JPH08119928A - 新規なアルギニン誘導体およびこれを用いるペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】Ｆｍｏｃ−アミノ−Ｎ^W −５−（置換また
は非置換−ジベンゾスベリル）アルギニン、並びにアル
ギニンを含むペプチドの製造方法において、該アルギニ
ン誘導体を使用することを特徴とするアルギニン含有ペ
プチドの製造方法。 【効果】本発明の新規アルギニン誘導体は、アルギニン
含有ペプチド製造のための優れた原料化合物を提供す
る。また、本発明の新規アルギニン誘導体を使用するこ
とにより、アルギニン含有ペプチドおよびアルギニンと
トリプトファンを含有するペプチドを高収率かつ高純度
で製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なアルギニン
誘導体およびこれを用いるアルギニン含有ペプチドの新
規な製造方法に関する。さらに詳しくは、アルギニン残
基を含むペプチドの製造において有用な、アルギニンの
側鎖グアニジノ基を置換または非置換のジベンゾスベリ
ル基で保護したアルギニン誘導体およびこれを使用する
ことを特徴とするアルギニン残基を含むペプチドの製造
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ペプチドの化学的製造においては、アミ
ノ酸残基の不安定な官能基を保護してカップリング反応
を行わせ、全てのアミノ酸の導入が終了した後に、保護
基を除去しなければならない。かかる目的に適した保護
基が多くの官能基について開発されてきている。例え
ば、Ｎαアミノ基の保護基としてフルオレニルメチルオ
キシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を用い、その除去に温和
なピペリジンを用いるＦｍｏｃストラテジーの場合、各
アミノ酸側鎖の官能基の保護には、トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）による除去の可能なトリフェニルメチル基
（Ｔｒｔ基）、ターシャリブチル基（ｔＢｕ）またはタ
ーシャリブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）基等が用い
られている。

【０００３】しかし、アルギニン残基の側鎖グアニジノ
基の保護基としては、充分満足すべきものはいまだ開発
されていないのが現状である。アルギニンの側鎖グアニ
ジノ基は、求核性が強く極めてアシル化を受け易い。従
って、ペプチド製造においては、アルギニン側鎖のグア
ニジノ基の保護は不可欠である。しかしながら、アルギ
ニンの側鎖グアニジノ基の保護基としては、他の官能基
の場合のようにＴＦＡにより容易に除去できるものはな
かった。

【０００４】例えば、４−メトキシ−２，３，６−トリ
メチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）基（M.Fujino et
al.,Chem.Pharm.Bull.,29 ,2825(1981))による保護は、
酸に耐性であるため、除去されにくい。また、トリプト
ファン含有ペプチドの製造時には、副生成物を生じ、収
率が低下する (P.Siber,Tetrahedron Lett.,28,1637(19
87))。また、近年開発された、２，３，４，５，６−ペ
ンタメチルベンゼンスルホニル（Ｐｍｃ）基（R.Ramage
et al.,Tetrahedron Lett.,28, 2287(1987))による保
護であっても、アルギニンの側鎖グアニジノ基を保護し
た場合は、酸に耐性があり、８０％以上の濃度のＴＦＡ
を使用して２〜４時間、さらに複数のアルギニン残基を
含むペプチドでは６〜８時間の処理が必要となる。そこ
で、アルギニン含有ペプチドの製造ではアルギニンの側
鎖の脱保護が律速となり、長時間のＴＦＡ処理を行った
り、トリメチルシリルブロマイドのような危険な副反応
の多い特殊な試薬を用いているのが現状である。従っ
て、アルギニンの側鎖グアニジノ基の保護基であって、
酸によって容易に切断されるものの開発が望まれてい
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、アルギニンの側鎖グアニジノ基の保護基であって、
他の側鎖保護基と少なくとも同程度の酸で除去される不
安定なものであって、しかも脱保護の際に生ずるカチオ
ンが安定であって、さらに併用するスカベンジャーによ
って除去され易く、トリプトファン残基等を攻撃しない
ものを開発し、かかる保護基で側鎖グアニジノ基を保護
したアルギニン誘導体を提供することである。本発明の
他の目的は、かかる誘導体を使用する効率的なアルギニ
ン含有ペプチドの製造方法を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の状
況に鑑み、アルギニンの側鎖グアニジノ基の保護基を鋭
意検討したところ、ジベンゾスベリル基がアルギニンの
側鎖グアニジノ基の保護基として優れているのみでな
く、この保護基が適度に酸に不安定であり、しかも酸に
よる保護基の切断に際して生ずるカチオンが比較的安定
であるため、トリプトファン残基をも含むペプチドの製
造にも有利に使用できることを発見した。さらに、本発
明者らは、ジベンゾスベリル基で保護されたアルギニン
誘導体を塩酸塩型にすると、グアニジノ基の親電子攻撃
を受け易いローンペアエレクトロンがプロトン化される
ため安定となり、一層有利にペプチド製造に使用するこ
とができることを見いだした。

【０００７】しかしながら、側鎖グアニジノ基が酸によ
って容易に切断される保護基は、従来用いられてきたア
リルベンゼンスルホン酸誘導体保護基の場合に比べグア
ニジノ基の求核性が増大することとなり、その結果アル
ギニンをペプチドと結合させる場合に、生成するアルギ
ニンの活性エステル中間体が分子内閉環し、即ちグアニ
ジノ基の窒素とカルボキシル基のカルボニル炭素との間
でラクタム結合が形成され、ペプチドと反応できなくな
る可能性がある（Organic Preparations and Procedure
s Int. 2(5), 427-463 (1988))。そこで、ジベンゾスベ
リル基を保護基に持つアルギニン誘導体をさらに鋭意検
討し、ペプチド結合に関与するアミノ基（ペプチドの遊
離アミノ基）の存在下にアルギニンを活性エステル形成
試薬と反応させることにより、分子内ラクタム形成とい
う副反応を抑え、目的とするペプチドが高純度で生成す
ることを見出した。本発明は、かかる発見に基づき、さ
らに研究を進めて完成するに至ったものである。

