JPH0813837B2 - 新規ペプチド - Google Patents
新規ペプチドInfo
- Publication number
- JPH0813837B2 JPH0813837B2 JP63079869A JP7986988A JPH0813837B2 JP H0813837 B2 JPH0813837 B2 JP H0813837B2 JP 63079869 A JP63079869 A JP 63079869A JP 7986988 A JP7986988 A JP 7986988A JP H0813837 B2 JPH0813837 B2 JP H0813837B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- macrophages
- boc
- arg
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、マクロファージ及び多形核白血球などの貧
食能を活性化する作用を有していて、免疫増強剤として
利用可能性のある新規なペプチドに関する。
食能を活性化する作用を有していて、免疫増強剤として
利用可能性のある新規なペプチドに関する。
従来の技術 従来、感染症などで生体内に細菌などの外的異物が侵
入してきた際には、生体防御反応の第一歩として、マク
ロファージや好中球、多形核白血球などの食胞作用によ
つて、これらの外的異物が細胞内に包み込まれ、その
後、その外的異物を包み込んだ細胞内で殺菌や分解など
の生体反応が行われる。そして、これらの生体反応の結
果、外的異物に関する情報が抗原として免疫を司る細胞
に提示され、それぞれの免疫が成立することが知られて
いる。
入してきた際には、生体防御反応の第一歩として、マク
ロファージや好中球、多形核白血球などの食胞作用によ
つて、これらの外的異物が細胞内に包み込まれ、その
後、その外的異物を包み込んだ細胞内で殺菌や分解など
の生体反応が行われる。そして、これらの生体反応の結
果、外的異物に関する情報が抗原として免疫を司る細胞
に提示され、それぞれの免疫が成立することが知られて
いる。
このように、外的異物の侵入に対する生体反応として
の貧食作用（Phagocytosis）は、例えばマクロファージ
や好中球、多形核白血球などの貧食細胞が、外的異物と
直接接触して作用することや、或いは抗体によるオプソ
ニン作用によるが、これらの反応機構については十分解
明されていないのが現状である。また、多くの貧食能を
促進する物質も報告されているが、相互の関係について
は、明らかにされていない。
の貧食作用（Phagocytosis）は、例えばマクロファージ
や好中球、多形核白血球などの貧食細胞が、外的異物と
直接接触して作用することや、或いは抗体によるオプソ
ニン作用によるが、これらの反応機構については十分解
明されていないのが現状である。また、多くの貧食能を
促進する物質も報告されているが、相互の関係について
は、明らかにされていない。
また、免疫不全症の患者においては、この貧食能が極
端に低下するという問題があり、何らかの貧食能調節機
構の異常が推定されている。
端に低下するという問題があり、何らかの貧食能調節機
構の異常が推定されている。
一方、マクロファージなどの貧食細胞に作用して、そ
の細胞の遊走を開始させ得る物質（Chemataxisfactor）
として、ロイコトリエン類やヒスタミン類が知られてい
る。また、その他、マクロファージ・アクチベーティン
グ・ファクターやマクロファージ・イミグレーション・
ファクターなどのリンホカイン類やレンチナンなどのβ
グルカンなどが貧食能を増強する作用を有することが知
られている。
の細胞の遊走を開始させ得る物質（Chemataxisfactor）
として、ロイコトリエン類やヒスタミン類が知られてい
る。また、その他、マクロファージ・アクチベーティン
グ・ファクターやマクロファージ・イミグレーション・
ファクターなどのリンホカイン類やレンチナンなどのβ
グルカンなどが貧食能を増強する作用を有することが知
られている。
しかし、低分子のペプチドで貧食能を増強する作用を
有する物質としては、免疫グロブリン（IgG）の酵素加
水分解物である、タフトシン〔K.Nishioka et.al,「バ
イオケミカル バイオフイジクス アクタ」（Biochem.
Biophys.Acta）,310,217（1973）〕及びリギン〔N.I.Ve
retennikova et.al,「インターナシヨナル ジヤーナル
オブ ペプチド プロテイン リサーチ」（Int.J.Pe
ptide Protein Res.）,17,430（1981）〕のみが、存在
するに過ぎない。
有する物質としては、免疫グロブリン（IgG）の酵素加
水分解物である、タフトシン〔K.Nishioka et.al,「バ
イオケミカル バイオフイジクス アクタ」（Biochem.
