１
６５〜１６８頁、１９８５年）で配列決定した。
【００５１】このためには制限地図により決定した切断
部位により、プラスミドｐＳＦ３の欠陥誘導体を製造し
た。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂは直接の配列決定に好適
であるので、この欠陥誘導体をすぐに配列決定のために
使用することができた。
部位により、プラスミドｐＳＦ３の欠陥誘導体を製造し
た。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂは直接の配列決定に好適
であるので、この欠陥誘導体をすぐに配列決定のために
使用することができた。
【００５２】この配列決定はＴ７−配列決定キット（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ社、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）及びプライマ
ー“一般（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）”もしくは“復帰（ｒ
ｅｖｅｒｓｅ）”で行なわれた。ヌクレオチド配列は両
方のＤＮＡ−鎖によって決定された（図２）。
ｈａｒｍａｃｉａ社、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）及びプライマ
ー“一般（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）”もしくは“復帰（ｒ
ｅｖｅｒｓｅ）”で行なわれた。ヌクレオチド配列は両
方のＤＮＡ−鎖によって決定された（図２）。
【００５３】ＩＳ−配列ＩＳＣｇ１は長さ１４５２塩基
対（ｂｐ）であり、かつ長さ２４ｂｐの不完全逆方向反
復末端を有する。ｌｙｓＩ−遺伝子中の挿入位で長さ８
ｂｐの直接反復配列が生じる。これは２つの開放読み取
り枠（ＯＲＦ）有し、これらは多分蛋白質をコードす
る。ＯＲＦ１（ｂｐ１３０〜４１７）はアミノ酸９６個
の蛋白質をコードし、ＯＲＦ２（ｂｐ３２１〜１４３
６）はアミノ酸３７２個の蛋白質をコードする。ＯＲＦ
１はＡＴＧ−開始コドンではじまり、この前にグラム陽
性バクテリアのリボソーム結合位に類似性を有する配列
が存在する（ｂｐ１１７〜１２１ ５′−ＡＡＡＧＧ−
３′）。ＯＲＦ１の末端が重なるＯＲＦ２はいくつかの
内部の可能なＡＴＧ−又はＧＴＧ−開始コドンを有し、
この前には可視のリボソーム結合位を有さない。
対（ｂｐ）であり、かつ長さ２４ｂｐの不完全逆方向反
復末端を有する。ｌｙｓＩ−遺伝子中の挿入位で長さ８
ｂｐの直接反復配列が生じる。これは２つの開放読み取
り枠（ＯＲＦ）有し、これらは多分蛋白質をコードす
る。ＯＲＦ１（ｂｐ１３０〜４１７）はアミノ酸９６個
の蛋白質をコードし、ＯＲＦ２（ｂｐ３２１〜１４３
６）はアミノ酸３７２個の蛋白質をコードする。ＯＲＦ
１はＡＴＧ−開始コドンではじまり、この前にグラム陽
性バクテリアのリボソーム結合位に類似性を有する配列
が存在する（ｂｐ１１７〜１２１ ５′−ＡＡＡＧＧ−
３′）。ＯＲＦ１の末端が重なるＯＲＦ２はいくつかの
内部の可能なＡＴＧ−又はＧＴＧ−開始コドンを有し、
この前には可視のリボソーム結合位を有さない。
【００５４】例３： コリネ型バクテリアから挿入配列を単離するためのベク
ターの構成 挿入配列（ＩＳ−配列）又はトランスポゾンを単離する
ためにバシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）からのｓａｃＢ−遺伝子を使用する（Ｇ
ａｙ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１５３巻、第１
４２４〜１４３１頁、１９８３年）。この遺伝子は外来
酵素レバンスクラーゼ（Ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）を
コードし、この酵素は反応蔗糖加水分解及びレバン合成
を触媒する（Ｄｅｄｏｎｄｅｒ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．第８巻、第５００〜５０５頁、１
９６６年）。大腸菌中のｓａｃＢの発現はペリプラズム
中への酵素の搬送に導びき（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ等、Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第１９１巻、第１３８〜
１４４頁、１９８３年）、かつ大腸菌及び他のグラム陰
性菌は５％を越える蔗糖を含有する培地上で死に到る
（Ｇａｙ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１６４巻、
第９１８〜９２１頁）。
ターの構成 挿入配列（ＩＳ−配列）又はトランスポゾンを単離する
ためにバシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）からのｓａｃＢ−遺伝子を使用する（Ｇ
ａｙ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１５３巻、第１
４２４〜１４３１頁、１９８３年）。この遺伝子は外来
酵素レバンスクラーゼ（Ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）を
コードし、この酵素は反応蔗糖加水分解及びレバン合成
を触媒する（Ｄｅｄｏｎｄｅｒ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．第８巻、第５００〜５０５頁、１
９６６年）。大腸菌中のｓａｃＢの発現はペリプラズム
