JPH08283173A - 血圧降下剤及びその製造法 - Google Patents
血圧降下剤及びその製造法Info
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- JPH08283173A JPH08283173A JP7084247A JP8424795A JPH08283173A JP H08283173 A JPH08283173 A JP H08283173A JP 7084247 A JP7084247 A JP 7084247A JP 8424795 A JP8424795 A JP 8424795A JP H08283173 A JPH08283173 A JP H08283173A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】Lys Val Leu Pro Val Pro Glnのアミノ酸配列
で示されるペプチド及びその塩を有効成分として含有す
る血圧降下剤、及び獣乳成分を原料として、発酵法又は
プロティナーゼ処理により得る前記血圧降下剤の製造
法。 【効果】前記血圧降下剤は、ヒト及び哺乳動物の血圧を
有効に降下させることができ、安全性が高く、副作用が
少ないため、医薬品、機能性食品等への利用が可能であ
る。また前記血圧降下剤は、獣乳成分を原料としたプロ
ティナーゼ処理法又は発酵法により、容易にしかも安価
に製造することができる。
で示されるペプチド及びその塩を有効成分として含有す
る血圧降下剤、及び獣乳成分を原料として、発酵法又は
プロティナーゼ処理により得る前記血圧降下剤の製造
法。 【効果】前記血圧降下剤は、ヒト及び哺乳動物の血圧を
有効に降下させることができ、安全性が高く、副作用が
少ないため、医薬品、機能性食品等への利用が可能であ
る。また前記血圧降下剤は、獣乳成分を原料としたプロ
ティナーゼ処理法又は発酵法により、容易にしかも安価
に製造することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血圧降下作用等を有
し、医薬品、特定保健用食品、健康食品等に利用できる
ペプチド及びその塩を有効成分として含有する血圧降下
剤及びその製造法に関する。
し、医薬品、特定保健用食品、健康食品等に利用できる
ペプチド及びその塩を有効成分として含有する血圧降下
剤及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来血圧降下剤として、天然物、化学合
成物等が多数報告されており、例えば化学合成物として
は、カプトプリル（Ｄ−２−メチル−３−メルカプトプ
ロパノイル−Ｌ−プロリン）が有名であり、既に経口用
降圧剤として実用化されている。しかし、これら化学合
成物は、常に安全性の問題に注意を払わなければならな
い。
成物等が多数報告されており、例えば化学合成物として
は、カプトプリル（Ｄ−２−メチル−３−メルカプトプ
ロパノイル−Ｌ−プロリン）が有名であり、既に経口用
降圧剤として実用化されている。しかし、これら化学合
成物は、常に安全性の問題に注意を払わなければならな
い。
【０００３】また、天然物あるいは天然物由来の血圧降
下物質としては、蛇毒ペプチド及びその類縁体等が知ら
れている。また食品原料由来のペプチド性物質にも降圧
作用が見られることが報告されており、例えば獣乳カゼ
イン、魚肉蛋白質等の酵素分解物から得られるペプチド
に降圧作用があることが報告されており、最近、特に乳
酸菌産生プロティナーゼによるカゼイン分解ペプチドの
血圧降下作用に関する報告がなされている（N. Yamamot
o et, al. J. Dairy Sci. 77: 917-922 (1994)、N. Yam
amoto et, al., Biosci. Biotech. Biochem., 58, 776-
778 (1994)）。
下物質としては、蛇毒ペプチド及びその類縁体等が知ら
れている。また食品原料由来のペプチド性物質にも降圧
作用が見られることが報告されており、例えば獣乳カゼ
イン、魚肉蛋白質等の酵素分解物から得られるペプチド
に降圧作用があることが報告されており、最近、特に乳
酸菌産生プロティナーゼによるカゼイン分解ペプチドの
血圧降下作用に関する報告がなされている（N. Yamamot
o et, al. J. Dairy Sci. 77: 917-922 (1994)、N. Yam
amoto et, al., Biosci. Biotech. Biochem., 58, 776-
778 (1994)）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安全
性が高く、微量の経口投与で有効な血圧降下作用を示す
血圧降下剤及びその製造法を提供することにある。
性が高く、微量の経口投与で有効な血圧降下作用を示す
血圧降下剤及びその製造法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、下記ア
ミノ酸配列で示されるペプチド及びその塩を有効成分と
して含有する血圧降下剤が提供される。 Lys Val Leu Pro Val Pro Gln また本発明によれば、獣乳成分を原料として、発酵法に
より得ることを特徴とする前記血圧降下剤の製造法が提
供される。更に本発明によれば、獣乳成分を原料とし
て、プロティナーゼ処理により得ることを特徴とする前
記血圧降下剤の製造法が提供される。
ミノ酸配列で示されるペプチド及びその塩を有効成分と
して含有する血圧降下剤が提供される。 Lys Val Leu Pro Val Pro Gln また本発明によれば、獣乳成分を原料として、発酵法に
より得ることを特徴とする前記血圧降下剤の製造法が提
供される。更に本発明によれば、獣乳成分を原料とし
て、プロティナーゼ処理により得ることを特徴とする前
記血圧降下剤の製造法が提供される。
【０００６】以下、本発明を更に詳細に説明する。本発
明の血圧降下剤において、有効成分は、前記アミノ酸配
列で示されるペプチド又はその塩である。その塩として
は、薬理学上許容される塩類、例えば塩酸塩、硫酸塩、
リン酸塩等の無機酸塩及びクエン酸塩、マレイン酸塩、
