JPH0811070B2 - 核酸増幅反応の汚染を防除する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この出願は、米国特許出願第０７
／３６０１２０号（１９８９年６月１日出願）および同
第０７／４０１８４０号（１９８９年９月１日出願）の
一部継続出願である米国特許出願第０７／６３３３８９
号（１９９０年１２月３１日出願）の一部継続出願であ
る。これらの特許出願の全内容を説明のために本明細書
に包含させる。この発明は核酸配列を増幅する方法の改
良に関するものである。特にこの発明は、核酸増幅操作
で、その後の増幅操作反応を汚染する増幅操作反応生産
物を除去する手段を提供する。１態様として、オリゴヌ
クレオチドに依存する核酸増幅操作反応を実施したの
ち、その後の反応を汚染する生産物を除去することによ
って、核酸試料の汚染の繰り越しを防止する方法を提供
する。そのようなオリゴヌクレオチド依存性核酸増幅操
作には、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）等がある。この発明の改良
によって、増幅操作の結果が核酸鋳型の繰り越し汚染の
存在を反映しないことが保証される。

【０００２】

【従来の技術】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法は、
変性、オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、
およびＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長から
なる一連の操作により、特定の核酸配列を増幅する
［Ｋ.Ｂ. マリスら、米国特許第４６８３２０２号、同
第４６８３１９５号、Ｋ.Ｂ. マリス、ヨーロッパ特許
第２０１１８４号、Ｈ. エルリッヒ、ヨーロッパ特許第
５０４２４号、同第８４７９６号、同第２５８０１７
号、同第２３７３６２号、Ｈ. エルリッヒ、米国特許第
４５８２７８８号、Ｒ. サイキら、米国特許第４６８３
２０２号、Ｋ.Ｂ. マリスら、コールド・スプリングハ
ーバー・シンポジウム・オン・クォンティタティブ・バ
イオロジー(Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bio
l.)、５１巻、２６３頁（１９８６年）、Ｒ. サイキ
ら、サイエンス(Science)、２３０巻、１３５０頁（１
９８５年）、Ｒ. サイキら、サイエンス、２３１巻、４
８７頁（１９８８年）、Ｅ.Ｙ. ローら、サイエンス、
２４３巻、２１７頁（１９８８年）］。これらの段階は
何回も繰り返すことができ、もとの特定配列のコピー数
の膨大な増幅を生じ得る可能性をもつ。ＤＮＡ配列のた
だ１つのコピーからでも、これを増幅して数百ナノグラ
ムの生産物を生産できることが判っている［Ｈ. リら、
ネーチャー(Nature)、３３５巻、４１４頁（１９８８
年）］。これとは別の既知の核酸増幅方法は転写に基づ
いた増幅方式である［Ｄ. クォーら、プロシーディング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ(Proc. Natl. Acad. Sci. US
A)、８６巻、１１７３頁（１９８９年）、Ｔ.Ｒ.ジンジ
ェラスら、ＷＯ８８／１０３１５］。また得られた「ジ
オリゴヌクレオチド」配列を有する核酸標的の存在で、
２個（またはそれ以上）のオリゴヌクレオチドのライゲ
ーションに基づいて、ジオリゴヌクレオチドを増幅する
方法も既知である［Ｄ.Ｙ. ウーおよびＲ.Ｂ. ワレー
ス、ジェノミックス(Genomics)、４巻、５６０頁（１９
８９年）、バックマンら、ヨーロッパ特許第３２０３０
８号、Ｂ. ワレース、ヨーロッパ特許第３３６７３１
号、Ｌ. オージェル、ＷＯ８９／０９８３５］。そのよ
うなオリゴヌクレオチドに依存する増幅は「リガーゼ連
鎖反応」（ＬＣＲ）と呼ばれる。

【０００３】ＰＣＲまたはＬＣＲのような増幅操作の結
果、増幅生産物そのものが次のＰＣＲまたはＬＣＲ反応
の基質となり得る。そのうえ増幅生産物の量は多く、Ｐ
ＣＲおよびＬＣＲの感度が極めて高いから、ＰＣＲまた
はＬＣＲ反応のような反応のごく小型の断片でも実験室
領域へ散乱する可能性が大であり、そのために別の試料
を増幅しようとするその後の操作の汚染を招来し、それ
によって疑似陽性の結果を生じ得る。繰り越し汚染を回
避するため、細心の注意を払わなければならない［Ｓ.
クォックおよびＲ. ヒグチ、ネーチャー、３３９巻、２
３７頁（１９８９年）］。これは甚だしく不便であり、
ＰＣＲおよびＬＣＲのような増幅実施のコストを著しく
増大する。即ち、その前の増幅から起こり得る繰り越し
汚染について懸念することなく、そのような増幅を実施
し得る日常的、経済的な核酸増幅の方法の必要性が存在
する。この発明は、一般に天然に存在するＤＮＡと区別
し得る増幅生産物を作成することによる試験管内での核
酸増幅方法に関する改良である。したがって次の増幅反
応を開始する前に、そのような生産物を、その後の増幅
の鋳型として不活性にする。

【０００４】

【発明の構成】この発明は、核酸増幅操作から生じる増
幅生産物鎖へ外来試料ヌクレオチドを挿入する方法に関
する。生産物鎖が得られ、それを分析し終えたら（例え
ばハイブリダイゼーション、サザンブロット等によ
り）、挿入した外来試料ヌクレオチドに作用を加えるこ
とにより、外来試料鎖を選択的に破壊することができ
る。２つの実施態様を提供する。第１の態様では、過剰
の外来試料ヌクレオチド三リン酸の存在下で増幅反応を
実施することにより、外来試料ヌクレオチドを挿入す
る。第２の態様では、１またはそれ以上の外来試料ヌク
レオチドをその配列の一部として有するオリゴヌクレオ
チドの存在下で増幅反応を実施することにより、外来試
料ヌクレオチドを挿入する。外来試料ヌクレオチド（複
数もあり）を含有するプライマーを単独で使用すること
ができ、あるいは第１の態様と組み合わせて、即ち、過
剰の外来試料ヌクレオチド三リン酸の存在で増幅反応を
実施することにより、外来試料ヌクレオチドを挿入する
ことができる。

【０００５】第２の態様の変法として、増幅反応の前
に、外来試料ヌクレオチドを少なくとも１オリゴヌクレ
オチドに挿入する。好ましくはオリゴヌクレオチドの末
端、またはその近くで外来試料ヌクレオチドを挿入す
る。増幅前には、外来試料ヌクレオチドを含有するオリ
ゴヌクレオチドは実質上増幅可能である。増幅後は、増
幅されたオリゴヌクレオチド（外来試料ヌクレオチドを
含有する）は実質上増幅不能である。増幅操作中の処理
によって、外来試料ヌクレオチドを含有するオリゴヌク
レオチドを増幅不能にすることもできる。外来試料ヌク
レオチドの位置またはその近くで、外来試料ヌクレオチ
ドを含有する増幅したオリゴヌクレオチドを切断するこ
とは、そのようなオリゴヌクレオチドを実質上増幅不能
にする１例である。

【０００６】この発明は、増幅される能力に影響を受け
ない試料から核酸を除去する処理により、その前の増幅
生産物がさらに増幅されることを解消する。この処理に
よって核酸の増幅に伴う重要な問題、即ち、その前の増
幅操作の目的生産物で出発物質を汚染する問題を著しく
低下する。換言すれば、この発明は、普通に天然に見い
だされる核酸のために、次に実施する増幅反応の前に、
増幅生産物を識別する方法を提供する。より具体的に
は、この発明は酵素を利用して特異的な核酸配列を増幅
する試験管内反応に関するものである。そのような反応
の例として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリ
ガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）等がある。ＰＣＲ法、ＬＣＲ
法およびその他の類似の方法の重大な限界は、個々の反
応の増幅された核酸目的生産物による実験室環境の汚染
である。そのような汚染は、対象試料中に存在し得る基
準核酸の増幅ばかりでなく、その前の反応から汚染され
た目的生産物の増幅にも共通して生じ得る。この発明
は、所望する基準核酸の増幅に影響を与えることなく、
起こり得るこの種の汚染を排除する方法を提供する。