中への酵素の搬送に導びき（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ等、Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第１９１巻、第１３８〜
１４４頁、１９８３年）、かつ大腸菌及び他のグラム陰
性菌は５％を越える蔗糖を含有する培地上で死に到る
（Ｇａｙ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１６４巻、
第９１８〜９２１頁）。
【００５５】本発明においてはｓａｃＢ−遺伝子をコリ
ネ型バクテリア中の挿入配列を見い出すために使用す
る。完全ｓａｃＢ−遺伝子の発現はＣ．グルタミクム及
び他のコリネ型バクテリアにおいても１０％蔗糖を含有
する培地上で死に到らしめる（例４）。従って、不活性
化ｓａｃＢ−遺伝子を含有するクローンはこの種の培地
上で陽性に選択されうる。こうして、ｓａｃＢ中に挿入
されている挿入配列を見い出すための可能性が得られ
る。ＩＳ−捕獲ベクターｐＷＪ５（図３）はプラスミド
ｐＥＣＭ２の誘導体である。プラスミドｐＥＣＭ２の製
造のためにプラスミドｐＥＣＭ１（Ｓｃｈａｅｆｅｒ
等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１７２巻、第１６６３
〜１６６６頁、１９９０年；ヨーロッパ特許Ａ−０３７
２２３０号明細書参照）を制限酵素ＳａｌＩで切断しＴ
４−ＤＮＡ−リガーゼで再連結した。この際、ｐＥＣＭ
１から０．３ｋｂのＳａｌＩ−フラグメントを欠いた誘
導体が得られ、これをｐＥＣＭ２と名付けた。ＩＳ−捕
獲ベクターは次のように製造された：プラスミドｐＵＭ
２４（Ｒｉｅｄ及びＣｏｌｌｍｅｒ，Ｇｅｎｅ第５７
巻、第２３９〜２４６頁、１９８７年）を制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ及びＥｃｏＲＶで制限したところ、これによりｓ
ａｃＢ−遺伝子を有する、大きさ１．９ｋｂのＤＮＡ−
フラグメントが生じた。このプラスミドｐＥＣＭ２を制
限酵素ＸｂａＩで切断し、引き続き酵素クレノウ−ポリ
メラーゼで処理し、切断位に生じた突き出した１本鎖−
末端を消化切断した（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ １，２改訂版、５．４２、
１９８９年）。このように処理したＤＮＡをフェノール
化及びアルコール沈殿により精製し、かつ濃縮し、かつ
引き続き制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。両方の配合物
を合して、Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼで連結した。連結混
合物で大腸菌株Ｓ１７−１のコンピテント細胞（Ｓｉｍ
ｏｎ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１巻、第７８４〜７
９４頁、１９８３年）を形質転換した。形質転換したク
ローンの選択を第１にクロラムフェニコール５０μｇ／
ｍｌを含有するＰＡ−寒天（培地１ｌ上ペナセイ（Ｐｅ
ｎａｓｓａｙ）スープ１７．５ｇ＋寒天１５ｇ）上で行
なった。耐性クローンを１０％蔗糖を含有するＬＢ−培
地上に平行担持することにより感度の高い表現型で認識
可能なｓａｃＢ−遺伝子の成功したクローン化に関して
テストした。
ネ型バクテリア中の挿入配列を見い出すために使用す
る。完全ｓａｃＢ−遺伝子の発現はＣ．グルタミクム及
び他のコリネ型バクテリアにおいても１０％蔗糖を含有
する培地上で死に到らしめる（例４）。従って、不活性
化ｓａｃＢ−遺伝子を含有するクローンはこの種の培地
上で陽性に選択されうる。こうして、ｓａｃＢ中に挿入
されている挿入配列を見い出すための可能性が得られ
る。ＩＳ−捕獲ベクターｐＷＪ５（図３）はプラスミド
ｐＥＣＭ２の誘導体である。プラスミドｐＥＣＭ２の製
造のためにプラスミドｐＥＣＭ１（Ｓｃｈａｅｆｅｒ
等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１７２巻、第１６６３
〜１６６６頁、１９９０年；ヨーロッパ特許Ａ−０３７
２２３０号明細書参照）を制限酵素ＳａｌＩで切断しＴ
４−ＤＮＡ−リガーゼで再連結した。この際、ｐＥＣＭ
１から０．３ｋｂのＳａｌＩ−フラグメントを欠いた誘
導体が得られ、これをｐＥＣＭ２と名付けた。ＩＳ−捕
獲ベクターは次のように製造された：プラスミドｐＵＭ
２４（Ｒｉｅｄ及びＣｏｌｌｍｅｒ，Ｇｅｎｅ第５７
巻、第２３９〜２４６頁、１９８７年）を制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ及びＥｃｏＲＶで制限したところ、これによりｓ
ａｃＢ−遺伝子を有する、大きさ１．９ｋｂのＤＮＡ−
フラグメントが生じた。このプラスミドｐＥＣＭ２を制
限酵素ＸｂａＩで切断し、引き続き酵素クレノウ−ポリ
メラーゼで処理し、切断位に生じた突き出した１本鎖−
末端を消化切断した（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ １，２改訂版、５．４２、
１９８９年）。このように処理したＤＮＡをフェノール
化及びアルコール沈殿により精製し、かつ濃縮し、かつ
引き続き制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。両方の配合物
を合して、Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼで連結した。連結混
合物で大腸菌株Ｓ１７−１のコンピテント細胞（Ｓｉｍ
ｏｎ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１巻、第７８４〜７
９４頁、１９８３年）を形質転換した。形質転換したク
