JPH08208515A - リウマチ治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 滑膜細胞にアポトーシスを誘導して、滑膜細
胞の異常増殖を特異的に抑制するリウマチ治療剤を提供
する。 【解決手段】 本発明リウマチ治療剤は、リウマチ患者
の滑膜細胞のＦａｓ抗原と特異的に反応し、滑膜細胞に
アポトーシスを発現させる抗Ｆａｓモノクローナル抗体
を有効或分とする。該抗Ｆａｓモノクローナル抗体は好
ましくはヒト型Ｆａｓ抗原と特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体で、代表例は、ヒト二倍体繊維芽細胞により
免疫して得られたクローンから産生されたもの、詳しく
は、ヒト二倍体繊維芽細胞をマウスに免疫した後、その
脾細胞とマウスミエローマ細胞とを融合させて得られた
ｃｌｏｎｅ ＣＨ−１１から産生されたものである。又
本発明リウマチ治療剤は抗Ｆａｓモノクローナル抗体と
アクチノマイシンＤ等の細胞増殖抑制剤との組み合わせ
を有効成分とする。好適な投与形態は関節注入剤であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗Ｆａｓモノクロ
ーナル抗体または抗Ｆａｓモノクローナル抗体と細胞増
殖抑制作用を有する薬物との組み合わせを有効成分とす
るリウマチ治療剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】リウマチ、特に慢性関節リウマチ（Ｒ
Ａ）は、内的、外的要因によって引き起こされる種々の
免疫学的異常を伴う滑膜細胞の増殖を基礎病変とする疾
患群であり、炎症性細胞浸潤および骨の侵食（骨の粗鬆
化、さらには骨の侵食像の発現）を伴う滑膜細胞の増殖
異常と考えられている。ＲＡはまた、増殖性滑膜細胞の
退行と、それに続く繊維性組織へのリプレイスメント
（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）とによって特徴付けられる
が（Ｆａｓｓｂｅｎｄｅｒ ＢＧ：Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ
ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｂｅ
ｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−
Ｖｅｒｌａｇ，１９７５）、その退行ならびにリプレイ
スメントの機構はいまだ不明な部分が多い。しかしなが
ら、ＲＡにおける罹患関節を中心とする組織破壊は、炎
症性滑膜細胞からのサイトカインの産生異常、過剰放出
がその成因であろうとされている。

【０００３】このように滑膜細胞は、ＲＡにおいて重要
な役割を担っている。例えば、リウマチ患者の関節の状
態を調べると、滑膜絨毛の増生や滑膜細胞の多層化など
がみられ、滑膜細胞が異常に増殖している（Ｄａｎｉｅ
ｌ Ｊ．ＭｃＣａｒｔｙ著，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎ
ｄ ａｌｌｉｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，Ａ ｔｅｘ
ｔｂｏｏｋ ｏｆ ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ １１
版）。これらの滑膜細胞の異常増殖を抑制することがで
きれば、その薬物はリウマチの治療剤となると考えられ
る。

【０００４】現在、リウマチの薬物治療には、ステロイ
ドなどの抗炎症剤、金剤、免疫調節剤などが用いられて
いるが、滑膜細胞の異常増殖を特異的に抑制する薬物は
未だ知られていない。

【０００５】一方、Ｋｅｒｒらは壊死とは異なり、正常
な細胞交代のためなどに生じる生理的な細胞死のことを
アポトーシスと名づけた（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２
６，２３９（１９７２））。このアポトーシスはプログ
ラム細胞死の一つの形態である。細胞の壊死は、高熱、
抗体と補体による攻撃あるいは化学的要因によって細胞
膜内容物の放出などを伴う過程を経るが、プログラム細
胞死は、生体内においてあらかじめ死滅るべくプログラ
ム化されているある種の細胞群にみられる細胞死であ
り、細胞表面の湾曲、核クロマチンの凝縮、染色体ＤＮ
Ａの断片化といった現象を伴うアポトーシスと称される
過程を経る。

【０００６】最近、免疫担当細胞のアポトーシスに関与
する細胞膜分子であるＦａｓ抗原に対する抗Ｆａｓモノ
クローナル抗体が米原らによって報告された（Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．，１６９，１７４７（１９８９））。ま
た、Ｋｒａｍｍｅｒらによってアポトーシスを伴う抗原
と特異的に結合する抗体として抗ＡＰ０−１抗体が報告
された（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５，３０１（１９８
９））が、後になってこれらが認識する抗原は同一のも
のであることが確認されている（Ｃｅｌｌ，６６，２３
３（１９９１））。