Biophys.Acta）,310,217（1973）〕及びリギン〔N.I.Ve
retennikova et.al,「インターナシヨナル ジヤーナル
オブ ペプチド プロテイン リサーチ」（Int.J.Pe
ptide Protein Res.）,17,430（1981）〕のみが、存在
するに過ぎない。
発明が解決しようとする課題 本発明者らは、各種食品蛋白質の一次構造中に存在す
るタフトシン類似のアミノ酸配列に相当するペプチドを
化学合成し、それらのマクロファージに対する貧食能活
性化作用を検討したところ、前記（Ｉ）式のペプチドが
マクロファージの貧食能を活性化することを見出し、本
発明をなすに至つた。
るタフトシン類似のアミノ酸配列に相当するペプチドを
化学合成し、それらのマクロファージに対する貧食能活
性化作用を検討したところ、前記（Ｉ）式のペプチドが
マクロファージの貧食能を活性化することを見出し、本
発明をなすに至つた。
したがつて、本発明は、マクロファージ及び多形核白
血球の貧食能を活性化する作用を有していて、免疫増強
剤の有効成分として利用可能性のある新規ペプチドを提
供することを課題とする。
血球の貧食能を活性化する作用を有していて、免疫増強
剤の有効成分として利用可能性のある新規ペプチドを提
供することを課題とする。
以下本発明を詳しく説明する。
発明の構成 本発明の特徴は、マクロファージ及び多形核白血球の
貧食能活性化作用を示す次式（Ｉ） Ｈ−Gln−Arg−Pro−Arg−OH （Ｉ） で表される新規ペプチド又はその塩にある。
貧食能活性化作用を示す次式（Ｉ） Ｈ−Gln−Arg−Pro−Arg−OH （Ｉ） で表される新規ペプチド又はその塩にある。
本発明に係る新規ペプチドは、大豆蛋白質などの当該
アミノ酸配列を含む蛋白質の酵素加水分解物から単離し
て得られることができ、また、ペプチド化学合成法によ
つて調製することもできる。
アミノ酸配列を含む蛋白質の酵素加水分解物から単離し
て得られることができ、また、ペプチド化学合成法によ
つて調製することもできる。
課題を解決するための手段 本発明において、化学合成法によるペプチドの調製法
を次に例示する。
を次に例示する。
化学合成： 合成装置として、バイオサーチ社製のSAM2ペプチド合
成装置を用い、ペプチドの担体としての樹脂からの脱離
と保護基の除去は、10％アニソールを含む無水フッ化水
素中で、０℃の温度条件下に１時間攪拌することにより
行う。
成装置を用い、ペプチドの担体としての樹脂からの脱離
と保護基の除去は、10％アニソールを含む無水フッ化水
素中で、０℃の温度条件下に１時間攪拌することにより
行う。
上記フッ化水素を留去した後、樹脂をエーテルで洗浄
し、30％酢酸によりペプチドを抽出する。抽出により得
られたペプチドは、30％酢酸で平衡化したバイオゲルＰ
−２カラム（2.6×80cm）を用いてゲル濾過した後、オ
クタデシルシリル（ODS）カラム（Cosmosil 5C18、２×
25cm）による逆相高速液体クロマトグラフィにより精製
する。目的とする本ペプチドは、0.1％トリフルオロ酢
酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配による展開の
際に、12％アセトニトリルの濃度でカラムから溶出す
る。
し、30％酢酸によりペプチドを抽出する。抽出により得
られたペプチドは、30％酢酸で平衡化したバイオゲルＰ
−２カラム（2.6×80cm）を用いてゲル濾過した後、オ
クタデシルシリル（ODS）カラム（Cosmosil 5C18、２×
25cm）による逆相高速液体クロマトグラフィにより精製
する。目的とする本ペプチドは、0.1％トリフルオロ酢
酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配による展開の
際に、12％アセトニトリルの濃度でカラムから溶出す
る。
上記のようにして得られた、本発明に係るペプチドに
ついて、以下のように、マクロファージに対する貧食能
活性化作用を測定した。
ついて、以下のように、マクロファージに対する貧食能
活性化作用を測定した。
測定方法： ヒツジ赤血球を外的異物としたマウス腹腔マクロファー
ジの貧食能を測定した。
ジの貧食能を測定した。
６週令のメスBalb/cマウスの腹腔内に2.9％チオグリ
コレートブロス（Difco社製）を3ml注射した。３日後に
腹腔中をリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）にて洗浄し、
細胞を回収した。回収した細胞を1,000rpm、10分間で遠
心分離した後、４×105cell/mlとなるようにPBS中に分
散させ、0.5mlずつ24穴プラスチツクプレート（直径16m
m）の各ウエルに加え、５％CO2、37℃の条件下に３時間
インキュベートしてマクロファージをプレートに吸着さ
せた。次に、非吸着細胞をPBSで洗浄した後、５％牛胎
児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地を加えて３時
間インキュベートした。そして、PBSで洗浄した後、PBS