ローンの選択を第１にクロラムフェニコール５０μｇ／
ｍｌを含有するＰＡ−寒天（培地１ｌ上ペナセイ（Ｐｅ
ｎａｓｓａｙ）スープ１７．５ｇ＋寒天１５ｇ）上で行
なった。耐性クローンを１０％蔗糖を含有するＬＢ−培
地上に平行担持することにより感度の高い表現型で認識
可能なｓａｃＢ−遺伝子の成功したクローン化に関して
テストした。
【００５６】例４ コリネ型バクテリアからのＩＳ−配列の単離 大規模なコリネ型バクテリアからの挿入配列の検出及び
単離をｓａｃＢ−システムを使用することにより達成し
た：移動性シャトル・ベクターｐＷＪ５（例３）を接合
（西独特許公開第３８４１４５３．８号公報；Ｓｃｈａ
ｅｆｅｒ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１７２巻、第
１６６３〜１６６６頁（１９９０年））により移動菌株
大腸菌Ｓ１７−１（Ｓｉｍｏｎ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ、第１巻、第７８４〜７９４頁（１９８３
年））からアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ）及びロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ）の属からのコリネ型受容菌株全部で２０種中に転位
した（表１）。コリネ型菌株中の不変のｐＷＪ５−プラ
スミドの存在は移入接合体（Ｔｒａｎｓｋｏｎｊｕｇａ
ｔｅｎ；Ｂｉｒｎｂｏｉｍ＆Ｄｏｌｙ，Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．、第７巻、第１５１３〜１５２３頁
（１９７９年））の溶解、制限エンドヌクレアーゼＢａ
ｍＨＩ及びＳｓｐＩでのプラスミドの切断、及びアガロ
ースゲル中でのフラグメントの分析により証明した。そ
れぞれの２０種のテストした菌株は引き続き行なったテ
スト中でＫｍ25を有するＬＢ−培地上では成長するが、
１０％蔗糖を含有ＬＢＫｍ25−培地上では成長しない
（表１）。この蔗糖選択性はプラスミドｐＷＪ５の完全
ｓａｃＢ−遺伝子の発現に起因される。それというのも
このプラスミドｐＥＣＭ２（例３）を含有する菌株は１
０％蔗糖を含有するＬＢＫｍ25上で成長することができ
るからです。テストすべき菌株のｐＷＪ５を含有する個
々のコロニーをＬＢ−液体培地中で対数増殖期が達せら
れるまで３０℃でエヤー振動機中で恒温保持した。それ
ぞれ細胞約５×１０9個を３０００ｒ．ｐ．ｍで１０分
間遠心分離することにより収獲し、このペレットをＬＢ
−培地１ｍｌ中に取り込み、かつＬＢ−培地上に置いた
０．４５μｍセルロースアセテートフィルター（直径４
０ｍｍ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅ
ｎ，ＦＲＧ）の表面に担持させた。乾燥させた後、この
細胞を３８．５℃で２０時間恒温保持した。その後、こ
のフィルターをＬＢ−培地１ｍｌで洗出し、未希釈懸濁
液及びＬＢ−培地で１：１０の比に希釈した懸濁液各々
０．１ｍｌを蔗糖１０％を含有するＬＢＫｍ25−寒天上
にひろげる。２〜３日間３０℃で保持した後、すべての
コリネ型バクテリア株に関して蔗糖耐性コロニーが異な
る頻度で得られる（表１）。コリネバクテリウム・グル
タミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔ
ａｍｉｃｕｍ）に関しては配合物あたり蔗糖耐性コロニ
ー２．５×１０5が得られ、これは頻度５×１０-5に相
応する。蔗糖耐性クローン１６個を例として、溶解、酵
素ＢａｍＨＩ及びＳｓＰＩでのプラスミドの制限及び引
き続くアガロース−ゲル電気泳動により調べた。クロー
ン８個中にはプラスミドｐＷＪ５中で大きさ約１．４５
ｋｂのｓａｃＢ−遺伝子の延長を証明することができ
た。すべての挿入は制限エンドヌクレアーゼ、ＢａｍＨ
Ｉ、ＢｃｌＩ、ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＤｒａＩ
に関する認識部位を示し、これらは挿入配列ＩＳＣｇ１
（例２）中にも存在する。すべての試験した挿入物はジ
ゴキシゲニン−ｄＵＴＰ標識ＩＳＣｇ１−ＤＮＡとハイ
ブリッド形成した。更に、ＩＳ−捕獲ベクターを用い
て、ＩＳＣｇ１−型の挿入物をＣ．グルタミクムＡＳＯ
１９、Ｃ．ファスシアンスＤＭ２００−２、Ｃ．ファス
シアンスＤＭ２００−１、Ｃ．ヘルクリス及びＢ．フラ
ブムＡＴＣＣ１４０６７から単離することができた（表
１）。
単離をｓａｃＢ−システムを使用することにより達成し
た：移動性シャトル・ベクターｐＷＪ５（例３）を接合
（西独特許公開第３８４１４５３．８号公報；Ｓｃｈａ
ｅｆｅｒ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１７２巻、第
１６６３〜１６６６頁（１９９０年））により移動菌株
大腸菌Ｓ１７−１（Ｓｉｍｏｎ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ、第１巻、第７８４〜７９４頁（１９８３
年））からアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ）及びロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ）の属からのコリネ型受容菌株全部で２０種中に転位
した（表１）。コリネ型菌株中の不変のｐＷＪ５−プラ
スミドの存在は移入接合体（Ｔｒａｎｓｋｏｎｊｕｇａ
ｔｅｎ；Ｂｉｒｎｂｏｉｍ＆Ｄｏｌｙ，Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．、第７巻、第１５１３〜１５２３頁
（１９７９年））の溶解、制限エンドヌクレアーゼＢａ
ｍＨＩ及びＳｓｐＩでのプラスミドの切断、及びアガロ