【０００７】第１の態様は、４種の正常なリボヌクレオ
シド三リン酸（ｒＮＴＰ）またはデオキシリボヌクレオ
シド三リン酸（ｄＮＴＰ）の１またはそれ以上を、増幅
しようとする試料中の核酸内に見いだされる、普通には
存在しないか、またはごくまれにしか存在しない１また
はそれ以上の外来試料ヌクレオチドと置き換える第１の
増幅反応の実施を含む。そのような増幅操作中に生産さ
れたＤＮＡまたはＲＮＡを試料核酸から分別することが
できる。即ち、試料ＤＮＡまたはＲＮＡのために、その
前に増幅された核酸はもはや増幅されないが、試料ＤＮ
ＡまたはＲＮＡはそのまま増幅可能であるように、増幅
操作中に生産された核酸を次の増幅操作の前または増幅
操作中に識別することができる。この発明は試験管内に
おけるオリゴヌクレオチドによる核酸の増幅反応に関す
る改良を提供する。この発明の方法では、増幅生産物へ
明瞭な特性を付与する態様によって、増幅生産物を増幅
開始に使用した核酸基質と区別できるようにする。した
がって新たな増幅反応を開始する前に、これらの明瞭な
特性を利用して、その前の増幅生産物を、次の増幅反応
における鋳型として不活性にすることができる。

【０００８】したがってこの発明は、（ａ）第１試料の
核酸を増幅し、ここでその増幅は１またはそれ以上の特
異的なオリゴヌクレオチドに依存して行われ、そのよう
な特異的なオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは外来
試料ヌクレオチドを含有し、それによって外来試料ヌク
レオチドを含有する増幅された核酸を生産し、（ｂ）外
来試料ヌクレオチドを含有する増幅された核酸を、その
ような特異的なオリゴヌクレオチドに依存する増幅に対
し実質上増幅不能とし、外来試料ヌクレオチドを含有し
ない核酸の増幅に実質上影響を与えない処理を第２試料
の核酸に行い、それによって、そのような第２試料の核
酸配列の特異的なオリゴヌクレオチドに依存性の増幅
中、第２試料を汚染するそのような第１試料由来の増幅
された核酸配列を、さらに実質上増幅しない段階を含む
試料中の１またはそれ以上の核酸配列のオリゴヌクレオ
チド依存性の増幅方法に関する。

【０００９】またこの発明は、さらに（ａ）第１試料の
核酸を増幅し、ここでその増幅は１またはそれ以上の特
異的なオリゴヌクレオチドに依存して行われ、その特異
的なオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは外来試料ヌ
クレオチドを含有し、それによって外来試料ヌクレオチ
ドを含有する増幅された核酸を生産し、（ｂ）外来試料
ヌクレオチドを含有する増幅された核酸を、特異的なオ
リゴヌクレオチドに依存する増幅に対し実質上増幅不能
とし、外来試料ヌクレオチドを含有しない核酸の増幅を
実質上妨げない処理を第２試料に行い、ここで、外来試
料ヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドは、増幅
前、外来試料ヌクレオチドを含有する増幅された核酸よ
り、その処理に対して実質上感度が一層乏しく、それに
よって第２試料の核酸配列の特異的なオリゴヌクレオチ
ドに依存する増幅中、第２試料を汚染する第１試料由来
の増幅された核酸配列がさらに実質上増幅されない段階
を含む試料中の１またはそれ以上の核酸配列のオリゴヌ
クレオチド依存性の増幅方法に関する。

【００１０】さらにこの発明は、それぞれ鎖長が等しい
か、または等しくない２つの独立した相補鎖を核酸毎に
含んでいる核酸または核酸混合物中に含まれている少な
くとも１種類の特異的な核酸配列を増幅する方法を提供
する。この方法はさらに（ｅ）それぞれ異なった特異的
配列を増幅するため、２種類のオリゴヌクレオチドプラ
イマーでそれぞれ異なった配列を増幅するような条件下
で、そのような相補鎖を処理して、各核酸鎖に相補的で
ある各プライマーの伸長生産物を合成し、ここでそのよ
うなプライマーは、一方のプライマーから合成された伸
長生産物をその相補鎖から分離すると、他方のプライマ
ーの伸長生産物の合成の鋳型として作動できるように、
特異的な配列同士のそれぞれ異なった鎖とハイブリッド
形成するのに十分に相補的であるように選び、（ｆ）プ
ライマー伸長生産物が合成された鋳型から生産物を分離
し、１本鎖分子を生産し、（ｇ）段階（ｆ）で生産され
た１本鎖をそれぞれ鋳型として使用してプライマー伸長
生産物を合成する条件下で、段階（ｆ）から生じた１本
鎖分子を段階（ｅ）のプライマーで処理することを含
む。この発明によって、外来試料ヌクレオチドを増幅段
階（ｅ）〜（ｇ）の間に増幅することができ、あるいは
外来試料ヌクレオチドを段階（ｅ）および（ｇ）で使用
する少なくとも１種類のプライマーに挿入することがで
きる。おのずから明らかなように、増幅段階中に、外来
試料ヌクレオチドをプライマーの一部として増幅生産物
に挿入し得る。段階（ｅ）の２種類のプライマーは同定
しても、しなくてもよい。

【００１１】さらにこの発明は、 （Ａ）核酸分子がそれぞれ鎖長が等しいか、または等し
くない２つの独立した相補鎖を有する核酸配列または核
酸分子の混合物を含んでいる第１試料では、（ａ）それ
ぞれ異なった特異的な核酸分子を増幅するため、それぞ
れ異なった核酸分子を増幅するような条件下で、少なく
とも１プライマーが外来試料ヌクレオチドを含んている
２種類のオリゴヌクレオチドプライマーでそのような相
補鎖を処理して、各核酸鎖に相補的である各プライマー
の伸長生産物を合成し、ここでそのようなプライマー
は、一方のプライマーから合成された伸長生産物をその
相補鎖から分離すると、他方のプライマーの伸長生産物
の合成の鋳型として作動できるように、特異的な核酸分
子同士のそれぞれ異なった鎖とハイブリッド形成するの
に十分に相補的であるように選び、（ｂ）プライマー伸
長生産物が合成された核酸分子鋳型から生産物を分離
し、１本鎖分子を生産し、（ｃ）段階（ｂ）で生産され
た１本鎖をそれぞれ鋳型として使用してプライマー伸長
生産物を合成するような条件下で、段階（ｂ）から生じ
た１本鎖分子を段階（ａ）のプライマーで処理し、
（ｄ）段階（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１回反復し、そ
れによってそのような第１試料によって含有される特異
的な核酸配列を増幅し、そして （Ｂ）核酸分子がそれぞれ鎖長が等しいか、または等し
くない２つの独立した相補鎖を有する核酸分子または核
酸分子の混合物を含んでおり、段階（Ａ）の増幅された
核酸分子がそのような第２試料中に存在し得る第２試料
では、（ｅ）そのような外来試料ヌクレオチドを含んで
いる核酸を、そのような特異的なプライマーに依存する
増幅に対して実質上増幅不能とし、外来試料ヌクレオチ
ドを含んでいない核酸の増幅には実質上影響を与えない
処理を第２試料の核酸に行い、それによって段階（Ａ）
で増幅し、第２試料に存在する第１試料の任意のプライ
マー伸長生産物を、段階（Ｂ）でさらに実質上増幅しな
い段階を含む試料中の１またはそれ以上の核酸分子を増
幅する方法を提供する。

【００１２】より詳細には、この発明は、 （Ａ）核酸分子がそれぞれ鎖長が等しいか、または等し
くない２つの独立した相補鎖を有する核酸分子または核
酸分子の混合物を含んでいる第１試料では、（ａ）それ
ぞれ異なった特異的な核酸配列を増幅するため、それぞ
れ異なった核酸分子を増幅するような条件下で、少なく
とも１プライマーがデオキシウリジンを含んている２種
類のオリゴヌクレオチドプライマーでそのような相補鎖
を処理して、各核酸鎖に相補的である各プライマーの伸
長生産物を合成し、ここでそのようなプライマーは、一
方のプライマーから合成された伸長生産物をその相補鎖
から分離すると、他方のプライマーの伸長生産物の合成
の鋳型として作動できるように、特異的な核酸分子同士
のそれぞれ異なった鎖とハイブリッド形成するのに十分
に相補的であるように選び、（ｂ）プライマー伸長生産
物が合成された核酸分子鋳型から生産物を分離し、１本
鎖分子を生産し、（ｃ）段階（ｂ）で生産された１本鎖
をそれぞれ鋳型として使用してプライマー伸長生産物を
合成する条件下で、段階（ｂ）から生じた１本鎖分子を
段階（ａ）のプライマーで処理し、（ｄ）段階（ａ）〜
（ｃ）を少なくとも１回反復し、それによってそのよう
な第１試料によって含有される特異的な核酸分子を増幅
し、 （Ｂ）核酸配列がそれぞれ鎖長が等しいか、または等し
くない２つの独立した相補鎖を有する核酸配列または核
酸配列の混合物を含んでおり、段階（Ａ）の増幅された
核酸配列がそのような第２試料中に存在し得る第２試料
では、（ｅ）そのような鎖をウラシルＤＮＡグリコシラ
ーゼで処理し、（ｆ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼの
鎖に対する作用を加熱によって停止し、（ｇ）段階
（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１回反復し、それによって
第２試料が含有している任意の特異的な核酸配列を増幅
し、それによって段階（Ａ）で増幅し、第２試料に存在
する第１試料の任意のプライマー伸長生産物を、段階
（Ｂ）でさらに実質上増幅しない段階を含む試料中の１
またはそれ以上の核酸分子を増幅する方法を提供する。