【０００７】抗Ｆａｓ抗体の医薬への応用について種々
の研究がなされており、エイズや腫瘍の治療剤となるこ
とが報告されている（特開平２−２３７９３５，特表平
５−５０３２８１）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、リウマ
チの病因は炎症性細胞の浸潤と骨の破壊を伴う滑膜細胞
の増殖とによって特徴付けられるが、滑膜細胞の増殖は
無制限に生じるものでは無く、自発抑制することが認め
られている。そこでまず、リウマチ患者の滑膜組織の変
性がどのように生じ、それがプログラム細胞死（アポト
ーシス）で調節されているかどうかを研究し、さらに滑
膜細胞にＦａｓ抗原が存在するかどうかを研究する必要
がある。これらの研究が本発明の理論的裏付けをするた
めの課題である。

【０００９】本発明の主題は、抗Ｆａｓモノクローナル
抗体のリウマチ治療剤、特に慢性関節リウマチ治療剤と
しての用途を開発することにあるが、そのためには以下
の研究課題がある。

【００１０】１） 抗Ｆａｓモノクローナル抗体がＲＡ
の滑膜細腹に特異的にアポトーシスを起すかどうか、 ２） 抗Ｆａｓモノクローナル抗体がヒトのＲＡに対し
て有効であるかどうか、および、 ３） 抗Ｆａｓモノクローナル抗体が他の細胞、臓器に
対して悪影響を及ぼさないかどうか。

【００１１】すなわち、ＲＡの滑膜細胞においてアポト
ーシスが観察され、その滑膜細胞に特異的にアポトーシ
スを起させることにより、滑膜細胞の異常増殖を抑制で
き、しかも、ヒトのＲＡに対する有効性を予見でき、他
の細胞、臓器に対して悪影響を及ぼさない薬物であれ
ば、リウマチの根本的治療剤になると考えられる。

【００１２】ところが、滑膜細胞にアポトーシスを誘導
する薬物は未だ知られておらず、滑膜細胞の異常増殖を
特異的に抑制する薬物を見い出すことは重要な課題であ
った。

【００１３】

【課題を解決するための手段】この課題を解決するべ
く、本発明者らはまずＲＡ患者の滑膜組織の変性を観察
し、滑膜細胞にアポトーシスが発現することおよび滑膜
細胞にＦａｓ抗原が発現することを見い出し、次いでＲ
Ａ患者の異常増殖した滑膜細胞に抗Ｆａｓモノクローナ
ル抗体を加えることにより、その異常増殖した滑膜細胞
にアポトーシスが誘導されるかどうかについて検討を行
なった。その結果、ＲＡ患者の異常増殖した滑膜細胞は
ＲＡ患者以外の滑膜細胞と比較してアポトーシスを生じ
る割合が格段に高かった。この結果は、抗Ｆａｓモノク
ローナル抗体は正常な滑膜細胞に対する作用は少なく、
異常増殖している滑膜細胞を特異的にアポトーシスへと
導くことができることを示したものである。

【００１４】本発明は特にヒト型Ｆａｓ抗原と特異的に
反応する抗Ｆａｓモノクローナル抗体に関するものであ
り、その臨床的効果を調べるにはこれをヒトに投与する
必要があるが、ヒトに対しての投与は簡単には行なえな
い。そこで、マウスＦａｓ抗原により免疫して得られる
マウス抗Ｆａｓ抗体をマウスに投与しその効果を調べる
ことにより、ヒトに対する効果を予見することに成功し
た。さらに、本発明に係る抗Ｆａｓモノクローナル抗体
が他の細胞、臓器に悪影響を及ぼさないかどうか検討し
たところ、特に問題がないことが判った。

【００１５】さらに、抗Ｆａｓモノクローナル抗体に細
胞増殖抑制作用を有する薬物であるアクチノマイシンＤ
を添加すると、ＲＡ患者の滑膜細胞のアポトーシスを生
じる比率を高めることもわかった。

【００１６】

【発明の開示】本発明は抗Ｆａｓモノクローナル抗体ま
たは抗Ｆａｓモノクローナル抗体と細胞増殖抑制作用を
有する薬物との組み合わせを有効成分とするリウマチ治
療剤に関する。

【００１７】より詳しく説明すれば、本発明でいう抗Ｆ
ａｓモノクローナル抗体とは、ＲＡ患者の滑膜細胞にお
けるＦａｓ抗原、特にヒト型Ｆａｓ抗原と特異的に反応
し、滑膜細胞にアポトーシスを発現させるものである。

【００１８】本発明において使用される抗Ｆａｓモノク
ローナル抗体は、例えばヒト二倍体繊維芽細胞により免
疫して得られたクローンから産生されたものである。こ
れは例えば米原らの方法（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６
９，１７４７（１９８９））に従って作成すればよく、
具体的試験にはヒト二倍体繊維芽細胞ＦＳ−７で免疫し
たＢＡＬＢ／Ｃマウスの牌細胞とマウスミエローマ細胞
（ＮＳ−１）とを細胞融合させて得られたハイプリドー
マ「ｃｌｏｎｃ ＣＨ−１１」から産生されたものを用
いた。この抗Ｆａｓモノクローナル抗体は株式会社医学
生物学研究所より市販されている。この市販品の性状
は、「ｃｌｏｎｅ ＣＨ−１１」をＢＡＬＢ／Ｃマウス
に播種して得られた腹水をアフィニティー・クロマトグ
ラフィーで精製したＩｇＭ分画である。