【０００８】即ち、本発明の要旨は、（１） 一般式
（１）で表されるアルギニン誘導体、

【０００９】

【化２】

【００１０】（式中、Ｒ₁ 〜Ｒ₈ は、おのおの別個に水
素原子、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４の
アルコキシ基を表し、Ｒ₉ 又はＲ₁₀は、ともに水素原
子、一方が水素原子で他方がフルオレニルメチルオキシ
カルボニル（Ｆｍｏｃ）基、一方が水素原子で他方が炭
素数１〜４のアルキル基、又は一方がＦｍｏｃ基で他方
が炭素数１〜４のアルキル基を表す。） （２） Ｒ₁ 〜Ｒ₈ のうち、４〜７個が水素原子である
前記（１）記載のアルギニン誘導体、（３） Ｒ₁ 〜Ｒ
₈ がすべて水素原子である前記（１）記載のアルギニン
誘導体、（４） Ｒ₁ 〜Ｒ₈ のうち、１個がメトキシ基
で残りが水素原子である前記（１）記載のアルギニン誘
導体、（５） Ｒ₃ がメトキシ基で残りが水素原子であ
る前記（１）記載のアルギニン誘導体、（６） 前記
（１）〜（５）いずれかに記載のアルギニン誘導体の塩
酸塩、（７） アルギニンを含むペプチドの製造方法に
おいて、前記（１）〜（５）いずれかに記載のアルギニ
ン誘導体または前記（６）に記載のアルギニン誘導体の
塩酸塩を使用することを特徴とするアルギニン含有ペプ
チドの製造方法、に関する。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下に本発明について詳細に説明
する。本発明の新規なアルギニン誘導体は、一般式
（１）で表される。

【００１２】

【化３】

【００１３】（式中、Ｒ₁ 〜Ｒ₈ は、おのおの別個に水
素原子、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４の
アルコキシ基を表し、Ｒ₉ 又はＲ₁₀は、ともに水素原
子、一方が水素原子で他方がフルオレニルメチルオキシ
カルボニル（Ｆｍｏｃ）基、一方が水素原子で他方が炭
素数１〜４のアルキル基、又は一方がＦｍｏｃ基で他方
が炭素数１〜４のアルキル基を表す。）

【００１４】この化合物は、アルギニンの側鎖グアニジ
ノ基を置換または非置換のジベンゾスベリル基で保護し
て得られる新規なアルギニン誘導体であり、そのαアミ
ノ基はフリーでもＦｍｏｃ基で保護されたものでもよ
い。式中、Ｒ₁ 〜Ｒ₈ は、ジベンゾスベリル基の置換基
を表し、非置換の場合は水素原子を、置換されている場
合は、おのおの別個に炭素数１〜４のアルキル基又は炭
素数１〜４のアルコキシ基を表す。炭素数１〜４のアル
キル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イ
ソプロピル基、ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ
−ブチル基を挙げることができる。炭素数１〜４のアル
コキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキ
シ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキ
シ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基を挙げることができる。中
でもメトキシ基が好ましい。上記の中でも、Ｒ₁ 〜Ｒ₈
が全て水素原子の場合、Ｒ₁ 〜Ｒ₈ の１個がメトキシ基
で残りが全て水素原子の場合、特にＲ₃ がメトキシ基で
残りが全て水素原子の場合が本発明に特に有利に使用さ
れる。

【００１５】一般式（１）中、Ｒ₉ またはＲ₁₀はいずれ
も水素原子であるか、一方が水素原子で他方がＦｍｏｃ
基、一方が水素原子で他方が炭素数１〜４のアルキル
基、または一方がＦｍｏｃ基で他方が炭素数１〜４のア
ルキル基を表す。ここに、炭素数１〜４のアルキル基と
しては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピ
ル基、ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル
基を挙げることができる。

【００１６】Ｆｍｏｃ基は、ペプチド合成においてαア
ミノ基の保護基として汎用されている極めて温和な条件
下で除去可能な保護基である。本発明のアルギニン誘導
体は、アルギニンの側鎖グアニジノ基を置換または非置
換のジベンゾスベリル基で保護することに特徴があり、
ペプチド合成反応に使用するに際して必要なαアミノ基
の保護基としてはＦｍｏｃ基が好適ではあるが、これに
限定されるものではない。Ｆｍｏｃ基と同様にその除去
にＴＦＡのような酸を必要とせずピペリジンその他の塩
基で除去可能な保護基であれば、すべてＦｍｏｃ基に代
えて本発明に使用することができる。より一般的にいえ
ば、アルギニンの側鎖グアニジノ基を保護している置換
または非置換のジベンゾスベリル基が脱離しない条件下
で除去できるαアミノ基の保護基であればすべて一般式
（１）におけるＦｍｏｃ基に代えて、本発明に使用する
ことができる。

【００１７】一般式（１）で表される本発明のアルギニ
ン誘導体は、塩酸塩型としてペプチド合成に使用するの
が好ましい。これはグアニジノ基の強い塩基性をプロト
ン化により保護し、親電子攻撃から守るためである。本
発明のアルギニン誘導体塩酸塩をペプチド合成に使用す
る場合は、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢ
ｔ）を２〜５倍当量併用するのが好ましい。