【００１３】さらにこの発明は、 （ａ）試料の核酸を１本鎖核酸として提供し、 （ｂ）試料中に、少なくとも４種のＤＮＡプローブを提
供し、ここで（ｉ）プローブの第１および第２は１次プ
ローブであり、プローブの第３および第４は２次核酸プ
ローブであり、（ii）第１プローブは標的核酸の１次鎖
の第１セグメントへハイブリッド形成し得る１本鎖であ
り、（iii）第２プローブは標的核酸配列の１次鎖の第
２セグメントへハイブリッド形成し得る１本鎖であり、
（iv）標的の１次鎖の第１セグメントの５'末端は、そ
のプローブを標的核酸の１次鎖へハイブリッド形成した
とき、第１プローブの３'末端が第２プローブの５'末端
へ接続できるように標的の１次鎖の第２セグメントの
３'末端に対して配置され、（ｖ）第３プローブは第１
プローブヘハイブリッド形成でき、（vi）第４プローブ
は第２プローブへハイブリッド形成でき、（vii）少な
くとも第１プローブの３'ヌクレオチドまたは第２プロ
ーブの５'ヌクレオチドがデオキシウリジンであり、（v
iii）少なくとも第４プローブの３'ヌクレオチドまたは
第３プローブの５'ヌクレオチドがデオキシウリジンで
あり、そして （ｃ）（ｉ）そのプローブを試料中の核酸でハイブリッ
ド形成し、（ii）ハイブリッド形成したプローブをライ
ゲーションして、認められた融合プローブ配列を形成
し、（iii）試料中のＤＮＡを変性する反応サイクルを
反復して実施し、 （ｄ）認められた融合プローブ配列を検出することによ
って、連続した反応サイクルで認められた融合１次プロ
ーブおよび融合２次プローブの量の増加を検出する段階
を含む試料中の標的核酸を検出する方法を提供する。

【００１４】この発明では上述の方法により、そのよう
な特異的なプローブに依存する増幅において、外来試料
ヌクレオチドを含有する増幅された核酸を実質上増幅不
能とし、外来試料ヌクレオチドを含有しない核酸の増幅
に実質上影響を与えない処理を、段階（ｃ）の前に試料
に行う追加的な段階を含み得る。

【００１５】図１は、リガーゼ連鎖反応で外来試料ヌク
レオチドを適用する略図を示す。

【００１６】

【定義】以下の説明では、分子生物学および核酸増幅技
術で使用される多数の用語を広範に用いる。明細書およ
び請求範囲の理解を一層明瞭かつ正確にするため、その
ような用語の範囲を含め、下記の定義を行う。本明細書
で用いる「増幅」の語は、ヌクレオチド配列（複数もあ
り）のコピー数を増大させる任意の試験管内操作をい
う。核酸増幅はＤＮＡおよびＲＮＡへのヌクレオチドの
挿入を生じる。本明細書で用いるように、１増幅反応
は、多数回のＤＮＡ複製を含み得る。例えば１「ＰＣ
Ｒ」反応は３０〜１００「サイクル」の変性および複製
を含み得る。

【００１７】本明細書で用いる「ヌクレオチド」とは、
塩基−糖−リン酸結合を表す技術用語である。ヌクレオ
チドは核酸高分子（即ち、ＤＮＡおよびＲＮＡ）のモノ
マー単位である。この用語はｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧ
ＴＰ、ｒＵＴＰのようなリボヌクレオシド三リン酸、お
よびｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐのようなデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む。
「ヌクレオシド」は塩基−糖結合、即ち、ヌクレオチド
のリン酸を欠いたものである。用語ヌクレオシドおよび
ヌクレオチドの用法には一定の互換性があることが当業
界で認められている。例えばヌクレオチドデオキシウリ
ジン三リン酸（ｄＵＴＰ）は、デオキシリボヌクレオシ
ド三リン酸である。これをＤＮＡへ挿入すると、ＤＮＡ
モノマーとして働き、正式にはデオキシウリジル酸エス
テル、即ち、ｄＵＭＰまたはデオキシウリジンモノリン
酸エステルである。得られたＤＮＡにｄＵＴＰ部分がな
くても、ｄＵＴＰをＤＮＡへ挿入したと言い得る。同様
に、それが単に基質分子の一部であっても、デオキシウ
リジンをＤＮＡへ挿入したと言い得る。本明細書で用い
る「外来試料ヌクレオチド」の語は、一般に増幅される
試料または配列中で見いだされないヌクレオチドをい
う。大部分のＤＮＡ試料で、デオキシウリジンは外来試
料ヌクレオチドの例である。デオキシウリジンの三リン
酸エステル形（ｄＵＴＰ）は、生きている生物体内で代
謝中間体として存在するがＤＮＡへ挿入されることは滅
多にない。ｄＵＴＰがＤＮＡへ挿入されると、生体内で
は、正常のプロセス、例えば酵素ウラシルＤＮＡグリコ
シラーゼ（ＵＤＧ）を含むプロセスによって速やかに除
去される。即ち、デオキシウリジンは、天然ＤＮＡには
まれにしか生ぜず、あるいは全く生じない。ある生物体
ではデオキシウリジンを天然にＤＮＡへ挿入し得ること
が認められている。それらの生物体の核酸試料では、デ
オキシウリジンは外来試料ヌクレオチドとみなされな
い。デオキシウリジンまたは任意の他の外来試料ヌクレ
オチドの存在は、当業界既知の方法を用いて容易に測定
し得る。それ以外の外来試料ヌクレオチドも想定し得
る。多数のＤＮＡグリコシラーゼが当業界で既知であ
る。増幅中にＤＮＡへ挿入され得る任意の外来試料ヌク
レオチド、およびそれに作用するＤＮＡグリコシラーゼ
がこの発明で使用し得る。

【００１８】技術用語である「ウラシルＤＮＡグリコシ
ラーゼ」（ＵＤＧ）は、モノマーヌクレオチドｄＵＴＰ
がＤＮＡ分子へ挿入され、デオキシウリジン部分の挿入
を生じたときだけ、塩基ウラシルと糖デオキシリボース
間のグリコシド結合を切断する酵素をいう［Ｂ. ダンカ
ン、ジ・エンザイムズ(The Enzymes)、１４巻、５６５
頁（１９８１年）、Ｐ. ボイヤー編］。この酵素は遊離
ｄＵＴＰ、遊離デオキシウリジン、またはＲＮＡには作
用しない（ダンカン、前掲）。本明細書で用いる「挿
入」とは、核酸高分子の一部となることをいう。本明細
書で用いる「終結」とは、停止処理を起こすことをい
う。この用語は恒久的および条件つき停止の双方を表
す。例えば処理が酵素的なものであれば、恒久的な停止
は加熱変性であり、条件つき停止とは、例えば酵素の活
性範囲外の温度を用いることである。２種類の型の停止
は、ともにこの用語の範囲に入る。

【００１９】本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」
とは、技術上の２つの用語「オリゴヌクレオチド」およ
び「ポリヌクレオチド」を包括的、互換的に表す。オリ
ゴヌクレオチドとポリヌクレオチドは技術上別個の用語
であるが、これらの２つの用語間には厳密な境界線はな
く、本明細書ではこれらを互換的に用いていることに注
意せよ。また用語「プローブ」もこれらの用語「オリゴ
ヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」と互換的に
用い得る。本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド依存
性の増幅」とは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレ
オチドまたはプローブを核酸配列を増幅するのに使用し
た増幅を表す。オリゴヌクレオチド依存性の増幅は、２
またはそれ以上の鎖長のモノヌクレオチド・サブユニッ
トで、最後には新たに生成した増幅された核酸分子の一
部となる１またはそれ以上のオリゴヌクレオチドまたは
ポリヌクレオチドまたはプローブの存在を必要とする任
意の増幅である。本明細書で用いる「プライマー」と
は、増幅中に核酸モノマーの共有結合的な付加によって
伸長される１本鎖オリゴヌクレオチドまたは１本鎖ポリ
ヌクレオチドをいう。核酸増幅は核酸ポリメラーゼによ
る核酸合成に基づいて行われることが多い。多数のその
ようなポリメラーゼは、伸長されてそのような核酸合成
を開始することができるプライマーの存在を必要とす
る。

