JPH0824568B2 - 複数バクテリオシン産生ラクトコッカス及び組成物 - Google Patents
複数バクテリオシン産生ラクトコッカス及び組成物Info
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- JPH0824568B2 JPH0824568B2 JP5129967A JP12996793A JPH0824568B2 JP H0824568 B2 JPH0824568 B2 JP H0824568B2 JP 5129967 A JP5129967 A JP 5129967A JP 12996793 A JP12996793 A JP 12996793A JP H0824568 B2 JPH0824568 B2 JP H0824568B2
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- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、２つ以上のバクテリオ
シンを産生するラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ）、及び前記バクテリオシンを含む組成物に関する。
特に、本発明は受容株ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ）由来のバクテリオシンと共にバクテリオシン
を供給する供与体ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ）から移植されたＤＮＡを含有するラクトコッカス
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）に関する。
シンを産生するラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ）、及び前記バクテリオシンを含む組成物に関する。
特に、本発明は受容株ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ）由来のバクテリオシンと共にバクテリオシン
を供給する供与体ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ）から移植されたＤＮＡを含有するラクトコッカス
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）に関する。
【０００２】
【従来の技術】ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ）属にはランスフィールドの血清学的群Ｎに属する乳
製品の乳酸産生連鎖球菌が含まれる。この種には、ラク
トコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌ
ａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、ラクト
コッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａ
ｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、及び
クエン酸発酵性ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａ
ｃｔｉｓ）生物型ジアセチルラクティス（ｄｉａｃｅｔ
ｙｌａｃｔｉｓ）（Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，Ｋ．Ｈ．，Ｆ
ＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４６（３）：２
０１〜２０３（１９８７））が含まれる。前述の種は乳
製品の発酵に従来から使用されており、米国合衆国農務
省によって“一般的に安全であるとみなされている（Ｇ
ＲＡＳ）”ものである。
ｓ）属にはランスフィールドの血清学的群Ｎに属する乳
製品の乳酸産生連鎖球菌が含まれる。この種には、ラク
トコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌ
ａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、ラクト
コッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａ
ｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、及び
クエン酸発酵性ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａ
ｃｔｉｓ）生物型ジアセチルラクティス（ｄｉａｃｅｔ
ｙｌａｃｔｉｓ）（Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，Ｋ．Ｈ．，Ｆ
ＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４６（３）：２
０１〜２０３（１９８７））が含まれる。前述の種は乳
製品の発酵に従来から使用されており、米国合衆国農務
省によって“一般的に安全であるとみなされている（Ｇ
ＲＡＳ）”ものである。
【０００３】群エヌ・ラクトコッカス（Ｎ Ｌａｃｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ）種のある株は、バクテリオシンと呼ばれ
る非常に近縁の細菌に対する蛋白質性の拮抗物質を産生
する（Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ，Ｔ．Ｒ．，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｅ ６０（３）：３３７−３４９（１９８
８））。これらのバクテリオシンのほとんどは、その種
のうちの他の株又は非常に近縁の種のある株に対して狭
い拮抗活性スペクトルを持つ。しかし、ラクトコッカス
・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
ｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）のある株によって
産生されるバクテリオシンであるニシンは、胞子形成性
クロストリディア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）種及びバシ
ラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種を含めた他のグラム陽性菌
に対して広い活性スペクトルを持つ（Ｄｅｌｖｅｓ−Ｂ
ｒｏｕｇｈｔｏｎ．，Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌ．４４
（１１）：１００−１１２，１１７（１９９０））。
ｃｏｃｃｕｓ）種のある株は、バクテリオシンと呼ばれ
る非常に近縁の細菌に対する蛋白質性の拮抗物質を産生
する（Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ，Ｔ．Ｒ．，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｅ ６０（３）：３３７−３４９（１９８
８））。これらのバクテリオシンのほとんどは、その種
のうちの他の株又は非常に近縁の種のある株に対して狭
い拮抗活性スペクトルを持つ。しかし、ラクトコッカス
・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
ｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）のある株によって
産生されるバクテリオシンであるニシンは、胞子形成性
クロストリディア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）種及びバシ
ラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種を含めた他のグラム陽性菌
に対して広い活性スペクトルを持つ（Ｄｅｌｖｅｓ−Ｂ
ｒｏｕｇｈｔｏｎ．，Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌ．４４
（１１）：１００−１１２，１１７（１９９０））。
【０００４】種々の食品発酵に乳製品ラクトコッカス
（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ）が伝統的に使用されており
（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｓ．Ｅ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ｓｔａｒｔｅｒ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｆｏｏ
ｄｓ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａ
ｔｏｎ，ＦＬ ５〜２３ページ，（１９８５））、それ
らがＧＲＡＳであるとされており、非病原性であること
から、これらの細菌によって産生されたバクテリオシン
は、貯蔵期間を延ばすのに、又は潜在的な食品保有病原
体に対する十分な安全性を与えるために、食品系中で安
全に使用できる（生きている培養菌を加えることにより
食品系中でその場で産生させるか、又は食品系に無細胞
の精製もしくは半精製もしくは粗な調製品として加え
る）。このような株に近縁の株又は種とは異なるタイプ
のバクテリオシンについての遺伝情報を導入することに
よって株のバクテリオシン産生能が広がれば、前記バク
テリオシン産生株の有用性は特に増加するであろう。
（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ）が伝統的に使用されており
（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｓ．Ｅ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ｓｔａｒｔｅｒ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｆｏｏ
ｄｓ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａ
ｔｏｎ，ＦＬ ５〜２３ページ，（１９８５））、それ
らがＧＲＡＳであるとされており、非病原性であること
から、これらの細菌によって産生されたバクテリオシン
は、貯蔵期間を延ばすのに、又は潜在的な食品保有病原
体に対する十分な安全性を与えるために、食品系中で安
全に使用できる（生きている培養菌を加えることにより
食品系中でその場で産生させるか、又は食品系に無細胞
の精製もしくは半精製もしくは粗な調製品として加え
る）。このような株に近縁の株又は種とは異なるタイプ
のバクテリオシンについての遺伝情報を導入することに
よって株のバクテリオシン産生能が広がれば、前記バク
テリオシン産生株の有用性は特に増加するであろう。
【０００５】遺伝情報は、接合、形質転換（電気的形質
転換（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）
を含む）及び形質導入によって移入できる。一般的に問
題は、バクテリオシンが受容体ラクトコッカス（Ｌａｃ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ）に対して拮抗性であり、受容体が死
んでしまうか移入が起こらないことである。
転換（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）
を含む）及び形質導入によって移入できる。一般的に問
題は、バクテリオシンが受容体ラクトコッカス（Ｌａｃ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ）に対して拮抗性であり、受容体が死
んでしまうか移入が起こらないことである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、２つ以上のバクテリオシンをコードし、食品発酵に
有用なラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）株を
提供することである。更に、複数のバクテリオシンを含
む組成物及びその使用法を提供することも本発明の目的
である。更に、安全で経済的な組成物を提供することも
本発明の目的である。前記の及び他の目的は以下の記述
と図面とを参照することにより一層明らかになるであろ
う。
は、２つ以上のバクテリオシンをコードし、食品発酵に
有用なラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）株を
提供することである。更に、複数のバクテリオシンを含
む組成物及びその使用法を提供することも本発明の目的
である。更に、安全で経済的な組成物を提供することも
本発明の目的である。前記の及び他の目的は以下の記述
と図面とを参照することにより一層明らかになるであろ