【００１８】一般式（１）で表される本発明のアルギニ
ン誘導体は、以下のようにして製造することができる。
例えば、一般式（１）においてＲ₉ 又はＲ₁₀の一方が水
素原子で他方がＦｍｏｃ基の場合は、ジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ）中、ジイソプロピルジエチルアミンを塩
基触媒として、Ｆｍｏｃ−アルギニン（２）と置換また
は非置換のジベンゾスベリルクロライドとを室温で反応
させ、グアニジノ基とカルボキシル基とに置換または非
置換のジベンゾスベリル基が導入された化合物（３）を
得る。次いで、極めて弱い酸性条件下でカルボン酸エス
テルのみを加水分解して、目的の一般式（４）で表され
る本発明のアルギニン誘導体、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｓｕ
ｂ')−ＯＨを得ることができる。以上の反応を以下の化
学反応式に示す。

【００１９】

【化４】

【００２０】反応液から生成物を単離するには、常法に
よる。即ち、反応溶媒を留去し、残留物をクロロホルム
−メタノールを溶出液とするシリカゲルカラムクロマト
グラフィー等で精製することにより目的物が得られる。

【００２１】また、本発明のアルギニン誘導体の塩酸塩
は、上記のようにして得られたアルギニン誘導体を０．
０１Ｎ ＨＣｌ−アセトニトリル（約１：１）の混合液
に溶解しまたは懸濁して凍結乾燥することにより容易に
製造することができる。

【００２２】ここに、Ｆｍｏｃ−アルギニンは、市販の
もの（例えば、スイス Senn Chemicals AG社製）をその
まま用いることができる。また、非置換又は置換のジベ
ンゾスベリルクロライドは、市販のジベンゾスベリルア
ルコール（Aldrich 社製）をチオニルクロライドと反応
させることにより製造することができる。例えば、３−
メトキシ−５−ジベンゾスベリルクロライドは、３−メ
トキシ−５−ジベンゾスベレノン（J. Org. Chem. 59,
7969 (1994))をＮａＢＨ₄ で還元してアルコールとな
し、ついでチオニルクロライドと反応させることにより
容易に製造することができる。

【００２３】また、一般式（１）で表されるアルギニン
誘導体のうちで、Ｎα−位がフリ−のものは、上記のよ
うにして得られた一般式（４）で表されるＦｍｏｃ−Ａ
ｒｇ（Ｓｕｂ')−ＯＨを常法によりピペリジンで処理す
ることにより得ることができる。

【００２４】一般式（１）で表される本発明のアルギニ
ン誘導体の酸安定性は高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）で調べることができる。本発明のアルギニン誘
導体であるＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｓｕｂ）ＯＨは、２５％
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）−ジクロロメタン溶液中で
約３０分間で、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｓｕｂ−ＯＭｅ）Ｏ
Ｈは５％ＴＦＡ−ジクロロメタン溶液中で約３０分間
で、ほぼ１００％の保護基の切断が起こるのが認められ
る。従って、一般式（１）で表される本発明のアルギニ
ン誘導体またはその塩酸塩は、従来用いられている保護
基で保護されたアルギニン誘導体と比較して、より温和
な酸条件下で脱保護が可能であり、アルギニン含有ペプ
チド製造においても温和な酸条件下でクリーベイジを行
って、目的の生成物を得ることができる。このことか
ら、酸に不安定なトリプトファン含有ペプチドの製造に
も有用であることが分かる。本発明のアルギニン誘導体
を使用すると、アルギニン残基を含むペプチドを高効率
に製造することができる。

【００２５】本発明のアルギニン誘導体またはその塩酸
塩型を使用するアルギニン含有ペプチドの製造は、常法
により行うことができる。固相法、液相法のいずれにも
使用することができる。固相法でアルギニン含有ペプチ
ドの製造を行うには、、島津製作所製のペプチド自動合
成機モデルＰＳＳＭ−８を使用するのが便宜であるが、
マニュアル操作で行うこともできる。以下にＰＳＳＭ−
８自動合成機を用いるアルギニン含有ペプチドの製造お
よびマニュアル操作によるアルギニン含有ペプチドの製
造を例示する。

【００２６】アミノ酸のＮα−アミノ基の保護は、Ｆｍ
ｏｃ基で行うのが効率的である。この場合の側鎖官能基
の保護は、例えば、グルタミン酸残基やアスパラギン酸
残基のカルボキシル基の保護の場合はｔｅｒｔ−ブチル
エステル（ＯｔＢＵ）として、グルタミン残基やアスパ
ラギン残基の酸アミド基の保護の場合はトリフェニルメ
チル（Ｔｒｔ）基で、セリン残基、トレオニン残基やチ
ロジン残基の水酸基の保護の場合はｔｅｒｔ−ブチル
（ｔＢｕ）基で、ヒスチジン残基のイミタゾリル基の保
護の場合はトリフェニルメチル（Ｔｒｔ）基で、Ｌｙｓ
残基の側鎖アミノ基やＴｒｐ残基のインドール基の保護
の場合はｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）
基で、そしてアルギニン残基のグアニジノ基の保護の場
合は本発明の置換又は非置換のジベンゾスベリル（Ｓｕ
ｂ')基で行う。これらのアミノ酸誘導体は、アルギニン
誘導体を除きすべて市販されている（例えば、ＳｙｎＰ
ｒｏＰｅｐ試薬）。なお、アルギニン残基以外のアミノ
酸残基の保護は上記以外の保護基を使用することも可能
である。