【００２０】本明細書で用いる「実質上増幅不能」の語
は、任意の試験管内操作における核酸増幅の阻害を表
す。核酸が「実質上増幅不能」であるといえば、核酸分
子の大半（≧５０％）が、例えばＰＣＲまたはＬＣＲに
よって増幅できず、または増幅を阻害される。「実質上
増幅不能」の語は、核酸配列の増幅が妨げられ、もしく
は増幅を阻害されることを表すが、それでもなお若干の
増幅は起こり得る。ただし「実質上増幅不能」なそのよ
うな核酸の「バックグラウンド」増幅は、「実質上増幅
可能」である他の核酸の増幅とは区別できる。相対的に
いうと「実質上増幅可能」である核酸は「実質上増幅不
能」な核酸より一層大幅に（少なくとも２倍以上に）増
幅される。通常の当業者であれば、この発明でいう「実
質上増幅不能」な核酸と「実質上増幅可能」な核酸の増
幅とを区別する制御を容易に利用し得よう。

【００２１】

【好ましい実施態様】第１の実施態様では、４種の正常
なリボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ）またはデオキ
シリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の１またはそ
れ以上を、外来試料ヌクレオチドに置き換えた第１試料
について増幅反応を実施する。残存し得る汚染した増幅
生産物があれば、第２の増幅の前に、外来試料ヌクレオ
チドを含有する核酸を実質上増幅不能とする物理的、化
学的、酵素的、または生物学的処理を行う。処理は独立
した段階として実施し得、あるいは好ましくは増幅すべ
き核酸配列を含んでいる第２試料の存在で実施し得る。
第２試料を汚染する第１試料由来の増幅された核酸配列
は、第２試料の核酸配列の増幅中、さらに実質上増幅さ
れない。デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＵＴ
Ｐ）を、本明細書ではＰＣＲで例示した酵素的ＤＮＡ増
幅反応へ都合よく挿入され得、それによってデオキシウ
リジン含有ＤＮＡを生じ得る外来試料ヌクレオチドの例
として示した。そのような反応のＤＮＡ生産物は、通例
多数のウラシル塩基を含んでいる。天然ＤＮＡと成績物
デオキシウリジン含有増幅反応生産物との識別は、ウラ
シルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）酵素によって行い
得る。ウラシル塩基を含有するＤＮＡをウラシルＤＮＡ
グリコシラーゼで処理することにより、ＤＮＡ糖−リン
酸骨格のデオキシリボースとウラシル塩基の間のグリコ
シド結合の切断を生じる。ウラシルの喪失によってＤＮ
Ａにアピリミジン部位が生じ、そのために、ＤＮＡポリ
メラーゼがＤＮＡ鎖を相補的なＤＮＡ鎖合成の鋳型とし
て利用するのを遮断する［Ｒ.シャーパーら、プロシー
ディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８０巻、４８７頁
（１９８３年）］。各ＤＮＡ標的分子内の相当数のアピ
リミジン部位の存在は、ＤＮＡポリメラーゼを利用して
標的ＤＮＡのコピーを合成する増幅反応を妨害する。つ
いでグリコシド結合のＵＤＧ切断後に残存するＤＮＡ糖
−リン酸骨格を、エンドヌクレアーゼIV、アルカリ性加
水分解、Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−ＬｙｓおよびＬｙｓ−Ｔｙｒ
−Ｌｙｓのような塩基性残基間に芳香族残基を含んでい
るトリペプチド［ピエールら、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)、２５６
巻、１０２１７〜１０２２６頁（１９８１年）］等によ
って切断することができる。

【００２２】本明細書に例示したように、基本的な増幅
プロトコールは周知のＰＣＲ法である。ＰＣＲを下記の
３種の態様で修飾した。即ち、（１）ｄＴＴＰをｄＵＴ
Ｐで置換し、（２）ＵＤＧを最初のＰＣＲ反応混合物へ
添加し、（３）ＵＤＧがその前のＰＣＲ反応の汚染生産
物を破壊し得るように、最初のインキュベーション期間
を追加した。ＵＤＧ自身は、第１のＰＣＲサイクルにお
ける高温によって恒久的に失活させるか、あるいは最近
好まれるＰＣＲプロトコールでＴａｑポリメラーゼで用
いる高温で活性でなくする。この失活によって、新たに
合成されたＰＣＲ生産物を、ＵＤＧが破壊するのを防止
する。ＵＤＧ活性を常に消滅させるとは限らない核酸増
幅プロトコールでは、超ＵＤＧ不活性化段階が必要であ
ろう。外来試料ヌクレオチドを含有する核酸を増幅操作
抵抗性にする物理的、化学的、酵素的、または生物学的
な処理の終結（本明細書で例示したＵＤＧの加熱失活の
ような）は好ましいが、この態様はまた終結段階を欠い
た変法をも包含する。例えば予測される出発物質の汚染
を除去するのに十分高いが、増幅率を維持するには不十
分である酵素量および処理期間を用い得る。換言すれ
ば、処理は汚染核酸を破壊できるかもしれないが、増幅
操作は、その処理が新たに合成された核酸を破壊できる
より一層速やかに、新しい核酸をなお生産できる。

【００２３】本明細書で記載した実施態様に関して、さ
らに変法が予想され得る。例えば外来試料ヌクレオチド
なしに（即ち、正常なヌクレオチドを使用して）、増幅
を実施し得る。増幅されたＤＮＡ中の正常なヌクレオチ
ドを、ついで外来試料ヌクレオチドへ変換する。ついで
変換されたＤＮＡを、あとから汚染した任意の試料から
除去することができる。１例を挙げれば、隣接したピリ
ミジン残基、特にチミジンをピリミジン２量体（チミジ
ン２量体）へ変換し、それによってＤＮＡを鋳型として
適合しなくする。またチミジン２量体を、エンドヌクレ
アーゼVIIおよびｒｅｃＢＣのような酵素によって除去
することもできる。この発明の方法は、そのような増幅
生産物の検出分析を妨害されることなく、ただしそのよ
うな増幅生産物が、その後の増幅反応で鋳型として作動
する能力を破壊するある種の処理に独自に感受性となる
態様で、増幅生産物をもとの核酸基質から識別し得るよ
うにする。この態様の方法によって増幅されるべき試料
の前処理は、この感受性に基づいて、その前の増幅の任
意の汚染生産物を試料から除去することを可能とする。
第１の実施態様では、増幅反応そのものの間に外来試料
ヌクレオチドを増幅生産物へ挿入し、そのような増幅さ
れた配列をもとの試料から識別する。第２の実施態様で
は、増幅生産物を識別するのに使用する外来試料ヌクレ
オチドを、増幅前にオリゴマーまたはポリマーの一部と
して提供するが、第１の実施態様の外来試料ヌクレオチ
ドは、増幅中にポリマー核酸へ挿入されることとなるヌ
クレオシド三リン酸として提供される。第２の実施態様
の方法は、特異的な核酸配列を増幅するのに酵素を利用
する任意の試験管内反応、特にＰＣＲおよびＬＣＲへ適
用し得る。

【００２４】第２の実施態様の好ましい変法では、外来
試料ヌクレオチドを含有するプライマーを使用する増幅
によって生産された核酸生産物が、外来試料ヌクレオチ
ドを含有する増幅によって生産されない出発鋳型とは化
学的に異なっている。この化学的な差異により、外来試
料ヌクレオチドを含有するプライマーを使用した増幅に
よって生産された核酸生産物が、さらにそれ以上指数増
幅できなくすることができる。プライマーまたはプロー
ブへ外来試料ヌクレオチドを挿入することによって、そ
のような増幅操作中に生産されたＤＮＡまたはＲＮＡ
を、増幅前の試料中に存在するもとの核酸から区別する
ことができる。所望により、複製する核酸へ挿入するた
めの外来試料ヌクレオチドを、増幅反応自体によってさ
らに追加的に提供し得る。標準的には、オリゴヌクレオ
チド中の４種のリボヌクレオチド（ＡＴＰ、ＵＴＰ、Ｃ
ＴＰ、ＧＴＰ）、またはデオキシヌクレオチド（ｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）の１またはそれ以
上を、１種またはそれ以上の外来試料ヌクレオチドで置
き換えたオリゴヌクレオチドを使用する。高比率の外来
試料ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを利用す
る実施態様の方が、それより低比率の外来試料ヌクレオ
チド含有オリゴヌクレオチドで実施する態様より好まし
い。特にオリゴヌクレオチドの３'ＯＨ−末端に外来試
料ヌクレオチドの高画分を配置したオリゴヌクレオチド
は好ましい。別の好ましい実施態様では、外来試料ヌク
レオチドは３'ヌクレオチドである。