【００１９】また、米原らの方法で用いられたＦＳ−７
の代わりに、ヒト型Ｆａｓ抗原を用い、以下米原らの方
法と同様にして調製した抗Ｆａｓモノクローナル抗体
（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８，２２３１（１９９
３））を用いることもできる。

【００２０】本発明における各種試験で用いた抗Ｆａｓ
モノクローナル抗体は上記で説明したものであるが、そ
のＶ（ｖａｒｉａｂｌｅ）領域をマウスのまま保持し、
その他のＣ（ｃｏｎｓｔａｎｔ）領域をヒト由来のもの
に置き換え（キメラ抗体）て使用することもでき、ま
た、ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔ
ｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）領域のみをマウスの
まま残し、他の全ての領域をヒト由来のものに置き換え
（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ抗体）て使用することもでき
る。

【００２１】キメラ抗体やＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ抗体
への変換は公知の方法（Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３
１，１０７７（１９９０）；Ｎａｔｕｒｅ，３４９，２
９３（１９９１）など）に従って行なうことができる。

【００２２】本発明では、ヒト型Ｆａｓ抗原と特異的に
反応し、滑膜細胞にアポトーシスを発現させる抗Ｆａｓ
モノクローナル抗体を利用することにより、リウマチを
治療することが目的であって、抗体の活性領域が保持さ
れておればどのような変換体であっても本発明に包含さ
れる。

【００２３】リウマチ患者において生じている関節の滑
膜細胞にアポトーシスを生じさせ、異常増殖を抑制でき
れば優れたリウマチの治療剤となると考えられる。

【００２４】そこで、本発明者らはまずリウマチ患者の
滑膜細胞においてアポトーシスの発現の有無を調べるべ
く、慢性関節リウマチ患者（ＲＡ患者）および比較とし
て変形関節症患者（ＯＡ患者）から得られた滑膜組織サ
ンプルでＤＮＡの断片化が生じているかどうかを調べ
た。

【００２５】その結果、アポトーシスとして特徴付けら
れるＤＮＡの断片化は、ＲＡ患者においてのみ観察さ
れ、ＯＡ患者には認められなかった。ＲＡ患者から得ら
れた滑膜におけるＤＮＡの断片化形成を起こす細胞は滑
膜液の付着滑膜細胞であって、浸潤細胞ではなかった。
この知見は電子顕微鏡解析およびアポトーシス細胞死と
しての特徴をとらえるｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉ
ｎｇ法でも支持された。

【００２６】電子顕徴鏡によりＲＡ患者の滑膜組織の変
性を観察したところ、ＲＡ患者の滑膜組織では典型的な
アポトーシス滑膜細胞が確認され、組織マクロファージ
類似細胞である滑膜Ａタイプ細胞に隣接していた。かか
る現象は、アポトーシス細胞はマクロファージなどと隣
接している（Ｓａｖｉｌｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａ
ｙ １４，１３１（１９９３））というアポトーシスの
病理学と一致していた。

【００２７】さらに、ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉ
ｎｇ法により、ビオチン化ｄＵＴＰ−ラベル化した細胞
は、滑液繊維芽細胞であり、ＲＡ滑膜中の浸潤単核細胞
ではないことが確認された。この陽性細胞は、主として
滑膜組織内膜に認められたが、これらの結果は、ＲＡ滑
膜細胞が、その場でアポトーシスを生じていることを示
すものである。一方、ＯＡ患者では陽性細胞は認められ
なかった。

【００２８】次に、滑膜細胞でＦａｓ抗原が検出される
かどうかを調べるため、培養リウマチ性滑膜細胞を用い
フローサイトメトリー分析を行なった結果、Ｆａｓ抗原
が検出された。

【００２９】以上の結果から、ＲＡ患者の滑膜細胞でア
ポトーシスが生じており、しかもＦａｓ抗原がそれに関
与することが示唆された。

【００３０】次に、ＲＡ患者から採取した関節の滑膜細
胞に抗Ｆａｓモノクローナル抗体を加え、滑膜細胞にア
ポトーシスが生じるかどうかの実験を行なった。詳細な
データは後述の試験の項に示すが、抗Ｆａｓモノクロー
ナル抗体を添加するとＲＡ患者以外の滑膜細胞がほとん
どアポトーシスを生じないのに対し、ＲＡ患者の滑膜細
胞では抗Ｆａｓモノクローナル抗体の濃度に依存してア
ポトーシスが生じる割合が増加した。この結果は、抗Ｆ
ａｓモノクローナル抗体は正常細胞には実質的に作用せ
ず、異常増殖している滑膜細胞を特異的にアポトーシス
に導くことができることを示したものである。