う。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、ラクトコッカ
ス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔ ｉ
ｓ）より選択され、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８
８０９（ＬＬＡ ２．０）由来のバクテリオシンをコー
ドするＤＮＡを含む群エヌ・ラクトコッカス（Ｎ Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種であって、ラクトコッカス・ラ
クティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）ＮＲ
ＲＬ−Ｂ−１８８０９由来のバクテリオシンと共にラク
トコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種の親株由来の
他のバクテリオシンをコードするラクトコッカス（Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種に関する。
ス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔ ｉ
ｓ）より選択され、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８
８０９（ＬＬＡ ２．０）由来のバクテリオシンをコー
ドするＤＮＡを含む群エヌ・ラクトコッカス（Ｎ Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種であって、ラクトコッカス・ラ
クティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）ＮＲ
ＲＬ−Ｂ−１８８０９由来のバクテリオシンと共にラク
トコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種の親株由来の
他のバクテリオシンをコードするラクトコッカス（Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種に関する。
【０００８】特に本発明は食品中に汚染菌として存在す
るラクトバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｃａｓｅｉ）の増殖から食品を予防する方法に関
し、前記方法はラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）より選択され、ラクト
コッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａ
ｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９由来のバクテリオ
シンをコードするＤＮＡを含む群エヌ・ラクトコッカス
（Ｎ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種であって、ラクトコ
ッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃ
ｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９由来のバクテリオシ
ンと共にラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種
の親株由来の他のバクテリオシンをコードするラクトコ
ッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種の細胞を食品中に
供給することを含み、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ）種を食品中に供給し、細胞数はラクトバチラ
ス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅ
ｉ）を阻害するのに十分であることを特徴とする。
るラクトバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｃａｓｅｉ）の増殖から食品を予防する方法に関
し、前記方法はラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）より選択され、ラクト
コッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａ
ｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９由来のバクテリオ
シンをコードするＤＮＡを含む群エヌ・ラクトコッカス
（Ｎ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種であって、ラクトコ
ッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃ
ｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９由来のバクテリオシ
ンと共にラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種
の親株由来の他のバクテリオシンをコードするラクトコ
ッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種の細胞を食品中に
供給することを含み、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ）種を食品中に供給し、細胞数はラクトバチラ
ス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅ
ｉ）を阻害するのに十分であることを特徴とする。
【０００９】更に、本発明は食品中に汚染菌として存在
し得るラクトバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｃａｓｅｉ）及び他の細菌を阻害する組成物に
も関し、前記組成物は（Ａ）ラクトコッカス・ラクティ
ス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−
Ｂ−１８８０９によって産生される第１のバクテリオシ
ンと（Ｂ）ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８５３５
によって産生される第２のバクテリオシンとを混合して
含み、（Ａ）対（Ｂ）の重量比は約２５：１〜１：２５
である。
し得るラクトバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｃａｓｅｉ）及び他の細菌を阻害する組成物に
も関し、前記組成物は（Ａ）ラクトコッカス・ラクティ
ス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−
Ｂ−１８８０９によって産生される第１のバクテリオシ
ンと（Ｂ）ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８５３５
によって産生される第２のバクテリオシンとを混合して
含み、（Ａ）対（Ｂ）の重量比は約２５：１〜１：２５
である。
【００１０】本発明は食品中に汚染菌として存在し得る
ラクトバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃａｓｅｉ）及び他の細菌の増殖に対して食品を予防
する方法にも関し、前記方法は（Ａ）ラクトコッカス・
ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）
ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９によって産生される第１のバ
クテリオシンと（Ｂ）ラクトコッカス・ラクティス（Ｌ
ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１
８５３５によって産生される第２のバクテリオシンとを
混合して、食品中に汚染菌として存在するラクトバチラ
ス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅ
ｉ）及び他の細菌を阻害するのに十分な量含む組成物を
供給することから成る。
ラクトバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃａｓｅｉ）及び他の細菌の増殖に対して食品を予防
する方法にも関し、前記方法は（Ａ）ラクトコッカス・
ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）
ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９によって産生される第１のバ
クテリオシンと（Ｂ）ラクトコッカス・ラクティス（Ｌ
ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１
８５３５によって産生される第２のバクテリオシンとを
混合して、食品中に汚染菌として存在するラクトバチラ
ス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅ
ｉ）及び他の細菌を阻害するのに十分な量含む組成物を
供給することから成る。
【００１１】本発明は食品中に汚染菌として存在するラ
クトコッカス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃａｓｅｉ）の増殖に対して食品を予防する方法にも関
し、前記方法は食品中に、ニシン様バクテリオシンを産
生するラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８５３５の細
胞と、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９の細
胞とを、ラクトバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）及び他の細菌を阻害するのに十
分な量供給することから成る。
クトコッカス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃａｓｅｉ）の増殖に対して食品を予防する方法にも関
し、前記方法は食品中に、ニシン様バクテリオシンを産
生するラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８５３５の細
胞と、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９の細
胞とを、ラクトバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）及び他の細菌を阻害するのに十
分な量供給することから成る。
【００１２】最後に、本発明は、（Ａ）ニシン様バクテ
リオシンを産生するラクトコッカス・ラクティス（Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１
８５３５の細胞と、（Ｂ）ラクトコッカス・ラクティス
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ
−１８８０９の細胞とを、食品中のラクトバチラス・カ
ゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）及び
他の細菌を阻害するのに十分な量で含む細菌組成物に関
する。
リオシンを産生するラクトコッカス・ラクティス（Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１
８５３５の細胞と、（Ｂ）ラクトコッカス・ラクティス
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ
−１８８０９の細胞とを、食品中のラクトバチラス・カ
ゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）及び
他の細菌を阻害するのに十分な量で含む細菌組成物に関
する。
【００１３】供与株はラクトコッカス・ラクティス（Ｌ
ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−
１８８０９であり、独特のバクテリオシンを産生する。
この株は、スクロース陽性、ラクトース陽性、凝乳及び
アルギニンデアミナーゼ陽性という発酵特性を有する。
なお、この株はラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）よって産生されるバク
テリオシンをコードするプラスミドｐＳＲＱ４００をも
含んでいる。
ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−
１８８０９であり、独特のバクテリオシンを産生する。
この株は、スクロース陽性、ラクトース陽性、凝乳及び
アルギニンデアミナーゼ陽性という発酵特性を有する。
なお、この株はラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）よって産生されるバク