【００２５】第２の実施態様の１変法では、増幅された
核酸を増幅不能とする外来試料ヌクレオチドプライマー
の処理を、増幅反応開始前に実施する。第２の実施態様
の別の変法では、第１の増幅反応を終結し、さらに分析
のため増幅生産物の試料を採取したのち、ただしもとの
出発核酸を新たな次の増幅反応へ加える前に、増幅され
た核酸を増幅不能とする処理を実施する。例えば増幅
し、分析のため増幅生産物を採取したのち、残存し得る
増幅生産物に、外来試料ヌクレオチドを含有する増幅生
産物を実質上増幅不能とする処理を行う。外来試料ヌク
レオチドを含有する増幅された核酸を増幅不能とするそ
のような処理は、物理的、化学的、酵素的、または生物
学的処理であり得る。そのような処理は独立した段階と
して実施し得、あるいは好ましくは増幅すべき核酸配列
を含有する第２試料の存在で実施し得る。したがって第
２試料を汚染する外来試料ヌクレオチドの存在で第１試
料を増幅することにより生産された増幅された核酸配列
は、これと同一のオリゴヌクレオチド（複数もあり）を
プライマーまたはプローブとして使用したとしても、核
酸配列の第２のオリゴヌクレオチド依存性の増幅中にさ
らに実質上増幅されない。

【００２６】外来試料ヌクレオチドデオキシウリジンを
含有しない核酸と、増幅反応のデオキシウリジン含有生
産物との識別は、ＵＤＧ酵素によって達成され得る。ウ
ラシル塩基を含有するＤＮＡをＵＤＧで処理することに
より、ＤＮＡ糖−リン酸骨格のデオキシリボースとウラ
シル塩基の間のグリコシド結合の切断を生じる。ウラシ
ルの喪失によってアピリミジン部位がＤＮＡに生じ、そ
のために、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鎖を相補的なＤ
ＮＡ鎖の合成の鋳型として利用するのを遮断する［Ｒ.
シャーパーら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・Ｕ
ＳＡ、８０巻、４８７頁（１９８３年）］。各ＤＮＡ標
的分子内の相当数のアピリミジン部位の存在は、ＤＮＡ
ポリメラーゼを利用して標的ＤＮＡのコピーを合成する
増幅反応を妨害する。ついでグリコシド結合のＵＤＧ切
断後に残存するＤＮＡ糖−リン酸骨格を、エンドヌクレ
アーゼIV、アルカリ性加水分解、Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙ
ｓおよびＬｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓのような塩基性残基間
に芳香族残基を含んでいるトリペプチド［ピエールら、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２
５６巻、１０２１７〜１０２２６頁（１９８１年）、お
よびデッチュら、ミューテーション・リサーチ(Mutatio
n Research)、２３６巻、１７３〜２０１頁（１９９０
年）］等によって切断することができる。

【００２７】外来試料ヌクレオチドを含有するプライマ
ーを提供することにより、増幅される各ＤＮＡ鋳型鎖の
５'末端にそのような外来試料ヌクレオチドを配置す
る。デオキシウリジン含有プライマーを使用し、試料を
ＵＤＧで処理すると、各ＤＮＡ標的鋳型分子の５'末端
にそれぞれ相当数のアピリミジン部位が見いだされる。
そのようなアピリミジン部位は、新たに作成された鎖の
３'末端で伸長を妨害する。これらの３'末端配列はもと
の外来試料含有プライマーが結合する標的である。即ち
これらのプライマーは、外来試料ヌクレオチド含有プラ
イマーによって開始される分子に由来する核酸を結合で
きる標的配列を有する。その末端またはその近くにデオ
キシウリジンを含有するオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ
糖−リン酸骨格のデオキシウリジンとウラシル塩基の間
のグリコシド結合のＵＤＧによる切断に対して実質上感
受性ではない。したがって特にＬＣＲ反応では、その末
端またはその近くにデオキシウリジンを含有するそのよ
うなオリゴヌクレオチドは、ＵＤＧ処理後でも増幅可能
である。

【００２８】好ましくはＬＣＲによって増幅したのち、
連結、即ちライゲーションしたデオキシウリジンを含有
するオリゴヌクレオチド（プローブ）は、実質上ＵＤＧ
によって切断され、それによってライゲーション、即ち
連結したオリゴヌクレオチドの糖−リン酸骨格でアピリ
ミジンデオキシリボースを生成する。生じた糖−リン酸
骨格を、エンドヌクレアーゼIV、アルカリ性加水分解、
塩基性残基間に芳香族残基を含むトリペプチド［ピエー
ルら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、２５６巻、１０２７１〜１０２２０頁（１９９１
年）］等で処理することによって切断できる。即ち、Ｕ
ＤＧ処理、および所望により糖−リン酸骨格の切断は、
ライゲーション生産物の増幅を実質上防止し、それによ
ってそのような増幅生産物を識別し、その後の増幅反応
から可能な限り汚染物を除去することができる。

【００２９】本明細書で例示したデオキシウリジン以外
の外来試料ヌクレオチドも想定し得る。多数のＤＮＡグ
リコシラーゼが当業界で既知である。化学的または酵素
的にオリゴヌクレオチドへ挿入し得る外来試料ヌクレオ
チド、およびそれに作用するＤＮＡグリコシラーゼがこ
の発明に使用し得る。その他の外来使用ヌクレオチドは
当業者にとって自明のものであろう。例えばＤＮＡ増幅
に使用されるＲＮＡプライマーは、塩基または好適なリ
ボヌクレアーゼ（ＲＮＡ分解酵素）によって容易に破壊
できる。ＲＮＡ分解酵素Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリ
ッドのＲＮＡを分解し、多数の１本鎖ＲＮＡ分解酵素
は、変性段階後に１本鎖ＲＮＡを消化するのに有用であ
ることが知られている［汚染ＤＮＡのＲＮＡ分解酵素Ｈ
による消化後、ただしその変性前に、ＲＮＡプライマー
に対応するＤＮＡ鎖が１本鎖デオキシリボヌクレアーゼ
（ＤＮＡ分解酵素）によって除去されなければ、汚染す
るＤＮＡは直線的な態様で増幅されることに注意。ただ
しオリゴヌクレオチド依存性のＤＮＡ増幅の大部分はＤ
ＮＡを指数的に増幅しようとするから、汚染水準が極度
に高くなければこれは問題にならないであろう。ＲＮＡ
で開始されるこの発明の変法を考案する通常の当業者
は、不必要な実験をしなくても、測定における最低汚染
許容水準を決定できるはずである］。もう１つの実施態
様では、ブロモデオキシウリジン（ＢｄＵＲ）を含むデ
オキシオリゴヌクレオチドを外来試料ヌクレオチドとし
て使用する。ＢｄＵＲを含有するＤＮＡは、好適な条件
下で光に露出することによって分解され得る。

【００３０】本明細書で例示したように、第２の実施態
様の好ましい変法では、基本的な増幅プロトコールＰＣ
Ｒを、（１）最初に、デオキシチミジンを置換したデオ
キシウラシルを含有するオリゴヌクレオチドプライマー
を使用して増幅を実施し、増幅生産物の試料を分析のた
めに採取し、（２）ついでＵＤＧをその次のＰＣＲ反応
混合物へ添加し、（３）ＵＤＧが、その前のＰＣＲ反応
からの汚染生産物中のウラシル含有配列に作用できるよ
うにインキュベーション期間を追加する３種の態様で修
飾する。本明細書で例示したように、第２の実施態様の
別の好ましい変法では、基本的な増幅プロトコールＬＣ
Ｒを、（１）最初に、オリゴヌクレオチドの少なくとも
１末端またはその近くに、デオキシチミジンを置換した
デオキシウラシルを含有するオリゴヌクレオチドプロー
ブを使用して増幅を実施し、増幅生産物の試料を分析の
ために採取し、（２）ついでＵＤＧをその次のＬＣＲ反
応混合物へ添加し、（３）ＵＤＧが、その前のＬＣＲ反
応からの汚染生産物中のウラシル含有配列に作用できる
ようにインキュベーション期間を追加する３種の態様で
修飾する。ＵＤＧ処理だけで、プローブ末端の近くにデ
オキシウラシルを含有するオリゴヌクレオチドプローブ
の増幅に実質上影響を与えることなく、ウラシル含有ラ
イゲーション生産物の増幅を実質上防止することが判明
した。ＵＤＧ処理単独の別法として、ＵＤＧおよび糖−
リン酸骨格（ＵＤＧ処理後に残存する）切断処理を用い
得る。そのような糖−リン酸骨格を切断する処理は、エ
ンドヌクレアーゼIV、アルカリ性加水分解、Ｌｙｓ−Ｔ
ｒｐ−ＬｙｓおよびＬｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓのようなト
リペプチド［ピエールら、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー、２５６巻、１０２１７〜１０２
２０頁（１９８１年）］、エンドヌクレアーゼＶのよう
なＡＰエンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼIII、
エンドヌクレアーゼVI、エンドヌクレアーゼVII、ヒト
エンドヌクレアーゼII等［Ｓ. リン、ニュークリエーシ
ズ・インボルブド・イン・ＤＮＡ・リペア・イン・ニュ
ークリエーシズ(Nucleases Involved in DNA Repair in
Nucleases)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、Ｓ.リンお
よびＲ. ロバーツ編（１９８５年）］を包含し得るが、
それだけに限定されるものではない。