【００３１】また、抗Ｆａｓモノクローナル抗体は細胞
増殖抑制作用を有する薬物と併用するとその効果が増大
することが期待される。細胞増殖抑制作用を有する薬物
としては、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、シ
クロヘキシミド、インターフェロンγなどが挙げられる
が、その代表例としてアクチノマイシンＤを抗Ｆａｓモ
ノクローナル抗体に加え、得られた混合物をＲＡ患者の
滑膜細胞に添加する実験を行なった結果、アポトーシス
を生じる割合が著しく増加することを見い出した。

【００３２】本発明に係る抗Ｆａｓモノクローナル抗体
のヒトにおける臨床効果を予見するため、ハムスターを
マウスＦａｓ抗原により免疫させ、その牌細胞とマウス
ミエローマ細胞とを融合させた「ｃｌｏｎｅ ＲＫ−
８」から産生させた抗マウスＦａｓモノクローナル抗体
（株式会社医学生物学研究所）をマウス病態モデルに投
与したところ、明確な治癒効果が認められた。このこと
は、本発明に係る抗Ｆａｓモノクローナル抗体のヒトに
おける臨床効果を十分予見させるものである。

【００３３】また、この抗マウスＦａｓモノクローナル
抗体をマウスの後肢関節腹腔内に注入し（５μｇ／マウ
ス）毒性発現を検討したところ、胸腺、腎臓、肺、脾臓
および心臓には異常は観察されず、本発明に係る抗Ｆａ
ｓモノクローナル抗体が他の細胞、臓器に実質上悪影響
を及ぼさないことがわかった。

【００３４】本発明における抗Ｆａｓモノクローナル抗
体は、ＲＡ患者の滑膜細胞におけるＦａｓ抗原と特異的
に反応し、滑膜細胞にアポトーシスを発現させる特性を
有することが必須要件となる。ところで、抗Ｆａｓモノ
クローナル抗体と称されるものであっても本発明の必須
要件を満足するものと満足しないものとがあることを見
い出した。例えば、ヒトＦａｓ抗原ｃＤＮＡで形質転換
したマウス細胞より得たリコンビナントＦａｓ抗原をマ
ウスに免疫した後、その脾細胞とマウスミエローマ細胞
とを融合させたハイブリドーマ「ｃｌｏｎｅＺＢ４」か
ら得た抗Ｆａｓモノクローナル抗体を用い、これがＲＡ
患者の滑膜細胞にアポトーシスを発現させるかどうか検
討したところ、実質的にアポトーシスを発現しないこと
を見い出した。さらに、この抗体は単にアポトーシスを
発現しないだけでなく、アポトーシスを発現する抗Ｆａ
ｓモノクローナル抗体の作用を打ち消す作用も示すこと
を見い出した。

【００３５】この結果は、本発明における抗Ｆａｓモノ
クローナル抗体の定義として上記に述べた定義が適切で
あることを裏付けるものである。尚、アポトーシスを発
現するものの例として「ｃｌｏｎｅＣＨ−１１」より産
生された抗体（株式会社医学生物学研究所）、ａｎｔｉ
−ＡＰＯ−１／Ｆａｓ（ｉｎｄｕｃｉｎｇ）と名付けら
れた抗体（Ｂｅｎｄｅｒ＋Ｃｏ Ｇｅｓ ｍｂＨ）など
があるが、本発明における抗Ｆａｓモノクローナル抗体
は上述の特性を有するものであればよく、これらの例に
限定されるものではない。

【００３６】抗Ｆａｓモノクローナル抗体の投与には、
通常、膝、肩などの関節に関節注入剤の形態でこれを注
射する方法が採られるが、経口投与や直腸内投与などの
方法を用いてもよい。抗Ｆａｓモノクローナル抗体の投
与量は症状や剤型などによって決められるが、注射剤で
あれば０．０００１〜１．０重量％のものを０．１〜１
０ｍｌ程度用いればよく、経口剤であれば通常１日０．
００１〜１０ｍｇを１回または数回に分けて投与すれば
よい。また、細胞増殖抑制作用を有する薬物の投与量は
注射剤であれば０．００００１〜０．１重量％、経口剤
であれば通常１日０．０００１〜１ｍｇを抗Ｆａｓモノ
クローナル抗体に添加すればよい。

【００３７】抗Ｆａｓモノクローナル抗体の製剤は、常
法により調製することができる。注射剤の場合であれ
ば、抗Ｆａｓモノクローナル抗体に必要に応じて塩化ナ
トリウムなどの浸透圧調整剤、リン酸ナトリウムなどの
ｐＨ調整剤、ポリソルベート８０などの界面活性剤、メ
チルセルロースなどの増粘剤などの通常用いられる賦形
剤を加え、注射用の蒸留水に溶解すればよい。また、用
時溶解の形を用いてもよい。錠剤の場合であれば、抗Ｆ
ａｓモノクローナル抗体に必要に応じて乳糖などの増量
剤、結晶セルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合
剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤などの通常
用いられる賦形剤を加えて調製すればよい。また、薬物
を患部に効果的に移行できるリポ化製剤、すなわち特開
昭６０−５１１０５、５８−２０１７１２などに開示さ
れているような脂肪乳剤に包含させたものも使用でき
る。以下に処方例を実施例として示す。