【００２７】ペプチド合成反応は、ＰＳＳＭ−８のプロ
トコール（市販品）に従って行うのが便宜である。固相
として使用する樹脂は、市販品、例えばＳｙｎＰｒｏＰ
ｅｐ社製のＴｅｎｔａＧｅｌ^R Ｓ−ＲＡＭ、Ｔｅｎｔａ
Ｇｅｌ^R Ｓ−ＣＨＡ、または目的ペプチドのＣ末端アミ
ノ酸が既に結合した樹脂、例えばＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ
Ｂｕ）−Ｗａｎｇ（ＳｙｎＰｒｏＰｅｐ社製）を使用す
るのが便宜である。

【００２８】ＰＳＳＭ−８自動合成機により、必要なア
ミノ酸をすべて導入するまで合成サイクルを繰り返す。
各工程ごとにＤＭＦ洗浄、Ｆｍｏｃ基の除去（ＤＭＦ中
の３０％ピペリジンによる洗浄）、ＤＭＦ洗浄、アミノ
酸の活性化（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−
トリス（ピロリジノ）ホスホニウム ヘキサフルオロフ
ォスフェート（ＰｙＢｏｐ）（ＳｙｎＰｒｏＰｅｐ試
薬）を用いるのが便宜である。）、カップリング、そし
てＤＭＦ洗浄を繰り返す。最終アミノ酸の導入が終わっ
た後、ＤＭＦ洗浄、ピペリジン洗浄によるＦｍｏｃ基の
除去、ＤＭＦ洗浄、メタノール洗浄、ターシャリブチル
メチルエーテル洗浄を行い、次いで窒素ガスを吹きこみ
乾燥させる。こうして、Ｎ−末端がフリーで側鎖の保護
されたペプチドレジンを得る。

【００２９】得られたレジンを充分乾燥した後、クリー
ベイジの工程を行う。この工程は、ＴＦＡスカベンジャ
ーカクテルにより、側鎖保護基を除去すると同時にペプ
チド鎖を支持体レジンより切り離す工程である。この工
程は、従来の保護基では強酸の使用や長時間の処理が必
要であったため、副反応等により目的物の収率低下の原
因となり、また処理に熟練を要した困難な工程であっ
た。しかし、本発明の保護基を使用することにより、こ
のクリーベイジ工程は、下記クリーベイジカクテル中に
室温で６０分間放置するだけで完了する。なお、クリー
ベイジ時間はペプチドのアミノ酸配列に依存するもの
の、従来最も優れた保護基とされているＰｍｃを用いた
場合でも、複数のアルギニン残基を含むペプチドの場合
は、クリーベイジに４〜８時間を要する。クリーベイジ
カクテル：ＴＦＡ ７５％、エチルメチルスルフィド
５％、水５％、チオアニソール ５％、チオフェノール
５％、およびエタンジオール５％。

【００３０】クリーベイジ工程の終了後、カクテルを窒
素圧で遠心分離用チューブに移し、これにドライエーテ
ルを加え、遠心分離により沈澱を得、これを酢酸に溶解
し更にドライエーテルを加えて沈澱させ、窒素通気で乾
燥させた後希塩酸に溶解し、凍結乾燥して粗ペプチドを
得る。

【００３１】マニュアル操作でアルギニン含有ペプチド
を製造するには、以下のようなプロセスが便利である
が、これに限定されるものではない。使用するアミノ酸
誘導体、固相として使用する樹脂等は、上記のとおりで
ある。カルボキシル基の活性化法としては、ＰｙＢｏｐ
およびＨＯＢＴ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）
による方法が便宜である。

【００３２】具体的な操作の１例は以下のとおりであ
る。反応容器に固相として使用する樹脂例えばＴｅｎｔ
ａＧｅｌ^R Ｓ−ＣＨＡを入れ、これに適当な溶媒例えば
ＤＭＦを加え、洗浄とともに膨潤させ、ついで２０％ピ
ペリジン／ＤＭＦを加え振盪を繰り返し、さらにＤＭＦ
で繰り返し洗浄する。これにアミノ酸誘導体を加え、Ｐ
ｙＢｏｐおよびＨＯＢＴをＤＭＦに溶解して添加し、さ
らに塩基触媒として例えばＮ−メチルモルホリンを加え
充分振盪してカップリング反応を行う。この操作をペプ
チドに結合させるアミノ酸残基の数だけ繰り返す。この
方法ではアミノ酸の活性化時に常に遊離のアミノ基が存
在するため、活性化アミノ酸がＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｓｕ
ｂ）ＯＨ、またはＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｓｕｂ−ＯＭｅ）
ＯＨであっても、分子内ラクタム形成は起こらず、反応
収率は極めて高い。得られたレジンは五酸化リン上で減
圧乾燥する。クリーベイジは５０％ＴＦＡ、３２％メチ
レンクロライド、５％チオアニソール、５％Ｈ₂ Ｏ、３
％エチルメチルスルフィド、３％エタンジチオール、２
％チオフェノールからなる混合カクテルを合成後のレジ
ンに加え室温で１時間放置して行う。クリーベイジ後、
レジンを濾過して除き、濾液にエーテルを加えることに
よりペプチドを沈殿させ、遠心分離する。得られた沈殿
を減圧乾燥し、粗ペプチドを得る。

【００３３】得られたペプチドは、必要があれば逆相Ｈ
ＰＬＣで精製し、逆相ＨＰＬＣで単一成分であることを
確認した上、液体二次イオン質量分析法、エドマン
分解によるアミノ酸配列分析、アミノ酸組成分析等に
より、目的物であることを確認できる。