【００３１】増幅反応を続ける前に、ＵＤＧおよび糖−
リン酸骨格（存在すれば）を切断する酵素処理を失活さ
せるべきである。ＵＤＧおよび糖−リン酸骨格を切断す
る酵素処理は、第１のＰＣＲまたはＬＣＲサイクルで高
温により、あるいは最近好まれるＰＣＲまたはＬＣＲプ
ロトコールにおいてＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼまたは
Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼでそれぞれ用いられる高温の何
れかによって恒久的に失活され得る。この失活によっ
て、新たに合成されたＰＣＲまたはＬＣＲ生産物をＵＤ
Ｇが破壊するのを防止する。本来、必ずしも常にＵＤＧ
活性を解消しない核酸増幅プロトコールでは、超ＵＤＧ
不活性化段階が必要である。

【００３２】外来試料ヌクレオチドを含有するオリゴヌ
クレオチドの占める比率が大きい態様ほど好ましい。た
だし２種のオリゴヌクレオチドプライマーに依存する標
準的なＰＣＲ実施態様でも、少なくとも１プライマーが
外来試料ヌクレオチドを含んでいる限り、この発明では
ＰＣＲ汚染を増幅不能にすることが可能である。必ずし
もすべてではないが、単一の外来試料ヌクレオチド含有
オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲまたはＬＣＲ生産物の増
幅を与えられた状況に対して十分に低水準化し得る。通
常の当業者であれば不必要な実験をしなくても、ＰＣＲ
またはＬＣＲ測定の日常的な最適化および試験中、どの
プライマーまたはプローブが許容し得るかを経験的に決
定できる。オリゴヌクレオチドの適合性試験を目的とす
る日常的測定の最適化は、（１）外来試料ヌクレオチド
を含有するオリゴヌクレオチドを作成し、（２）このオ
リゴヌクレオチドを使用する標的配列の第１核酸増幅を
実施し、（３）生じた第１生産物の各種の量を標的配列
を含有しない新たな第２増幅に播種し、（４）第２増幅
を、外来試料ヌクレオチド含有核酸が増幅不能となるよ
うに処理し、（５）第２増幅を実施し、（６）第１のハ
イブリダイゼーションからの汚染配列の存在について生
じた第２生産物を検定することによって実施できる。こ
れらすべての段階は、実験的制御として、また方法の正
常な正当性の一部として日常的に実施される。この実施
態様を実行するものにとって必要な唯一の追加的作業
は、必要であり得る任意の追加的なオリゴヌクレオチド
の日常的な合成である。一般にオリゴヌクレオチドが好
適でないと判明したら、代替物を見いだし、同様に試験
することは容易にできる。

【００３３】当業者にとって自明なように、この発明の
方法は指数的増幅を防止し得るが、直線的増幅を防止し
得ない。直線的な増幅は、通常必ずしも増幅反応の実質
的な問題とはならない。例えば１サイクル２倍の係数で
増幅するＰＣＲの２０サイクルを実施した試料を汚染す
る１回の増幅生産物分子は、直線的な増幅であれば、約
２０分子を生じるに過ぎないが、もし最大理論効率で指
数的に増幅したのであれば、約１００万分子に達し得
る。したがって直線的増幅は一般にさほど重要ではな
い。

【００３４】第２の実施態様は核酸ポリメラーゼを使用
しない増幅で使用するのに適合できる。例えば本明細書
に例示したように、その前に作成した生産物による試料
の汚染は、リガーゼでオリゴヌクレオチドを重合する増
幅方式によって制御することができる［例えばウーおよ
びワレース（前掲）、およびバラニー、プロシーディン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８８巻、１８９〜１９３
頁（１９９１年）］。

【００３５】この発明はまた、キットの作成に理想的に
好適である。そのようなキットは、バイアル、試験管、
瓶等のような１またはそれ以上の容器構造を密に収納し
得る区画された運搬構造を含み得る。この容器構造は、
それぞれデオキシウリジンを含有するオリゴヌクレオチ
ドのような外来試料ヌクレオチドを含有するオリゴヌク
レオチド、デオキシウリジンのような外来試料ヌクレオ
チド、核酸リガーゼ、核酸ポリメラーゼ、ウラシルＤＮ
Ａグリコシラーゼ等を含み得る。おのずから明らかなよ
うに、核酸リガーゼ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ等
のようなキットに含まれる成分を、各種の組み合わせで
混合し得、そのような組み合わせを単数または複数の容
器構造に含み得る。以上この発明を全般的に説明した
が、この発明についてさらに理解を深めるため、実施例
をあげて説明する。実施例は単にこの発明を説明するた
めのものであって、ほかに指定しない場合、これによっ
て発明の範囲を限定する目的をもつものではない。

【００３６】

【実施例】実施例１ ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行うことにより、ヒト
パピローマウイルス１６型(ＨＰＶ１６)ＤＮＡの領域を
増幅させた(ダースト等、「プロシーディングス・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」
(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ)８０:３８１２
(１９８３))。使用されたプライマーの配列は、５'ＧＧ
ＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴＴＧ３'および５'Ｇ
ＴＣＴＡＣＧＴＧＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣ３'であっ
た。ＨＰＶ１６ＤＮＡを、制限酵素ＢamＨＩにより完全
長プラスミドクローン、pＴ７ＨＰＶ１６(この発明の意
図としては、シードフ等、「バイロロジー」(Ｖirol.)１
４５:１８１(１９８５)により記載されたpＵＣ８プラス
ミドと均等である)から切除した。５０マイクロリット
ルの２５ミリモルのトリスＨＣl(pＨ８.３)、５ミリモ
ルのＭgＣl₂、５０ミリモルのＮaＣl、０.０１％のゼラ
チン、０.０５％のＷ１ポリオキシエチレンエーテル洗
浄剤(シグマ)、各々０.２ミリモルのdＡＴＰ、dＧＴ
Ｐ、dＣＴＰ、０.２ミリモルのdＵＴＰまたはdＴＴＰ、
１マイクロモルの各プライマーおよびサーマス・アクア
ティクス(シータス／パーキン-エルマー)からの耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼ２.５単位を含むＰＣＲ反応物に、
線状ＤＮＡ(１０ピコグラム)を加えた。次の温度プロフ
ィール:９４℃で５分間、次いで９４℃で１分間(変
性)、５５℃で２分間(アニーリング)および７２℃で３
分間(プライマー伸長)から成る３０サイクルを用いて、
熱サイクラー(cylcer)(シータス／パーキン−エルマー)
中で反応物を増幅させた。温度サイクルの完了後、７２
℃１０分の最終伸長が行なわれた。２８４塩基対ＨＰＶ
１６ＤＮＡフラグメントの増幅は、ＰＣＲ反応産物のア
ガロース／臭化エチジウム・ゲル電気泳動(マニアチス
等、「モレキュラー・クローニング」(Ｍolecular Ｃloni
ng)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
(１９８２))(１レーン当たり各反応物５マイクロリット
ル)により確認された。反応物は全てかなりの増幅を示
した。ＨＰＶ １６ＤＮＡが加えられなかった陰性対照
反応物からは、認識可能なＤＮＡ産物は全く生じなかっ
た。