テリオシンをコードするプラスミドｐＳＲＱ４００をも
含んでいる。
【００１４】供与株であるラクトコッカス・ラクティス
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−
Ｂ−１８８０９によって産生されるバクテリオシンは、
以下の配列： Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｃ
ｙｓ Ｔｈｒ ＰｒｏＧｌｙ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ ＧｌｙＣｙｓ Ａ
ｓｎ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｃｙ
ｓ ＡｓｎＣｙｓ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｌｙｓ を有する。
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−
Ｂ−１８８０９によって産生されるバクテリオシンは、
以下の配列： Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｃ
ｙｓ Ｔｈｒ ＰｒｏＧｌｙ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｍｅｔ ＧｌｙＣｙｓ Ａ
ｓｎ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｃｙ
ｓ ＡｓｎＣｙｓ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｌｙｓ を有する。
【００１５】なお、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１
８８０９及びＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９によって産生さ
れるバクテリオシンは米国特許出願第０７／７２１，７
７４号（特開平６−９６９０号公報に対応）に詳細に記
載されている。明細書中、ラクトコッカス・ラクティス
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−
Ｂ−１８８０９をＬＬＡ ２．０、ＮＲＲＬ−Ｂ−１８
８０９によって産生されるバクテリオシンをＬＬ−２と
略記することもある。
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１
８８０９及びＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９によって産生さ
れるバクテリオシンは米国特許出願第０７／７２１，７
７４号（特開平６−９６９０号公報に対応）に詳細に記
載されている。明細書中、ラクトコッカス・ラクティス
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−
Ｂ−１８８０９をＬＬＡ ２．０、ＮＲＲＬ−Ｂ−１８
８０９によって産生されるバクテリオシンをＬＬ−２と
略記することもある。
【００１６】好適な受容株は、ラクトコッカス・ラクテ
ィス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲ
Ｌ−Ｂ−１８５３５であり、ニシン様バクテリオシンを
産生する。この株は、デキストロース陽性、マンニトー
ル陽性、ショ糖陽性、麦芽糖陽性、サリシン陽性、ラム
ノース陽性、トレハロース陽性、セルビオース陽性、マ
ンノース陽性、果糖陽性及びＮ−アセチルグルコサミン
陽性という発酵特性を有する。
ィス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲ
Ｌ−Ｂ−１８５３５であり、ニシン様バクテリオシンを
産生する。この株は、デキストロース陽性、マンニトー
ル陽性、ショ糖陽性、麦芽糖陽性、サリシン陽性、ラム
ノース陽性、トレハロース陽性、セルビオース陽性、マ
ンノース陽性、果糖陽性及びＮ−アセチルグルコサミン
陽性という発酵特性を有する。
【００１７】受容株であるラクトコッカス・ラクティス
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−
Ｂ−１８５３５が産生するバクテリオシンは、ニシンに
似ているが、ニシンとはアミノ酸１つが異なるものの、
このバクテリオシンの正確な化学的及び物理的構造は明
らかでない。
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−
Ｂ−１８５３５が産生するバクテリオシンは、ニシンに
似ているが、ニシンとはアミノ酸１つが異なるものの、
このバクテリオシンの正確な化学的及び物理的構造は明
らかでない。
【００１８】なお、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１
８５３５及びＮＲＲＬ−Ｂ−１８５３５によって産生さ
れるニシン様バクテリオシンは米国特許出願第０７／４
９２，９６９号（特開平４−２１７９９９号公報に対
応）に詳細に記載されている。明細書中、ラクトコッカ
ス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
ｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８５３５ＬＬＡ １．０、ＮＲＲ
Ｌ−Ｂ−１８５３５によって産生されるバクテリオシン
をＬＬ−１と略記することもある。
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１
８５３５及びＮＲＲＬ−Ｂ−１８５３５によって産生さ
れるニシン様バクテリオシンは米国特許出願第０７／４
９２，９６９号（特開平４−２１７９９９号公報に対
応）に詳細に記載されている。明細書中、ラクトコッカ
ス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
ｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８５３５ＬＬＡ １．０、ＮＲＲ
Ｌ−Ｂ−１８５３５によって産生されるバクテリオシン
をＬＬ−１と略記することもある。
【００１９】好適な被接合株は、ラクトコッカス・ラク
ティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲ
Ｌ−Ｂ−１８９２２である。
ティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲ
Ｌ−Ｂ−１８９２２である。
【００２０】上記したＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９、ＮＲ
ＲＬ−Ｂ−１８５３５およびＮＲＲＬ−Ｂ−１８９２２
の各菌株はブダペスト条約下、イリノイ州にあるｔｈｅ
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに寄託されており、各番号
は寄託番号である。プラスミドｐＳＲＱ４００もＮＲＲ
Ｌ−Ｂ−１８８０９の寄託に含まれている。
ＲＬ−Ｂ−１８５３５およびＮＲＲＬ−Ｂ−１８９２２
の各菌株はブダペスト条約下、イリノイ州にあるｔｈｅ
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに寄託されており、各番号
は寄託番号である。プラスミドｐＳＲＱ４００もＮＲＲ
Ｌ−Ｂ−１８８０９の寄託に含まれている。
【００２１】これらのバクテリオシンを食品中に一緒に
供給する。これらのバクテリオシンを、両方のバクテリ
オシンを産生する単一の被接合株又はこれらのバクテリ
オシンを別々に産生する２つの株を用いて供給できる。
ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種を１つに
合わせて食品に導入することもできる。
供給する。これらのバクテリオシンを、両方のバクテリ
オシンを産生する単一の被接合株又はこれらのバクテリ
オシンを別々に産生する２つの株を用いて供給できる。
ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種を１つに
合わせて食品に導入することもできる。
【００２２】バクテリオシンを発現させるためにラクト
コッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）を慣用的な増殖培
地で増殖させ、これを凍結及び凍結乾燥することができ
る。バクテリオシンを増殖培地から単離し、食品に使用
することができる。これらを使用する前の輸送のために
凍結乾燥又は凍結した形態で保存することもできる。
コッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）を慣用的な増殖培
地で増殖させ、これを凍結及び凍結乾燥することができ
る。バクテリオシンを増殖培地から単離し、食品に使用
することができる。これらを使用する前の輸送のために
凍結乾燥又は凍結した形態で保存することもできる。
【００２３】バクテリオシンを産生するのに好適な培地
は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９及びＮ
ＲＲＬ−Ｂ−１８５３５に関する米国特許出願第０７／
４９２，９６９号（特開平４−２１７９９９号公報に対
応）及び米国特許出願第０７／７２１，７７４号（特開
平６−９６９０号公報に対応）に詳細に記載されている
ものである。最も好適な培地はＭＲＳラクトバチラス
（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ブロス（Ｄｉｆｃｏ，
Ｄｅｔｒｏｉｔ ＭＩ）である。バクテリオシンを増殖
培地から単離し、これを前記の特許出願明細書に記載さ
れているように遠心分離などを用いて濃縮することがで
きる。
は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９及びＮ
ＲＲＬ−Ｂ−１８５３５に関する米国特許出願第０７／
４９２，９６９号（特開平４−２１７９９９号公報に対
応）及び米国特許出願第０７／７２１，７７４号（特開
平６−９６９０号公報に対応）に詳細に記載されている
ものである。最も好適な培地はＭＲＳラクトバチラス
（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ブロス（Ｄｉｆｃｏ，
Ｄｅｔｒｏｉｔ ＭＩ）である。バクテリオシンを増殖
培地から単離し、これを前記の特許出願明細書に記載さ
れているように遠心分離などを用いて濃縮することがで
きる。
【００２４】バクテリオシン混合物は、ＬＬＡ ２．０
由来のバクテリオシンとＬＬＡ １．０由来のバクテリ
オシンとを重量比約１：２５〜２５：１で食品中に使用
される。ＬＬＡ ２．０対ＬＬＡ １．０の重量比が
１：２０〜２５：１であるのが好ましい。嵩を増すため
に組成物にスターチ、デキストロースなどの種々の食品
グレードの賦形剤を補充することもできる。
由来のバクテリオシンとＬＬＡ １．０由来のバクテリ
オシンとを重量比約１：２５〜２５：１で食品中に使用
される。ＬＬＡ ２．０対ＬＬＡ １．０の重量比が
１：２０〜２５：１であるのが好ましい。嵩を増すため
に組成物にスターチ、デキストロースなどの種々の食品
グレードの賦形剤を補充することもできる。
【００２５】
【実施例】２つのバクテリオシンを産生するラクトコッ
カス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔ
ｉｓ）の好適な被接合株の産生方法を実施例１に後述す
る。転移されるプラスミドが形質転換又は形質導入には
大きすぎるので接合を用いた。形質転換又は形質導入に
よってＤＮＡ転移を行うにはプラスミドの大きさを小さ
くしなければならないことにてらし、接合は最も簡単な
方法である。実施例１には、被接合株の単離とその株の
試験を示す。実施例２には、前記被接合株の種々の食品
への使用を示す。
カス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔ
ｉｓ）の好適な被接合株の産生方法を実施例１に後述す
る。転移されるプラスミドが形質転換又は形質導入には
大きすぎるので接合を用いた。形質転換又は形質導入に
よってＤＮＡ転移を行うにはプラスミドの大きさを小さ
くしなければならないことにてらし、接合は最も簡単な
方法である。実施例１には、被接合株の単離とその株の
試験を示す。実施例２には、前記被接合株の種々の食品
への使用を示す。
【００２６】実施例１ ｐＳＲＱ４００の接合転移 本実施例１の目的は、（１）ラクトース発酵とバクテリ
オシン産生（ＬＬ−２＋）をコードする定住プラスミド
ｐＳＲＱ４００（６９Ｋｂ）を他の近縁の株に導入し得
ること、（２）接合（交配）によってラクトコッカス・
ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）
ＬＬＡ ２．０からｐＳＲＱ４００が転移されることを
確証することである。受容体は（ａ）ＬＬＡ ２．０に
よって産生されるバクテリオシンに非感受性で、（ｂ）
ＬＬＡ ２．０を阻害せず、（ｃ）供与体ＬＬＡ ２．