フマル酸塩、酒石酸塩、乳酸塩等の有機酸塩を挙げるこ
とができる。
明の血圧降下剤において、有効成分は、前記アミノ酸配
列で示されるペプチド又はその塩である。その塩として
は、薬理学上許容される塩類、例えば塩酸塩、硫酸塩、
リン酸塩等の無機酸塩及びクエン酸塩、マレイン酸塩、
フマル酸塩、酒石酸塩、乳酸塩等の有機酸塩を挙げるこ
とができる。
【０００７】前記ペプチドを調製するには、後に詳述す
る獣乳成分を原料として、発酵法又はプロティナーゼ処
理等により処理し、公知の方法で目的とするペプチドを
精製する方法等により得ることができる。即ち前記ペプ
チドは、獣乳蛋白質成分の１種であるβカゼインを構成
するペプチド単位の一部である。また公知の有機化学合
成法により得ることもできる。
る獣乳成分を原料として、発酵法又はプロティナーゼ処
理等により処理し、公知の方法で目的とするペプチドを
精製する方法等により得ることができる。即ち前記ペプ
チドは、獣乳蛋白質成分の１種であるβカゼインを構成
するペプチド単位の一部である。また公知の有機化学合
成法により得ることもできる。
【０００８】本発明の血圧降下剤は、前記ペプチド及び
その塩を含有するものであるので、その製造法において
は、獣乳カゼインを原料とする微生物による発酵法、あ
るいは獣乳カゼインのプロティナーゼによる酵素加水分
解法等により製造することができ、前記ペプチドを単離
する程度の精製を必ずしも行なう必要はない。
その塩を含有するものであるので、その製造法において
は、獣乳カゼインを原料とする微生物による発酵法、あ
るいは獣乳カゼインのプロティナーゼによる酵素加水分
解法等により製造することができ、前記ペプチドを単離
する程度の精製を必ずしも行なう必要はない。
【０００９】前記発酵法においては、発酵原料として獣
乳成分、例えば牛乳、山羊乳、馬乳又はこれらの脱脂乳
の乳培地等を用いることができる。またカゼインあるい
はカゼイン塩を添加したＢＬ培地、Briggs liver broth
培地、ＭＲＳ培地、ＧＡＭ培地、ＴＴＹ培地、ＭＧＬＰ
培地等を用いることができる。使用できる乳酸菌として
は、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus
helveticus）、ラクトバチルス・デルブルィキィ・サブ
スペシィーズ・ブルガリカス(Lactobacillus delbrueck
ii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・アシドフィ
ラス（Lactobacillus acidophilus）等のラクトバチル
ス属乳酸菌を用いることができる。更に好ましくはラク
トバチルス・ヘルベティカス JCM-1003（Lactobacillus
helveticus JCM-1003）、ラクトバチルス・デルブルィ
キィ・サブスペシィーズ・ブルガリカス JCM-1002（Lac
tobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus JCM-100
2）、ラクトバチルス・アシドフィラス JCM-1132（Lact
obaticillus acidophilus JCM-1132）等を挙げることが
できる。
乳成分、例えば牛乳、山羊乳、馬乳又はこれらの脱脂乳
の乳培地等を用いることができる。またカゼインあるい
はカゼイン塩を添加したＢＬ培地、Briggs liver broth
培地、ＭＲＳ培地、ＧＡＭ培地、ＴＴＹ培地、ＭＧＬＰ
培地等を用いることができる。使用できる乳酸菌として
は、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus
helveticus）、ラクトバチルス・デルブルィキィ・サブ
スペシィーズ・ブルガリカス(Lactobacillus delbrueck
ii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・アシドフィ
ラス（Lactobacillus acidophilus）等のラクトバチル
ス属乳酸菌を用いることができる。更に好ましくはラク
トバチルス・ヘルベティカス JCM-1003（Lactobacillus
helveticus JCM-1003）、ラクトバチルス・デルブルィ
キィ・サブスペシィーズ・ブルガリカス JCM-1002（Lac
tobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus JCM-100
2）、ラクトバチルス・アシドフィラス JCM-1132（Lact
obaticillus acidophilus JCM-1132）等を挙げることが
できる。
【００１０】発酵条件としては、発酵温度２０〜５０
℃、好ましくは３０〜４０℃、発酵時間３〜３０時間、
好ましくは６〜１２時間の条件下で行なうことができ
る。発酵時間はスターター接種量及び発酵温度により異
なるが、発酵乳酸量が好ましくは０．５〜２．０重量
％、更に好ましくは０．７〜１．５重量％となるまで行
うことにより、目的とするペプチドを含む発酵乳を得る
ことができる。
℃、好ましくは３０〜４０℃、発酵時間３〜３０時間、
好ましくは６〜１２時間の条件下で行なうことができ
る。発酵時間はスターター接種量及び発酵温度により異
なるが、発酵乳酸量が好ましくは０．５〜２．０重量
％、更に好ましくは０．７〜１．５重量％となるまで行
うことにより、目的とするペプチドを含む発酵乳を得る
ことができる。
【００１１】具体的には、例えばスターター接種量３重
量％、発酵温度３７℃、発酵時間８時間程度で発酵乳酸
量を０．７〜０．８重量％とすることができ、またスタ
ーター接種量１重量％、発酵温度３７℃とした場合に
は、発酵時間１０〜１２時間程度で、発酵乳酸量を０．
７〜０．８重量％とすることができる。更に長時間発酵
を行った場合には、乳酸菌が産生するペプチダーゼの作
用を受けて、有効成分としてのペプチドは減少する。更
に発酵を続けることにより、前記ペプチダーゼの作用を
受けて新たにVal Pro ProやIle Pro Proが生成し、新た
な血圧降下作用を示すことが知られている(日本農芸化