【００３７】ＰＣＲ増幅産物の濃度を、アガロースゲル
から評価した。新たなＰＣＲ反応物は、１０フェムトメ
ートル量の、dＴＴＰの導入から生じるデオキシチミジ
ンまたはdＵＴＰ含有反応物からのデオキシウリジンを
含む増幅産物により汚染されていた。陽性対照反応物
は、１０ピコグラムの線状ＨＰＶ１６ＤＮＡを含んでい
た。陰性対照反応物は標的ＤＮＡを受け入れなかった。
新しいＰＣＲ反応物は、dＴＴＰの代わりにdＵＴＰを含
み、さらに５ナノグラムのＵＤＧ(ファン・デ・サン
ド、ユニバーシティー・オブ・カルガリー、ライフ・テ
クノロジーズ・インコーポレイテッド(ピー・オー・ボ
ックス９４１８、ガイザースバーグ、メリーランド、２
０８９８)からも入手可能)を含むか、ＵＤＧを全く含ま
なかった。全反応物を３７℃で１５分間インキュベーシ
ョンすることにより、ＵＤＧのデオキシウリジン含有Ｄ
ＮＡに対する作用を行わせ、次いで上記の同じ熱サイク
ル・プロトコールに付した。各反応物のアリコートを、
アガロース／臭化エチジウム・ゲル電気泳動により分析
した。アガロース・ゲル分析は、ＵＤＧ処理を行わなく
ても、デオキシウリジン含有ＰＣＲ産物が再増幅された
結果、ゲル電気泳動によって立証されている通り、正常
ＨＰＶ１６ＤＮＡを増幅することにより得られる産物と
サイズの点で事実上区別がつかないＤＮＡ産物を与え得
ることを示した。ＰＣＲ前にデオキシウリジン含有ＤＮ
ＡをＵＤＧとインキュベーションした反応物は、アガロ
ース・ゲル上に認識可能な産物を与えなかった。デオキ
シチミジンを含むＰＣＲ増幅産物は、それらをＵＤＧと
インキュベーションした場合もしなかった場合もうまく
増幅された。この実験は、ＵＤＧが、デオキシウリジン
を含むＰＣＲ産物の増幅を実質的に阻止するが、デオキ
シチミジンを含むＤＮＡの増幅に対する実質的な作用は
全くもたないことを示した。前記内容は第１態様の特に
好ましい変形に関するものであるが、この態様はその通
りに限定されるわけではないことは明白である。当業界
の通常熟練者であれば、開示された実施態様に様々な修
正が加えられ得ること、およびそれらの修正もこの態様
の範囲内に含まれるものとされることは容易に想到でき
るはずである。

【００３８】実施例２ 第２態様の一般的実験条件 ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行うことにより、ヒト
パピローマウイルス１６型(ＨＰＶ１６)ＤＮＡの領域を
増幅させた(ダースト等、「プロシーディングス・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」
(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ)８０:３８１２
(１９８３))。使用されたオリゴヌクレオチドプライマ
ーの配列は、５'ＧＧＵＣＧＡＵＧＵＡＵＧＵＣＵＵＧ
ＵＵＧ３'および５'ＧＵＣＵＡＣＧＵＧＵＧＵＧＣＵＵ
ＵＧＵＡＣ３'(各々dＵプライマーdＵ₁およびdＵ₂)また
は５'ＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴＴＧ３'お
よび５'ＧＴＣＴＡＣＧＴＧＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣ
３'(各々対照dＴプライマーdＴ₁およびdＴ₂)であった。
ただし、ＴをＵと置き換えた点を除くとdＴ₁およびdＵ₁
の配列は同一であり、dＴ₂およびdＵ₂も同様に同一であ
った。ＨＰＶ１６ＤＮＡを、制限酵素ＢamＨＩにより完
全長プラスミドクローン、pＴ７ＨＰＶ１６(この発明の
意図としては、シードフ等、「バイロロジー」(Ｖirol.)
１４５:１８１(１９８５)により記載されたpＵＣ８に基
づくプラスミドと均等である)から切除した。５０マイ
クロリットルの２５ミリモルのトリスＨＣl(pＨ８.
３)、５ミリモルのＭgＣl₂、５０ミリモルのＮaＣl、
０.０１％のゼラチン、各々０.２ミリモルのdＡＴＰ、d
ＧＴＰ、dＣＴＰ、０.２ミリモルのdＵＴＰまたはdＴＴ
Ｐ、１マイクロモルの各プライマー、およびサーマス・
アクアティクス(シータス／パーキン-エルマー)からの
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ２.５単位を含むＰＣＲ反応
物に、線状ＤＮＡ(１０ピコグラム)を加えた。プライマ
ーおよびトリホスフェートを次の要領で対にした。すな
わち、dＵプライマーとdＴＴＰ(pＵxＴ反応物(「Ｔによ
り伸長されたＵによりプライムされた」という英文の略
語))および対照dＴプライマーとdＵＴＰ(pＴxＵ反応
物)。次の温度プロフィール:９４℃で５分間、次いで９
４℃で１分間(変性)、５５℃で２分間(アニーリング)お
よび７２℃で３分間(プライマー伸長)から成る３０サイ
クルを用いて、熱サイクラー(cylcer)(シータス／パー
キン−エルマー)中で反応物を増幅させた。温度サイク
ルの完了後、７２℃１０分の最終伸長が行なわれた。２
８４塩基対ＨＰＶ１６ＤＮＡフラグメントの増幅は、Ｐ
ＣＲ反応産物のアガロース／臭化エチジウム・ゲル電気
泳動(マニアチス等、「モレキュラー・クローニング」(Ｍ
olecular Ｃloning)、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー(１９８２))(１レーン当たり各反応物５
マイクロリットル)により確認された。反応物は全てか
なりの増幅を示した。ＨＰＶ １６ＤＮＡが加えられな
かった陰性対照反応物からは、ＤＮＡ産物は全く生じな
かった。ＰＣＲ増幅産物の濃度を、アガロースゲルから
評価した。

【００３９】実施例３ ２つのデオキシウリジン含有プライマーを用いた増幅。
dＴＴＰを含むがdＵプライマーを欠く新しいpＵxＴ Ｐ
ＣＲ反応物を製造した。これらは前反応によるpＵxＴ増
幅産物１０フェムトメートルにより汚染されていた。こ
れらを、ＵＤＧ(ファン・デ・サンド、ユニバーシティ
ー・オブ・カルガリー、ライフ・テクノロジーズ・イン
コーポレイテッド(ピー・オー・ボックス９４１８、ガ
イザースバーグ、メリーランド、２０８９８)からも入
手可能)の存在または非存在下３７℃で１５分間インキ
ュベーションした。次いで、これらの反応物を９４℃で
インキュベーションすることによりＵＤＧを不活化し、
１５℃に冷却し、dＵプライマーを加えた。新しいpＴx
Ｕ ＰＣＲ反応物をdＴプライマーおよびdＵＴＰにより
製造した。これらは１０フェムトグラムのpＴxＵ増幅産
物により汚染されていた。これらの反応物をＵＤＧの存
在または非存在下３７℃で１５分間インキュベーション
することにより、各々ＵＤＧ活性およびＰＣＲ増幅に関
する対照として機能させた。次いで、新しいＰＣＲ反応
物を上記の同じＰＣＲ温度サイクルに付した。アガロー
ス／臭化エチジウム・ゲル電気泳動は、ＵＤＧ処理の非
存在下でも、pＵxＴおよびpＴxＵ反応産物は両方ともＰ
ＣＲにより再増幅されることにより、ＨＰＶ１６ＤＮＡ
の増幅時に得られた結果と見かけ上同じ結果を与え得る
ことを示した。反対に、ＵＤＧ処理は、dＵプライマー
を含む、pＴxＵ反応産物(陽性対照)およびpＵxＴ反応産
物の両方の再増幅を阻止した。別の実験で、プライマー
または伸長産物におけるデオキシウリジンの非存在下で
は、ＵＤＧは天然ＨＰＶ１６ＤＮＡのＰＣＲ増幅に全く
作用しないことが示された。ＵＤＧ処理を行わない場
合、デオキシウリジン含有ＰＣＲ産物を再増幅した結
果、アガロースゲル電気泳動によって立証されている通
り、デオキシウリジンを含まず、正常ＨＰＶ１６ＤＮＡ
を増幅することにより得られる産物とサイズの点で事実
上区別がつかないＤＮＡ産物を与え得ることが示され
た。ＤＮＡがデオキシウリジン含有プライマーにより作
製され、ＰＣＲ前にＵＤＧとインキュベーションされた
反応物は、アガロース・ゲル上に認識可能な産物を与え
なかった。別の実験で、ＵＤＧは天然ＤＮＡの増幅に作
用しないことが示された。