【００３８】

【発明の実施の形態】本発明によるリウマチ治療剤の処
方例をいくつか示す。

【００３９】

【実施例】

１）注射剤 処方１（１００ｍｌ中） 抗Ｆａｓモノクローナル抗体 ０．０１ｇ 塩化ナトリウム ０．９ｇ 注射用蒸留水 適量

【００４０】 処方２（１００ｍｌ中） 抗Ｆａｓモノクローナル抗体 ０．００１ｇ 塩化ナトリウム ０．９ｇ メチルセルロース ０．５ｇ 注射用蒸留水 適量

【００４１】 処方３（１００ｍｌ中） 抗Ｆａｓモノクローナル抗体 ０．０１ｇ アクチノマイシンＤ ０．００５ｇ 塩化ナトリウム ０．９ｇ 注射用蒸留水 適量

【００４２】２）錠剤 処方１ 抗Ｆａｓモノクローナル抗体 １ｍｇ 乳糖 １３３ｍｇ 結晶セルロース ３０ｍｇ ポリピニルピロリドンＫ３０ ５ｍｇ ステアリン酸マグネシウム １ｍｇ 計 １７０ｍｇ

【００４３】 処方２ 抗Ｆａｓモノクローナル抗体 ０．１ｍｇ アクチノマイシンＤ ０．０２ｍｇ 乳糖 １３３．８８ｍｇ 結晶セルロース ３０ｍｇ ポリビニルピロリドンＫ３０ ５ｍｇ ステアリン酸マグネシウム １ｍｇ 計 １７０ｍｇ

【００４４】

【発明の効果】本発明の効果を示すために、以下に各種
試験の結果を示す。

【００４５】「試験例」 １．リウマチ患者の滑膜細胞におけるアポトーシス発現
の検出 （実験方法）アメリカのリウマチ学会の慢性閲節リウマ
チ診断基準に従い、慢性関節リウマチ（ＲＡ）であると
診断された患者から滑膜組織を取り、Ｇｏｔｏらの方法
（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８０，７８６（１９
８７））に従って滑膜細胞を採取した。すなわち、滑膜
の組織を細かく切り、コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用
い組織を処理して得られた単細胞懸濁物を一晩インキュ
ベートし、浮遊している細胞を滑膜の非付着浸潤細胞と
して分離した。一方、付着細胞すなわち滑膜細胞は、試
験開始まで培養皿中で培養した。尚、比較として、変形
性関節症患者（ＯＡ患者）の滑膜細胞を用いた。

【００４６】次に、これらの細胞にアポトーシスが生じ
ているかどうかを確認するため、細胞からＤＮＡを抽出
し、電気泳動でＤＮＡの断片化を確認する実験を文献
（Ｓｃｉｅｎｃｅ，５５７，２１７（１９９２）；Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｊ，２３０３（１
９７６））の方法に従って行なった。すなわち、細胞を
０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ）−
ＴＮＥ（０．１Ｍ塩化ナトリウムと１ｍＭのＥＤＴＡを
含む１０ｍＭトリス緩衝液：ｐＨ７．５）−ＳＤＳ溶液
中、５０℃にて１時間インキュベートし、次いで０．１
ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａ（ニッポン・ジーン）でＤ
ＮＡを更に処理した。処理したＤＮＡ１０μｌを１．５
％アガロースゲル上で電気泳動させ、エチジウムプロミ
ドで染色し観察した。

【００４７】（結果）ＲＡ患者の滑膜細胞から抽出した
ＤＮＡのサンプルの全てでアポトーシスの典型的なＤＮ
Ａの断片化が観察された。

【００４８】次に、ＲＡ患者の滑膜組織をコラゲナーゼ
処理し、分離した非付着浸潤細胞と付着細胞（滑膜細
胞）について観察をした結果、付着細胞のみにＤＮＡの
断片化が観察された。

【００４９】上記ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動の結
果を図１に示す。

【００５０】これに対し、ＯＡ患者の滑膜細胞にはＤＮ
Ａの断片化が認められなかった。

【００５１】図１中、ＯＡ１およびＯＡ２は各々ＯＡ患
者のものであることを示し、ＲＡ１〜ＲＡ６は各々ＲＡ
患者のものであることを示す。番号を付した各レーンの
うち、レーン２および４はＯＡ患者の膝関節滑膜細胞の
ＤＮＡを示し、レーン９、１１、２１および２６は各Ｒ
Ａ患者の膝関節滑膜細胞のＤＮＡを示し、レーン１０、
１４、２５および２７は肘関節滑膜細胞のＤＮＡを示
し、レーン１２および１５は手首関節滑膜細胞のＤＮＡ
を示し、レーン１６、２０、２３および２４は手指関節
滑膜細胞のＤＮＡを示し、レーン１８および１９は足首
関節滑膜細胞のＤＮＡを示す。その他のレーンについて
は本項とは直接関係がないので、説明は省略する。上記
で示したＲＡ患者の関節のＤＮＡには断片化が観察され
たが、ＯＡ患者の関節ＤＮＡには断片化が観察されなか
った。