学学会誌 67, 3, 289(1993))。しかし前述の発酵条件で
は、血圧降下作用を示す量のVal Pro ProやIle Pro Pro
の生成は認められない。
量％、発酵温度３７℃、発酵時間８時間程度で発酵乳酸
量を０．７〜０．８重量％とすることができ、またスタ
ーター接種量１重量％、発酵温度３７℃とした場合に
は、発酵時間１０〜１２時間程度で、発酵乳酸量を０．
７〜０．８重量％とすることができる。更に長時間発酵
を行った場合には、乳酸菌が産生するペプチダーゼの作
用を受けて、有効成分としてのペプチドは減少する。更
に発酵を続けることにより、前記ペプチダーゼの作用を
受けて新たにVal Pro ProやIle Pro Proが生成し、新た
な血圧降下作用を示すことが知られている(日本農芸化
学学会誌 67, 3, 289(1993))。しかし前述の発酵条件で
は、血圧降下作用を示す量のVal Pro ProやIle Pro Pro
の生成は認められない。
【００１２】前記獣乳カゼインのプロティナーゼ酵素加
水分解法は、原料として獣乳カゼイン、獣乳カゼイン塩
等を用い、酵素として、例えば微生物産生プロティナー
ゼを用いることができる。前記微生物産生プロティナー
ゼは、微生物、例えば乳酸菌由来のものを用いることが
できる。このような乳酸菌産生プロティナーゼにより獣
乳成分を酵素加水分解する方法は従来知られた方法であ
る。例えば、ラクトバチルス ヘルベティカス(Lactobac
illus helveticus)産生プロティナーゼの性質とカゼイ
ン配列内の切断点についての報告があるが(Claude ZEVA
CO and J.C.GRIPON, Le Lait, 68,393-408(1988)、Yama
moto N. et. al., J. Biochem., 114, 740-745(199
3))、前記ペプチドLys Val Leu Pro Val Pro Gln部位で
の切断は報告されていない。更にラクトバチルス・ラク
ティス・サブスペシィーズ・クレモリス(Lactobacillus
lactis subsp. cremoris)産生P1及びP3タイプのプロテ
ィナーゼによるβカゼイン加水分解の比較についても報
告されており（Julian R. Reid et.al.Applied Microbi
ology and Biotechnology, 36, 344-351(1991))、その
切断点より、前記ペプチドの生成が予測される。しか
し、前記ペプチドの血圧降下作用及び前記ペプチドを発
酵乳中から調製する方法の報告はなされていない。
水分解法は、原料として獣乳カゼイン、獣乳カゼイン塩
等を用い、酵素として、例えば微生物産生プロティナー
ゼを用いることができる。前記微生物産生プロティナー
ゼは、微生物、例えば乳酸菌由来のものを用いることが
できる。このような乳酸菌産生プロティナーゼにより獣
乳成分を酵素加水分解する方法は従来知られた方法であ
る。例えば、ラクトバチルス ヘルベティカス(Lactobac
illus helveticus)産生プロティナーゼの性質とカゼイ
ン配列内の切断点についての報告があるが(Claude ZEVA
CO and J.C.GRIPON, Le Lait, 68,393-408(1988)、Yama
moto N. et. al., J. Biochem., 114, 740-745(199
3))、前記ペプチドLys Val Leu Pro Val Pro Gln部位で
の切断は報告されていない。更にラクトバチルス・ラク
ティス・サブスペシィーズ・クレモリス(Lactobacillus
lactis subsp. cremoris)産生P1及びP3タイプのプロテ
ィナーゼによるβカゼイン加水分解の比較についても報
告されており（Julian R. Reid et.al.Applied Microbi
ology and Biotechnology, 36, 344-351(1991))、その
切断点より、前記ペプチドの生成が予測される。しか
し、前記ペプチドの血圧降下作用及び前記ペプチドを発
酵乳中から調製する方法の報告はなされていない。
【００１３】前記乳酸菌産生プロティナーゼを調製する
際の乳酸菌、及びこれらを培養する際の培地としては、
具体的には、前記発酵法で列挙したものを好ましく挙げ
ることができる。
際の乳酸菌、及びこれらを培養する際の培地としては、
具体的には、前記発酵法で列挙したものを好ましく挙げ
ることができる。
【００１４】発酵条件としては、発酵温度２０〜５０
℃、好ましくは３０〜４０℃、発酵時間３〜３０時間、
好ましくは６〜１２時間の条件下で行うことができる。
また、得られる発酵液は、通常ｐＨ３〜４を示すが、目
的とするプロティナーゼの収率を増加させるためには、
前記発酵液を中性域のｐＨに保ち行うのが好ましい。更
にプロティナーゼの抽出は、好ましくは５〜４０℃にて
１０〜６０分間抽出する工程を２〜５回繰り返すことに
より行うことができる。
℃、好ましくは３０〜４０℃、発酵時間３〜３０時間、
好ましくは６〜１２時間の条件下で行うことができる。
また、得られる発酵液は、通常ｐＨ３〜４を示すが、目
的とするプロティナーゼの収率を増加させるためには、
前記発酵液を中性域のｐＨに保ち行うのが好ましい。更
にプロティナーゼの抽出は、好ましくは５〜４０℃にて
１０〜６０分間抽出する工程を２〜５回繰り返すことに
より行うことができる。
【００１５】前記乳酸菌産生プロティナーゼで獣乳カゼ
イン等の獣乳成分を分解するには、該乳酸菌産生プロテ
ィナーゼと、例えばリン酸緩衝液等の緩衝液に溶解した
獣乳成分とを混合し、３０〜５０℃にて、１〜１２時間
反応させ、次いで、遠心分離し、好ましくは分子量分画
１００００〜５００００の限外濾過膜等で限外濾過し、
更に逆相液体カラムクロマトグラフィーを用いて目的の
ペプチドを含む成分を精製する方法等により得ることが
できる。この際乳酸菌産生プロティナーゼと獣乳成分と
の混合割合は、重量比で１：１００〜１：５０００であ
るのが好ましい。
イン等の獣乳成分を分解するには、該乳酸菌産生プロテ
ィナーゼと、例えばリン酸緩衝液等の緩衝液に溶解した
獣乳成分とを混合し、３０〜５０℃にて、１〜１２時間
