JPH08256756A - 培地除去器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 小容量の培養容器（プレートウェル）中で細
胞塊や組織塊を培養する際の、培地交換における旧培地
の除去を、簡単に細胞塊や組織塊にダメージを与えるこ
となく行うことが出来、且つ、同時に培地中の蛋白成分
のＥＬＩＳＡ法による定量分析に供し得る試料の調製を
行うことを可能にする。 【構成】 吸水性の材料よりなり、断面形状が円形もし
くは多角形をなす中空筒状、もしくは先端部に凹みを有
する柱状に形成した培地除去部材（８）の後端部側を、
蛋白質を固相化するための担体となる基盤（１１）の凹
部に挿入、固定した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、組織培養、細胞培養等
の分野で使用されるもので、組織塊および細胞塊を形成
される三次元培養における培地交換の際に、旧培地の除
去と同時にそのまま、その培地中に含まれる細胞の産成
物の免疫学的手法による分析に供することのできる、培
地除去器に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】最近、細胞培養の分野においては、細胞
の機能維持を目的として細胞塊を形成させ、長期に亘っ
て培養を行うことが盛んに行われるようになった。培養
中、細胞の代謝による産生物や老廃物等は培地中に排出
されるので、長期培養においては、定期的に培地交換を
行う必要がある。また、培地交換の際、旧培地中の細胞
由来の代謝物や合成物の定性や定量を行うことが多い。

【０００３】培地交換を行うにはまず古い培地を除去
し、その後に新しい培地を加える。古い培地の除去に
は、従来、吸引器やピペットなどにより、培養器から培
地を吸引する方法が行われている。培地中の細胞由来の
代謝物や、合成物の分析の際も同様である。三次元培養
の場合、細胞と培養面の接着は強固なものではなく、培
養中の組織塊や細胞塊を吸い込んでしまう問題がある。
特に、９６穴プレートの場合はウェルの径が小さく容量
が小さいため、培地の弱い吸引でも細胞塊を吸い込んで
しまう。

【０００４】９６穴プレートのウェル中の液体を１度に
回収するものとして、培地交換を目的としたものではな
いが、標的細胞障害実験用に細胞から遊離された放射能
を含む上清を、吸引性フィルター中に回収採取するシス
テムであるが。これは、平板の９６穴プレートの各ウェ
ルに対応する位置に、９６個のフィルター（線維を不織
布状に圧縮加工した多孔質体）を並べて固定したもの
で、９６個のウェル中の上清を１度に採取することがで
きる。このシステムによる上清の採取の目的は、上清中
の放射能を測定することであり、培地を吸収したフィル
ターそのものの中の放射能の測定を行うことであり、精
度を上げるため、放射能を与える細胞がフィルター中に
吸い込まれないように、フィルターの先端に細胞より小
さい穴を有する取り外し可能な膜が装着されている。

【０００５】しかし、このシステムを細胞塊の培養の際
の、培地交換時の旧培地の除去に使用した場合、旧培地
を完全に回収しようとすれば、フィルターの先端をプレ
ートのウェルの底部まで持っていく必要があり、その時
の培養中の細胞塊や組織塊を圧迫してしまう恐れがあ
る。又、フィルター先端に装着された膜に、細胞や組織
が付着することになる。このような事態にならないよう
に、フィルターをウェル内に浅く入れたのでは、旧培地
を十分に除去することができない。

【０００６】培地交換における従来のこのような問題点
を解決するため、本発明者は先に、吸水性フィルターの
先端部に凹みを設けるか、中空筒状に形成することによ
り、培養中の細胞塊や組織塊を吸引してしまったり、ダ
メージを与えることなく、しかもプレートのウェル内の
培地をほぼ完全に除去することのできる培地除去部材、
およびそれを適用した培地除去器の発明をなし、特願平
５−２６８８９７号、および特願平６−４０２３号に開
示した。