０と区別される抗生物質マーカーを有し、（ｄ）ｐＳＲ
Ｑ４００の転移が容易に行われ得るようにラクトース陰
性（Ｌａｃ−）であり、（ｅ）近縁の受容株、すなわち
同種又は同族である。
オシン産生（ＬＬ−２＋）をコードする定住プラスミド
ｐＳＲＱ４００（６９Ｋｂ）を他の近縁の株に導入し得
ること、（２）接合（交配）によってラクトコッカス・
ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）
ＬＬＡ ２．０からｐＳＲＱ４００が転移されることを
確証することである。受容体は（ａ）ＬＬＡ ２．０に
よって産生されるバクテリオシンに非感受性で、（ｂ）
ＬＬＡ ２．０を阻害せず、（ｃ）供与体ＬＬＡ ２．
０と区別される抗生物質マーカーを有し、（ｄ）ｐＳＲ
Ｑ４００の転移が容易に行われ得るようにラクトース陰
性（Ｌａｃ−）であり、（ｅ）近縁の受容株、すなわち
同種又は同族である。
【００２７】使用した株はラクトコッカス・ラクティス
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＬＬＡ
１．０であり、所望の抗生物質を適当な濃度勾配で通す
ことによって耐性自然突然変異体を得ることができる。
ＬＬＡ ２．０に対して試験すると、この株はＬＬＡ
２．０が産生するバクテリオシン（ＬＬ−２Ａ及びＬＬ
−２Ｂ）に対し非感受性であることがわかった。ＬＬＡ
２．０も、ＬＬ−１と呼ばれるバクテリオシンを産生
するＬＬＡ １．０によって阻害されなかった。更にＬ
ＬＡ １．０株はラクトース陰性（Ｌａｃ−）であっ
た。これらの好ましい特徴のため、ＬＬＡ １．０を受
容体として選択した。
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＬＬＡ
１．０であり、所望の抗生物質を適当な濃度勾配で通す
ことによって耐性自然突然変異体を得ることができる。
ＬＬＡ ２．０に対して試験すると、この株はＬＬＡ
２．０が産生するバクテリオシン（ＬＬ−２Ａ及びＬＬ
−２Ｂ）に対し非感受性であることがわかった。ＬＬＡ
２．０も、ＬＬ−１と呼ばれるバクテリオシンを産生
するＬＬＡ １．０によって阻害されなかった。更にＬ
ＬＡ １．０株はラクトース陰性（Ｌａｃ−）であっ
た。これらの好ましい特徴のため、ＬＬＡ １．０を受
容体として選択した。
【００２８】産生されるであろう被接合体を選択し確認
するためにＬａｃ＋表現型以外の適当なスクリーニング
手順を確立することが、まず重要であった。ＬＬＡ
１．０とＬＬＡ ２．０とを識別する他の特徴を確立し
なければならなかった。この目的を達成するために、２
つの選択肢を有するアプローチを使用した。
するためにＬａｃ＋表現型以外の適当なスクリーニング
手順を確立することが、まず重要であった。ＬＬＡ
１．０とＬＬＡ ２．０とを識別する他の特徴を確立し
なければならなかった。この目的を達成するために、２
つの選択肢を有するアプローチを使用した。
【００２９】（１）ＬＬＡ １．０に対して毒性な予め
単離したファージを用いてＬＬＡ１．０とＬＬＡ ２．
０とをスクリーニングした。スクリーニングによって、
ファージｌｌａ−１はＬＬＡ １．０に特異的であり、
ＬＬＡ ２．０を感染しないことが示された。
単離したファージを用いてＬＬＡ１．０とＬＬＡ ２．
０とをスクリーニングした。スクリーニングによって、
ファージｌｌａ−１はＬＬＡ １．０に特異的であり、
ＬＬＡ ２．０を感染しないことが示された。
【００３０】（２）いくつかの考えられる因子に対して
ＬＬＡ １．０とＬＬＡ ２．０とをスクリーニング
し、ＬＬＡ １．０によっては阻害されない株をＬＬＡ
２．０が阻害するか否か調べた。初期の研究によっ
て、ＬＬＡ ２．０のコロニーはラクトバチラス・カゼ
イ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）８４２
（ＮＲＲＬ−Ｂ−１５９７２）を阻害するが、ＬＬＡ
１．０は同様の阻害を示さないことがわかった。これら
の特徴を使用すれば被接合体の非選択的マーカー分析を
行うことができる。
ＬＬＡ １．０とＬＬＡ ２．０とをスクリーニング
し、ＬＬＡ １．０によっては阻害されない株をＬＬＡ
２．０が阻害するか否か調べた。初期の研究によっ
て、ＬＬＡ ２．０のコロニーはラクトバチラス・カゼ
イ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）８４２
（ＮＲＲＬ−Ｂ−１５９７２）を阻害するが、ＬＬＡ
１．０は同様の阻害を示さないことがわかった。これら
の特徴を使用すれば被接合体の非選択的マーカー分析を
行うことができる。
【００３１】交配混合物の選択寒天平板培養で現れるＬ
ａｃ＋コロニーの簡易なスクリーニングを更に容易にす
るため、これらの薬剤に対して耐性のＬＬＡ １．０自
然突然変異体を選択することにした。
ａｃ＋コロニーの簡易なスクリーニングを更に容易にす
るため、これらの薬剤に対して耐性のＬＬＡ １．０自
然突然変異体を選択することにした。
【００３２】
【表１】 ストック溶液（溶液Ａ，１００，０００μｇ／ｍｌ）を
調合しフィルター滅菌した。 ＢＭＧ：グルコース入り基礎培地。 溶液Ａを滅菌蒸留水を使用して１／１０希釈し溶液Ｂ
（１０，０００μｇ／ｍｌ）を調製した。 溶液Ｂを１／１０希釈し溶液Ｃ（１，０００μｇ／ｍ
ｌ）を調製した。 溶液Ｃを１／１０希釈し溶液Ｄ（１００μｇ／ｍｌ）を
調製した。 Ｓｔｒ：ストレプトマイシン。
調合しフィルター滅菌した。 ＢＭＧ：グルコース入り基礎培地。 溶液Ａを滅菌蒸留水を使用して１／１０希釈し溶液Ｂ
（１０，０００μｇ／ｍｌ）を調製した。 溶液Ｂを１／１０希釈し溶液Ｃ（１，０００μｇ／ｍ
ｌ）を調製した。 溶液Ｃを１／１０希釈し溶液Ｄ（１００μｇ／ｍｌ）を
調製した。 Ｓｔｒ：ストレプトマイシン。
【００３３】培養ＬＬＡ １．０をこれらの溶液に段階
的に移し、耐性単離物（Ｓｔｒ２０００）を精製し凍結
した。これをＬＬＡ １．１と称した。フシジン酸に晒
して２薬剤耐性突然変異体を発育させるのに、この株を
使用した。分離したＬＬＡ１．１はファージｌｌａ−１
に対して感受性であった。
的に移し、耐性単離物（Ｓｔｒ２０００）を精製し凍結
した。これをＬＬＡ １．１と称した。フシジン酸に晒
して２薬剤耐性突然変異体を発育させるのに、この株を
使用した。分離したＬＬＡ１．１はファージｌｌａ−１
に対して感受性であった。
【００３４】ＬＬＡ １．１にＦｕｓｒマーカーをつけ
るために、グルコース入り基礎寒天培地（ＢＭＧ）２０
ｍｌを滅菌ネジ口チューブに導入した。
るために、グルコース入り基礎寒天培地（ＢＭＧ）２０
ｍｌを滅菌ネジ口チューブに導入した。
【００３５】フシジン酸５ｍｇを秤量し、メタノール
５．０ｍｌに溶解して１ｍｇ（１０００μｇ）／ｍｌの
溶液Ａを得、これを１／１０に希釈して溶液Ｂを得た。
５．０ｍｌに溶解して１ｍｇ（１０００μｇ）／ｍｌの
溶液Ａを得、これを１／１０に希釈して溶液Ｂを得た。
【００３６】
【表２】
【００３７】薬剤を混合した寒天を滅菌シャーレに注ぎ
固めた。シャーレの表面水分を乾燥させた。
固めた。シャーレの表面水分を乾燥させた。
【００３８】ＢＭＧブロス中で１８時間培養したＬＬＡ
１．１（０．１ｍｌ）をフシジン酸１μｇ／ｍｌ及び
５μｇ／ｍｌを含む平板上に広げた。これらの平板のう
ちの１つに現れたコロニーを更に薬剤濃度の高い平板上
に画線した。このような手順によってフシジン酸２０μ
ｇ／ｍｌに耐性のある誘導体を得た。この誘導体をＬＬ
Ａ １．２と称した。
１．１（０．１ｍｌ）をフシジン酸１μｇ／ｍｌ及び
５μｇ／ｍｌを含む平板上に広げた。これらの平板のう
ちの１つに現れたコロニーを更に薬剤濃度の高い平板上
に画線した。このような手順によってフシジン酸２０μ
ｇ／ｍｌに耐性のある誘導体を得た。この誘導体をＬＬ
Ａ １．２と称した。
【００３９】この方法は、ラクトース、ｐＨ指示薬ブロ
モクレゾールパープル（ＢＣＰ）及びストレプトマイシ
ンを含む基礎培地上で交配混合物を平板培養するためで
あった。交配平板からのＬａｃ＋コロニーをＦｕｓ１０
平板上でスクリーニングし、被接合体を選択した。
モクレゾールパープル（ＢＣＰ）及びストレプトマイシ
ンを含む基礎培地上で交配混合物を平板培養するためで
あった。交配平板からのＬａｃ＋コロニーをＦｕｓ１０
平板上でスクリーニングし、被接合体を選択した。
【００４０】微生物 ＬＬＡ １．２と名付けた、ストレプトマイシン及びフ
シジン酸耐性でラクトース陰性でかつプラスミドを含ま
ないバクテリオシン産生能の強い自発性ラクトコッカス
・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
ｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）株を交配実験の受
容体として使用した。この株はニシン様バクテリオシン
を産生した。供与体はＬＬＡ ２．０と名付けられたも
う１つのラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉ
ｓ）株であった。供与株ＬＬＡ ２．０は２つの関連し
たバクテリオシンを産生し、そのうちの１つはもう１つ
のバクテリオシンの分解産物であると考えられた。株Ｌ
ＬＡ ２．０は６９．０Ｋｂの大きさの１つのプラスミ
ド（ｐＳＲＱ４００）を含んでいた。このプラスミドが
キュアすると、ＬＬＡ２．０のラクトース発酵能がなく
なり、ＬＬＡ ２．０によってバクテリオシンが産生さ
れなくなった。株ＬＬＡ １．２はＬＬＡ ２．０に対
し阻害作用を持たず、ＬＬＡ ２．０もＬＬＡ １．２
に対し阻害作用を持たなかった。更に、ＬＬＡ ２．０
のコロニーはラクトバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）亜種カゼイ（ｃａｓｅｉ）
８４２に対し非常に阻害的であったが、ＬＬＡ １．２
はこのラクトバチラスに対して作用しなかった。ラクト
バチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａ
ｓｅｉ）は食品中の汚染菌であり得、又はカビを抑制す
るために加えても良い。
シジン酸耐性でラクトース陰性でかつプラスミドを含ま
ないバクテリオシン産生能の強い自発性ラクトコッカス
・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
ｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）株を交配実験の受
容体として使用した。この株はニシン様バクテリオシン
を産生した。供与体はＬＬＡ ２．０と名付けられたも
う１つのラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉ
ｓ）株であった。供与株ＬＬＡ ２．０は２つの関連し
たバクテリオシンを産生し、そのうちの１つはもう１つ
のバクテリオシンの分解産物であると考えられた。株Ｌ
ＬＡ ２．０は６９．０Ｋｂの大きさの１つのプラスミ
ド（ｐＳＲＱ４００）を含んでいた。このプラスミドが
キュアすると、ＬＬＡ２．０のラクトース発酵能がなく
なり、ＬＬＡ ２．０によってバクテリオシンが産生さ
れなくなった。株ＬＬＡ １．２はＬＬＡ ２．０に対
し阻害作用を持たず、ＬＬＡ ２．０もＬＬＡ １．２
に対し阻害作用を持たなかった。更に、ＬＬＡ ２．０
のコロニーはラクトバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）亜種カゼイ（ｃａｓｅｉ）
８４２に対し非常に阻害的であったが、ＬＬＡ １．２
はこのラクトバチラスに対して作用しなかった。ラクト
バチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａ
ｓｅｉ）は食品中の汚染菌であり得、又はカビを抑制す
るために加えても良い。
【００４１】ＬＬＡ １．２に対し毒性であるがＬＬＡ
２．０に対して不活性であるｌｌａ−１と称する特異
的なバクテリオファージを、交配実験における被接合体
についての試験に使用した。ラクトバチラス・カゼイ
（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）亜種カゼイ
（ｃａｓｅｉ）８４２に対する活性によって被接合体を
選択試験した。使用した微生物及びその特徴を第１表に
示す。
２．０に対して不活性であるｌｌａ−１と称する特異
的なバクテリオファージを、交配実験における被接合体
についての試験に使用した。ラクトバチラス・カゼイ
（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）亜種カゼイ
（ｃａｓｅｉ）８４２に対する活性によって被接合体を
選択試験した。使用した微生物及びその特徴を第１表に
示す。
【００４２】
【表３】 Ｓｔｒｒ−ストレプトマイシン耐性；Ｓｔｒｓ−ストレ
プトマイシン感受性；Ｆｕｓｒ−フシジン酸耐性；Ｆｕ
ｓｓ−フシジン酸感受性；Ｌａｃ＋−ラクトース陽性；
Ｌａｃ−−ラクトース陰性；Ｅｒｙｒ−エリスロマイシ
ン耐性；Ｅｒｙｓ−エリスロマイシン感受性；ＬＬ−１
＋−バクテリオシンＬＬ−１産生に対して陽性；ＬＬ−
１−−バクテリオシンＬＬ−１産生に対して陰性；ＬＬ
−２＋−バクテリオシンＬＬ−２産生に対して陽性；Ｌ
Ｌ−２−−バクテリオシンＬＬ−２産生に対して陰性ａ