反応させ、次いで、遠心分離し、好ましくは分子量分画
１００００〜５００００の限外濾過膜等で限外濾過し、
更に逆相液体カラムクロマトグラフィーを用いて目的の
ペプチドを含む成分を精製する方法等により得ることが
できる。この際乳酸菌産生プロティナーゼと獣乳成分と
の混合割合は、重量比で１：１００〜１：５０００であ
るのが好ましい。
【００１６】本発明の血圧降下剤は、前記ペプチド及び
その塩を有効成分として含有するので、ヒトをはじめと
する哺乳動物の高血圧の治療、予防に有効である。
その塩を有効成分として含有するので、ヒトをはじめと
する哺乳動物の高血圧の治療、予防に有効である。
【００１７】本発明の血圧降下剤の投与方法は、主に経
口投与、静脈注射等で行うことができる。剤形は、液状
として、また乾燥粉末とした後に錠剤、顆粒製剤、カプ
セル製剤等として用いることもできる。前記ペプチド及
びその塩は、発酵法、酵素加水分解法又は有機化学合成
法により得られたそれ自体、又は更に公知の方法により
精製処理を行なったものを前記各種剤形となるよう調製
して使用することができる。前記ペプチド及びその塩
は、後述するように微量でも血圧降下作用を発揮するの
で、前記酵素加水分解法又は発酵法で得られた前記ペプ
チド及びその塩を含む溶液を、そのまま、又は種々の栄
養分等を加えて、もしくは飲食品内に含有させて血圧降
下作用、高血圧予防の機能をもたせた機能性食品、特定
用保健食品、健康食品等として用いることができる。更
に前記発酵物を、ヨーグルト、チーズ等の直接摂取用発
酵食品として用いることもできる。
口投与、静脈注射等で行うことができる。剤形は、液状
として、また乾燥粉末とした後に錠剤、顆粒製剤、カプ
セル製剤等として用いることもできる。前記ペプチド及
びその塩は、発酵法、酵素加水分解法又は有機化学合成
法により得られたそれ自体、又は更に公知の方法により
精製処理を行なったものを前記各種剤形となるよう調製
して使用することができる。前記ペプチド及びその塩
は、後述するように微量でも血圧降下作用を発揮するの
で、前記酵素加水分解法又は発酵法で得られた前記ペプ
チド及びその塩を含む溶液を、そのまま、又は種々の栄
養分等を加えて、もしくは飲食品内に含有させて血圧降
下作用、高血圧予防の機能をもたせた機能性食品、特定
用保健食品、健康食品等として用いることができる。更
に前記発酵物を、ヨーグルト、チーズ等の直接摂取用発
酵食品として用いることもできる。
【００１８】本発明の血圧降下剤の投与量は、患者の年
齢、体重、高血圧症状等により異なるが、前記ペプチド
及びその塩の含有量に換算して、０．５ｍｇ／体重ｋｇ
・日以上で有効である。好ましくは１ｍｇ／体重ｋｇ・
日前後で使用するのが望ましい。また前記発酵法で得ら
れた発酵乳をヨーグルトとして摂取する場合は、好まし
くは５〜２０ｍｌ／体重ｋｇ・日の摂取量で、目的とす
る血圧降下作用を得ることができる。
齢、体重、高血圧症状等により異なるが、前記ペプチド
及びその塩の含有量に換算して、０．５ｍｇ／体重ｋｇ
・日以上で有効である。好ましくは１ｍｇ／体重ｋｇ・
日前後で使用するのが望ましい。また前記発酵法で得ら
れた発酵乳をヨーグルトとして摂取する場合は、好まし
くは５〜２０ｍｌ／体重ｋｇ・日の摂取量で、目的とす
る血圧降下作用を得ることができる。
【００１９】前記ペプチドをＷＫＹラット（１５週令、
体重約３００ｇ、ｎ＝５）へ１０ｍｇ／体重ｋｇ・日、
１か月間経口投与したが、ラットに異常は認められず、
本発明のペプチドの安全性が確認された。
体重約３００ｇ、ｎ＝５）へ１０ｍｇ／体重ｋｇ・日、
１か月間経口投与したが、ラットに異常は認められず、
本発明のペプチドの安全性が確認された。
【００２０】
【発明の効果】本発明の血圧降下剤は、ヒト及び哺乳動
物の血圧を有効に降下させることができ、安全性が高
く、副作用が少ないため、医薬品、機能性食品等への利
用が可能である。また前記血圧降下剤は、獣乳成分を原
料としたプロティナーゼ処理法又は発酵法により、容易
にしかも安価に製造することができる。
物の血圧を有効に降下させることができ、安全性が高
く、副作用が少ないため、医薬品、機能性食品等への利
用が可能である。また前記血圧降下剤は、獣乳成分を原
料としたプロティナーゼ処理法又は発酵法により、容易
にしかも安価に製造することができる。
【００２１】
【実施例】以下実施例により更に詳細に説明するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。
発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
【実施例１】乳酸菌としてラクトバチルス・ヘルベティ
カス JCM-1003のスターター発酵液３００ｇを用い、９
重量％の脱脂粉乳１０ｋｇに接種した後、３Ｎ水酸化ナ
トリウム溶液を自動的に加え、ｐＨを６．０に保ちなが
ら、濁度１．０になるまで３７℃、５時間培養した（濁
度測定方法は、培養液１０ｍｌにクエン酸ナトリウムを
終濃度１重量％になるように加え、乳蛋白質を可溶化し
た後、５９０ｎｍの吸光度を測定した）。培養終了後ク
エン酸ナトリウムを全発酵液に１重量％となるように添
加し、室温にて２０分間保持して乳蛋白質を可溶化し
た。次に５０００回転／分、２０分間の遠心分離を行い
集菌した菌体を、２０ｍＭ塩化カルシウム、５０ｍＭβ
−グリセロリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗
浄した後、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）５０ｍ
ｌを加えて３７℃で３０分間保温、抽出した。次いで１
００００回転／分、１０分間の遠心分離を行い上清液を
採取した。抽出、遠心操作を４回繰り返して、上清液約
２００ｍｌを採取した（粗抽出液）。この粗抽出液を予
め５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含
む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ＴＥ緩衝液、ｐＨ７．
８）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム（５ｍ