【００５２】２．電子顕徴鏡およびＤＮＡ ｎｉｃｋ
ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ法によるアポトーシスの検出
（実験方法）ＲＡ患者およびＯＡ患者から得た滑膜組織
を２．５％グルタールアルデヒドで固定し、電子顕徴鏡
を用いて評価した。また、組織部分のＤＮＡ ｎｉｃｋ
ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ法による評価はＧａｖｒｉ
ｅｌｉらの方法（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１
９，４９３（１９９２））に従って行なった。

【００５３】すなわち、滑膜組織を４％ｂｕｆｆｅｒｅ
ｄホルムアルデヒドで固定し、パラフィンで包埋した。
次に、パラフィン切片（４〜６μｍ）をあらかじめ０．
０１％のポリリジン（３０万ｍｏｌ．ｗｔ．，Ｓｉｇｍ
ａ）水溶液で処理したスライドにのせた後、パラフィン
を除去し、組織を水和させた。室温で組織を２０μｇ／
ｍｌのプロテイナーゼＫとインキュベートすることによ
り核から蛋白を除去し、内因性のパーオキシダーゼは２
％過酸化水素により消去させた。このサンプルをターミ
ナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴＤ
Ｔ）緩衝液（３０ ｍＭの Ｔｒｉｚｍａｂａｓｅ，ｐ
Ｈ７．２，１４０ ｍＭの ｓｏｄｉｕｍ ｃａｃｏｄ
ｙｌａｔｅ，１ ｍＭの ｃｏｂａｌｔ ｃｈｌｏｒｉ
ｄｅ）に浸潤させた。次いで、ＴＤＴ（０．３ｕ／μ
ｌ）とＴＤＴ緩衝液に溶解したｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅ
ｄ−ｄＵＴＰを加えた。反応はスライドをＴＢ緩衝液
（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリ
ウム）に入れることによって終わらせた。次に、サンプ
ルを２％ヒト血清アルプミン（ＨＳＡ）またはウシ血清
アルプミン（ＢＳＡ）水溶液中に入れ、続いてＥｘｔｒ
ａ−ａｖｉｄｉｎ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ処理した後、
ＡＥＣで染色した。

【００５４】（結果）この電子顕徴鏡写真を図２に示
す。

【００５５】図２から明らかなように、ＲＡ患者の滑膜
組織にはアポトーシスの典型的な形態、すなわち固く詰
まった細胞小器官および核壁に沿って密集したｃｈｒｏ
ｍａｔｉｎ ｂｏｕｎｄが電子顕微鏡によって観察され
た。さらに、滑膜タイプＡ細胞（組織マクロファージ類
似の細胞）がアポトーシス細胞の近くに見い出された。

【００５６】一方、ＯＡ患者の滑膜組織では典型的なア
ポトーシスによる変化は認められなかった。

【００５７】次に、ＲＡ患者の滑膜組織をヘマトキシリ
ン−エオシン染色した染色写真を図３Ａに、同患者から
の滑膜組織をｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ法に
より処理し、染色した組織の染色写真を図３Ｂにそれぞ
れ示す。

【００５８】図３Ｂ中に矢印で示されるように、滑膜組
織の中で、繊維芽細胞の核が染色されており、一方、浸
潤していない単核細胞は染色されていなかった。

【００５９】３．Ｆａｓ抗原のフローサイトメトリー分
析 （実験方法）細胞表面Ｆａｓ抗原を以下のようにして検
出した。ＲＡおよびＯＡ患者から得た滑膜細胞（５×１
０^５）を等張化されたリン酸緩衝液（ＰＢＳ緩衝液）で
洗浄後、１％ウシ血清アルプミン、０．０２％アジ化ナ
トリウムおよび２０μｌ／ｍｌの抗Ｆａｓモノクローナ
ル抗体（株式会社医学生物学研究所、「ｃｌｏｎｅＣＨ
−１１」より産生）を加えたＰＢＳ緩衝液０．１ｍｌに
懸濁させ、３０分間氷冷した。細胞をＰＢＳ緩衝液で２
回洗浄した後、１％ウシ血清アルプミン、０．０２％ア
ジ化ナトリウムおよび１０μｇ／ｍｌの ａｆｆｉｎｉ
ｔｙ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＦＩＴＣ−ｌａｂｅｌｅｄｇ
ｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＭを含有させた
０．１ｍｌのＰＢＳ緩衝液で３０分間インキュベートし
た。その後、細胞を３回ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、フロー
サイトメーターで分析を行なった。