【００３４】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。

【００３５】実施例１（Ｆｍｏｃ−アミノ−Ｎ^W −５−
ジベンゾスベリルアルギニンの製造） Ｆｍｏｃアルギニン３．０ｇ（７．６ｍＭｏｌ）をＤＭ
Ｆ（２０ｍｌ）に溶解し、さらにジベンゾスベリルクロ
ライド（Ｓｕｂ−Ｃｌ）５．２ｇ（３当量）を加えた。
攪拌下にジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）
１．３２ｍｌ（１当量）を滴下し、室温で４時間攪拌し
た。反応液にさらにＤＩＰＥＡを１．３２ｍｌ（１当
量）滴下し、攪拌しつつ一夜放置した。溶媒を減圧下に
留去し、残留物をジクロロメタンに溶解し、さらに水を
加えた。水層を飽和炭酸水素ナトリウム水で中和したの
ちジクロロメタン層を分取し、飽和食塩水で洗浄、乾燥
し、溶媒を留去した。残留物にジエチルエーテルを加え
不溶物を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄後、乾燥して
中間生成物（エステル体）を得た。

【００３６】得られた中間生成物をジオキサン（２００
ｍｌ）及び水（１００ｍｌ）に溶解し、ｐＨを約５とな
し４時間攪拌した。中和後、溶媒留去し、残留物をシリ
カゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒はＣＨＣｌ
₃ −ＭｅＯＨ（８：１→５：１））で精製して、Ｆｍｏ
ｃ−アミノ−Ｎ^W −５−ジベンゾスベリルアルギニン
２．７５６ｇ（収率：６２％）を得た。ＣＨＣｌ₃ −Ｍ
ｅＯＨから再結晶して無色結晶（ｍｐ１４３〜１４６
℃）を得た。 元素分析値：Ｃ₃₆Ｈ₃₄Ｏ₄ Ｎ₄ ・ＣＨＣｌ₃ 理論値：Ｃ＝６１．０６、Ｈ＝５．２８、Ｎ＝７．９１ 分析値：Ｃ＝６０．５９、Ｈ＝５．０２、Ｎ＝７．５７¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆) δ（ppm)：１．４〜
１．８（６Ｈ、ｍ、アルギニンＣβ〜Ｃγメチレン−
（ＣＨ₂ ）₃ −）、２．９〜３．３（４Ｈ、ｍ、ジベン
ゾスベリルメチレンＣ１０、Ｃ１１）、３．６５〜３．
７２（１Ｈ、ｍ、アルギニンＣαメチン）、４．２５
（３Ｈ、ｂｒ．ｓ、Ｆｍｏｃメチレン、メチン）、６．
３２（１Ｈ、ｂｒ．ｓ、ジベンゾスベリルメチンＣＨ−
ＮＨ）、６．７（１Ｈ、ｂｒ．ｓ、グアニジノＮＨ
＝）、７．０〜７．９（１６Ｈ、ｍ、芳香環Ｈ）、８．
３０（１Ｈ、ｂｒ．ｓ、アルギニンＮαＨ）、９．８〜
１０．８（１Ｈ、ｂｒ．ｓ、アルギニンＣＯＯＨ）

【００３７】実施例２（Ｆｍｏｃ−アミノ−Ｎ^W −３−
メトキシ−５−ジベンゾスベリルアルギニンの製造） ３−メトキシ−５−ジベンゾスベレノン（５）５．０ｇ
（ｍＭｏｌ）をイソプロピルアルコール（５０ｍｌ）に
溶解し、さらにＮａＢＨ₄ の０．７９５ｇ（１当量）を
加え、５．５時間加熱攪拌した。溶媒を減圧下に留去
し、残留物を水と少量の酢酸エチルに溶解し、氷冷下希
塩酸で中和し、酢酸エチルで抽出、飽和食塩水で洗浄、
乾燥し、溶媒を減圧下に留去した。残留物をシリカゲル
カラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン
（１：５））により精製し、３−メトキシ−５−ジベン
ゾスベレノ−ル（６）４．２７２ｇ（収率８５％）を得
た。得られたアルコール体をメチレンクロライド（５０
ｍｌ）に溶媒し、氷冷下ＳＯＣｌ₂ を滴下、０℃で２０
分、さらに室温で２時間攪拌した。溶媒を減圧下に留去
し、残留物を石油エーテルで洗浄、乾燥し粗３−メトキ
シ−５−ジベンゾスベリルクロライド（７）４．０３６
ｇを得た。