ｌ）に通した。カラムを０．３Ｍの塩化ナトリウムを含
むＴＥ緩衝液３０ｍｌで洗浄後、１．０Ｍ塩化ナトリウ
ムを含むＴＥ緩衝液１５ｍｌで溶出し、約１５０μｇの
乳酸菌産生プロティナーゼをほぼ単一なものとして得
た。
カス JCM-1003のスターター発酵液３００ｇを用い、９
重量％の脱脂粉乳１０ｋｇに接種した後、３Ｎ水酸化ナ
トリウム溶液を自動的に加え、ｐＨを６．０に保ちなが
ら、濁度１．０になるまで３７℃、５時間培養した（濁
度測定方法は、培養液１０ｍｌにクエン酸ナトリウムを
終濃度１重量％になるように加え、乳蛋白質を可溶化し
た後、５９０ｎｍの吸光度を測定した）。培養終了後ク
エン酸ナトリウムを全発酵液に１重量％となるように添
加し、室温にて２０分間保持して乳蛋白質を可溶化し
た。次に５０００回転／分、２０分間の遠心分離を行い
集菌した菌体を、２０ｍＭ塩化カルシウム、５０ｍＭβ
−グリセロリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗
浄した後、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）５０ｍ
ｌを加えて３７℃で３０分間保温、抽出した。次いで１
００００回転／分、１０分間の遠心分離を行い上清液を
採取した。抽出、遠心操作を４回繰り返して、上清液約
２００ｍｌを採取した（粗抽出液）。この粗抽出液を予
め５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含
む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ＴＥ緩衝液、ｐＨ７．
８）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム（５ｍ
ｌ）に通した。カラムを０．３Ｍの塩化ナトリウムを含
むＴＥ緩衝液３０ｍｌで洗浄後、１．０Ｍ塩化ナトリウ
ムを含むＴＥ緩衝液１５ｍｌで溶出し、約１５０μｇの
乳酸菌産生プロティナーゼをほぼ単一なものとして得
た。
【００２３】次にカゼイン１ｇを２０ｍＭのリン酸緩衝
液（ｐＨ７．５）１００ｍｌに溶解し、前記乳酸菌産生
プロティナーゼ５０μｇと混合し、４２℃で１５時間反
応させた。その反応液を１００００回転／分、１０分間
の遠心後に上清を回収し、限外濾過（商品名「アドバン
テック東洋ＵＨＰ−１５０」、限外濾過膜：分子量分画
１００００、富士フィルター工業株式会社製）を行った
ところ、カゼイン１ｇからプロティナーゼ分解ペプチド
約７００ｍｇ（収率約７０％）が限外濾過外液９０ｍｌ
中に得られた。
液（ｐＨ７．５）１００ｍｌに溶解し、前記乳酸菌産生
プロティナーゼ５０μｇと混合し、４２℃で１５時間反
応させた。その反応液を１００００回転／分、１０分間
の遠心後に上清を回収し、限外濾過（商品名「アドバン
テック東洋ＵＨＰ−１５０」、限外濾過膜：分子量分画
１００００、富士フィルター工業株式会社製）を行った
ところ、カゼイン１ｇからプロティナーゼ分解ペプチド
約７００ｍｇ（収率約７０％）が限外濾過外液９０ｍｌ
中に得られた。
【００２４】次いで得られた全限外濾過外液を、次の条
件に従って逆相高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を
用いて１０分おきに分取し、６つの溶出画分を得た。
件に従って逆相高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を
用いて１０分おきに分取し、６つの溶出画分を得た。
【００２５】ポンプ：Ｌ６２００インティリジェントポ
ンプ（日立製作所製） Ｌ６０００ポンプ（日立製作所製） 検出器：Ｌ４０００ＵＶ検出器（日立製作所製） ２１
５ｎｍの紫外部吸収 カラム：ウオーターズ マイクロボンダスフェアー５μ
Ｃ１８（日本ミリポア社製） 溶出液：Ａ液：０．１重量％ＴＦＡ水溶液 Ｂ液：０．１重量％ＴＦＡ入りアセトニトリル 濃度勾配：（Ｂ液／Ａ液＋Ｂ液）×１００（％）：０％
→４０％（６０分）（以下、濃度勾配（１）と略す） 流速：１ｍｌ／分 それぞれの溶出画分を凍結乾燥し、生理食塩水５０ｍｌ
にて溶解した。それらを高血圧自然発症ラット（ＳＨ
Ｒ：日本チャールズ・リバー社より購入、１群５匹、１
９〜２５週令、雄）に胃ゾンデで２ｍｌ／匹強制投与
し、６時間後にコントロール群（０．０５％カゼイン）
と血圧降下値を比較した。血圧測定は、非観血式血圧測
定装置（商品名「ＰＥ−３００」、ナルコバイオシステ
ムズ社製）を用い、tail cuff法で最高血圧値を求め
た。溶出開始２０〜３０分後の画分に最大の血圧降下活
性が確認されたので、その画分２５ｍｌを前記方法によ
りＨＰＬＣで再分画し、図１の溶出結果を得、Ａ、Ｂ、
Ｃ及びＤの４つの画分を分取した。それぞれの溶出画分
全量を凍結乾燥して生理食塩水２５ｍｌに溶解し、前記
方法により高血圧自然発症ラットに強制投与して、６時
間後の血圧降下値を測定した。その結果、Ｄ画分に最大
の血圧降下値を得たので、Ｄ画分１０ｍｌを前記方法に
よりＨＰＬＣで更に溶出し、主要ピーク１０本を分取し
た。それぞれの分取したピークを凍結乾燥後、水５ｍｌ
に溶解して濃度勾配を下記の通りに変更した他は前記方
法と同じ条件で、全量をＨＰＬＣを用いて精製した。
ンプ（日立製作所製） Ｌ６０００ポンプ（日立製作所製） 検出器：Ｌ４０００ＵＶ検出器（日立製作所製） ２１
５ｎｍの紫外部吸収 カラム：ウオーターズ マイクロボンダスフェアー５μ
Ｃ１８（日本ミリポア社製） 溶出液：Ａ液：０．１重量％ＴＦＡ水溶液 Ｂ液：０．１重量％ＴＦＡ入りアセトニトリル 濃度勾配：（Ｂ液／Ａ液＋Ｂ液）×１００（％）：０％
→４０％（６０分）（以下、濃度勾配（１）と略す） 流速：１ｍｌ／分 それぞれの溶出画分を凍結乾燥し、生理食塩水５０ｍｌ
にて溶解した。それらを高血圧自然発症ラット（ＳＨ
Ｒ：日本チャールズ・リバー社より購入、１群５匹、１
９〜２５週令、雄）に胃ゾンデで２ｍｌ／匹強制投与
し、６時間後にコントロール群（０．０５％カゼイン）
と血圧降下値を比較した。血圧測定は、非観血式血圧測
定装置（商品名「ＰＥ−３００」、ナルコバイオシステ