【００６０】尚、比較するため抗Ｆａｓモノクローナル
抗体のかわりにコントロールとしてマウスＩｇＭを加え
たものについても同様の実験を行なった。

【００６１】（結果）得られた結果を図４に示した。図
４から明らかなように、コントロールと比べ抗Ｆａｓモ
ノクローナル抗体を添加したものは強く発色しており、
ＲＡ患者の滑膜細胞にＦａｓ抗原が発現していることが
明らかとなった。ＯＡ患者でも同様な結果が得られた。

【００６２】４．抗Ｆａｓモノクローナル抗体添加によ
る滑膜細胞のアポトーシスの誘導 （実験方法）試験例１で得られたＲＡ患者の滑膜細胞
（１×１０^６個）に、Ｄ−ＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’
ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）溶
液、次いで抗Ｆａｓモノクローナル抗体（株式会社医学
生物学研究所、「ｃｌｏｎｅＣＨ−１１」より産生、５
０％グリセロールを含むＰＢＳ緩衝液）を最終的に０．
０１〜１．０μｇ／ｍｌの濃度となるように加え、３７
℃で２４時間インキュベートした。次に、この細胞をト
リパンプルーで染色し、位相差顕徴鏡でカウントするこ
とにより生存している細胞数を求め、死んだ細胞からア
ポトーシスを起こしている割合を求めた。尚、比較とし
て、ＯＡ患者と正常なヒト（半月板損傷の患者）の滑膜
細胞を用い、同様の実験を行なった。

【００６３】次に、抗Ｆａｓモノクローナル抗体を加え
たものについては死んだ細胞がアポトーシスを起こして
いるのかどうかを確認するため、細胞からＤＮＡを抽出
し、電気泳動でＤＮＡの断片化を確認する実験を試験例
１と同様の方法を用いて行なった。

【００６４】また、抗Ｆａｓモノクローナル抗体に一定
量のアクチノマイシンＤ（５０ｎｇ／ｍｌ）を加えたも
のをＲＡ患者の滑膜細胞に加えて上記と同様の実験を行
なった。

【００６５】（結果）抗Ｆａｓモノクローナル抗体のみ
を加えたときの滑膜細胞にアポトーシスが生じる割合を
表１に示した。

【００６６】

【表１】 表１に示されるように、ＲＡ患者以外の滑膜細胞は抗Ｆ
ａｓモノクローナル抗体の作用をほとんど受けていない
のに対し、ＲＡ患者の滑膜細胞では抗Ｆａｓモノクロー
ナル抗体の濃度に依存して細胞死が増加していることが
わかる。また、電気泳動を用いた実験により、ＤＮＡの
断片化が確認されたことから、滑膜細胞の細胞死がアポ
トーシスによるものであることが確認できた。

【００６７】次に抗Ｆａｓモノクローナル抗体にアクチ
ノマイシンＤを加えたときの結果を表２に示す。

【００６８】

【表２】 表２に示されるように、抗Ｆａｓモノクローナル抗体と
アクチノマイシンＤの併用の場合、抗Ｆａｓモノクロー
ナル抗体単独の場合より、細胞死が生じる割合が著しく
増加していた。

【００６９】以上の結果は、抗Ｆａｓモノクローナル抗
体が異常に増殖した滑膜細胞に対しアポトーシスを起こ
させることを示すものであり、またＲＡ患者以外の細胞
に対してはその作用がほとんどないかもしくは極めて弱
いことから、優れたリウマチ治療剤となることは明らか
である。

【００７０】５．マウスモデルを使用したｉｎ ｖｉｖ
ｏ試験 抗Ｆａｓモノクローナル抗体のヒトに対する臨床効果を
予見するため、抗マウスＦａｓモノクローナル抗体をマ
ウス病態モデルに投与し効果を検討した。

【００７１】（抗体）組み換え型可溶性マウスＦａｓ抗
原をＡｒｍｅｎｉａｎハムスターに免疫した後、その牌
細胞とマウスミエローマ細胞（ＮＳ−１）とを融合させ
たハイプリドーマ「ｃｌｏｎｅ ＲＫ−８」から得た精
製モノクローナルＩｇＧ型抗体である抗マウスＦａｓモ
ノクローナル抗体（株式会社医学生物学研究所）を使用
した。

【００７２】（病態モデル）ヒトＲＡに近似したモデル
であるＢＡＬＢ／ＣＡｎＮ Ｐｘトランスジェニックマ
ウス（１０〜２０週令、日本生物科学研究所にて系統維
持）関節炎発症モデルを使用した。

【００７３】（実験方法）抗マウスＦａｓモノクローナ
ル抗体（１ｍｇ／ｍｌ、リン酸緩衝液）５μｌをマウス
後肢関節腔内に注入し、足浮腫の量を測定した。測定
は、関節の幅および甲の高さをノギスにより測定するこ
とにより行ない、その幅と高さを乗じた値を足浮腫の量
とした。コントロールとしては精製ハムスターＩｇＧ
（ＵＣＸ８−４Ｂ３、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用い
た。