ｐＧＫ４１：Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ大学（オランダ）のＪ
ａｎ Ｋｏｋ博士より寄贈ｂｐＳＲＱ４００：米国特許
出願第０７／７２１，７７４号（特開平６−９６９０号
公報に対応）ｃＬＬＡ １．２（ｐＧＫ４１）Ｔ１：実
験室で命名−株３０２。
プトマイシン感受性；Ｆｕｓｒ−フシジン酸耐性；Ｆｕ
ｓｓ−フシジン酸感受性；Ｌａｃ＋−ラクトース陽性；
Ｌａｃ−−ラクトース陰性；Ｅｒｙｒ−エリスロマイシ
ン耐性；Ｅｒｙｓ−エリスロマイシン感受性；ＬＬ−１
＋−バクテリオシンＬＬ−１産生に対して陽性；ＬＬ−
１−−バクテリオシンＬＬ−１産生に対して陰性；ＬＬ
−２＋−バクテリオシンＬＬ−２産生に対して陽性；Ｌ
Ｌ−２−−バクテリオシンＬＬ−２産生に対して陰性ａ
ｐＧＫ４１：Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ大学（オランダ）のＪ
ａｎ Ｋｏｋ博士より寄贈ｂｐＳＲＱ４００：米国特許
出願第０７／７２１，７７４号（特開平６−９６９０号
公報に対応）ｃＬＬＡ １．２（ｐＧＫ４１）Ｔ１：実
験室で命名−株３０２。
【００４３】培地 株ＬＬＡ １．２をグルコース入り基礎培地（ＢＭＧ）
中で一般的に増殖させた。株ＬＬＡ ２．０をラクトー
ス入り基礎培地（ＢＭＬ）中で培養した。これらの培地
の組成はＧｏｎｚａｌｅｚ及びＫｕｎｋａによって記載
されている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｃ．Ｆ．及びＢ．Ｓ．
Ｋｕｎｋａ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．４６：８１−８９（１９８３））。固体培地
用に寒天１．５％をそれぞれのブロスに加えた。交配混
合物を選択平板培養するために、ｐＨ指示薬としてブロ
モクレゾールパープル（ＢＣＰ）０．００８％と選択剤
としてストレプトマイシン１０００μｇ／ｍｌとを含む
ＢＭＬ−寒天を使用した。ＢＭＬ（ＢＣＰ）−Ｓｔｒ
１０００平板上のラクトース陽性のコロニーをＢＭＬ
（ＢＣＰ）−Ｆｕｓ１０平板上で対比選択して供与体の
Ｓｔｒｒ自然突然変異体を除いた。ファージ感受性を試
験するために、単離物を接種した軟質寒天上層に高力価
のファージｌｌａ−１の溶解産物をスポットした。この
試験に使用した培地は０．０２％塩化カルシウムで強化
した固体及び半固体ＢＭＧ寒天であった。
中で一般的に増殖させた。株ＬＬＡ ２．０をラクトー
ス入り基礎培地（ＢＭＬ）中で培養した。これらの培地
の組成はＧｏｎｚａｌｅｚ及びＫｕｎｋａによって記載
されている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｃ．Ｆ．及びＢ．Ｓ．
Ｋｕｎｋａ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．４６：８１−８９（１９８３））。固体培地
用に寒天１．５％をそれぞれのブロスに加えた。交配混
合物を選択平板培養するために、ｐＨ指示薬としてブロ
モクレゾールパープル（ＢＣＰ）０．００８％と選択剤
としてストレプトマイシン１０００μｇ／ｍｌとを含む
ＢＭＬ−寒天を使用した。ＢＭＬ（ＢＣＰ）−Ｓｔｒ
１０００平板上のラクトース陽性のコロニーをＢＭＬ
（ＢＣＰ）−Ｆｕｓ１０平板上で対比選択して供与体の
Ｓｔｒｒ自然突然変異体を除いた。ファージ感受性を試
験するために、単離物を接種した軟質寒天上層に高力価
のファージｌｌａ−１の溶解産物をスポットした。この
試験に使用した培地は０．０２％塩化カルシウムで強化
した固体及び半固体ＢＭＧ寒天であった。
【００４４】バクテリオシンアッセイ 培養物の無細胞上清液中のバクテリオシンの力価を０．
４５μｍフィルターを通した上清液で測定した。使用し
た指標はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅ
ｕｓ ＦＢＢ６３Ｃであった。濾過した上清液と濾液を
順次２倍希釈したものを、Ｇｏｎｚａｌｅｚ及びＫｕｎ
ｋａによって記載されているように（Ｇｏｎｚａｌｅ
ｚ．，Ｃ．Ｆ．及びＢ．Ｓ．Ｋｕｎｋａ，Ａｐｐｌ．Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：２５３４−
２５３８（１９８７））、指標の無水分ＭＲＳ−軟質寒
天上層に容量５μｌでスポットした。１活性単位（Ａ
Ｕ）を、指標菌叢（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｌａｗｎ）上
に一定の阻害ゾーンを示す最も高い希釈率の逆数として
定義する。
４５μｍフィルターを通した上清液で測定した。使用し
た指標はＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅ
ｕｓ ＦＢＢ６３Ｃであった。濾過した上清液と濾液を
順次２倍希釈したものを、Ｇｏｎｚａｌｅｚ及びＫｕｎ
ｋａによって記載されているように（Ｇｏｎｚａｌｅ
ｚ．，Ｃ．Ｆ．及びＢ．Ｓ．Ｋｕｎｋａ，Ａｐｐｌ．Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：２５３４−
２５３８（１９８７））、指標の無水分ＭＲＳ−軟質寒
天上層に容量５μｌでスポットした。１活性単位（Ａ
Ｕ）を、指標菌叢（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｌａｗｎ）上
に一定の阻害ゾーンを示す最も高い希釈率の逆数として
定義する。
【００４５】コロニーによるバクテリオシン産生を立証
するために、個々のコロニーを滅菌つまようじで緩衝Ｍ
ＲＳ−寒天平板（１．９％β−グリセロリン酸ナトリウ
ムを含有するＭＲＳ−寒天）の無水表面に移植して、移
植したもののコロニーの成長を直径１〜２ｍｍとした。
発育しているコロニーが互いに２ｃｍ以上離れているよ
うに移植した。コロニーを発育させた後、ラクトバチラ
ス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅ
ｉ）亜種カゼイ（ｃａｓｅｉ）８４２を接種した軟質Ｍ
ＲＳ−寒天の層を注いだ。３５℃で一晩インキュベート
した後、指標の阻害について平板を試験した。縁がもろ
い広い（１ｃｍ以上）の綺麗な区域があれば、バクテリ
オシン産生に関して陽性であると採点した。
するために、個々のコロニーを滅菌つまようじで緩衝Ｍ
ＲＳ−寒天平板（１．９％β−グリセロリン酸ナトリウ
ムを含有するＭＲＳ−寒天）の無水表面に移植して、移
植したもののコロニーの成長を直径１〜２ｍｍとした。
発育しているコロニーが互いに２ｃｍ以上離れているよ
うに移植した。コロニーを発育させた後、ラクトバチラ
ス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅ
ｉ）亜種カゼイ（ｃａｓｅｉ）８４２を接種した軟質Ｍ
ＲＳ−寒天の層を注いだ。３５℃で一晩インキュベート
した後、指標の阻害について平板を試験した。縁がもろ
い広い（１ｃｍ以上）の綺麗な区域があれば、バクテリ
オシン産生に関して陽性であると採点した。
【００４６】培養物交配法 寒天表面交配法を使用した。交配混合物（供与体：受容
体の比１：２及び１：４）及び供与体と受容体の対照を
ＢＭＧ−寒天の表面に広げた。種々の各実験につき１組
５枚の平板を使用した。各平板に試料０．２ｍｌを広げ
た。平板を３２℃で一晩インキュベートし、寒天表面を
ｐＨ７．０の滅菌リン酸緩衝液を各平板につき２．０ｍ
ｌづつ使用して洗浄して細胞を回収した。１試料につき
各組５枚の平板からの総量約１０ｍｌを合わせ、細胞を
遠心分離によって沈降させた。リン酸緩衝液１０ｍｌで
洗浄後、細胞を緩衝液１．１ｍｌに再懸濁させた。細胞
を５枚のＢＭＬ（ＢＣＰ）−Ｓｔｒ１０００平板上に各
平板につき０．２ｍｌづつ広げた。平板を水素−二酸化
炭素発生パウチ（ｐｏｕｃｈ）を備えたＧａｓ Ｐａｋ
Ｊａｒ内で３２℃で４８時間インキュベートした。イ
ンキュベート時間が終了したら平板を試験した。
体の比１：２及び１：４）及び供与体と受容体の対照を
ＢＭＧ−寒天の表面に広げた。種々の各実験につき１組
５枚の平板を使用した。各平板に試料０．２ｍｌを広げ
た。平板を３２℃で一晩インキュベートし、寒天表面を
ｐＨ７．０の滅菌リン酸緩衝液を各平板につき２．０ｍ
ｌづつ使用して洗浄して細胞を回収した。１試料につき
各組５枚の平板からの総量約１０ｍｌを合わせ、細胞を
遠心分離によって沈降させた。リン酸緩衝液１０ｍｌで
洗浄後、細胞を緩衝液１．１ｍｌに再懸濁させた。細胞
を５枚のＢＭＬ（ＢＣＰ）−Ｓｔｒ１０００平板上に各
平板につき０．２ｍｌづつ広げた。平板を水素−二酸化
炭素発生パウチ（ｐｏｕｃｈ）を備えたＧａｓ Ｐａｋ
Ｊａｒ内で３２℃で４８時間インキュベートした。イ
ンキュベート時間が終了したら平板を試験した。
【００４７】コロニースクリーニング 交配混合物を含む平板からのラクトース陽性の黄色コロ
ニー全てをＢＭＬ（ＢＣＰ）−Ｆｕｓ１０平板上に短く
画線し、自発性Ｓｔｒｒ供与体コロニーに対して選択し
た。ＢＭＬ（ＢＣＰ）−Ｆｕｓ１０平板からの予定され
る被接合体をラクトバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）亜種カゼイ（ｃａｓｅｉ）
８４２に対する阻害活性についてスクリーニングした。
拮抗活性を示すものを単一コロニーを単離するために画
線し（精製ステップ）、株８４２に対する活性について
再試験した。拮抗活性陽性のコロニーをファージｌｌａ
−１に対する感受性について試験した。ファージに対し
て感受性のコロニーをブロス中で増殖させ保存した。
ニー全てをＢＭＬ（ＢＣＰ）−Ｆｕｓ１０平板上に短く
画線し、自発性Ｓｔｒｒ供与体コロニーに対して選択し
た。ＢＭＬ（ＢＣＰ）−Ｆｕｓ１０平板からの予定され
る被接合体をラクトバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）亜種カゼイ（ｃａｓｅｉ）
８４２に対する阻害活性についてスクリーニングした。
拮抗活性を示すものを単一コロニーを単離するために画
線し（精製ステップ）、株８４２に対する活性について
再試験した。拮抗活性陽性のコロニーをファージｌｌａ
−１に対する感受性について試験した。ファージに対し
て感受性のコロニーをブロス中で増殖させ保存した。
【００４８】プラスミドＤＮＡの単離及び電気泳動 細胞の増殖、細胞の溶解、プラスミドＤＮＡの単離、電
気泳動による分離及びゲルの臭化エチジウム染色には、
Ｇｏｎｚａｌｅｚ及びＫｕｎｋａによって記載されてい
る手順（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｃ．Ｆ．及びＢ．Ｓ．Ｋｕ
ｎｋａ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．４６：８１−８９（１９８３））を使用した。
気泳動による分離及びゲルの臭化エチジウム染色には、
Ｇｏｎｚａｌｅｚ及びＫｕｎｋａによって記載されてい
る手順（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｃ．Ｆ．及びＢ．Ｓ．Ｋｕ
ｎｋａ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．４６：８１−８９（１９８３））を使用した。
【００４９】被接合体ＬＬＡ １．２（ｐＧＫ４１）Ｔ
１（実験室名３０２）のバクテリオシン活性の精製 ＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ
ｉｇａｎ）２１に株３０２（ＭＲＳブロス中で増殖させ
た）の８時間培養物を１％で接種し、３２℃で２４時間
静置増殖した。４℃、１６，３００×ｇで１５分間遠心
分離して細胞を除去した。孔径０．２μｍのポリビニリ
デンジフロライド（ＰＶＤＦ）メンブランを備えたＭｉ
ｎｉｔａｎ接線濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄ
ｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して濾
過した。バクテリオシン産生を前記のようにアッセイし
た。
１（実験室名３０２）のバクテリオシン活性の精製 ＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ
ｉｇａｎ）２１に株３０２（ＭＲＳブロス中で増殖させ
た）の８時間培養物を１％で接種し、３２℃で２４時間
静置増殖した。４℃、１６，３００×ｇで１５分間遠心
分離して細胞を除去した。孔径０．２μｍのポリビニリ
デンジフロライド（ＰＶＤＦ）メンブランを備えたＭｉ
ｎｉｔａｎ接線濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄ
ｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して濾
過した。バクテリオシン産生を前記のようにアッセイし
た。
【００５０】接線濾過からの濾液を、表面積１ｆｔ２、
カットオフ分子量３０００ダルトンの螺旋形セルロース
ベースＳ１Ｙ３限外濾過カートリッジ（Ａｍｉｃｏｎ，
Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を用いて約６倍に濃縮した。濃