ムズ社製）を用い、tail cuff法で最高血圧値を求め
た。溶出開始２０〜３０分後の画分に最大の血圧降下活
性が確認されたので、その画分２５ｍｌを前記方法によ
りＨＰＬＣで再分画し、図１の溶出結果を得、Ａ、Ｂ、
Ｃ及びＤの４つの画分を分取した。それぞれの溶出画分
全量を凍結乾燥して生理食塩水２５ｍｌに溶解し、前記
方法により高血圧自然発症ラットに強制投与して、６時
間後の血圧降下値を測定した。その結果、Ｄ画分に最大
の血圧降下値を得たので、Ｄ画分１０ｍｌを前記方法に
よりＨＰＬＣで更に溶出し、主要ピーク１０本を分取し
た。それぞれの分取したピークを凍結乾燥後、水５ｍｌ
に溶解して濃度勾配を下記の通りに変更した他は前記方
法と同じ条件で、全量をＨＰＬＣを用いて精製した。
【００２６】（Ｂ液／Ａ液＋Ｂ液）×１００（％）：１
５％→３０％（４０分）（以下、濃度勾配（２）と略
す） 最終的に精製した画分をそれぞれ凍結乾燥後、水３０μ
ｌに溶解し、島津製作所社製「全自動タンパク質一次構
造分析装置ＰＰＳＱ−１０システム」により、ペプチド
のＮ末端からアミノ酸配列を分析した結果、１０種のペ
プチドが同定された。得られた各ペプチドのアミノ酸配
列を表１に示す。
５％→３０％（４０分）（以下、濃度勾配（２）と略
す） 最終的に精製した画分をそれぞれ凍結乾燥後、水３０μ
ｌに溶解し、島津製作所社製「全自動タンパク質一次構
造分析装置ＰＰＳＱ−１０システム」により、ペプチド
のＮ末端からアミノ酸配列を分析した結果、１０種のペ
プチドが同定された。得られた各ペプチドのアミノ酸配
列を表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
【実施例２】実施例１で得られた１０種のペプチドと同
じアミノ酸配列のぺプチドを、島津製作所社製ペプチド
自動合成装置「ＰＰＳＭ−８型」を用いて固相法により
合成し、それぞれの降圧作用を下記の方法に従って測定
した。動物及び血圧測定方法は実施例１に準じ、各々の
ペプチド１ｍｇ／体重ｋｇを胃ゾンデで強制投与し、コ
ントロール群と比較した。その結果、１種類のペプチド
（Lys Val Leu Pro Val Pro Gln)が有意に血圧低下作用
を示すことが確認された。血圧降下値は、−24.1±7.8*
で、コントロール群に対して有意差があった（*；P<0.0
5）。結果を（投与前最高血圧値−投与後最高血圧値）
±ＳＥで表２に示す。更に他の２種類のペプチド（Thr
Lys Val Ile Pro、Tyr Lys Val Pro Gln Leu）も血圧低
下の傾向が認められた。
じアミノ酸配列のぺプチドを、島津製作所社製ペプチド
自動合成装置「ＰＰＳＭ−８型」を用いて固相法により
合成し、それぞれの降圧作用を下記の方法に従って測定
した。動物及び血圧測定方法は実施例１に準じ、各々の
ペプチド１ｍｇ／体重ｋｇを胃ゾンデで強制投与し、コ
ントロール群と比較した。その結果、１種類のペプチド
（Lys Val Leu Pro Val Pro Gln)が有意に血圧低下作用
を示すことが確認された。血圧降下値は、−24.1±7.8*
で、コントロール群に対して有意差があった（*；P<0.0
5）。結果を（投与前最高血圧値−投与後最高血圧値）
±ＳＥで表２に示す。更に他の２種類のペプチド（Thr
Lys Val Ile Pro、Tyr Lys Val Pro Gln Leu）も血圧低
下の傾向が認められた。
【００２９】
【表２】
【００３０】
【実施例３】実施例２で有意に血圧降下活性の見られた
ペプチド Lys Val Leu Pro Val ProGln について、投与
量と血圧降下度に関するドーズレスポンスを調べた。動
物及び血圧測定方法は、実施例１に準じて行なった。即
ち、血圧測定はペプチド０．２、０．５、１．０、２．
０ｍｇ／体重ｋｇを各群ラットに経口投与し、投与６時
間後の最高血圧値を測定してコントロール群と比較する
ことにより行なった。その結果を図２に示す。図２よ
り、０．５〜２．０ｍｇ／体重ｋｇの範囲で、用量依存
的な効果が認められた。
ペプチド Lys Val Leu Pro Val ProGln について、投与
量と血圧降下度に関するドーズレスポンスを調べた。動
物及び血圧測定方法は、実施例１に準じて行なった。即
ち、血圧測定はペプチド０．２、０．５、１．０、２．
０ｍｇ／体重ｋｇを各群ラットに経口投与し、投与６時
間後の最高血圧値を測定してコントロール群と比較する
ことにより行なった。その結果を図２に示す。図２よ
り、０．５〜２．０ｍｇ／体重ｋｇの範囲で、用量依存
的な効果が認められた。
【００３１】
【実施例４】乳酸菌としてラクトバチルス・ヘルベティ
カスJCM-1003を用い、菌体を９重量％脱脂乳培地１５ｇ
に接種後、２０時間培養した。その培養液全量を更に９
重量％脱脂乳培地５００ｇに接種し、３７℃で乳酸量が
０．８％となるまで培養してヨーグルトとした。次いで
ホモジナイザー（商品名「Ｄ ７８０１型」、Mitamura
Riken Kogyo 社製）で液状化後、１００００回転／分で
１０分間遠心した。得られた上清１００ｇを、限外濾過
（商品名「アドバンテック東洋ＵＨＰ−１５０」、限外
濾過膜：分子量分画１００００、富士フィルター工業株
式会社製）にかけ、７０ｍｌの限外濾過液を得た。得ら
れた限外濾過液３ｍｌを凍結乾燥後水１ｍｌに溶解し、
実施例１の溶出条件で、全量をＨＰＬＣを用いて前記濃
度勾配（１）に従って分析した。実施例１で、前記濃度
勾配（１）に従ってペプチドを得た溶出時間と同じ溶出
時間に溶出したピークを分取した。得られた画分全量を
凍結乾燥後に水１ｍｌに溶解し、実施例１の溶出条件
で、全量をＨＰＬＣを用いて前記濃度勾配（２）に従っ
て分析した。実施例１で、前記濃度勾配（２）に従って
ペプチドを得た溶出時間と同じ溶出時間に溶出したピー
クを分取した。得られた画分全量を凍結乾燥後水３０μ
ｌに溶解し、全量を島津製作所社製「全自動タンパク質
一次構造分析装置ＰＰＳＱ−１０システム」により、ペ
プチドのＮ末端から分析した結果、Lys Val Leu Pro Va
l Pro Glnであることが確認された。発酵乳５００ｇ中
には、Lys Val Leu Pro Val Pro Glnが約５８μｇ／ｍ