ースゲル中でのフラグメントの分析により証明した。そ
れぞれの２０種のテストした菌株は引き続き行なったテ
スト中でＫｍ25を有するＬＢ−培地上では成長するが、
１０％蔗糖を含有ＬＢＫｍ25−培地上では成長しない
（表１）。この蔗糖選択性はプラスミドｐＷＪ５の完全
ｓａｃＢ−遺伝子の発現に起因される。それというのも
このプラスミドｐＥＣＭ２（例３）を含有する菌株は１
０％蔗糖を含有するＬＢＫｍ25上で成長することができ
るからです。テストすべき菌株のｐＷＪ５を含有する個
々のコロニーをＬＢ−液体培地中で対数増殖期が達せら
れるまで３０℃でエヤー振動機中で恒温保持した。それ
ぞれ細胞約５×１０9個を３０００ｒ．ｐ．ｍで１０分
間遠心分離することにより収獲し、このペレットをＬＢ
−培地１ｍｌ中に取り込み、かつＬＢ−培地上に置いた
０．４５μｍセルロースアセテートフィルター（直径４
０ｍｍ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅ
ｎ，ＦＲＧ）の表面に担持させた。乾燥させた後、この
細胞を３８．５℃で２０時間恒温保持した。その後、こ
のフィルターをＬＢ−培地１ｍｌで洗出し、未希釈懸濁
液及びＬＢ−培地で１：１０の比に希釈した懸濁液各々
０．１ｍｌを蔗糖１０％を含有するＬＢＫｍ25−寒天上
にひろげる。２〜３日間３０℃で保持した後、すべての
コリネ型バクテリア株に関して蔗糖耐性コロニーが異な
る頻度で得られる（表１）。コリネバクテリウム・グル
タミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔ
ａｍｉｃｕｍ）に関しては配合物あたり蔗糖耐性コロニ
ー２．５×１０5が得られ、これは頻度５×１０-5に相
応する。蔗糖耐性クローン１６個を例として、溶解、酵
素ＢａｍＨＩ及びＳｓＰＩでのプラスミドの制限及び引
き続くアガロース−ゲル電気泳動により調べた。クロー
ン８個中にはプラスミドｐＷＪ５中で大きさ約１．４５
ｋｂのｓａｃＢ−遺伝子の延長を証明することができ
た。すべての挿入は制限エンドヌクレアーゼ、ＢａｍＨ
Ｉ、ＢｃｌＩ、ＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＤｒａＩ
に関する認識部位を示し、これらは挿入配列ＩＳＣｇ１
（例２）中にも存在する。すべての試験した挿入物はジ
ゴキシゲニン−ｄＵＴＰ標識ＩＳＣｇ１−ＤＮＡとハイ
ブリッド形成した。更に、ＩＳ−捕獲ベクターを用い
て、ＩＳＣｇ１−型の挿入物をＣ．グルタミクムＡＳＯ
１９、Ｃ．ファスシアンスＤＭ２００−２、Ｃ．ファス
シアンスＤＭ２００−１、Ｃ．ヘルクリス及びＢ．フラ
ブムＡＴＣＣ１４０６７から単離することができた（表
１）。
【００５７】更に、種々のコリネ型菌株のＥｃｏＲＩ−
切断染色体ＤＮＡのハイブリッド形成をＰＣＲ−反応か
らのジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ標識１．９ｋｂフラグメ
ント（例２）と実施した。このハイブリッド形成はＣ．
グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２中及び突然変異体ＬＴ
５．５中でそれぞれＩＳＣｇ１の又はそれに非常に類似
の配列のコピー５つが生じたのを示す。更に、ＩＳＣｇ
１又は非常に類似の配列をハイブリッド形成により菌株
Ｃ．グルタミクムＡＳＯ１９及びブレビバクテリウム・
フラブムＤＳＭ２０４１１中で同定した。ハイブリッド
形成によりＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０５８、Ｃ．
アセトアシドフィルムＡＴＣＣ２１３５０、ブレビバク
テリウム・ジバリカツムＤＳＭ２０２９７及び大腸菌Ｋ
１２中にＩＳＣｇ１のコピーは検出することができなか
った。こうして、ハイブリッド形成により調べられた結
果はＩＳ−捕獲ベクターｐＷＪ５を用いて調べたコリネ
型バクテリア中のＩＳＣｇ１−タイプのＩＳ−配列の分
布と一致する。
切断染色体ＤＮＡのハイブリッド形成をＰＣＲ−反応か
らのジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ標識１．９ｋｂフラグメ
ント（例２）と実施した。このハイブリッド形成はＣ．
グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２中及び突然変異体ＬＴ
５．５中でそれぞれＩＳＣｇ１の又はそれに非常に類似
の配列のコピー５つが生じたのを示す。更に、ＩＳＣｇ
１又は非常に類似の配列をハイブリッド形成により菌株
Ｃ．グルタミクムＡＳＯ１９及びブレビバクテリウム・
フラブムＤＳＭ２０４１１中で同定した。ハイブリッド
形成によりＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０５８、Ｃ．
アセトアシドフィルムＡＴＣＣ２１３５０、ブレビバク
テリウム・ジバリカツムＤＳＭ２０２９７及び大腸菌Ｋ
１２中にＩＳＣｇ１のコピーは検出することができなか
った。こうして、ハイブリッド形成により調べられた結
果はＩＳ−捕獲ベクターｐＷＪ５を用いて調べたコリネ
型バクテリア中のＩＳＣｇ１−タイプのＩＳ−配列の分
布と一致する。
【００５８】他のタイプの挿入物はＢ．ラクトフェルメ
ンツム（ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３
８６９から単離され（表１）ＩＳＢｌ１と名付けられ
た。これらの約１．４ｋｂの大きさの挿入物は同様にｐ
ＷＪ５のｓａｃＢ−遺伝子中に見い出され、かつＩＳＣ
ｇ１に対して部分的な相同性を示すにすぎない。ジゴキ
シゲニン−ｄＵＴＰ標識ＩＳＢｌ１−ＤＮＡをＢ．ラク
トフェルメンツムＡＴＣＣ１３８６９からのＥｃｏＲＩ
切断総−ＤＮＡとハイブリッド形成することにより、こ