縮はぜん動性ポンプ（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ，Ｃｈｉ
ｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を用いてメンンブランの
両側の差圧を２０ｌｂ／ｉｎ２に維持して４℃で行っ
た。
カットオフ分子量３０００ダルトンの螺旋形セルロース
ベースＳ１Ｙ３限外濾過カートリッジ（Ａｍｉｃｏｎ，
Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を用いて約６倍に濃縮した。濃
縮はぜん動性ポンプ（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ，Ｃｈｉ
ｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を用いてメンンブランの
両側の差圧を２０ｌｂ／ｉｎ２に維持して４℃で行っ
た。
【００５１】濃縮した上清液３５０ｍｌのアリコート
を、ｐＨ４．０の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液で平衡
化したＤＥＡＥ−６５０Ｍ陰イオン交換樹脂（Ｔｏｓｏ
−Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）の１０
ｃｍ×２０ｃｍカラム（１．５７ｌ）に流速１１０ｍｌ
／分でかけた。溶離液の２８０ｎｍにおける吸光度をモ
ニターし、最初に吸光度がベースラインより上昇してか
ら吸光度がベースラインに戻るまで溶離液を収集した。
溶離液の容量は３１５０ｍｌで、活性は１６００ＡＵ／
ｍｌであった。
を、ｐＨ４．０の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液で平衡
化したＤＥＡＥ−６５０Ｍ陰イオン交換樹脂（Ｔｏｓｏ
−Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）の１０
ｃｍ×２０ｃｍカラム（１．５７ｌ）に流速１１０ｍｌ
／分でかけた。溶離液の２８０ｎｍにおける吸光度をモ
ニターし、最初に吸光度がベースラインより上昇してか
ら吸光度がベースラインに戻るまで溶離液を収集した。
溶離液の容量は３１５０ｍｌで、活性は１６００ＡＵ／
ｍｌであった。
【００５２】陰イオン交換クロマトグラフィーからの溶
離液の全容量を、ｐＨ４．０の０．１Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液で予め平衡化したＣＭ−６５０Ｍ陽イオン交換樹
脂（Ｔｏｓｏ−Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，
ＰＡ）の１０ｃｍ×３５ｃｍカラム（２．７５ｌ）にか
けた。１Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ４．０の同じ緩衝
液を用いて活性分を溶離した。最初に伝導率がベースラ
イン（０．１５９ｍｉｃｒｏ Ｓｉｅｍａｎｓ）より上
昇してから溶離液を収集した。２８０ｎｍにおける吸光
度がベースラインの吸光度に戻るまで収集した。溶離液
の容量は２０００ｍｌで、活性は４００ＡＵ／ｍｌであ
った。
離液の全容量を、ｐＨ４．０の０．１Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液で予め平衡化したＣＭ−６５０Ｍ陽イオン交換樹
脂（Ｔｏｓｏ−Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，
ＰＡ）の１０ｃｍ×３５ｃｍカラム（２．７５ｌ）にか
けた。１Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ４．０の同じ緩衝
液を用いて活性分を溶離した。最初に伝導率がベースラ
イン（０．１５９ｍｉｃｒｏ Ｓｉｅｍａｎｓ）より上
昇してから溶離液を収集した。２８０ｎｍにおける吸光
度がベースラインの吸光度に戻るまで収集した。溶離液
の容量は２０００ｍｌで、活性は４００ＡＵ／ｍｌであ
った。
【００５３】陽イオン交換クロマトグラフィーからの溶
離液を、Ｓ１Ｙ３カートリッジ（Ａｍｉｃｏｎ，Ｄａｎ
ｖｅｒｓ，ＭＡ）を用いて残量が１００ｍｌとなるまで
限外濾過して約１０倍に濃縮した。それから、脱イオン
水４００ｍｌを３回加えてフィルターを通し（ｄｉａｆ
ｉｌｔｅｒｉｎｇ）、約１００ｍｌになるまで濃縮する
ことによって、塩化ナトリウム含量を約１／１２５に低
減させた。カートリッジを空にして脱イオン水１００ｍ
ｌで洗浄した。濃縮物を洗浄溶液と合わせ、活性３２０
０ＡＵ／ｍｌのバクテリオシン２３０ｍｌを得た。
離液を、Ｓ１Ｙ３カートリッジ（Ａｍｉｃｏｎ，Ｄａｎ
ｖｅｒｓ，ＭＡ）を用いて残量が１００ｍｌとなるまで
限外濾過して約１０倍に濃縮した。それから、脱イオン
水４００ｍｌを３回加えてフィルターを通し（ｄｉａｆ
ｉｌｔｅｒｉｎｇ）、約１００ｍｌになるまで濃縮する
ことによって、塩化ナトリウム含量を約１／１２５に低
減させた。カートリッジを空にして脱イオン水１００ｍ
ｌで洗浄した。濃縮物を洗浄溶液と合わせ、活性３２０
０ＡＵ／ｍｌのバクテリオシン２３０ｍｌを得た。
【００５４】真空遠心分離機（Ｓａｖａｎｔ，Ｆａｒｍ
ｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を用いて更にバクテリオシン濃
縮物の容量を減らし、活性６４０００ＡＵ／ｍｌの残渣
１６ｍｌを得た。この濃縮物のアリコートを０．１％ト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の水溶液で平衡化した２．５
ｃｍ×２５ｃｍＯＤＳカラム（Ｖｙｄａｃ，Ｈｉｓｐｅ
ｒｉａ，ＣＡ）にかけた。３０分かけて０．１％トリフ
ルオロ酢酸含有の２０％アセトニトリル（ＡｃＣＮ）か
ら４０％アセトニトリル（ＡｃＣＮ）へと典型的に直線
変化させる勾配を用いて活性分を溶離した。流速は１０
ｍｌ／分をとした。０．５分間隔で画分を集め、各画分
から５μｌを直接ＦＢＢ６３Ｃ指標平板にスポットし
て、クロマトグラム中の活性の位置を決めた。蛋白溶離
物を波長２３０ｎｍのＵＶ検出器を用いてモニターし
た。
ｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を用いて更にバクテリオシン濃
縮物の容量を減らし、活性６４０００ＡＵ／ｍｌの残渣
１６ｍｌを得た。この濃縮物のアリコートを０．１％ト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の水溶液で平衡化した２．５
ｃｍ×２５ｃｍＯＤＳカラム（Ｖｙｄａｃ，Ｈｉｓｐｅ
ｒｉａ，ＣＡ）にかけた。３０分かけて０．１％トリフ
ルオロ酢酸含有の２０％アセトニトリル（ＡｃＣＮ）か
ら４０％アセトニトリル（ＡｃＣＮ）へと典型的に直線
変化させる勾配を用いて活性分を溶離した。流速は１０
ｍｌ／分をとした。０．５分間隔で画分を集め、各画分
から５μｌを直接ＦＢＢ６３Ｃ指標平板にスポットし
て、クロマトグラム中の活性の位置を決めた。蛋白溶離
物を波長２３０ｎｍのＵＶ検出器を用いてモニターし
た。
【００５５】バクテリオシンの特性解析 親株由来の精製したＬＬ−１、ＬＬ−２Ａ及びＬＬ−２
Ｂと被接合株由来の単離した３０２Ａ及び３０２Ｂの活
性を比較した。０．４５ｃｍ×２５ｃｍＣ１８分析カラ
ム（Ｖｙｄａｃ，Ｈｉｓｐｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉａ）上でこれらの比較を行った。
Ｂと被接合株由来の単離した３０２Ａ及び３０２Ｂの活
性を比較した。０．４５ｃｍ×２５ｃｍＣ１８分析カラ
ム（Ｖｙｄａｃ，Ｈｉｓｐｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉａ）上でこれらの比較を行った。
【００５６】結果 最初の交配実験によって、供与体があまりにも多くのＳ
ｔｒｒコロニーを産生したため、スクリーニングでコロ
ニーを選択するのは困難であることが明らかになった。
この問題を回避するため、シャトルベクターｐＧＫ４１
をエレクトロポレーションすることによってにエリスロ
マイシン耐性マーカー（Ｅｒｙｒ）を供与体に導入し
た。後の交配実験では、ＢＭＬ（ＢＣＰ）−Ｓｔｒ
１０００Ｅｒｙ５平板上で対照と交配混合物との選択的
平板培養を行った。これらの平板上では供与体コロニー
の突破（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ）は見られなかっ
た。
ｔｒｒコロニーを産生したため、スクリーニングでコロ
ニーを選択するのは困難であることが明らかになった。
この問題を回避するため、シャトルベクターｐＧＫ４１
をエレクトロポレーションすることによってにエリスロ
マイシン耐性マーカー（Ｅｒｙｒ）を供与体に導入し
た。後の交配実験では、ＢＭＬ（ＢＣＰ）−Ｓｔｒ
１０００Ｅｒｙ５平板上で対照と交配混合物との選択的
平板培養を行った。これらの平板上では供与体コロニー
の突破（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ）は見られなかっ
た。
【００５７】エリスロマイシン含有寒天上で平板培養し
た交配混合物は非常に弱いラクトース陽性（Ｌａｃ＋）
なコロニーを産生した。前記のコロニー全てをフシジン
酸含有培地でスクリーニングし、この培地で容易に増殖
することを示したコロニーについて株８４２に対する活
性を調べた。株８４２に対する阻害が陽性であるものに
ついて特定のファージに対する感受性を調べた。
た交配混合物は非常に弱いラクトース陽性（Ｌａｃ＋）
なコロニーを産生した。前記のコロニー全てをフシジン
酸含有培地でスクリーニングし、この培地で容易に増殖
することを示したコロニーについて株８４２に対する活
性を調べた。株８４２に対する阻害が陽性であるものに
ついて特定のファージに対する感受性を調べた。
【００５８】２つのコロニーが全てのスクリーニングの
基準を満たした。このことは第２表に示すように転移頻
度が導入した供与細胞につき２．０×１０−９であるこ
とを示した。
基準を満たした。このことは第２表に示すように転移頻
度が導入した供与細胞につき２．０×１０−９であるこ
とを示した。
【００５９】
【表４】
【００６０】しかし、２つの単離物はスクリーニング操
作中、そのＬａｃ＋表現型を損失したが、株８４２に対
する阻害活性を維持していた。それらのプラスミド含量
についての試験によって、どちらの株にもプラスミドが
ないことが示された。
作中、そのＬａｃ＋表現型を損失したが、株８４２に対
する阻害活性を維持していた。それらのプラスミド含量
についての試験によって、どちらの株にもプラスミドが
ないことが示された。
【００６１】それらの株の１つが産生するバクテリオシ
ンを分析して被接合体を更に試験した。まず被接合体の
１つであるＬＬＡ １．２（ｐＧＫ４１）Ｔ１（実験室
名は３０２である）が産生するバクテリオシンを精製し
て、２つの異なるバクテリオシンが存在することを主に
確証した。この２つの株は同一であると考えられた。
ンを分析して被接合体を更に試験した。まず被接合体の
１つであるＬＬＡ １．２（ｐＧＫ４１）Ｔ１（実験室
名は３０２である）が産生するバクテリオシンを精製し
て、２つの異なるバクテリオシンが存在することを主に
確証した。この２つの株は同一であると考えられた。
【００６２】親株由来の精製したＬＬ−１、ＬＬ−２Ａ
及びＬＬ−２Ｂの溶離時間をそれぞれ測定した。２０〜
４０％ＡｃＣＮ勾配を３０分に亘ってかけると、ＬＬ−
２Ａは２６．５′で、ＬＬ−２Ｂは３７′で、ＬＬ−１
は３５′で溶離した。２０〜４０％ＡｃＣＮ勾配をかけ
ると精製した３０２濃縮物には、２６．５′と３８〜４
０′の２つの活性エリアが現れた。これらのエリアのう
ち２番目のものだけが定義したピークと関係があった。
活性画分を単離し、それぞれ３０２Ａ、３０２Ｂと命名
した。この方法を用いて更に実験を行った。終了時に、
５つの異なるＨＰＬＣ実験を行い、各ピークの中心部
（ｈｅａｒｔ ｃｕｔ）（ピークとの関係から決定し
た）をｄＨ２Ｏで０．５ｍｌにし、力価を測定し蛋白濃
度を分析した。それらの純粋な画分を−２０℃で保存し
た。
及びＬＬ−２Ｂの溶離時間をそれぞれ測定した。２０〜
４０％ＡｃＣＮ勾配を３０分に亘ってかけると、ＬＬ−
２Ａは２６．５′で、ＬＬ−２Ｂは３７′で、ＬＬ−１
は３５′で溶離した。２０〜４０％ＡｃＣＮ勾配をかけ
ると精製した３０２濃縮物には、２６．５′と３８〜４
０′の２つの活性エリアが現れた。これらのエリアのう
ち２番目のものだけが定義したピークと関係があった。
活性画分を単離し、それぞれ３０２Ａ、３０２Ｂと命名
した。この方法を用いて更に実験を行った。終了時に、
５つの異なるＨＰＬＣ実験を行い、各ピークの中心部
（ｈｅａｒｔ ｃｕｔ）（ピークとの関係から決定し
た）をｄＨ２Ｏで０．５ｍｌにし、力価を測定し蛋白濃
度を分析した。それらの純粋な画分を−２０℃で保存し
た。
【００６３】精製して得られた種々の精製バクテリオシ
ン物質を比較するために、３０２Ｂと同量のＬＬ−１又
はＬＬ−２Ｂとを合わせた混合物を調製し、どちらのバ
クテリオシンが３０２Ｂと一緒に溶離するか調べた。予
め、０〜４５％ＡｃＣＮ勾配を用いて、ＬＬ−１とＬＬ
−２Ｂは非常に狭い範囲内で溶出するが、２つのピーク