ｌ含有されていた。
カスJCM-1003を用い、菌体を９重量％脱脂乳培地１５ｇ
に接種後、２０時間培養した。その培養液全量を更に９
重量％脱脂乳培地５００ｇに接種し、３７℃で乳酸量が
０．８％となるまで培養してヨーグルトとした。次いで
ホモジナイザー（商品名「Ｄ ７８０１型」、Mitamura
Riken Kogyo 社製）で液状化後、１００００回転／分で
１０分間遠心した。得られた上清１００ｇを、限外濾過
（商品名「アドバンテック東洋ＵＨＰ−１５０」、限外
濾過膜：分子量分画１００００、富士フィルター工業株
式会社製）にかけ、７０ｍｌの限外濾過液を得た。得ら
れた限外濾過液３ｍｌを凍結乾燥後水１ｍｌに溶解し、
実施例１の溶出条件で、全量をＨＰＬＣを用いて前記濃
度勾配（１）に従って分析した。実施例１で、前記濃度
勾配（１）に従ってペプチドを得た溶出時間と同じ溶出
時間に溶出したピークを分取した。得られた画分全量を
凍結乾燥後に水１ｍｌに溶解し、実施例１の溶出条件
で、全量をＨＰＬＣを用いて前記濃度勾配（２）に従っ
て分析した。実施例１で、前記濃度勾配（２）に従って
ペプチドを得た溶出時間と同じ溶出時間に溶出したピー
クを分取した。得られた画分全量を凍結乾燥後水３０μ
ｌに溶解し、全量を島津製作所社製「全自動タンパク質
一次構造分析装置ＰＰＳＱ−１０システム」により、ペ
プチドのＮ末端から分析した結果、Lys Val Leu Pro Va
l Pro Glnであることが確認された。発酵乳５００ｇ中
には、Lys Val Leu Pro Val Pro Glnが約５８μｇ／ｍ
ｌ含有されていた。
【００３２】
【実施例５】実施例４と同様の方法で、ラクトバチルス
・ヘルベティカスJCM-1003を用いてヨーグルトを得、そ
れをホモジナイザー（商品名「Ｄ ７８０１型」、Mitam
uraRiken Kogyo 社製）で液状化後、７ｇ／体重ｋｇを
ＳＨＲラットに胃ゾンデを用いて強制投与し、６時間後
の最高血圧値を測定し、未発酵乳（９重量％脱脂乳）投
与群と比較した。動物の条件及び血圧測定方法は、実施
例１に準じた。結果を（投与前最高血圧値−投与後最高
血圧値）±ＳＥで表３に示す。表３の結果より、未発酵
乳投与群と比較し有意に血圧が降下したことが判る（−
25.4±5.6**、**；P<0.01）。
・ヘルベティカスJCM-1003を用いてヨーグルトを得、そ
れをホモジナイザー（商品名「Ｄ ７８０１型」、Mitam
uraRiken Kogyo 社製）で液状化後、７ｇ／体重ｋｇを
ＳＨＲラットに胃ゾンデを用いて強制投与し、６時間後
の最高血圧値を測定し、未発酵乳（９重量％脱脂乳）投
与群と比較した。動物の条件及び血圧測定方法は、実施
例１に準じた。結果を（投与前最高血圧値−投与後最高
血圧値）±ＳＥで表３に示す。表３の結果より、未発酵
乳投与群と比較し有意に血圧が降下したことが判る（−
25.4±5.6**、**；P<0.01）。
【００３３】
【表３】
【００３４】
配列番号：１ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Val Leu Pro Val Pro Gln 1 5
【図１】図１は、実施例１で血圧降下の見られた画分を
Ａ〜Ｄの４つに分取した時のグラフである。
Ａ〜Ｄの４つに分取した時のグラフである。
【図２】図２は、実施例３で行った Lys Val Leu Pro V
al Pro Glnの投与量と血圧降下度の関係を示すグラフで
ある。
al Pro Glnの投与量と血圧降下度の関係を示すグラフで
ある。
１ ペプチド Lys Val Leu Pro Val Pro Gln 含有ピー
ク ２ ペプチド Leu Gln Ser Trp 含有ピーク ３ ペプチド Arg Glu Leu Glu Glu Leu 含有ピーク ４ ペプチド Thr Lys Val Ile Pro 含有ピーク ５ ペプチド Ala Met Lys Pro Trp 含有ピーク ６ ペプチド Tyr Lys Val Pro Gln Leu, Met Lys Pro
Trp Ile Gln Pro Lys,Leu Leu Tyr Gln Gln Pro Val 含
有ピーク ７ ペプチド Ala Tyr Phe Tyr Pro, Ala Met Lys Pro
Trp Ile Gln Pro Lys含有ピーク
ク ２ ペプチド Leu Gln Ser Trp 含有ピーク ３ ペプチド Arg Glu Leu Glu Glu Leu 含有ピーク ４ ペプチド Thr Lys Val Ile Pro 含有ピーク ５ ペプチド Ala Met Lys Pro Trp 含有ピーク ６ ペプチド Tyr Lys Val Pro Gln Leu, Met Lys Pro
Trp Ile Gln Pro Lys,Leu Leu Tyr Gln Gln Pro Val 含
有ピーク ７ ペプチド Ala Tyr Phe Tyr Pro, Ala Met Lys Pro
Trp Ile Gln Pro Lys含有ピーク
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＵ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:225）
Claims (3)
- 【請求項１】 下記アミノ酸配列で示されるペプチド及
びその塩を有効成分として含有する血圧降下剤。 Lys Val Leu Pro Val Pro Gln - 【請求項２】 獣乳成分を原料として、発酵法により得
ることを特徴とする請求項１記載の血圧降下剤の製造
法。 - 【請求項３】 獣乳成分を原料として、プロティナーゼ
処理により得ることを特徴とする請求項１記載の血圧降
下剤の製造法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08424795A JP3782837B2 (ja) | 1995-04-10 | 1995-04-10 | 血圧降下剤及びその製造法 |