の菌株のゲノム中にＩＳＢｌ１のコピー４つが証明され
た。
ンツム（ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３
８６９から単離され（表１）ＩＳＢｌ１と名付けられ
た。これらの約１．４ｋｂの大きさの挿入物は同様にｐ
ＷＪ５のｓａｃＢ−遺伝子中に見い出され、かつＩＳＣ
ｇ１に対して部分的な相同性を示すにすぎない。ジゴキ
シゲニン−ｄＵＴＰ標識ＩＳＢｌ１−ＤＮＡをＢ．ラク
トフェルメンツムＡＴＣＣ１３８６９からのＥｃｏＲＩ
切断総−ＤＮＡとハイブリッド形成することにより、こ
の菌株のゲノム中にＩＳＢｌ１のコピー４つが証明され
た。
【００５９】更に、約１．３ｋｂの大きさの挿入配列は
ロドコックス・ファスシアンスＤＭ２００−２（昔はコ
リネバクテリウム・ファスシアンス）中で同定され（表
１）ＩＳＲｆ１と名付けられた。制限分析及びハイブリ
ッド形成研究はＩＳＣｇ１−族及びＩＳＢｌ１に対して
非常に僅かな類似性を示すだけである。ジゴキシゲニン
−ｄＵＴＰ標識ＩＳＲｆ１−ＤＮＡをＰｓｔＩ−切断し
たＲ．ファスシアンスＤＭ２００−２からの総−ＤＮＡ
とハイブリッド形成することにより菌株のゲノム中にＩ
ＳＲｆＩのコピー３つが証明された。ＩＳＲｆ１のコピ
ーはＲ．ファスシアンスＤＭ２００−２の内生プラスミ
ド上に位置決定することができた。
ロドコックス・ファスシアンスＤＭ２００−２（昔はコ
リネバクテリウム・ファスシアンス）中で同定され（表
１）ＩＳＲｆ１と名付けられた。制限分析及びハイブリ
ッド形成研究はＩＳＣｇ１−族及びＩＳＢｌ１に対して
非常に僅かな類似性を示すだけである。ジゴキシゲニン
−ｄＵＴＰ標識ＩＳＲｆ１−ＤＮＡをＰｓｔＩ−切断し
たＲ．ファスシアンスＤＭ２００−２からの総−ＤＮＡ
とハイブリッド形成することにより菌株のゲノム中にＩ
ＳＲｆＩのコピー３つが証明された。ＩＳＲｆ１のコピ
ーはＲ．ファスシアンスＤＭ２００−２の内生プラスミ
ド上に位置決定することができた。
【００６０】コリネ型バクテリアからの３種の単離ＩＳ
配列タイプの主な特性は表２中に比較して一緒に示し
た。
配列タイプの主な特性は表２中に比較して一緒に示し
た。
【００６１】例５ 挿入配列の使用によるコリネ型菌株の突然変異誘発 挿入配列での突然変異誘発の原理を菌株Ｃ．グルタミク
ムＡＴＣＣ１３０５８及びＩＳ−配列ＩＳＢｌ１（例
４）の例で示す：制限分析によりｓａｃＢ−遺伝子の
０．６５ｋｂの大きさのＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ−フ
ラグメント中のＩＳＢｌ１の挿入はｐＷＪ５上に位置決
定された。制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ及び
ＣｌａＩでのｐＷＪ５：：ＩＳＢｌ１−プラスミドの制
限により大きさ２．０５ｋｂのフラグメントが遊離し、
かつアガロースゲル電気泳動による分離の後、ゲルから
単離した。このためには相応するフラグメントを有する
細い帯状に切断し、６Ｍ沃化ナトリウム溶液２．５〜３
容量と混合する。５５℃で１０分間恒温保持した後、Ｄ
ＮＡを溶融したゲルからゲンクリーンキット（Ｇｅｎｅ
Ｃｌｅａｎ Ｋｉｔ；ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ．ＵＳＡ）を用いて製造者の指定にし
たがって単離し、かつ精製した。引き続き、フラグメン
トの突出した一本鎖末端を酵素クレノウーポリメラーゼ
でみたす。
ムＡＴＣＣ１３０５８及びＩＳ−配列ＩＳＢｌ１（例
４）の例で示す：制限分析によりｓａｃＢ−遺伝子の
０．６５ｋｂの大きさのＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ−フ
ラグメント中のＩＳＢｌ１の挿入はｐＷＪ５上に位置決
定された。制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ及び
ＣｌａＩでのｐＷＪ５：：ＩＳＢｌ１−プラスミドの制
限により大きさ２．０５ｋｂのフラグメントが遊離し、
かつアガロースゲル電気泳動による分離の後、ゲルから
単離した。このためには相応するフラグメントを有する
細い帯状に切断し、６Ｍ沃化ナトリウム溶液２．５〜３
容量と混合する。５５℃で１０分間恒温保持した後、Ｄ
ＮＡを溶融したゲルからゲンクリーンキット（Ｇｅｎｅ
Ｃｌｅａｎ Ｋｉｔ；ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ．ＵＳＡ）を用いて製造者の指定にし
たがって単離し、かつ精製した。引き続き、フラグメン
トの突出した一本鎖末端を酵素クレノウーポリメラーゼ
でみたす。
【００６２】移動可能な大腸菌ベクターｐＫ１８ｍｏｂ
（西独特許公開第４０２７４５３号公報）を制限酵素Ｓ
ｍａＩで線状にし、かつ専門家に常用の方法（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第
２改訂版、１．６節、Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９
年）により酵素アルカリ性ホスファターゼで処理した。
このように処理したベクターを充填ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃ
ｌａＩ−フラグメントと混合し、酵素Ｔ４−ＤＮＡリガ
ーゼで溶解した。引き続き、溶解配合物を大腸菌株Ｄｈ
５α（Ｗｏｏｄｃｏｃｋ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．第１７巻、第３４６９〜３４７８頁、１９
８９年）中に形質転換した。形質転換体をカナマイシン
（５０μｇ／ｍｌ）及び５−ブロム−４−クロル−３−
インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（２０μｇ／ｍｌ）