として溶離することがわかっていた。同量のＬＬ−２Ｂ
と３０２Ｂも２つのピークで溶離し、２つの別々のバク
テリオシンが存在することを示した。対照的に、同量の
ＬＬ−１と３０２Ｂは、１つのピークのみで溶離した。
従って、３０２ＢはＬＬ−１と同一であると思われる。
同様の方法で、３０２ＡをＬＬ−２Ａと比較した。分析
的規模では（０〜４５％ＡｃＣＮ，３０′）３０２Ａと
ＬＬ−２Ａとは２７．１′で溶離した。結果を第３表及
び第４表に示す。
ン物質を比較するために、３０２Ｂと同量のＬＬ−１又
はＬＬ−２Ｂとを合わせた混合物を調製し、どちらのバ
クテリオシンが３０２Ｂと一緒に溶離するか調べた。予
め、０〜４５％ＡｃＣＮ勾配を用いて、ＬＬ−１とＬＬ
−２Ｂは非常に狭い範囲内で溶出するが、２つのピーク
として溶離することがわかっていた。同量のＬＬ−２Ｂ
と３０２Ｂも２つのピークで溶離し、２つの別々のバク
テリオシンが存在することを示した。対照的に、同量の
ＬＬ−１と３０２Ｂは、１つのピークのみで溶離した。
従って、３０２ＢはＬＬ−１と同一であると思われる。
同様の方法で、３０２ＡをＬＬ−２Ａと比較した。分析
的規模では（０〜４５％ＡｃＣＮ，３０′）３０２Ａと
ＬＬ−２Ａとは２７．１′で溶離した。結果を第３表及
び第４表に示す。
【００６４】
【表５】
【００６５】
【表６】 付記：同量のＬＬ−１とＬＬ−２Ｂとを混合すると２つ
のピークが得られた； 同量の３０２ＢとＬＬ−１とを混合すると１つのピーク
が得られた； 同量の３０２ＢとＬＬ−２Ｂとを混合すると２つのピー
クが得られた； 同量のＬＬ−２Ａと３０２Ａとを混合すると１つのピー
クが得られた。
のピークが得られた； 同量の３０２ＢとＬＬ−１とを混合すると１つのピーク
が得られた； 同量の３０２ＢとＬＬ−２Ｂとを混合すると２つのピー
クが得られた； 同量のＬＬ−２Ａと３０２Ａとを混合すると１つのピー
クが得られた。
【００６６】交配によって２つの異なるバクテリオシン
活性が発現され、１つはＬＬ−１であると思われ、もう
一方はＬＬ−２Ａに匹敵し、２つのバクテリオシンのう
ち弱い方がＬＬＡ ２．０バクテリオシン産生に関連が
あった。従って、ＬＬＡ ２．０由来のＢａｃ＋遺伝子
はＬＬＡ １．２の染色体に上手く組み込まれ、バクテ
リオシンＬＬ−２Ａの産生によって証明されるように部
分的に表現型を発現する。
活性が発現され、１つはＬＬ−１であると思われ、もう
一方はＬＬ−２Ａに匹敵し、２つのバクテリオシンのう
ち弱い方がＬＬＡ ２．０バクテリオシン産生に関連が
あった。従って、ＬＬＡ ２．０由来のＢａｃ＋遺伝子
はＬＬＡ １．２の染色体に上手く組み込まれ、バクテ
リオシンＬＬ−２Ａの産生によって証明されるように部
分的に表現型を発現する。
【００６７】３０２培地からの精製された単離物中には
バクテリオシンＬＬ−２Ｂは検出されなかった。ＬＬＡ
２．０培地から単離した精製ＬＬ−２ＢはＨＰＬＣク
ロマトグラムでは単一ピークを有し、時間が経つとＬＬ
−２Ａと同じ位置に溶離する第２の物質を形成する。精
製ＬＬ−２Ａは、クロマトグラムではずっと単一ピーク
として現れていたため、時間が経っても安定であると思
われる。これらの結果から、ＬＬ−２ＡとＬＬ−２Ｂは
関連があり、その関係はＬＬ−２ＡがＬＬ−２Ｂの分子
構造の不可逆的変化の生成物であるか、ＬＬ−２ＡがＬ
Ｌ−２Ｂのゆっくり形成されるがずっと安定なコンフォ
ーメーションに相当するかのいずれかであるという結論
に達し得る。従って３０２培地の単離物中のＬＬ−２Ａ
の存在は、たとえ最後の分析時に検出されなかったとし
ても、それより前のどこかの地点で親株ＬＬ−２Ｂの蛋
白が存在することの間接的な証拠と解釈される。
バクテリオシンＬＬ−２Ｂは検出されなかった。ＬＬＡ
２．０培地から単離した精製ＬＬ−２ＢはＨＰＬＣク
ロマトグラムでは単一ピークを有し、時間が経つとＬＬ
−２Ａと同じ位置に溶離する第２の物質を形成する。精
製ＬＬ−２Ａは、クロマトグラムではずっと単一ピーク
として現れていたため、時間が経っても安定であると思
われる。これらの結果から、ＬＬ−２ＡとＬＬ−２Ｂは
関連があり、その関係はＬＬ−２ＡがＬＬ−２Ｂの分子
構造の不可逆的変化の生成物であるか、ＬＬ−２ＡがＬ
Ｌ−２Ｂのゆっくり形成されるがずっと安定なコンフォ
ーメーションに相当するかのいずれかであるという結論
に達し得る。従って３０２培地の単離物中のＬＬ−２Ａ
の存在は、たとえ最後の分析時に検出されなかったとし
ても、それより前のどこかの地点で親株ＬＬ−２Ｂの蛋
白が存在することの間接的な証拠と解釈される。
【００６８】各精製バクテリオシンＬＬ−１、ＬＬ−２
Ａ、ＬＬ−２Ｂ、３０２Ａ及び３０２Ｂを用いて、ラク
トバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃ
ａｓｅｉ）８４２の阻害について試験した。細胞全体に
ついてのその前の試験では、系ＬＬＡ ２．０（ＬＬ−
２を産生する）又は３０２（ＬＬ−１とＬＬ−２とを産
生する）が存在する時には阻害が示されたが、系ＬＬＡ
１．２（ＬＬ−１を産生する）が存在する時には阻害
は示されなかった。対照的に、６４００ＡＵ／ｍｌの精
製バクテリオシン５μｌをスポットしたとき、ＬＬ−
１、ＬＬ−２Ｂ及び３０２Ｂはラクトバチラス・カゼイ
（Ｌ．ｃａｓｅｉ）８４２の増殖を阻害したが、ＬＬ−
２Ａ及び３０２Ａは阻害しなかった。明らかに、３０２
細胞系はラクトバチラス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）８
４２に対する抗菌活性の点でＬＬＡ１．２細胞系より効
果的である。精製バクテリオシンに関する阻害実験によ
ると、３０２細胞バクテリオシン産生のＬＬ−１成分の
みが、ラクトバチラス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）８４
２に対して活性である。このことから、交配実験の結果
として遺伝子修飾が起こると、ＬＬ−１を介したラクト
バチラス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）８４２に対する活
性の有効性が、ＬＬＡ １．２細胞に比べ増加すると結
論付けられる。結果を第５表に示す。
Ａ、ＬＬ−２Ｂ、３０２Ａ及び３０２Ｂを用いて、ラク
トバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃ
ａｓｅｉ）８４２の阻害について試験した。細胞全体に
ついてのその前の試験では、系ＬＬＡ ２．０（ＬＬ−
２を産生する）又は３０２（ＬＬ−１とＬＬ−２とを産
生する）が存在する時には阻害が示されたが、系ＬＬＡ
１．２（ＬＬ−１を産生する）が存在する時には阻害
は示されなかった。対照的に、６４００ＡＵ／ｍｌの精
製バクテリオシン５μｌをスポットしたとき、ＬＬ−
１、ＬＬ−２Ｂ及び３０２Ｂはラクトバチラス・カゼイ
（Ｌ．ｃａｓｅｉ）８４２の増殖を阻害したが、ＬＬ−
２Ａ及び３０２Ａは阻害しなかった。明らかに、３０２
細胞系はラクトバチラス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）８
４２に対する抗菌活性の点でＬＬＡ１．２細胞系より効
果的である。精製バクテリオシンに関する阻害実験によ
ると、３０２細胞バクテリオシン産生のＬＬ−１成分の
みが、ラクトバチラス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）８４
２に対して活性である。このことから、交配実験の結果
として遺伝子修飾が起こると、ＬＬ−１を介したラクト
バチラス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）８４２に対する活
性の有効性が、ＬＬＡ １．２細胞に比べ増加すると結
論付けられる。結果を第５表に示す。
【００６９】
【表７】 ａラクトバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｃａｓｅｉ）株８４２の阻害ｂ バクテリオシンを力価６４００ＡＵ／ｍｌに調製し
た。
ｓ ｃａｓｅｉ）株８４２の阻害ｂ バクテリオシンを力価６４００ＡＵ／ｍｌに調製し
た。
【００７０】実施例２ ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ＮＲ
ＲＬ−Ｂ−１８９２２のラクトバチラス・カゼイ（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）８４２に対する
抑制活性を、発酵させた牛乳ベースのサラダドレッシン
グに変えることもできるサワークリームディップ系で試
験した。この系は問題の微生物を補助的貯蔵期間延長剤
として使用し得ることから、特に選んだものである。ラ
クトバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃａｓｅｉ）８４２はカビを阻害することが以前にＫｉ
ｎｇ等によって示されている（米国特許第４，５６，１
７７号）。しかしこのカビを阻害するラクトコッカス
（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）は牛乳ベースのディップ
及びドレッシング混合物中で過剰量の乳酸を産生する
と、酸味が強くなり過ぎホエーが分離し（ｗｈｅｙｉｎ
ｇ−ｏｆｆ）層分離が起こる。よって、このような系で
の酸の産生及びラクトバチラス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅ
ｉ）８４２の増殖を、そのカビ抑制活性に影響を及ぼさ
ずに調節する必要がある。被接合体ＮＲＲＬ−Ｂ−１８
９２２がラクトバチラス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）８
４２を阻害するため、本実施例ではサワークリームディ
ップ系におけるそれらの相互作用について試験した。
ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ＮＲ
ＲＬ−Ｂ−１８９２２のラクトバチラス・カゼイ（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）８４２に対する
抑制活性を、発酵させた牛乳ベースのサラダドレッシン
グに変えることもできるサワークリームディップ系で試
験した。この系は問題の微生物を補助的貯蔵期間延長剤
として使用し得ることから、特に選んだものである。ラ
クトバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃａｓｅｉ）８４２はカビを阻害することが以前にＫｉ
ｎｇ等によって示されている（米国特許第４，５６，１
７７号）。しかしこのカビを阻害するラクトコッカス
（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）は牛乳ベースのディップ
及びドレッシング混合物中で過剰量の乳酸を産生する
と、酸味が強くなり過ぎホエーが分離し（ｗｈｅｙｉｎ
ｇ−ｏｆｆ）層分離が起こる。よって、このような系で
の酸の産生及びラクトバチラス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅ
ｉ）８４２の増殖を、そのカビ抑制活性に影響を及ぼさ
ずに調節する必要がある。被接合体ＮＲＲＬ−Ｂ−１８
９２２がラクトバチラス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）８
４２を阻害するため、本実施例ではサワークリームディ
ップ系におけるそれらの相互作用について試験した。
【００７１】手順：店から新鮮なサワークリームを購入
した。４つのネジ口ジャーにサワークリーム１００ｇず
つを秤量して入れた。それぞれに、ランチフレーバー
（Ｒａｎｃｈ Ｆｌａｖｏｒ）スパイス混合物５．０ｇ
を加え、スパーテルで完全に混合した。ジャーに１、
２、３及び４とラベルを付けた。ジャー１を微生物を何
も加えない対照とした。ジャー２には新鮮な牛乳中で培
養したラクトバチラス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）８４
２を十分に希釈したものを１×１０５〜１×１０６ｃｆ
ｕ／ｇとなるように加えた。ジャー３には、ラクトコッ
カス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔ
ｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−
１８９２２の新鮮な培養物の希釈物を１×１０３〜１×
１０４ｃｆｕ／ｇ存在するように加えた。ジャー４に
は、ジャー２と同じ量のラクトバチラス・カゼイ（Ｌ．
ｃａｓｅｉ）８４２とジャー３と同じ量のＮＲＲＬ−Ｂ
−１８９２２とを混合物として加えた。全てのジャーを
４つの別々のスパーテルで完全に混合した。本実施例で
使用したラクトバチラス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）８
４２株は染色体リファマイシン耐性マーカーを含んでい
た。被接合体ＮＲＲＬ−Ｂ−１８９２２はエリスロマイ
シン耐性プラスミドを含んでいた。株にマーカーをつけ
ることによって、スパイス混合物を含むサワークリーム
中に他の細菌叢が存在していても２つの株を選択的に数
えることができるだけでなく、両方の株を含む混合物、
