JPH0812584A - α−アミラーゼ活性阻害物質、その製造法及びこれを含有する糖尿病の予防・治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 次の理化学的性質を有するα−アミラーゼ活
性阻害物質及びこれを含有する糖尿病予防・治療剤。 （１）ブタ膵臓由来のα−アミラーゼ及びヒト唾液由来
のアミラーゼを阻害し、オオムギ由来のα−アミラー
ゼ、バチルス属微生物由来のα−アミラーゼ及びアスペ
ルギルス属微生物由来のα−アミラーゼを阻害しない。
（２）ＭＷ＝１９，５００〜２１，０００（ゲル濾
過）。（３）４℃においてpH２〜１０の範囲で１８時間
安定である。（４）pH７及び温度１００℃において３時
間安定である。（５）プロティナーゼにより失活する。
（６）水に可溶である。 【効果】 安定、安全かつ有効性に優れる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、安定性、安全性及び有
効性の点で優れたα−アミラーゼ活性阻害物質、その製
造法、それを生産する微生物及び該α−アミラーゼ活性
阻害物質を含有する糖尿病予防・治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】アミラーゼは、デンプン、グリコールを
加水分解する酵素であり、動物の唾液、膵液中等に含ま
れる酵素であり、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ及び
糖化型アミラーゼに大別される。α−アミラーゼ活性阻
害物質は、α−アミラーゼの活性を阻害し、体内への糖
質の供給を抑制する。従って過剰なエネルギーの供給を
抑制するので糖尿病や肥満症等の予防、治療に有効であ
る。

【０００３】α−アミラーゼ活性阻害物質に関する研究
は古くから行われ、数多くのα−アミラーゼ活性阻害物
質が開発されてきた。主にそれらは、ペプチド系物質と
オリゴ糖系物質に分類される。

【０００４】微生物由来のペプチド系α−アミラーゼ活
性阻害物質としは、ストレプトマイセス属より村尾らが
見出したＨａｉｍ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，４４（７），１６７９−１６８１，１９８０）、
Ｐａｉｍ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４７
（２），４５３−４５４，１９８３）、Ｔ−７６（特公
平４−２６００号）、Ｎ−６１（特開平２−６７２９９
号）、ストレプトマイセス属より後藤らが見出したＸ−
２（特公昭５４−１１３９５号）、ストレプトマイセス
属より宮川らが見出したＩ−１００１（特開昭６１−７
４５８７号）、ストレプトマイセス属より原田らが見出
したＡＩ−Ｂ（特開昭５７−２６８４号）、クラドスポ
リウム属より遠藤らが見出したトマスタチン（特開昭５
７−１４６５８６号）などが挙げられる。

【０００５】微生物由来のオリゴ糖系α−アミラーゼ活
性阻害物質として、ストレプトマイセス属より村尾らが
見出したアミロスタチンＡ（特開昭５０−１２３８９１
号）、ストレプトマイセス属より横瀬らが見出したトレ
スタチン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ＆Ｃ
ｏ．，ＡＧ；１９７９；Ｇｅｒ．Ｏｆｆｅｎ．ＤＥ２９
０５６４９；Ｂｒｉｔ．ｐｒｉｏｒｉｔｙ Ｆｅｂｒｕ
ａｒｙ１４，１９７８）などが挙げられる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】このように、現在まで
多くのα−アミラーゼ活性阻害物質が開発されてきた
が、そのほとんどが放線菌であるストレプトマイセス属
の微生物より得られたものであり、安定性、安全性、有
効性等の点で問題があり、未だ実用の段階まで至ってい
ないのが実情である。従って、本発明の目的は、上記問
題点がなく、医薬等として用いることができるα−アミ
ラーゼ活性阻害物質を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】斯かる実情に鑑み本発明
者らは、新規なα−アミラーゼ活性阻害物質を見出すべ
く土壌より分離した多数の糸状菌についてスクリーニン
グを行った結果、ブラキスポリエラ（Ｂｒａｃｈｙｓｐ
ｏｒｉｅｌｌａ）属の代謝産物中に、安定性、安全性及
び有効性に優れ、医薬として有用な新規α−アミラーゼ
活性阻害物質を見出し本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明は下記の理化学的性質を
有するα−アミラーゼ活性阻害物質、この製造法及びこ
れを有効成分とする糖尿病の予防・治療剤を提供するも
のである。