【０００７】一方、培地中の含有成分を分析する場合、
上記のように吸水体中に培地を吸収回収したものを、免
疫学的手法、例えばＥＬＩＳＡ法により目的物を定量し
ようとするとすれば、一度吸収回収した培地を再溶出さ
せ、その溶出液をＥＬＩＳＡ分析用の９６ウェルプレー
トに分注し、９６ウェルプレートのウェル中に目的の蛋
白などを吸着させて、ＥＬＩＳＡ法により定量分析する
こととなり、手間がかかるほか定量において正確さに疑
問が残る。吸水体を使用せず、ピペットなどで培地を吸
引し、上記ＥＬＩＳＡ分析用プレートに移す場合は、す
でに記載したとおり細胞塊を吸引してしまうことにな
り、細胞塊を形成させ、継続的に培地交換と培養時の培
地中の蛋白質などの定量を行うことは、非常に困難な作
業を伴う。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、培地交換時
に培地中の含有成分を分析するための、試料の調製にお
けるこのような問題を解決することを目的としたもの
で、主に９６穴プレートのような小容量のウェルをもっ
たプレート中で培養を行う際に、ウェル内の旧培地を、
培養中の細胞塊や組織塊にダメージを与えたり、誤って
吸引してしまうことなく除去でき、また、多数個のウェ
ルをもったマルチプレートの全部、一部のウェル、ある
いはウェルの列単位でも適用でき、かつ、回収した培地
中に含有される蛋白成分の、ＥＬＩＳＡ法による分析に
供するための試料調製を簡便に行える培地除去器を提供
しようとするものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】このような目的を達成す
るために鋭意研究の結果、本発明者らは、吸水性フィル
ターの先端に凹みを設けるか、中空筒状に形成した培地
除去部材を、蛋白質類を吸着固相化するための担体に、
適切に接触させることにより、ＥＬＩＳＡ法による分析
に供し得る試料の調製が可能であることを見出し、本発
明を完成するに至ったものである。

【００１０】即ち本発明は、吸水性の材料よりなり、断
面形状が円形もしくは多角形をなす中空筒状、もしくは
先端部に凹みを有する柱状に形成した培地除去部材と、
蛋白質を固相化するための担体とからなり、培地除去部
材の後端部側に蛋白質固相化用担体を密接させて組み立
てたことを特徴とする培地除去器であり、さらには、蛋
白質固相化用担体がプラスチックの成形品よりなり、１
列もしくは複数列規則正しく配列して設けた凹部を有
し、その凹部にそれぞれ培地除去部材の後端部を嵌合固
定したものであることを特徴とする。

【００１１】以下、図面により本発明を詳細に説明す
る。図１は本発明の一実施例となる培地除去器の培地除
去部材を示す全体図で、図２は培地除去部材先端の形状
の例を示す拡大図、図３は培地除去部材先端の形状を示
す断面図である。

【００１２】本発明における培地除去部材は、図１に示
すように、筒状（１）もしくは柱状（３）をなし、その
断面形状は通常は円形であるが、使用時の対象となる培
養容器であるプレートのウェルの形状に応じて、三角
形、四角形、六角形等の多角形にしてもなんら差し支え
ない。また、柱状部材（３）では、先端部に凹み（４）
を設けるが、使用時の利便や蛋白質固相化用担体と密接
して組み合わせるため、図１（ｃ）のように後端部にも
凹み（５）を設けても良い。

【００１３】本発明の培地除去部材を構成する材質は、
耐水性があり、かつ、構造的に吸水性を有するものであ
れば特に指定はない。このようなのもとしは、アセテー
トなどの繊維の束や、プラスチックの気泡体、焼結体等
を中空筒状または棒状に成形したものが挙げられる。本
発明における部材（１、３）によって回収されるのは、
液状の培地のみであるから、部材材質の有する微細孔の
サイズは特に限定されるものではなく、液状の培地を速
やかに、かつ確実に吸収できるものであれば良いが、部
材の必要とする長さおよび吸水容量から、微細孔の密度
を選定することが必要である。

【００１４】中空部（２）を有する筒状部材（１）の場
合、培養容器のウェルへの挿入時の操作性を加味して、
外径は対象となるウェルの内径にほぼ等しいか若干小さ
くとるのがよい。また、中空部（２）の断面形状は特に
規定はないが、三次元培養で形成される細胞塊が球状に
近いことから、円形であることが望ましく、また、中空
部（２）の内径は対象となるウェルの内径の１／３〜２
／３程度が望ましい。これより大きいと吸水量が小さく
なり、筒状部材（１）の長さを大きくとる必要がある
他、部材の強度が弱くなり、使用時における取り扱いが
難しくなる。一方これより小さいと筒状の先端が組織塊
や細胞塊に接触する恐れがあり、あまり好ましくない。

【００１５】先端部に凹み（４）を有する柱状部材
（３）の場合は、その外径は筒状部材（１）の場合と同
様に、対象となるプレートの内径と等しいかやや小さい
のが望ましい。凹み（４）の底部（６）と突端部（７）
の距離、即ち深さは１．５ｍｍ程度あり、突端部（７）
における内径がウェルの内径の１／３〜２／３程度確保
できれば良い。形状の規定は特にないが、対象となる細
胞塊の形状が球状に近いことから、中心軸で切った縦断
面形状が、図３（ｂ），（ｃ）に示すような台形もしく
は半円形であることが望ましい。

【００１６】培地除去部材が吸収できる培地容量は、筒
状部材（１）、柱状部材（２）のいずれの場合でも培養
に使用する培地の量にほぼ等しくする。一般に、ウェル
中での培養の際の培地の量はウェル容量の１／４〜１／
２の間で３水準程度であり、それぞれの容量の部材を用
意するのが好ましい。