すなわちジャー４のような混合物中の２つの株を選択的
に数えることができる。
した。４つのネジ口ジャーにサワークリーム１００ｇず
つを秤量して入れた。それぞれに、ランチフレーバー
（Ｒａｎｃｈ Ｆｌａｖｏｒ）スパイス混合物５．０ｇ
を加え、スパーテルで完全に混合した。ジャーに１、
２、３及び４とラベルを付けた。ジャー１を微生物を何
も加えない対照とした。ジャー２には新鮮な牛乳中で培
養したラクトバチラス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）８４
２を十分に希釈したものを１×１０５〜１×１０６ｃｆ
ｕ／ｇとなるように加えた。ジャー３には、ラクトコッ
カス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔ
ｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−
１８９２２の新鮮な培養物の希釈物を１×１０３〜１×
１０４ｃｆｕ／ｇ存在するように加えた。ジャー４に
は、ジャー２と同じ量のラクトバチラス・カゼイ（Ｌ．
ｃａｓｅｉ）８４２とジャー３と同じ量のＮＲＲＬ−Ｂ
−１８９２２とを混合物として加えた。全てのジャーを
４つの別々のスパーテルで完全に混合した。本実施例で
使用したラクトバチラス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）８
４２株は染色体リファマイシン耐性マーカーを含んでい
た。被接合体ＮＲＲＬ−Ｂ−１８９２２はエリスロマイ
シン耐性プラスミドを含んでいた。株にマーカーをつけ
ることによって、スパイス混合物を含むサワークリーム
中に他の細菌叢が存在していても２つの株を選択的に数
えることができるだけでなく、両方の株を含む混合物、
すなわちジャー４のような混合物中の２つの株を選択的
に数えることができる。
【００７２】均一に配合した直後に加えた細菌の数を測
定した。ＮＲＲＬ−Ｂ−１８９２２の数を数えるのに
は、エリスロマイシン５μｇ／ｍｌ含有ＡＰＴ−寒天を
使用した。ラクトバチラス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）
８４２の数を数えるのには、リファマイシン２００μｇ
／ｍｌ含有ＭＲＳ−寒天を使用した。試料を室温に１週
間保ち、毎日視覚的な外観、香気及び臭気を調べた。１
週間経過したら、菌数を数えｐＨを測定した。
定した。ＮＲＲＬ−Ｂ−１８９２２の数を数えるのに
は、エリスロマイシン５μｇ／ｍｌ含有ＡＰＴ−寒天を
使用した。ラクトバチラス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）
８４２の数を数えるのには、リファマイシン２００μｇ
／ｍｌ含有ＭＲＳ−寒天を使用した。試料を室温に１週
間保ち、毎日視覚的な外観、香気及び臭気を調べた。１
週間経過したら、菌数を数えｐＨを測定した。
【００７３】結果：
【表８】
【００７４】７日の終了時のジャー１及び３のｐＨは、
カビが増殖しているのが目で分かったので測らなかっ
た。非常に酸っぱい匂いのしたジャー２のｐＨは３．８
であった。良好なランチの香気を維持したジャー４のｐ
Ｈは４．０であった。結論：ラクトバチラス・カゼイ
（Ｌ．ｃａｓｅｉ）自身を加えるとカビの増殖を抑制し
たが、ランチディップを室温に７日間置いた時には酸が
過剰に蓄積していた。何も加えなかったり、ＮＲＲＬ−
Ｂ−１８９２２のみを加えた場合は、スパイス混合物か
らのカビによる汚染は抑制されずに視覚的外観に影響を
及ぼし、ディップをカビ臭くした。ＮＲＲＬ−Ｂ−１８
９２２が存在すると、ラクトバチラス・カゼイ（Ｌ．ｃ
ａｓｅｉ）８４２はカビの発育を阻害した。同時に、ラ
クトコッカス（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ）のラクトバチラ
ス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）に対する阻害活性は、
ラクトバチラス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）の数の無
制限な増加を防ぎ、過剰に乳酸が蓄積するのを抑制し
た。ジャー４の視覚的外観、香気及び臭気は正常であっ
た。
カビが増殖しているのが目で分かったので測らなかっ
た。非常に酸っぱい匂いのしたジャー２のｐＨは３．８
であった。良好なランチの香気を維持したジャー４のｐ
Ｈは４．０であった。結論：ラクトバチラス・カゼイ
（Ｌ．ｃａｓｅｉ）自身を加えるとカビの増殖を抑制し
たが、ランチディップを室温に７日間置いた時には酸が
過剰に蓄積していた。何も加えなかったり、ＮＲＲＬ−
Ｂ−１８９２２のみを加えた場合は、スパイス混合物か
らのカビによる汚染は抑制されずに視覚的外観に影響を
及ぼし、ディップをカビ臭くした。ＮＲＲＬ−Ｂ−１８
９２２が存在すると、ラクトバチラス・カゼイ（Ｌ．ｃ
ａｓｅｉ）８４２はカビの発育を阻害した。同時に、ラ
クトコッカス（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ）のラクトバチラ
ス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）に対する阻害活性は、
ラクトバチラス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）の数の無
制限な増加を防ぎ、過剰に乳酸が蓄積するのを抑制し
た。ジャー４の視覚的外観、香気及び臭気は正常であっ
た。
【００７５】前記の記述は単に本発明を例示するもので
あり、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される
と意図される。
あり、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される
と意図される。
【図１】プラスミドｐＳＲＱ４００を好適な受容体ラク
トコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）株に交配するス
テップを示す概略図である。
トコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）株に交配するス
テップを示す概略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡ Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ピーター・エイ・バンデンバーグ アメリカ合衆国、フロリダ・33583、サラ ソタ、メドウクリーク・サークル・4414
Claims (8)
- 【請求項１】 ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）より選択され、ラクト
コッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａ
ｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９（ＬＬＡ ２．
０）由来のバクテリオシンをコードするＤＮＡを含む群
エヌ・ラクトコッカス（Ｎ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）
種であって、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０
９由来のバクテリオシンと共にラクトコッカス（Ｌａｃ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ）種の親株由来の他のバクテリオシン
をコードするラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ）種。 - 【請求項２】 ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａ
ｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８９２２。 - 【請求項３】 供与株であるラクトコッカス・ラクティ
ス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ
−Ｂ−１８８０９由来のバクテリオシンと、受容株であ
るラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８５３５由来のバ
クテリオシンとをコードするＤＮＡを含むラクトコッカ
ス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
ｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）。 - 【請求項４】 食品中に、亜種ラクトコッカス・ラクテ
ィス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）より選
択され、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９由
来のバクテリオシンをコードするＤＮＡを含む群エヌ・
ラクトコッカス（Ｎ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種であ
って、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃ
ｃｕｓｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９由来の
バクテリオシンと共にラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ）種の親株由来の他のバクテリオシンをコード
するラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種の細
胞を供給することから成る食品中に汚染菌として存在す
るラクトバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｃａｓｅｉ）の増殖に対する食品の予防方法であっ
て、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種を食
品中に供給し、細胞数がラクトバチラス・カゼイ（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）を阻害するのに
十分である前記方法。 - 【請求項５】 被接合体がラクトコッカス・ラクティス
（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクテ
ィス（ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８９２２である
請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ）が、供与株であるラクトコッカス・ラクティス（Ｌ
ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−
１８８０９由来のバクテリオシンと、受容株であるラク
トコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌ
ａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８５３５由来のバクテリ
オシンとをコードするＤＮＡを含む請求項４に記載の方
法。 - 【請求項７】 食品中に、（Ａ）ニシン様バクテリオシ
ンを産生するラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）の細胞と（Ｂ）ラクトコ
ッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃ
ｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９の細胞とを、ラクト
バチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａ
ｓｅｉ）及び他の汚染細菌を阻害するのに十分な量供給
することから成る、食品中に汚染菌として存在するラク
トバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃ
ａｓｅｉ）の増殖に対する食品の予防方法。 - 【請求項８】 （Ａ）ニシン様バクテリオシンを産生す
るラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８５３５の細
胞と（Ｂ）ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃ
ｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９の
細胞とを、食品中のラクトバチラス・カゼイ（Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）を阻害するのに十分
な量で含む細菌組成物。
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