【００７４】（結果）結果を表３に示す。表中の数値
は、投与前の状態を１００とし、それに対する足浮腫の
割合を平均値で示す。

【００７５】

【表３】 表３の結果に示されるように、抗体投与群は有意に足浮
腫を減少させた。

【００７６】６．アポトーシスの発現試験 抗Ｆａｓモノクローナル抗体のアポトーシス発現特異性
を検討するため、２種の抗Ｆａｓモノクローナル抗体を
用いてＲＡ患者の滑膜細胞に対する効果を調べた。

【００７７】（抗体）「ｃｌｏｎｅＣＨ−１１」から産
生された抗Ｆａｓモノクローナル抗体（上記試験例４で
用いたものと同じ抗体。以下「抗体Ａ」とする。）、お
よびヒトＦａｓ抗原ｃＤＮＡで形質転換したマウス細胞
より得たリコンビナントＦａｓ抗原をＢＡＬＢ／Ｃマウ
スに免疫した後、その牌細胞とマウスミエローマ細胞
（ＮＳ−１）とを融合させて得た「ｃｌｏｎｅ ＺＢ
４」から産生された抗Ｆａｓモノクローナル抗体（株式
会社医学生物学研究所、以下「抗体Ｂ」とする。）を用
いた。

【００７８】（実験方法）試験例１と同様にして得たＲ
Ａ患者の滑膜細胞（１×１０^５個）を細胞培養プレート
に播種し、細胞接着後、抗体Ａ（０．１μｇ／ｍｌ、１
μｇ／ｍｌ）または抗体Ｂ（０．５μｇ／ｍｌ）を加え
て一定時間後の細胞生存率を求めた。また、まず抗体Ｂ
（０．５μｇ／ｍｌ）を加えて１時間後に抗体Ａ（０．
１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ）を加え、一定時間後（抗
体Ａ添加後の時間で表わす）の細胞生存率を求めた。

【００７９】（結果）結果を表４に示す。

【００８０】

【表４】 表４に示されるように、抗体Ａは滑膜細胞のアポトーシ
スを濃度依存的に発現している（４８時間後には回復傾
向にある）のに対し、抗体Ｂはアポトーシスをほとんど
発現しない。また、抗体Ｂは抗体Ａに対し拮抗作用を示
し、抗体Ａの効果を打ち消している。

【図面の簡単な説明】

【図１】慢性関節リウマチ患者の新鮮な滑膜細胞から抽
出したＤＮＡがアポトーシスを起こしている典型的なＤ
ＮＡの断片化を示し、かつ、変形関節症患者のＤＮＡに
は断片化が生じていないことを示す電気泳動の写真であ
る。

【図２】慢性関節リウマチ患者の滑膜組織におけるアポ
トーシスの典型的な形態を示す電子顕微鏡写真である。

【図３】慢性関節リウマチ患者の滑膜組織をヘマトキシ
リン−エオシン染色した染色写真（図３Ａ）、および、
同患者からの滑膜組織をｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌ
ｉｎｇ法により処理し、染色した染色写真（図３Ｂ）で
ある。

【図４】慢性関節リウマチ患者の培養滑膜細胞上のＦａ
ｓ抗原の発現をフローサイトメトリー分析により確認し
たグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リウマチ患者の滑膜細胞におけるＦａｓ
   抗原と特異的に反応し、滑膜細胞にプログラム化細胞死
   の一形態であるアポトーシスを発現させる抗Ｆａｓモノ
   クローナル抗体を有効成分とするリウマチ治療剤。
2. 【請求項２】 抗Ｆａｓモノクローナル抗体がヒト型Ｆ
   ａｓ抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体である
   請求項１記載のリウマチ治療剤。
3. 【請求項３】 抗Ｆａｓモノクローナル抗体が、ヒト二
   倍体繊維芽細胞により免疫して得られたクローンから産
   生されたものである請求項１または２記載のリウマチ治
   療剤。
4. 【請求項４】 抗Ｆａｓモノクローナル抗体が、ヒト二
   倍体繊維芽細胞をマウスに免疫した後、その脾細胞とマ
   ウスミエローマ細胞とを融合させて得られたｃｌｏｎｅ
   ＣＨ−１１から産生されたものである請求項１または
   ２記載のリウマチ治療剤。
5. 【請求項５】 抗Ｆａｓモノクローナル抗体と細胞増殖
   抑制作用を有する薬物との組み合わせを有効成分とする
   リウマチ治療剤。
6. 【請求項６】 細胞増殖抑制作用を有する薬物がアクチ
   ノマイシンＤである請求項５記載のリウマチ治療剤。
7. 【請求項７】 投与形態が関節注入剤である請求項１〜
   ６記載のリウマチ治療剤。