【０００９】（１）作用 ブタ膵臓由来のα−アミラーゼ及びヒト唾液由来のα−
アミラーゼを阻害し、オオムギ由来のα−アミラーゼ、
バチルス属微生物由来のα−アミラーゼ及びアスペルギ
ルス属微生物由来のα−アミラーゼを阻害しない。α−
アミラーゼ活性阻害は非拮抗的である。 （２）分子量 ゲル濾過法で約１９，５００〜２１，０００、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥで約２０，０００。 （３）pH安定性 ４℃において、pH２〜１０の範囲で４８時間安定。 （４）温度安定性 pH７、１００℃で３時間安定。 （５）溶解性 水及び塩類水溶液に可溶。硫安６０％で塩析されて沈澱
する。 （６）プロティナーゼＫにより失活する。 （７）陰イオン交換体に吸着する。

【００１０】本発明のα−アミラーゼ活性阻害物質は、
例えば、ブラキスポリエラ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｏｒｉｅ
ｌｌａ）属に属し、α−アミラーゼ活性阻害物質を生産
し得る微生物を培養し、得られた培養液からα−アミラ
ーゼ活性阻害物質を採取することによって製造される。

【００１１】ここで用いるα−アミラーゼ活性阻害物質
を生産し得る微生物としては、ブラキスポリエラ属に属
し、該阻害物質を産生するものであれば特に限定されな
いが、本発明者らが、土壌中より発見したブラキスポリ
エラ ガヤナ Ｃ−５２５（Ｂｒａｃｈｙｓｐｏｒｉｅ
ｌｌａ ｇａｙａｎａ Ｃ−５２５）株を用いることが
好ましい。この菌株の菌学的性質を以下に示す。

【００１２】（１）分離：高尾山の土壌より分離した。 （２）生育状態：麦芽寒天培地では発育は速くなく、広
がらない。ビロード状で硬い集落。暗灰緑色から暗灰
色。裏面はほとんど黒色。分生子形成不良。

【００１３】（３）顕微鏡的性質 分生子柄：寄主上で高さ１４０〜２８０μｍに達し、単
独、直立、あるいは幾分屈曲、厚膜、頂端近くで分生子
形成分岐を出す、幅は基部で８〜１０μｍ、先端は３〜
４μｍ、暗赤褐色、先端淡色である。 分生子形成細胞：フラスコ型、９〜１１×４〜６μｍ、
分生子形成に従って連鎖するか、あるいは離脱分生子に
付着する。

【００１４】分生子：アレウロ型分生子、分生子柄先端
あるいは側枝の分生子形成細胞端に生じ、倒卵形〜洋な
し形、下端は裁断状、暗褐色、４細胞が多い、上端細胞
も大きく、下端細胞は時として崩壊、２４〜２８（３
０）×１１〜１４μｍ、分生子形成後、形成細胞は切断
面から伸長し次の分生子をつくる、分生子の大きさは２
０〜３８×１２〜２０μｍ、２７〜４０×１６〜２１μ
ｍと幾分差がある。 （４）最適生育条件 温度：２４℃〜２８℃ pH：６．０〜６．５ （５）生育の範囲 温度：１５℃〜３０℃ pH：５．０〜７．５ （６）その他の特徴 胞子の色は濃緑色

【００１５】以上の菌学的性質を基準として菌類図鑑
（椿啓介、宇田川俊一編、講談社刊）を用いて検索した
ところ、本菌株は寒天培地上の生育菌系の色調、性状及
び分生子柄、分生子形成細胞並びに分生子の形状から判
断してブラキスポリエラ ガヤナ種の新規菌株であると
判断し、ブラキスポリエラ エスピー（Ｂｒａｃｈｙｓ
ｐｏｒｉｅｌｌａ ｓｐ．）Ｃ−５２５と命名し、工業
技術院生命工学工業技術研究所に微生物受託番号ＦＥＲ
Ｍ −Ｐ１４３７５として寄託した。

【００１６】本発明におけるα−アミラーゼ活性阻害物
質はＢｒａｃｈｙｓｐｏｒｉｅｌｌａ属に属するα−ア
ミラーゼ活性阻害物質生産菌を一般的手法によって培養
することにより、培地中に生成蓄積させることができ
る。培地には、ポリペプトン、酵母エキスなどの窒素
源、グルコース等の炭素源、及びリン酸１カリウム、リ
ン酸２カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩を加えた
ものを使用することが好ましい。また培養温度は１５〜
３０℃、好ましくは２４〜２８℃、pHは５〜７．５、特
に６〜６．５とすることが好ましい。

【００１７】培養液からの本発明α−アミラーゼ阻害物
質の採取方法としては、濾過、遠心分離等による菌体除
去、限外濾過、硫安処理、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロ
マトグラフィー、電気泳動法、凍結乾燥法、透析法等が
挙げられる。これらの方法を適当に組み合わせることに
より該物質を単離することができる。