を含有するＬＢ−培地上にひろげて、３７℃で２４時間
恒温保持した。白いコロニーをカナマイシン（５０μｇ
／ｍｌ）を含有するＬＢ−培地上で精製し、かつプラス
ミド内容物を細胞の溶解、プラスミド−ＤＮＡの制限及
びアガロースゲル電気泳動により分析した。両方の配向
においてＩＳＢｌ１を有する２．０５ｋｂの大きさの挿
入物を有するクローンが同定され、ｐＫ１８ｍｏｂ：：
ＩＳＢｌ１．１及びｐＫ１８ｍｏｂ：：ＩＳＢｌ１．２
と名付けた（図５）。ｐＫ１８ｍｏｂ：：ＩＳＢｌ１．
１を大腸菌Ｄｈ５αから単離し、大腸菌Ｓ１７−１のコ
ンピテント細胞中に形質転換した。
（西独特許公開第４０２７４５３号公報）を制限酵素Ｓ
ｍａＩで線状にし、かつ専門家に常用の方法（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第
２改訂版、１．６節、Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９
年）により酵素アルカリ性ホスファターゼで処理した。
このように処理したベクターを充填ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃ
ｌａＩ−フラグメントと混合し、酵素Ｔ４−ＤＮＡリガ
ーゼで溶解した。引き続き、溶解配合物を大腸菌株Ｄｈ
５α（Ｗｏｏｄｃｏｃｋ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．第１７巻、第３４６９〜３４７８頁、１９
８９年）中に形質転換した。形質転換体をカナマイシン
（５０μｇ／ｍｌ）及び５−ブロム−４−クロル−３−
インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（２０μｇ／ｍｌ）
を含有するＬＢ−培地上にひろげて、３７℃で２４時間
恒温保持した。白いコロニーをカナマイシン（５０μｇ
／ｍｌ）を含有するＬＢ−培地上で精製し、かつプラス
ミド内容物を細胞の溶解、プラスミド−ＤＮＡの制限及
びアガロースゲル電気泳動により分析した。両方の配向
においてＩＳＢｌ１を有する２．０５ｋｂの大きさの挿
入物を有するクローンが同定され、ｐＫ１８ｍｏｂ：：
ＩＳＢｌ１．１及びｐＫ１８ｍｏｂ：：ＩＳＢｌ１．２
と名付けた（図５）。ｐＫ１８ｍｏｂ：：ＩＳＢｌ１．
１を大腸菌Ｄｈ５αから単離し、大腸菌Ｓ１７−１のコ
ンピテント細胞中に形質転換した。
【００６３】移動性菌株大腸菌Ｓ１７−１からプラスミ
ドｐＫ１８ｍｏｂ：：ＩＳＢｌ１．１を接合転位（Ｓｃ
ｈａｅｆｅｒ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１７２
巻、第１６６３〜１６６６頁、１９９０年、ヨーロッパ
特許Ａ−０３７２２３０号明細書）により、３８．５℃
に高めた恒温保持温度でＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３
０５８に転位させた。選択培地（ＬＢＫｍ25Ｎｘ50）上
で、移入接合体１５００個が得られた。これらのクロー
ン１２個をそのプラスミド含有物に関して例として検査
した。その際遊離したプラスミド−ＤＮＡは全く検出さ
れませんでした。移入接合体４００をＬＢＫｍ25Ｎｘ50
培地及びＭＭＫｍ25Ｎｘ50培地上で平行して実施し、３
０℃で２〜３日間恒温保持した。３つのクローンは最少
培地上で全く成長を示さなかったので栄養要求株である
ことが示された。任意に選択した移入接合クローン１２
個をＬＢＫｍ50−培地中で培養し、かつ総ＤＮＡを単離
し、酵素ＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル中で分離
した。ジゴキシゲニン標識ＥｃｏＲＩ−切断ｐＫ１８ｍ
ｏｂ：：ＩＳＢｌ１．１−ＤＮＡとハイブリッド形成す
ることによりＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０５８のゲ
ノム中の種々異なる位置にベクターの挿入を証明するこ
とができた。
ドｐＫ１８ｍｏｂ：：ＩＳＢｌ１．１を接合転位（Ｓｃ
ｈａｅｆｅｒ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１７２
巻、第１６６３〜１６６６頁、１９９０年、ヨーロッパ
特許Ａ−０３７２２３０号明細書）により、３８．５℃
に高めた恒温保持温度でＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３
０５８に転位させた。選択培地（ＬＢＫｍ25Ｎｘ50）上
で、移入接合体１５００個が得られた。これらのクロー
ン１２個をそのプラスミド含有物に関して例として検査
した。その際遊離したプラスミド−ＤＮＡは全く検出さ
れませんでした。移入接合体４００をＬＢＫｍ25Ｎｘ50
培地及びＭＭＫｍ25Ｎｘ50培地上で平行して実施し、３
０℃で２〜３日間恒温保持した。３つのクローンは最少
培地上で全く成長を示さなかったので栄養要求株である
ことが示された。任意に選択した移入接合クローン１２
個をＬＢＫｍ50−培地中で培養し、かつ総ＤＮＡを単離
し、酵素ＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル中で分離
した。ジゴキシゲニン標識ＥｃｏＲＩ−切断ｐＫ１８ｍ
ｏｂ：：ＩＳＢｌ１．１−ＤＮＡとハイブリッド形成す
ることによりＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０５８のゲ
ノム中の種々異なる位置にベクターの挿入を証明するこ
とができた。
【図１】ＤＮＡフラグメントの制限地図を示す図であ
り、ここでＡは矢印で示したｌｙｓＩコード領域を有す
る大きさ５．６ｋｂの染色体Ｓａｕ３Ａ ＤＮＡ−フラ
グメントの制限地図を示し、Ｂはハイブリッド形成ゾン