【００３８】

【化５】

【００３９】Ｆｍｏｃアルギニン３．０ｇ（７．６ｍＭ
ｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍｌ）に溶解し、さらに３−メト
キシ−５−ジベンゾスベリルクロライド（Ｓｕｂ（ＯＭ
ｅ）−Ｃｌ）（７）４．９ｇ（２．５当量）を加えた。
攪拌下にジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）
０．６６２ｍｌ（１当量）を滴下し、室温で４時間攪拌
した。反応液にさらにＤＩＰＥＡ、０．６６２ｍｌ（１
当量）を滴下し、攪拌下に一夜放置した。溶媒を減圧下
に留去し、残留物をジクロロメタンに溶解し、さらに水
を加えた。水層を飽和炭酸水素ナトリウム水で中和した
後、ジクロルメタン層を分取した。ジクロルメタン不溶
性結晶を濾取し、Ｆｍｏｃ−アミノ−Ｎ^W−３−メトキ
シ−５−ジベンゾスベリルアルギニン３．０ｇを得た。
濾液は飽和食塩水で洗浄、乾燥し、溶媒を留去した。残
留物にジエチルエーテルを加え、不溶物を濾取し、ジエ
チルエーテルで洗浄後、得られた粗結晶をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィー（展開溶媒はＣＨＣｌ₃ −Ｍｅ
ＯＨ（８：１→５：１））で精製し、生成物０．９７ｇ
を得た。全量３．９７ｇのＦｍｏｃ−アミノ−Ｎ^W −５
−ジベンゾスベリルアルギニンを得た（収率：８５
％）。ＣＨＣｌ₃ −ＭｅＯＨから再結晶し、無色結晶
（ｍｐ１５０〜１５２℃）を得た。 元素分析値：Ｃ₃₇Ｈ₃₈Ｏ₅ Ｎ₄ 理論値：Ｃ＝７１．８２、Ｈ＝６．１９、Ｎ＝９．０６ 分析値：Ｃ＝７１．６４、Ｈ＝６．１６、Ｎ＝８．７６¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ₃ ＯＤ）δ（ppm)：１．４〜１．９
（６Ｈ、ｍ、アルギニンＣβ〜Ｃγメチレン−（Ｃ
Ｈ₂ ）₃ −）、２．９〜３．４（４Ｈ、ｍ、ジベンゾス
ベリルメチレンＣ１０、Ｃ１１、及び１Ｈ、ｍ、アルギ
ニンＣαメチン）、３．７（１Ｈ、ｓ、メトキシ、ＯＣ
Ｈ₃ ）、４．０〜４．４（３Ｈ、ｍ、Ｆｍｏｃメチレ
ン、メチン）、５．８６（１Ｈ、ｓ、ジベンゾスベリル
メチン、ＣＨ−ＮＨ）、６．７３（１Ｈ、ｂｒ．ｓ、グ
アニジノＮＨ＝）、７．１〜７．８（１６Ｈ、ｍ、芳香
環Ｈ）

【００４０】実施例３（５−ジベンゾスベリルアルギニ
ンの製造） 実施例１で得られたＦｍｏｃ−アミノ−Ｎ^W −５−ジベ
ンゾスベリルアルギニン１．０ｇを３０％ピペリジンを
含むＤＭＦ溶液１０ｍｌ中に溶解し、室温にて２時間放
置する。溶媒を減圧下に留去し、残留物にジエチルエー
テルを加え、不溶物を濾取し、固形物をジエチルエーテ
ルで洗浄して粗生成物を得た。クロロホルム−メタノー
ルから再結晶して無色の結晶５−ジベンゾスベリルアル
ギニン０．５ｇ（収率：８０％）を得た。 元素分析値：Ｃ₂₁Ｈ₂₆Ｏ₂ Ｎ₄ 理論値：Ｃ＝６８．８３、Ｈ＝７．１５、Ｎ＝１５．２
９ 分析値：Ｃ＝６８．５０、Ｈ＝７．０１、Ｎ＝１４．９
９¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆) δ（ppm)：１．２〜
１．７（６Ｈ、ｍ、アルギニンＣβ〜Ｃγメチレン−
（ＣＨ₂ ）₃ −）、２．６〜２．８（１Ｈ、ｍ、アルギ
ニンＣαメチン）、３．０〜３．２（４Ｈ、ｍ、ジベン
ゾスベリルメチレンＣ１０、Ｃ１１）、６．３５（１
Ｈ、ｂｒ．ｓ、ジベンゾスベリルメチンＣＨ−ＮＨ）、
７．０〜７．２５（６Ｈ、ｍ、芳香環Ｈ）、７．５〜
７．７（２Ｈ、ｍ、芳香環Ｈ）、および９．８〜１０．
７（１Ｈ、ｂｒ．ｓ、アルギニンＣＯＯＨ）

【００４１】実施例４（ＡｒｇとＴｒｐを含むデカペプ
チドの製造） Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨを用いるＡｒｇおよ
びＴｒｐ残基の両方を含有するペプチドの製造において
は、クリーベイジ時に脱離したＰｍｃ基によるカチオン
がＴｒｐ残基を攻撃して副生成物を生じることは広く認
められている（Tetrahedron Letters Vol.34, No.42, 6
661-6664(1993)、Int. J. Peptide Protein Res. 43, 3
1-38 (1994))。そこで、本発明方法によりＡｒｇとＴｒ
ｐの両残基を含む下記に示すペプチドの製造を行った。 Ｈ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｎ
−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−ＯＨ

【００４２】製造には、一般式（２）で表される本発明
のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｓｕｂ）−ＯＨ（Ｓｕｂ：非置換
のジベンゾスベリル基）を用いた。合成はベンゾトリア
ゾール−１−イル−オキシ−トリス（ピロリジノ）ホス
ホニウム ヘキサフルオロフォスフェート（ＰｙＢｏ
ｐ）（ＳｙｎＰｒｏＰｅｐ試薬）を用いる活性化法でＰ
ＳＳＭ−８の市販の通常のプロトコール（表１および表
２）を用いた。

【００４３】

【表１】

【００４４】

【表２】

【００４５】ペプチド合成反応の各工程で使用したアミ
ノ酸誘導体は、表３に示すとおりである。

【００４６】

【表３】

【００４７】上記の工程で１０アミノ酸残基をすべて導
入し、Ｎ末端がフリーのアミノ基、側鎖官能基は保護さ
れた状態のペプチドレジンを得た。レジンを減圧下Ｐ₂
Ｏ₅上で充分乾燥したのち、クリーベイジの工程を行っ
た。すなわち、ＴＦＡスカベンジャーカクテルにより側
鎖保護基を除去すると同時にペプチド鎖を支持体（レジ
ン）より切り離す工程である。