【００１８】かくして得られる本発明のα−アミラーゼ
阻害物質の理化学的性質及びその試験方法を詳細に示せ
ば、次の通りである。

【００１９】なお、以下α−アミラーゼ活性及びα−ア
ミラーゼ阻害活性は次の測定法により行った。

【００２０】α−アミラーゼ活性測定方法：４０μｌの
精製水、６０μｌのバッファー（０．２Ｍトリス マレ
イン酸−塩酸バッファー；pH７、５mMＣａＣｌ₂ ）、約
０．２単位（１単位とは、２５℃、pH６．９の条件下で
可溶性デンプンから１分間に１μＭのマルトースを遊離
する活性）のブタ膵臓由来のα−アミラーゼ（ｗｏｒｔ
ｈｉｎｇｔｏｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ製）を含有する酵素溶液１００μｌを混合
し、３７℃にて５分間予備加熱。次いで、この溶液に４
％可溶性デンプン溶液（０．２Ｍトリス マレイン酸−
塩酸バッファー；pH７、５mMＣａＣｌ₂ ）２００μｌを
添加し、３７℃にて１２分間反応させるこの反応液に
０．５Ｎ塩酸を５００μｌ添加し、振盪することにより
α−アミラーゼ反応を停止させる。この反応液５０μｌ
を採取し、精製水９５０μｌ、ルゴール（Ｌｕｇｏｌ）
液（０．００１６Ｎよう素含有）５００μｌを添加し、
振盪する。この溶液の６５５nmにおける吸光度をＣとす
る。別にブランクとして上記酵素溶液の代わりに精製水
を用いて反応液を調製し、同様の操作を行う。これによ
って得られた吸光度をＢとする。

【００２１】このようにして得られた吸光度Ｃ及びＢか
らα−アミラーゼ活性Ａが次式により算出される。ここ
でＡの計算値が０．５となるときのα−アミラーゼ活性
を１単位とする。

【００２２】Ａ＝（Ｂ−Ｃ）／Ｂ

【００２３】従って、阻害物質が存在しない場合のα−
アミラーゼ活性をＡｏとするとＡｏは上記α−アミラー
ゼ活性測定と同様にして測定され、得られた吸光度をＴ
ｏとすると、次式を用いて算出される。

【００２４】Ａｏ＝（Ｂ−Ｔｏ）／Ｂ

【００２５】α−アミラーゼ阻害活性測定法：上記α−
アミラーゼ活性測定方法における反応系中の精製水４０
μｌの代わりに阻害物質溶液４０μｌを用いて反応液を
調製し、同様の操作を行う。この操作によって得られた
吸光度をＴｉとする。阻害物質が存在する場合のアミラ
ーゼ活性をＡｉとするとＡｉは次式により算出される。

【００２６】Ａｉ＝（Ｂ−Ｔｉ）／Ｂ

【００２７】阻害物質が存在するときの阻害率をＩ
（％）とすると、Ｉは次式により算出される。

【００２８】Ｉ＝（（Ａｏ−Ａｉ）×１００）÷Ａｏ

【００２９】上記ブタ膵臓α−アミラーゼ活性の２単位
の５０％を阻害するα−アミラーゼ阻害物質の量を１阻
害単位とすると、α−アミラーゼ阻害物質の阻害活性は
次式により算出される。

【００３０】阻害活性＝（Ａｏ／１．０）×（Ｉ／５
０）×阻害物質の希釈倍数

【００３１】〔理化学的性質〕 （Ｔ）分子量 （１−１）ゲル濾過による分子量 セファクリルＳ−１００（ファルマシア社製）を用いた
ゲル濾過によると、分子量は１９，５００〜２１，００
０であった。 （１−２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２０％ アクリルアミド
ゲル使用）による分子量は約２０，０００であった。

【００３２】（２）タンパク質分解酵素の影響 該活性阻害物質に非特異的にタンパクを分解する酵素、
プロティナーゼＫ（メルク社）を作用させ、３７℃にて
６０分間反応した。プロティナーゼＫを失活させたの
ち、所定のα−アミラーゼ活性測定法により阻害活性の
有無を確認した結果、α−アミラーゼ阻害活性は消失し
た。よって、該α−アミラーゼ阻害物質はタンパク質で
あると考えられる。