デとして使用した大きさ５０５ｂｐのＳｓｔＩ−Ｐｓｔ
Ｉ ＤＮＡフラグメントを示し、Ｃは突然変異体ＬＴ
５．５中で拡張されたＤＮＡフラグメントであり、Ｄは
挿入物が局在する、大きさ２８３ｂｐのＰｖｕＩＩ−Ｐ
ｓｔＩ ＤＮＡフラグメントを示す。略語：Ｂｃ；Ｂｃ
ｌＩ，Ｅ；ＥｃｏＲＩ Ｐ；ＰｓｔＩ，Ｐｖ；ＰｖｕＩ
Ｉ，Ｓ；ＳｓｔＩ，Ｓａ；Ｓａｕ３Ａ。
り、ここでＡは矢印で示したｌｙｓＩコード領域を有す
る大きさ５．６ｋｂの染色体Ｓａｕ３Ａ ＤＮＡ−フラ
グメントの制限地図を示し、Ｂはハイブリッド形成ゾン
デとして使用した大きさ５０５ｂｐのＳｓｔＩ−Ｐｓｔ
Ｉ ＤＮＡフラグメントを示し、Ｃは突然変異体ＬＴ
５．５中で拡張されたＤＮＡフラグメントであり、Ｄは
挿入物が局在する、大きさ２８３ｂｐのＰｖｕＩＩ−Ｐ
ｓｔＩ ＤＮＡフラグメントを示す。略語：Ｂｃ；Ｂｃ
ｌＩ，Ｅ；ＥｃｏＲＩ Ｐ；ＰｓｔＩ，Ｐｖ；ＰｖｕＩ
Ｉ，Ｓ；ＳｓｔＩ，Ｓａ；Ｓａｕ３Ａ。
【図２】ＤＮＡ−フラグメントＩＳＣｇ１の塩基配列を
表わす図である。
表わす図である。
【図３】図２の続きであり、ＤＮＡ−フラグメントＩＳ
Ｃｇ１の塩基配列を表わす図である。
Ｃｇ１の塩基配列を表わす図である。
【図４】ベクターｐＷＪ５の制限地図を表わす図であ
る。
る。
【図５】ベクターｐＫ１８ｍｏｂ：：ＩＳＢｌ１．１及
びｐＫ１８ｍｏｂ：：ＩＳＢｌ１．２の構造を示す図で
あり、斜線を入れた部分はｓａｃＢ−遺伝子の部分を示
し、塗りつぶした部分は逆方向反復を示す。
びｐＫ１８ｍｏｂ：：ＩＳＢｌ１．２の構造を示す図で
あり、斜線を入れた部分はｓａｃＢ−遺伝子の部分を示
し、塗りつぶした部分は逆方向反復を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴォルフガング イェーガー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト １ ローラントシュトラーセ 34 アー (72)発明者 イェルン カリノフスキー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト １ ドレーゲシュトラーセ 25 (72)発明者 ヴォルフガング ヴォールレーベン ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト １ デューラーシュトラーセ 46 (72)発明者 アルフレート ピューラー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト 15 アム ヴァルトシュレースヒェン ２ (56)参考文献 欧州特許出願公開252558（ＥＰ，Ａ １) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/77 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ (54)【発明の名称】 コリネ型バクテリア中の挿入配列又はトランスポゾンの発見法及び発見用陽性選択システム、挿 入配列のＤＮＡ、及びコリネ型バクテリアの突然変異誘発法並びに菌株のゲノム中での更なるコ ピーの検出法
Claims (9)
- 【請求項１】 コリネ型バクテリア中の挿入配列（ＩＳ
−配列）又はトランスポゾンの発見法において、この方
法が： １．１．１ 大腸菌中で機能的なレプリコンを含有する
ＤＮＡ−セグメント、 １．１．２ 移動性機能をコードするＤＮＡ−フラグメ
ントを含有する第２のＤＮＡ−セグメント（ｏｒｉＴを
含有するＭｏｂ−部位）、 １．１．３ グラム陽性菌中で相同組換えをし、かつ／
またはコリネ型バクテリア中で機能的なレプリコンを含
有する第３のＤＮＡ−セグメント、 １．１．４ バシラス・ズブチリスからの、ｓａｃＢ−
遺伝子を含有するＤＮＡ−セグメント、 からなる １．１． 大腸菌移動性菌株からの移動性、自己非転位
性ベクターの構成、 １．２． 接合移入による該ベクターのコリネ型受容菌
株中への移動、 １．３． 該ベクターを含有する移入接合体の１０％蔗
糖を含有する栄養培地中での培養、 １．４． 蔗糖耐性クローンの細胞溶解、制限エンドヌ
クレアーゼでのプラスミドの切断及びフラグメントの分
析、 を包含するコリネ型バクテリア中の挿入配列又はトラン
スポゾンの発見法。 - 【請求項２】 コリネ型バクテリア中の挿入配列又はト
ランスポゾンの発見用陽性選択システムにおいて、これ
が ａ）大腸菌中で機能的なレプリコンを含有するＤＮＡ−
セグメント、 ｂ）移動性機能をコードするＤＮＡ−フラグメントを含
有する第２のＤＮＡ−セグメント（ｏｒｉＴを含有する
Ｍｏｂ−部位） ｃ）グラム陽性菌中で相同組換えをし、かつ／またはコ
リネ型バクテリア中で機能的なレプリコンを含有する第
３のＤＮＡ−セグメント、 ｄ）バシラス・ズブチリスからの、ｓａｃＢ−遺伝子を
含有するＤＮＡ−セグメント、 からなっている移動性、自己非転位性ベクターを包含す
る、コリネ型バクテリア中の挿入配列又はトランスポゾ
ンの発見用陽性選択システム。 - 【請求項３】 次の制限地図： 【化１】 で表わされ、かつ１１７９０ｂｐからなるベクターｐＷ
Ｊ５（捕獲ベクター）を使用する請求項２記載の選択シ
ステム。 - 【請求項４】 約１．４５ｋｂからなり、かつ次の塩基
配列の長さ２４ｂｐの逆方向反復末端： ＩＲ−Ｌ ＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＴＡＣＡＴＣＡ ＩＲ−Ｒ ＧＧＣＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＡＧＡＧＴＧＣＡＴＴＧ を有する 、Ｃ．グルタミクム、Ｃ．ファシアンス、Ｃ．
ヘルクリス及びＢ．フラブムからの挿入配列のＤＮＡ。 - 【請求項５】 １４５２ｂｐからなり、かつ次の塩基配