【００１７】本発明において使用する蛋白質固相化用の
担体としては、図４に示すような培地除去部材（８）を
挿入、固定するための凹部を設けた平板状の基盤（１
１）や、図６に示すような培地除去部材の中空部（２）
や凹み（５）に挿入固定可能な球形や筒状、柱状等のブ
ロック状担体（１４）が使用できる。

【００１８】平板状の基盤（１１）の場合は、図４に示
したように、基盤（１１）面に凹み（１２）又は環状の
リブ（１３）を設け、その中に培地除去部材（８）の後
端部を挿入し、嵌合固定する。固定するために接着剤は
使用しない。この場合は、凹み（１２）、リブ（１３）
の内側面が、培地中の含有成分である蛋白質を固相化す
る担体面となる。

【００１９】基盤（１１）の具体的な形状としては、図
５に示したように、基盤（１１）面に１列（ａ）、もし
くは複数列（ｂ，ｃ）規則正しく配列して設けた凹部、
即ち凹み（１２）又は環状のリブ（１３）にそれぞれ培
地除去部材（８）の後端部を嵌合し固定する。尚、１枚
の基盤（１１）に設ける培地除去部材（８）の列数や、
１列の個数は、使用現場のニーズに応じて決めればよ
く、特に制限されるものではないが、一般に９６穴など
のプレートは、世界的にウェルの配列が統一されている
ことから、その配列にあわせた方が良い。また、基盤
（１１）の形状は必ずしも平板状である必要はなく、一
般にＥＬＩＳＡ法に用いられているプレートや、ストリ
ップウェルをそのまま用いても良い。

【００２０】また、ＥＬＩＳＡ法でプレートを用いる方
法の他、蛋白質の固相化用担体としてブロック状担体
（１４）が用いられるが、図６に示したように、筒状部
材（１）の後端側中空部（２）や、柱状部材（３）の後
端側の凹み（５）の中に、ブロック状担体（１４）を挿
入し固定して用いても良い。その形状としては、図６
（ａ），（ｂ）のようなボール状、（ｃ），（ｄ）のよ
うな筒状体や、（ｅ），（ｆ）のように鍔部（１５）を
有し、部材後端側の中空部（２）又は凹み（５）にはま
り込むような形状のブロックでもよい。これらの外側表
面が、蛋白質を固相化する担体面となる。

【００２１】このようにしてブロック状担体（１４）を
挿入、固定した培地除去部材（８）は、前記と同様に図
５（ａ）〜（ｃ）に示すように、１列もしくは複数列規
則正しく配列して設けられた凹部を有するプレート等
の、凹部にその後端部を挿入、固定して用いられる。ま
た、図５（ｄ）に示すように、複数個の穴を設けたスト
リップ（１６）を使用することも可能である。

【００２２】基盤（１１）およびブロック状担体（１
４）の材質としては、耐水性が有りかつ非吸水性である
ことが必要である。この他、基盤（１１）の場合はプレ
ートリーダーにより直接吸光度を測る必要性から、透明
性を有することが要求される。これらの性質を有してい
れば特に指定はないが、量産性を考えた場合プラスチッ
クの成形品が好ましく、成形性や透明性、蛋白類が吸着
し易いことなどを加味すると、ポリスチレンやポリ塩化
ビニル、ポリメチルペンテンなどから選ぶのが良い。

【００２３】また、蛋白類の吸着特性を高めるため、基
盤（１１）の凹部内面やブロック状担体（１４）の外側
表面に、アミノ基やカルボキシル基、その他荷電性を有
する官能基を導入しても良い。また、測定対象となる蛋
白質の特異性を高めるため、その蛋白質に対する抗体を
固相化しておいても良い。

【００２４】次に、本発明による培地除去器の使用方法
について述べる。例えば、９６穴プレートを用いて三次
元培養をする場合、培地交換をするには、図５に示すよ
うな本発明の培地除去器を用いて、その培地除去部材
（８）を先端からプレートの各ウェルの底面に接するま
で挿入する。この時、筒状部材（１）の中空部（２）は
勿論のこと、柱状部材（３）の凹み（４）もウェルの底
面中央に接することはなく、形成された細胞塊を壊した
り、細胞塊が培地除去部材に吸着されることがない。旧
培地は、培地の表面張力により、培地除去部材（８）の
微細孔に吸収される形で、培地除去部材のウェルと接し
た部分へと移行し完全に吸い取られて、旧培地の除去お
よび回収が完了する。