【００３３】（３）溶媒に対する可溶性 水及び塩類水溶液に可溶である。 （４）硫安による塩析 硫安６０％で塩析されて沈澱する。

【００３４】（５）陰イオン交換体への吸着 Ｑ−セファロース（ファルマシア社製）等に吸着する。

【００３５】（６）pH安定性 ４℃において、pH２から１０の範囲で１８時間安定であ
る。すなわち、１００％の阻害率を示す培養上清をpH２
から１０のリン酸バッファーに溶解し、４℃にて１晩放
置後、０．２Ｍトリス マレイン酸バッファー（pH７）
に置換、所定のα−アミラーゼ活性測定法にて阻害活性
を測定した結果、上記pH範囲において阻害活性はほぼ１
００％残存し、広いpH範囲における安定性を確認した
（図１）。

【００３６】（７）熱に対する安定性 pH７、１００℃において３時間安定である。すなわち、
本発明物質を１００℃の沸騰浴中にて３０、６０、９
０、１２０、１８０分間加熱した後、所定のα−アミラ
ーゼ活性測定法にて阻害活性を測定した結果、上記条件
においては阻害活性はほぼ１００％残存し、熱に対する
安定性を確認した（図２）。

【００３７】（８）作用 ブタ膵臓由来のα−アミラーゼの代わりに種々のα−ア
ミラーゼを用い、α−アミラーゼ阻害活性測定法に準じ
て測定を行った。反応条件はそれぞれのα−アミラーゼ
の反応に適した条件とした結果、ブタ膵臓由来のα−ア
ミラーゼ、ヒト唾液由来のα−アミラーゼを阻害し、オ
オムギ由来のα−アミラーゼ、アスペルギルス由来のα
−アミラーゼ、バチルス由来のα−アミラーゼに対して
は阻害しなかった。

【００３８】（９）α−アミラーゼ活性阻害型式 非拮抗的阻害を示した（図３）。

【００３９】以上の理化学的性質より、本発明のα−ア
ミラーゼ阻害物質は従来知られている微生物起源のα−
アミラーゼ活性阻害物質及び植物起源のα−アミラーゼ
活性阻害物質とは全く異なる新規なものである。例えば
前記Ｔ−７６（特公平４−２６００号）の分子量は８，
０００であり、Ｎ−６１（特開平２−６７２９９号）は
ヒト唾液由来α−アミラーゼをほとんど阻害せず、更に
Ｈａｉｍ、Ｐａｉｍ、Ｘ−２及びＩ−１００１は分子量
が本発明物質に比べいずれも半分以下であり、本発明物
質とは明らかに異なる物質である。またＬＤ₅₀値は２ｇ
／kg以上であり実質上急性毒性は認められない。

【００４０】上記のように本発明α−アミラーゼ活性阻
害物質はヒト唾液由来α−アミラーゼを強く阻害するの
で、体内への過剰の糖質の供給を抑制するので、糖尿病
や肥満症の予防・治療剤として有用である。

【００４１】α−アミラーゼ活性阻害物質を糖尿病の予
防・治療薬として用いるには１日１００mg／kg程度を経
口投与するのが好ましい。また投与形態としては、錠
剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口投与用製剤が好まし
い。更にデンプン等を含む食品中に混合して投与する形
態としてもよい。

【００４２】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが本発明は、これらに限定されるものではない。
なお「％」は「重量％」を示す。

【００４３】実施例１ グルコース２％、大豆粉０．５％、ポリペプトン１％、
酵母エキス０．５％、リン酸１カリウム０．１％、リン
酸２カリウム０．２％、硫酸マグネシウム０．０５％を
含む培地（pH７）７Ｌを１０Ｌ容ジャーファーメンター
に入れ、１２１℃にて１５分滅菌し、冷却後、種菌（５
００ml坂口フラスコに上記培地１００mlを入れ、滅菌
後、Ｂｒａｃｈｙｓｐｏｒｉｅｌｌａ ｇａｙａｎａ
Ｃ−５２５株を無菌的に接種し、２８℃にて３日間振盪
培養したもの）３００mlを植菌し、２８℃にて１週間
０．５vvm の通気速度にて通気攪拌培養を行った。培養
終了後、培養液を濾過及び遠心分離を行い、菌体を取り
除き、培養上清６４５０mlを得た。本溶液のＩＣ₅₀は８
５μｇ（タンパク）／ml反応液、全阻害活性は５７，０
１８単位であった。

【００４４】実施例２ 培養上清を限外濾過（排除限外分子量１０，０００）に
かけ、濃縮液を得た。更に、濃縮液を硫化アンモニウム
５０％飽和で塩析を行い、遠心分離により、その上清を
得た。上清は、精製水及びバッファーにより１晩透析
（排除限界分子量６，０００〜８，０００）を行った。
更に、本溶液を凍結乾燥し、バッファーに溶解後、遠心
分離を行い、上清を得た。