列： 【化２】 【化３】 で表わされる請求項４記載の挿入配列のＤＮＡ。 - 【請求項６】 約１．４５ｋｂからなり、かつ次の塩基
配列の長さ２６ｂｐの逆方向反復末端： ＩＲ−Ｌ ＧＧＣＴＣＴＴＣＣＧＴＴＴＴＴＡＧＡＧＴＧＣＡＴＴＧ ＩＲ−Ｒ ＧＧＣＴＣＴＴＣＣＧＴＴＧＴＴＡＧＡＧＴＧＣＡＴＴＧ を有する 、Ｂ．ラクトフェルメンツムからの挿入配列の
ＤＮＡ。 - 【請求項７】 約１．３ｋｂからなり、かつ次の塩基配
列の長さ１８ｂｐの逆方向反復末端： ＩＲ−１ ＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＣＣＣＡＴＴＴＧ ＩＲ
−２ ＧＧＧＣＣＣＧＡＣＣＣＣＧＡＴＡＴＧを有す
る 、Ｃ.ファシアンスからの挿入配列のＤＮＡ。 - 【請求項８】 請求項４から７による挿入配列のＤＮＡ
を使用することによりコリネ型バクテリアを突然変異誘
発する方法において、 ９．１．１ 大腸菌中で機能的なレプリコンを含有する
ＤＮＡ−セグメント、 ９．１．２ 移動性機能をコードするＤＮＡ−フラグメ
ントを含有する第２のＤＮＡ−セグメント（ｏｒｉＴを
含有するＭｏｂ−部位）、 ９．１．３ グラム陽性菌中で相同組換えをし、かつ／
またはコリネ型バクテリア中で機能的なレプリコンを含
有する第３のＤＮＡ−セグメント、 ９．１．４ ＩＳ−配列を含有するＤＮＡ−セグメン
ト、 からなる ９．１． 大腸菌移動性菌株からの移動性、自己非転位
性ベクターを構成し、 ９．２． 接合移入により該ベクターをコリネ型受容菌
株中に移動し、 ９．３． 該ベクターを含有する移入接合体を所望の栄
養培地中で培養することを特徴とするコリネ型バクテリ
アの突然変異誘発法。 - 【請求項９】 請求項４から７による挿入配列のＤＮＡ
を使用することにより菌株のゲノム中での更なるコピー
を検出するために、ジオキシゲニン−ｄ−ＵＴＰで標識
付けしたＩＳ−配列ＤＮＡを含有するフラグメントをコ
リネ型バクテリアからの検査すべきＤＮＡに対してハイ
ブリッド形成することを特徴とする菌株のゲノム中での
更なるコピーの検出法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4208785.6 | 1992-03-19 | ||
| DE4208785A DE4208785A1 (de) | 1992-03-19 | 1992-03-19 | Verfahren zum auffinden von insertionselementen (is-elemente) oder transposonen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646867A JPH0646867A (ja) | 1994-02-22 |
| JP2944841B2 true JP2944841B2 (ja) | 1999-09-06 |
Family
ID=6454429
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5058443A Expired - Fee Related JP2944841B2 (ja) | 1992-03-19 | 1993-03-18 | コリネ型バクテリア中の挿入配列又はトランスポゾンの発見法及び発見用陽性選択システム、挿入配列のｄｎａ、及びコリネ型バクテリアの突然変異誘発法並びに菌株のゲノム中での更なるコピーの検出法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5380657A (ja) |
| EP (1) | EP0563527B1 (ja) |
| JP (1) | JP2944841B2 (ja) |
| DE (2) | DE4208785A1 (ja) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3298135B2 (ja) * | 1992-03-04 | 2002-07-02 | 味の素株式会社 | コリネホルム細菌由来のシュークラーゼ遺伝子 |
| US5714375A (en) * | 1995-06-05 | 1998-02-03 | Nobl Laboratories, Inc. | Ileal symbiont intracellularis propagation in suspended host cells |
| US5885823A (en) * | 1995-06-05 | 1999-03-23 | Nobl Laboratories, Inc. | Lawsonia intracellularis cultivation, anti-Lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents |
| FR2736066B1 (fr) * | 1995-06-30 | 1998-11-20 | Ajinomoto Kk | Procede d'amplification d'un gene par transposon artificiel, bacterie coryneforme obtenue par ce procede et procede de production d'un acide amine a l'aide de cette bacterie |
| JP4035855B2 (ja) † | 1996-06-05 | 2008-01-23 | 味の素株式会社 | Ｌ−リジンの製造法 |
| US5843664A (en) * | 1996-06-11 | 1998-12-01 | Institut Pasteur | Method of selection of allelic exchange mutants |
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