に溶解したペプチドを加え、37℃、15分間プレインキュ
ベートした。更に、ウサギの抗ヒツジ赤血球血清で処理
したヒツジ赤血球（SRBC）108個ずつを各ウエルに加え
て、37℃、45分間インキュベートした。そして、155mM
NH4Cl、10mM KHCO3及び1mM EDTAによつて、マクロファ
ージに貧食されなかつたSRBCを溶血、除去し、0.5％グ
ルタルアルデヒドを含むPBSで細胞を固定化して、顕微
鏡によりSRBCを貧食しているマクロファージの割合を計
数した。
コレートブロス（Difco社製）を3ml注射した。３日後に
腹腔中をリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）にて洗浄し、
細胞を回収した。回収した細胞を1,000rpm、10分間で遠
心分離した後、４×105cell/mlとなるようにPBS中に分
散させ、0.5mlずつ24穴プラスチツクプレート（直径16m
m）の各ウエルに加え、５％CO2、37℃の条件下に３時間
インキュベートしてマクロファージをプレートに吸着さ
せた。次に、非吸着細胞をPBSで洗浄した後、５％牛胎
児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地を加えて３時
間インキュベートした。そして、PBSで洗浄した後、PBS
に溶解したペプチドを加え、37℃、15分間プレインキュ
ベートした。更に、ウサギの抗ヒツジ赤血球血清で処理
したヒツジ赤血球（SRBC）108個ずつを各ウエルに加え
て、37℃、45分間インキュベートした。そして、155mM
NH4Cl、10mM KHCO3及び1mM EDTAによつて、マクロファ
ージに貧食されなかつたSRBCを溶血、除去し、0.5％グ
ルタルアルデヒドを含むPBSで細胞を固定化して、顕微
鏡によりSRBCを貧食しているマクロファージの割合を計
数した。
ペプチドのマクロファージに対する貧食能の活性化作
用は、ペプチドを添加しなかつた場合の貧食能を100と
して表した。その結果は次表に示す。
用は、ペプチドを添加しなかつた場合の貧食能を100と
して表した。その結果は次表に示す。
前記表に見られる通り、タフトシンでは３×10-8Ｍの
濃度で最大値147を示したが、本発明のペプチドでは10
-8Ｍの濃度が最大値150を示した。したがつて、本発明
のペプチドはタフトシンより３倍強力な貧食能活性化作
用を有しているといえる。
濃度で最大値147を示したが、本発明のペプチドでは10
-8Ｍの濃度が最大値150を示した。したがつて、本発明
のペプチドはタフトシンより３倍強力な貧食能活性化作
用を有しているといえる。
以下に実施例を示して本発明に係るペプチドの具体的
な化学合成法を説明する。
な化学合成法を説明する。
実施例 2gのBoc−Arg（Tos）−樹脂（0.3meq/g、バイオサー
チ社製）をSAM2（バイオサーチ社製）ペプチド合成装置
の反応槽に入れ、以下、標準プロトコルに従つて合成を
行つた。すなわち、45％トリフルオロ酢酸、2.5％アニ
ソールを含む塩化メチレン中に25分間攪拌してBoc基を
除去した後、塩化メチレンにより洗浄し、10％ジイソプ
ロピルエチルアミンを含む塩化メチレンによつて中和
し、再び塩化メチレンにより洗浄を行つた。
チ社製）をSAM2（バイオサーチ社製）ペプチド合成装置
の反応槽に入れ、以下、標準プロトコルに従つて合成を
行つた。すなわち、45％トリフルオロ酢酸、2.5％アニ
ソールを含む塩化メチレン中に25分間攪拌してBoc基を
除去した後、塩化メチレンにより洗浄し、10％ジイソプ
ロピルエチルアミンを含む塩化メチレンによつて中和
し、再び塩化メチレンにより洗浄を行つた。
次に、10mlの0.4M Boc−Proのジメチルフォルムアミ
ド溶液と10mlの0.4Mジイソプロピルカルボジイミドの塩
化メチレン溶液と混合した後、先の反応槽に加え、室温
で２時間攪拌してBoc−Proをカップリングさせた。この
Boc−Proをカップリングさせた樹脂をジメチルフォルム
アミド、塩化メチレン、10％ジイソプロピルエチルアミ
ンを含む塩化メチレン、塩化メチレン、ジメチルフォル
ムアミドで順次洗浄した後、20mlの0.3M Ｎ−アセチル
イミダゾールのジメチルフォルムアミド溶液を反応槽に
添加して、30分間反応させ、未反応のアミノ基のキャッ
ピングを行つた。更に、この樹脂をジメチルフォルムア
ミドにて洗浄し、Boc−Pro−Arg（Tos）−樹脂を得た。
同様に、Boc−Arg及びBoc−Glnを順次用いてカップリン
グを繰り返し、Boc−Gln−Arg（Tos）−Pro−Arg−（To
s）−樹脂を得た。
ド溶液と10mlの0.4Mジイソプロピルカルボジイミドの塩
化メチレン溶液と混合した後、先の反応槽に加え、室温
で２時間攪拌してBoc−Proをカップリングさせた。この
Boc−Proをカップリングさせた樹脂をジメチルフォルム
アミド、塩化メチレン、10％ジイソプロピルエチルアミ
ンを含む塩化メチレン、塩化メチレン、ジメチルフォル
ムアミドで順次洗浄した後、20mlの0.3M Ｎ−アセチル
イミダゾールのジメチルフォルムアミド溶液を反応槽に
添加して、30分間反応させ、未反応のアミノ基のキャッ