【００４５】実施例３ 上記濃縮液を強陰イオン交換樹脂Ｑ−セファロースＦａ
ｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア社製）に吸着させ、Ｎａ
Ｃｌ（０〜１Ｍ）を含むバッファー（５０mMリン酸バッ
ファーpH８．５）でステップワイズ溶出した。結果、
０．４Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーによる溶出画分に
阻害活性が濃縮された。活性画分は精製水及びバッファ
ーにより透析（排除限界分子量６，０００〜８，００
０）し、脱塩を行った。本操作によって得られた該活性
タンパク量は９８mg、ＩＣ₅₀値は７．５μｇ（タンパ
ク）／ml反応液、全阻害活性は２３，２５９単位であっ
た。

【００４６】実施例４ 直径２．５cm、長さ１００cmのカラムに充填したゲル濾
過樹脂セファクリルＳ−１００（ベッド体積約４５０m
l）に上記活性画分を吸着させ、０．２ＭのＮａＣｌを
含む２００mMリン酸バッファー（pH８．５）で展開し
た。結果、分子量約１９，５００から２１，０００に相
当するフラクションに阻害活性が確認された。本操作に
よって得られた該活性タンパク量は２１mgで、そのＩＣ
₅₀値は１．８５μｇ（タンパク）／ml反応液であった。
また、全阻害活性は７，００１単位であった。

【００４７】実施例５ シアノジェンブロマイド活性化 セファロース４Ｂにリ
ガンドとしてブタ膵臓由来α−アミラーゼを吸着させた
アフィニティークロマトを作成した。次に、実施例４で
得られた活性画分をチャージし、阻害物質のみをカラム
に吸着させ、夾雑物質を除いた。更に、溶出液のpHを３
に下げることによりブタ膵臓由来α−アミラーゼの立体
構造を変化させ、阻害物質との結合力を弱め、阻害物質
を溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度試験を行った
結果、分子量約２０，０００の単一タンパクであること
が確認された。本操作によって得られたタンパク量は７
mgで、そのＩＣ₅₀値は１．５μｇ（タンパク）／ml反応
液、全阻害活性は１，０３４単位であった。

【００４８】

【発明の効果】本発明の新規α−アミラーゼ活性阻害物
質は、安定性、安全性及び有効性に優れ、体内の糖質の
供給を抑制するので糖尿病の予防・治療剤として有用で
ある。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のα−アミラーゼ活性阻害物質のpH安定
性を示す図である。

【図２】本発明のα−アミラーゼ活性阻害物質の熱安定
性を示す図である。

【図３】本発明のα−アミラーゼ活性阻害物質の阻害型
式を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 1/02 Ｚ 7417−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 横倉 輝男 東京都港区東新橋１−１−19 株式会社ヤ クルト本社内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するα−アミラ
   ーゼ活性阻害物質。 （１）作用 ブタ膵臓由来のα−アミラーゼ及びヒト唾液由来のα−
   アミラーゼを阻害し、オオムギ由来のα−アミラーゼ、
   バチルス属微生物由来のα−アミラーゼ及びアスペルギ
   ルス属微生物由来のα−アミラーゼを阻害しない。α−
   アミラーゼ活性阻害は非拮抗的である。 （２）分子量 ゲル濾過法で約１９，５００〜２１，０００、ＳＤＳ−
   ＰＡＧＥで約２０，０００。 （３）pH安定性 ４℃において、pH２〜１０の範囲で４８時間安定。 （４）温度安定性 pH７、１００℃で３時間安定。 （５）溶解性 水及び塩類水溶液に可溶。硫安６０％で塩析されて沈澱
   する。 （６）プロティナーゼＫにより失活する。 （７）陰イオン交換体に吸着する。
2. 【請求項２】 請求項１記載のα−アミラーゼ活性阻害
   物質を有効成分として含有する糖尿病の予防・治療剤。
3. 【請求項３】 ブラキスポリエラ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｏ
   ｒｉｅｌｌａ）属に属し、α−アミラーゼ活性阻害物質
   を生産し得る微生物を培養し、得られた培養液からα−
   アミラーゼ活性阻害物質を採取することを特徴とする請
   求項１記載のα−アミラーゼ活性阻害物質の製造法。
4. 【請求項４】 α−アミラーゼ活性阻害物質を生産し得
   る微生物が、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥ
   ＲＭ Ｐ−１４３７５として寄託された微生物である請
   求項３記載の製造法。