【００４８】合成機より得られた約５０ｍｇのペプチド
レジンは合成機の反応バイアルに入れたまま乾燥した。
ここにクリーベイジカクテルを０．６ｍｌ加え、室温で
６０分放置した。カクテルの組成は、ＴＦＡ７５％、エ
チルメチルスルフィド５％、Ｈ₂ Ｏ５％、チオアニソー
ル５％、チオフェノール５％、エタンジチオール５％で
ある。尚、ペプチドレジンにはあらかじめ５ｍｇの２−
メチルインドールを加えておいてからカクテルを加え
た。次いで、島津モデルＰＳＳＭ−Ｃ８の窒素加圧ピス
トルを用いてカクテルを窒素圧で遠心分離チューブに数
１０秒で移し、得られたカクテルに無水ジエチルエーテ
ルを加えて遠心し（３０００ｒｐｍ５分）沈殿を得た。
上清を除き、沈殿を再び０．２ｍｌの酢酸に溶解し、無
水ジエチルエーテルを加えて再び沈殿させ、遠心で沈殿
を集め窒素パージ３分で乾燥させたのち０．０１ＮのＨ
Ｃｌ（１ｍｌ）に溶解して凍結乾燥し、粗ペプチド２１
ｍｇを得た。

【００４９】粗ペプチドについて、分析用ＨＰＬＣで純
度の分析を行った。ＨＰＬＣはＬＣ１０Ａシステムを用
い、カラムはＳｙｎＰｒｏＰｅｐＲＰＣ１８（逆相ＯＤ
Ｓシリカゲル５μ１２０Å）（４．６φ×１５０ｍｍ）
を用いた。溶出液はＡ＝１０ｍＭ ＨＣｌ、Ｂ＝ＣＨ₃
ＣＮでリニアグラジエントＡ＝９５％〜５５％、４０分
間で行い、２１０ｎｍ（ＵＶ）で検出した。流速は１．
０ｍｌ／ｍｉｎである。その結果を図１に示す。この図
から明らかなように、粗ペプチドの純度は極めて高いこ
とが分かる。約１５分に溶出する主ピークを分取し、分
析検定を行った。質量分析（液体二次イオン質量分析
法）を島津−Ｋｒａｔｏｓモデル Ｃｏｎｃｅｐｔ２Ｈ
により測定した。 理論値：Ｍ＝１２８３．４ 実験値：（Ｍ＋１）⁺ ＝１２８３．６ エドマン法によるアミノ酸配列分析により、目的の配列
であることを確認した。

【００５０】実施例５（ＡｒｇとＴｒｐとを含むヘキサ
ペプチドの製造） Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨを用いて行うＡｒｇ
およびＴｒｐ残基の両方を含有するペプチドの製造にお
いては、上記のようにクリーベイジ時に脱離したＰｍｃ
基によるカチオンがＴｒｐ残基を攻撃して副生成物を生
じることは広く認められており、さらに生成物であるペ
プチド中のＴｒｐ残基とＡｒｇ残基の間の距離がＰｍｃ
カチオンによる攻撃に影響し、Ｔｒｐ残基とＡｒｇ残基
の間にアミノ酸残基が１個存在する場合には特に副生成
物の生成が顕著であり、目的のペプチドはほとんど得ら
れないことが知られている（Int. J. Peptide Protein
Res. 43, 1994 31-38)。そこで、本発明の方法を用い、
従来法で合成が至難とされたＨ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｙ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ₂ の製造を行った。

【００５１】製造はＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−
１−イル−オキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウム
ヘキサフルオロフォスフェート及びＨＯＢＴ（１−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾール）を用いる活性化法でマニ
ュアル操作で行った。使用した固相レジンはテンタゲル
Ｓ−ＣＨＡ（J. Org. Chem. 59 (26), 7969 (1994)）、
アミノ酸誘導体は下記の通りである。 分子量 使用量 １）テンタゲルＳ−ＣＨＡ（0.26mMol/g) 28.8mg ２）Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｓｕｂ）−ＯＨ 588.68 43.8mg ３）Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ 311.34 25.6mg ４）Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ 526.57 43.0mg ５）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ 297.31 24.5mg

【００５２】反応容器にテンタゲルＳ−ＣＨＡレジンを
入れ、これにＤＭＦ（０．５ｍｌ）を加え、振盪して樹
脂を洗うとともに膨潤させ、次いで２０％ピペリジン／
ＤＭＦ（０．５ｍｌ）を加え、４分間振盪した。この操
作を再度繰り返し、さらにＤＭＦ（０．５ｍｌ）を加
え、５回洗浄した。これにＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｓｕｂ）
−ＯＨを加え、さらにＤＭＦ１ｍｌ中にＰｙＢＯＰを
０．５ｍＭｏｌ、ＨＯＢＴを０．５ｍＭｏｌ含む溶液の
０．１５ｍｌを加えて、５分間振盪した。Ｎ−メチルモ
ルホリン（０．０１２ｍｌ）を加え、さらに２５分間振
盪し、カップリング反応を行った。ＤＭＦ（０．５ｍ
ｌ）で洗浄（５回）後、表４に示す反応操作のステップ
１〜ステップ６の操作を繰り返した（５回）。最終工程
は表５に示すように行った。得られたレジンはＰ₂ Ｏ₅
存在下、減圧乾燥した。