【００２５】ここで、そのまま一定時間培地除去器を静
置し、基盤（１１）やブロック状担体（１４）等の蛋白
質固相化用担体の表面に、吸い取った培地中の蛋白質を
吸着または結合させる。この時培地中の水分が蒸発する
と、培地の温度が変化し培地中の測定すべき蛋白質の濃
度が変化してしまうので、水分の蒸発を防ぐため培地除
去器を密封できる容器や袋に入れて静置する。一定時間
静置し蛋白質の固相化が終了したら、培地除去部材
（８）を基盤（１１）の凹部から取りはずし、あるいは
培地除去部材（８）の中空部（２）や後端側の凹み
（５）に挿入したブロック状担体（１４）を取り出し
て、ＥＬＩＳＡ法の定法に基づいて定量測定を行う。

【００２６】尚、定量精度を上げるためには、培地除去
部材（８）が吸収した培地と、蛋白質固相化用担体との
接触面積を一定化することが必要であるが、１つの方法
として、培地除去部材（８）の後端部から一定の長さを
残して、表面の少なくとも一部に非吸水性処理を施すの
も好ましい態様である。即ち、培地除去部材（８）を基
盤（１１）に固定する際は、凹部の底面まで挿入するこ
ととし、凹部の内面に接する部位の内、後端側から凹部
の深さよりも短い範囲で一定の長さを残して非吸水性処
理を施せば、その部位では吸収された培地が表面に染み
出さないので、蛋白質が固相化される面積を一定にする
ことが出来る。

【００２７】

【発明の効果】本発明による培地除去器を使用すること
により、９６穴プレートのような小容量のウェルの中で
三次元培養する際の、培地交換における旧培地の除去
が、細胞塊を吸ってしまうことなく、また細胞塊を壊し
てしまうことなく完全にでき、且つ、そのままの状態で
引き続いて、細胞から培地中に分泌された蛋白成分のＥ
ＬＩＳＡ法による分析に供するための試料調製に移行す
ることができ、培養中の培地中の蛋白類の測定を継続的
に行う三次元培養用の培地除去手段として好適である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例となる培地除去器の培地除去
部材を示す全体図である。

【図２】本発明における培地除去部材の先端形状の例を
示す拡大図である。

【図３】本発明における培地除去部材の先端形状の例を
示す断面図である。

【図４】本発明における培地除去部材を平板状の基盤に
固定した例を示す断面図である。

【図５】本発明における培地除去部材を基盤に嵌合、固
定した使用例（培地除去器）を示す図である。

【図６】本発明の培地除去部材中に蛋白固相化担体を固
定保持した例を示した断面図である。

【符号の説明】 １ 筒状部材 ２ 中空部 ３ 柱状部材 ４、５、１２ 凹み ６ 底部 ７ 突端部 ８ 培地除去部材 １１ 基盤 １３ リブ １４ ブロック状担体 １５ 鍔部 １６ ストリップ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 吸水性の材料よりなり、断面形状が円形
   もしくは多角形をなす中空筒状に形成した培地除去部材
   と、蛋白質を固相化するための担体とからなり、培地除
   去部材の後端部側に蛋白質固相化用担体を密接させて組
   み立てたことを特徴とする培地除去器。
2. 【請求項２】 吸水性の材料よりなり、断面形状が円形
   もしくは多角形をなし、先端部に凹みを有する柱状に形
   成した培地除去部材と、蛋白質を固相化するための担体
   とからなり、培地除去部材の後端部側に蛋白質固相化用
   担体を密接させて組み立てたことを特徴とする培地除去
   器。
3. 【請求項３】 培地除去部材が、その後端部から一定の
   長さを残して、外側表面の少なくとも一部に非吸水性処
   理を施されていることを特徴とする、請求項（１）もし
   くは請求項（２）記載の培地除去器。
4. 【請求項４】 蛋白質固相化用担体がプラスチックの成
   形品よりなり、１列もしくは複数列規則正しく配列して
   設けた凹部を有し、該凹部にそれぞれ培地除去部材の後
   端部を嵌合固定したことを特徴とする、請求項（１）乃
   至請求項（３）のいずれかに記載の培地除去器。
5. 【請求項５】 蛋白質固相化用担体が、球形、筒状、柱
   状等の形状を有するブロック状のプラスチック成形品よ
   りなり、培地除去部材の後端部側の中空部もしくは凹み
   に挿入、固定されていることを特徴とする、請求項
   （１）乃至請求項（３）のいずれかに記載の培地除去
   器。
6. 【請求項６】 後端部にブロック状担体を挿入、固定し
   た請求項（５）記載の培地除去部材を、１列もしくは複
   数列規則正しく配列して凹部を設けた基盤の、該凹部に
   それぞれ嵌合固定したことを特徴とする、請求項（１）
   乃至請求項（３）のいずれかに記載の培地除去器。
7. 【請求項７】 蛋白質固相化用担体の少なくとも測定対
   象となる表面に抗体を結合させることを特徴とする、請
   求項（４）乃至請求項（６）のいずかれに記載の培地除
   去器。