ピングを行つた。更に、この樹脂をジメチルフォルムア
ミドにて洗浄し、Boc−Pro−Arg（Tos）−樹脂を得た。
同様に、Boc−Arg及びBoc−Glnを順次用いてカップリン
グを繰り返し、Boc−Gln−Arg（Tos）−Pro−Arg−（To
s）−樹脂を得た。
なお、Boc−Glnのカップリングに際しては、Boc−Gln
のジメチルフォルムアミド溶液に0.6M １−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾールを添加してニトリルの形成を防い
だ。
のジメチルフォルムアミド溶液に0.6M １−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾールを添加してニトリルの形成を防い
だ。
以上のようにして得たBoc−Gln−Arg（Tos）−Pro−A
rg−（Tos）−樹脂を20mlの10％アニソールを含むフッ
化水素中で、０℃、１時間攪拌してペプチドを樹脂から
遊離させた。そして、フッ化水素を減圧留去し、樹脂を
エーテルで洗浄した後、30％酢酸にてペプチドを抽出し
た。このペプチドを30％酢酸にて平衡化したバイオゲル
Ｐ−２カラム（2.6×80cm）にてゲル濾過し、更にODSカ
ラム（Cosmosil 5C18、２×25cm）による逆相液体クロ
マトグラフィーにより精製して、本発明のペプチド150m
gの純品を得た。
rg−（Tos）−樹脂を20mlの10％アニソールを含むフッ
化水素中で、０℃、１時間攪拌してペプチドを樹脂から
遊離させた。そして、フッ化水素を減圧留去し、樹脂を
エーテルで洗浄した後、30％酢酸にてペプチドを抽出し
た。このペプチドを30％酢酸にて平衡化したバイオゲル
Ｐ−２カラム（2.6×80cm）にてゲル濾過し、更にODSカ
ラム（Cosmosil 5C18、２×25cm）による逆相液体クロ
マトグラフィーにより精製して、本発明のペプチド150m
gの純品を得た。
なお、本明細書中に用いた略号は、次の通りである。
ArgはＬ−アルギニン、GlnはＬ−グルタミン、Lysは
Ｌ−リジン、ProはＬ−プロリン、ThrはＬ−スレオニン
の各アミノ酸残基を表し、またBocはｔ−ブトキシカル
ボニル基、Tosはトシル基をそれぞれ表す。
Ｌ−リジン、ProはＬ−プロリン、ThrはＬ−スレオニン
の各アミノ酸残基を表し、またBocはｔ−ブトキシカル
ボニル基、Tosはトシル基をそれぞれ表す。
Claims (1)
- 【請求項１】式（Ｉ） Ｈ−Gln−Arg−Pro−Arg−OH （Ｉ） で示されるペプチド又はその塩。 （ただし、式中GlnはＬ−グルタミン、ArgはＬ−アルギ
ニン、ProはＬ−プロリンを表わす）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63079869A JPH0813837B2 (ja) | 1988-03-31 | 1988-03-31 | 新規ペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63079869A JPH0813837B2 (ja) | 1988-03-31 | 1988-03-31 | 新規ペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01249800A JPH01249800A (ja) | 1989-10-05 |
| JPH0813837B2 true JPH0813837B2 (ja) | 1996-02-14 |
Family
ID=13702217
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63079869A Expired - Fee Related JPH0813837B2 (ja) | 1988-03-31 | 1988-03-31 | 新規ペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0813837B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2683993B2 (ja) * | 1992-03-04 | 1997-12-03 | 株式会社ホーネンコーポレーション | ペプチドの製造方法 |
| JP2753938B2 (ja) * | 1993-05-01 | 1998-05-20 | 株式会社ホーネンコーポレーション | 液性免疫増強用医薬組成物 |
| JP5386696B2 (ja) * | 2008-09-05 | 2014-01-15 | マルサンアイ株式会社 | ペプチド及び自然細胞性免疫促進剤 |
-
1988
- 1988-03-31 JP JP63079869A patent/JPH0813837B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01249800A (ja) | 1989-10-05 |
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