【００５３】クリーベイジは５０％ＴＦＡ、３２％メチ
レンクロライド、５％チオアニソール、５％Ｈ₂ Ｏ、３
％エチルメチルスルフィド、３％エタンジチオール、２
％チオフェノールからなる混合カクテル（０．５ｍｌ）
を合成後のレジンに加え、室温で１時間放置して行っ
た。クリーベイジ後、樹脂を濾去、得られた濾液にエー
テルを加えることによりペプチドを沈澱させ遠心分離し
た。

【００５４】得られた残留物を減圧乾燥させ粗ペプチド
４．６ｍｇを得た。得られた粗ペプチドについて、ＨＰ
ＬＣによる純度分析を行った。ＨＰＬＣは島津ＬＣ−１
０ＡＳ、ＳｙｎＰｒｏＰｅｐＲＰＣ１８（逆相ＯＤＳシ
リカゲル５μ１２０Å、４．６φ×１５０ｍｍ）カラム
を用いた。溶出液はＡ：０．０１Ｎ ＨＣｌ、Ｂ：ＣＨ
₃ ＣＮでリニアグラジエント、Ａ：１００〜６０％、４
０分間、流速１ｍｌ／ｍｍで行い、２１０ｎｍ（ＵＶ）
で検出した。得られた結果を図２に示す。図２から明ら
かなように、得られた粗ペプチドの純度は極めて高く、
副生成物は認められなかった。ＨＰＬＣにより主ピーク
を分取し、質量分析（ＬＳＩＭＳ）を行った。 島津−Ｋｖａｔｏｓ Ｃｏｎｃｅｐｔ ２Ｈ 測定結
果： 理論値：６１５．６９ 実験値：６１６．３ エドマン法によるアミノ酸配列分析により、目的の配列
であることを確認した。

【００５５】

【表４】

【００５６】

【表５】

【００５７】実施例６（Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｓｕｂ−Ｏ
Ｍｅ）−ＯＨの使用によるＨ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ₂ の製造） Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｓｕｂ−ＯＭｅ）−ＯＨを用いるＨ
−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
ＮＨ₂ の製造も行った。製造はＰｙＢＯＰ（ベンゾトリ
アゾール−１−イル−オキシ−トリス（ピロリジノ）ホ
スホニウム ヘキサフルオロフォスフェート及びＨＯＢ
Ｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）を用いる活性
化法でマニュアル操作で行った。使用した固相レジンは
テンタゲルＳ−ＣＨＡ（J. Org. Chem. 59 (26), 7969
(1994)）、アミノ酸誘導体は下記の通りである。 分子量 使用量 １）テンタゲルＳ−ＣＨＡ（0.26mMol/g) 28.8mg ２）Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｓｕｂ−ＯＭｅ）−ＯＨ 618.70 46.4mg ３）Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ 311.34 25.6mg ４）Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ 526.57 43.0mg ５）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ 297.31 24.5mg Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｓｕｂ）−ＯＨ４３．８ｍｇの代わ
りにＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｓｕｂ−ＯＭｅ）−ＯＨ４６．
４ｍｇを用いた他は全く同様な操作を行い、目的とする
ＡｒｇとＴｒｐを含むヘキサペプチドを製造することが
できた。ＨＰＬＣによる結果を図３に示す。図３から明
らかなように、得られた粗ペプチドの純度は極めて高
く、副生成物は認められなかった。

【００５８】

【発明の効果】本発明の新規アルギニン誘導体は、アル
ギニン含有ペプチド製造のための優れた原料化合物を提
供する。また、本発明の新規アルギニン誘導体を使用す
ることにより、アルギニン含有ペプチドおよびアルギニ
ンとトリプトファンを含有するペプチドを高収率かつ高
純度で製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例４で得られたデカペプチド（粗
ペプチド）の分析ＨＰＬＣのデータを示す図である。

【図２】図２は、実施例５で得られたヘキサペプチド
（粗ペプチド）の分析ＨＰＬＣのデータを示す図であ
る。

【図３】図３は、実施例６で得られたヘキサペプチド
（粗ペプチド）の分析ＨＰＬＣのデータを示す図であ
る。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（１）で表されるアルギニン誘導
   体。 【化１】 （式中、Ｒ₁ 〜Ｒ₈ は、おのおの別個に水素原子、炭素
   数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアルコキシ基
   を表し、Ｒ₉ 又はＲ₁₀は、ともに水素原子、一方が水素
   原子で他方がフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆ
   ｍｏｃ）基、一方が水素原子で他方が炭素数１〜４のア
   ルキル基、又は一方がＦｍｏｃ基で他方が炭素数１〜４
   のアルキル基を表す。）
2. 【請求項２】 Ｒ₁ 〜Ｒ₈ のうち、４〜７個が水素原子
   である請求項１記載のアルギニン誘導体。
3. 【請求項３】 Ｒ₁ 〜Ｒ₈ がすべて水素原子である請求
   項１記載のアルギニン誘導体。
4. 【請求項４】 Ｒ₁ 〜Ｒ₈ のうち、１個がメトキシ基で
   残りが水素原子である請求項１記載のアルギニン誘導
   体。
5. 【請求項５】 Ｒ₃ がメトキシ基で残りが水素原子であ
   る請求項１記載のアルギニン誘導体。
6. 【請求項６】 請求項１〜請求項５いずれか１項に記載
   のアルギニン誘導体の塩酸塩。
7. 【請求項７】 アルギニンを含むペプチドの製造方法に
   おいて、請求項１〜請求項５いずれか１項に記載のアル
   ギニン誘導体または請求項６に記載のアルギニン誘導体
   の塩酸塩を使用することを特徴とするアルギニン含有ペ
   プチドの製造方法。