| EP96302522A EP0737690A3 (en) | 1995-04-10 | 1996-04-10 | Antihypertensive agent from casein and method for preparing same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08424795A JP3782837B2 (ja) | 1995-04-10 | 1995-04-10 | 血圧降下剤及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08283173A true JPH08283173A (ja) | 1996-10-29 |
| JP3782837B2 JP3782837B2 (ja) | 2006-06-07 |
Family
ID=13825139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08424795A Expired - Fee Related JP3782837B2 (ja) | 1995-04-10 | 1995-04-10 | 血圧降下剤及びその製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0737690A3 (ja) |
| JP (1) | JP3782837B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002000228A (ja) * | 2000-06-21 | 2002-01-08 | Toyo Shinyaku:Kk | 麦若葉由来の素材を含む抗高血圧食品 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5854029A (en) * | 1996-08-02 | 1998-12-29 | Calpis Co., Ltd. | Method for preparing antihypertensive agent |
| FI113741B (fi) | 1999-11-01 | 2004-06-15 | Valio Oy | Menetelmä verenpainetta alentavia peptidejä sisältävän tuotteen valmistamiseksi |
| EP1365656A1 (en) * | 2001-03-09 | 2003-12-03 | Unilever N.V. | Fermented milk product |
| EP1529114A1 (en) * | 2002-08-09 | 2005-05-11 | Chr. Hansen A/S | Process for preparing peptides with anti-hypertensive properties |
| AU2003296605B2 (en) | 2003-01-06 | 2007-06-28 | Unilever Plc | Fermented milk product comprising tripeptide VPP and/or IPP |
| US7718171B2 (en) | 2003-04-07 | 2010-05-18 | Chr. Hansen A/S | Reducing heart rate in mammals using milk derived fermentation products produced using Lactobacillus helveticus |
| EP1568707A1 (en) * | 2004-02-26 | 2005-08-31 | Puleva Biotech, S.A. | Antihypertensive peptides from casein hydrolysates |
| WO2009046845A2 (en) * | 2007-09-11 | 2009-04-16 | Mondobiotech Laboratories Ag | Use of a lactoferrin partial peptide peptide as a therapeutic agent |
| CN102948476A (zh) * | 2012-11-19 | 2013-03-06 | 陕西科技大学 | 一种基于瑞士乳杆菌发酵的含ace抑制肽的羊乳饮料的制备方法 |
| CN117084934B (zh) * | 2023-10-20 | 2024-01-19 | 深圳市维琪科技股份有限公司 | 多肽的新用途 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2650955B1 (fr) * | 1989-08-16 | 1992-01-10 | Agronomique Inst Nat Rech | Procede d'obtention, a partir de la caseine beta, de fractions enrichies en peptides a activite biologique et les fractions peptidiques obtenues |
-
1995
- 1995-04-10 JP JP08424795A patent/JP3782837B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-04-10 EP EP96302522A patent/EP0737690A3/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002000228A (ja) * | 2000-06-21 | 2002-01-08 | Toyo Shinyaku:Kk | 麦若葉由来の素材を含む抗高血圧食品 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3782837B2 (ja) | 2006-06-07 |
| EP0737690A3 (en) | 1999-05-12 |
| EP0737690A2 (en) | 1996-10-16 |
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