【００４０】実施例４ 単一デオキシウリジン含有プライマーを用いた増幅。さ
らに別の実験は、２つのＰＣＲプライマーの一方のみが
エキソ試料ヌクレオチドを含む必要があることを立証し
た。ＰＣＲ増幅は、次のプライマーの対を用いて本質的
には上記要領で行なわれた。すなわち、(１)dＴ₂とd
Ｔ₁、(２)dＵ₂とdＴ₁、(３)dＴ₂とdＵ₁および(４)dＵ₂
とdＵ₁。ＰＣＲの第２ラウンド前に、ＵＤＧの存在下お
よび非存在下の両方でＰＣＲ産物の全組み合わせを処理
した。増幅(１)はＰＣＲ増幅の成果について試験し、増
幅(４)はＵＤＧの活性および汚染排除能力について試験
した。増幅(３)は、第２ラウンドのＰＣＲでのＵＤＧ処
理後には実質的に再増幅されないことが観察されている
ため、試料汚染物質の作用を低減化または排除するため
には一対のＰＣＲプライマーの一方のみがエキソ試料ヌ
クレオチドを含む必要があることを立証した。増幅(１)
よりもかなり低いレベルではあるが、増幅(２)は再増幅
されることが観察された。 要旨 要約すると、ＵＤＧが全く存在しない場合、プライマー
(複数もあり得る)中にデオキシウリジンを含むＰＣＲ増
幅産物はうまく増幅された。予めＵＤＧとのインキュベ
ーションを行うと増幅は阻止され得た。言い替えれば、
ＵＤＧは、デオキシウリジン含有プライマーにより作製
されたＰＣＲ産物の増幅を実質的に阻止し得るが、デオ
キシチミジン含有プライマーにより作製されたＤＮＡの
増幅に対する実質的な作用は示さなかった。

【００４１】実施例５ バラニーにより記載された(バラニー、「プロシーディン
グス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ
・アメリカ」(Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ)８
８、１８９−１９３、１９９１)リガーゼ連鎖反応(ＬＣ
Ｒ)に修正を加えることにより、ヒトベータグロビン遺
伝子領域の増幅を行った。ＬＣＲにおけるエキソ試料ヌ
クレオチドの適用を立証するこの実験の概略を図１に示
す。プローブオリゴヌクレオチドの配列は次の通りであ
った。 ＃１０８８(プローブ４):５' acc atg gtg cac ctg act ccu ３' #1089(プローブ３):５' gag gag aag tct gcc gtt act ３' ＃１０９０(プローブ２):５' cag gag tca ggt gca cca tg ３' ＃１０９１(プローブ１):５' cag taa cgg cag act tct ccu ３' 標的オリゴヌクレオチドの配列は次の通りであった。 ＃１０９２(標的): ５' gac acc atg gtg cac ctg act ccu gag gag aag tct gc c gtt act gcc ctg ３' 標準的技術によりオリゴヌクレオチドを化学的に合成し
た。それらを³²Ｐによりトレース標識し(各オリゴヌク
レオチド１ピコモル当たり約３０dpm)およびゲル精製
し、ハイブリダイゼーションおよび５％アガロース／臭
化エチジウムゲルによる電気泳動によりそれらの量を評
価した。サーマス・アクアティクスからの耐熱性ＤＮＡ
リガーゼを、ウィスコンシン、ミルウォーキーのモレキ
ュラー・バイオロジー・リソーシーズ(ＭＢＲ)から購入
した。ＵＤＧをライフ・テクノロジーズ、インコーポレ
イテッド(ガイザースバーグ、メリーランド)から購入し
た。使用された緩衝液は、ＭＢＲが提示したものであ
り、２０ミリモルのトリスＨＣl(pＨ７.５)、２５ミリ
モルのＫＣl、１０ミリモルのＭgＣl₂、１０ミリモルの
ジチオトレイトール、０.６ミリモルのＮＡＤ、０.１％
のトリトンＸ１００を含んでいた。プローブオリゴヌク
レオチド＃１０８９において、その５'末端を、Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼを用いて³²Ｐにより約２５００
００dpm／ピコモルの比活性に標識し、次いで非標識rＡ
ＴＰによりチェイスし、キナーゼを加熱不活化した。標
識＃１０８９オリゴヌクレオチドの最終濃度は１マイク
ロリットル当たり約１ピコモルであった。オリゴヌクレ
オチド＃１０９０において、その５'末端をrＡＴＰおよ
びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより燐酸化した。

【００４２】ＵＤＧ処理反応物は、２ピコモルの標的を
不含有または含有した４種の全トレース標識プローブオ
リゴ、各々２０ピコモルを含んでいた。これらの試料
を、０.５μl＝０.５単位のＵＤＧの存在または非存在
下３７°で１５分間油下１０μlの５０ミリモルのトリ
スＨＣl(pＨ８.０)、１ミリモルのＥＤＴＡ中でインキ
ュベーションした。それらは次の通りであった。 Ａ:プローブのみ、ＵＤＧ無し、 Ｂ:プローブのみ、＋ＵＤＧ、 Ｃ:プローブ＋標的、ＵＤＧ無し(ＬＣＲを助長すべきで
ある)、 Ｄ:プローブ＋標的＋ＵＤＧ(分解された標的、ＬＣＲ無
し)、 Ｅ:プローブのみ、＋ＵＤＧ。 ＵＤＧにより生成された脱塩基性部位(アピリミジン酸
部位)は全て、次の要領でアルカリ性加水分解により破
壊(すなわち、糖燐酸バックボーンの開裂)された。５つ
の管全てに、約１３のpＨを与える５μlの０.２モルＮa
ＯＨを加えた。管を９５°で１０分間インキュベーショ
ンし、冷却し、５μlの２.５％酢酸を加えてpＨを約５
に戻した。反応物中に存在する標的(オリゴ＃１０９２)
は全て、ＵＤＧによる塩基除去および高い温度およびp
Ｈによる糖燐酸バックボーンの破壊の組み合わせにより
開裂された。この時点で(アルカリ性pＨおよび加熱によ
るＵＤＧ不活化後)、１μl(２ピコモル)の標的(＃１０
９２)を反応物Ｅに加えた。すなわち、反応物「Ｅ」中の
標的は、活性ＵＤＧにさらされたのではなく、不活化Ｕ
ＤＧにさらされただけであった。アルカリ性加水分解反
応により生成された塩の濃度を減らすことにより、後続
のリガーゼ反応およびゲル電気泳動による干渉を回避し
た。５μlの各反応物を、１×ＭＢＲ緩衝液(２０ミリモ
ルのトリスＨＣl(pＨ７.５)、２５ミリモルのＫＣl、１
０ミリモルのＭgＣl₂、１０ミリモルのジチオトレイト
ール、０.６ミリモルのＮＡＤ、０.１％のトリトンＸ１
００)中で１:４０に希釈した。２０μlの各希釈オリゴ
混合物に０.５μl＝５００フェムトモルの³²Ｐ標識＃１
０８９を加えて、ＬＣＲ反応物の推移を追跡した。１０
フェムトモルの５'ＯＨ-標的＃１０９２の存在または非
存在下１００フェムトモルのプローブ５'ＯＨ-１０８
８、５'Ｐ-１０９０および５'-ＯＨ-１０９１、２００
フェムトモルの５'-³²Ｐ１０８９を含むこれらの混合物
４μlを、数対の管に等分し、１０単位のＭＢＲ Ｔaqリ
ガーゼを含有(「＋」)または不含有(「−」)の１×ＭＢＲ緩
衝液１６μlを加えた。一滴の油を２０μl反応物に加
え、シータス／パーキン・エルマー・サーマル・サイク
ラー中８５°３０秒、２０°２分、２０回のサイクルに
付した。標準的技術(マニアチス、前出)を用いて１２％
変性シークエンスゲルに各反応物２.５μｌを適用し
た。

【００４３】電気泳動およびＸ線フィルムへのゲル暴露
後、リガーゼの存在下で下記の結果が観察された。
「Ａ」反応(プローブのみ、ＵＤＧ処理無し)は、最少量
(出発プローブの約５％)の標的非依存性増幅を示した
(すなわち、約４０ヌクレオチドのライゲーション産物
が生成された)。「Ｂ」反応(ＵＤＧで処理したプローブ)
は、反応「Ａ」とは区別できない最少量の標的非依存性増
幅を示した。これは、ＵＤＧがプローブの組み込みに対
する作用を全くもたないことを示した。「Ｃ」反応(ＵＤ
Ｇ処理を伴わないプローブおよび標的を含む)は、プロ
ーブの大多数(約７０％)が標的依存性ライゲーションに
よる産物に変換されることを示した。反応「Ｄ」(ＵＤＧ
で処理されたプローブおよび標的を含む)は、存在する
ライゲーション産物の量におけるかなりの減少を示し
た。これは、標的中のウラシルがＵＤＧにより除去さ
れ、糖燐酸バックボーンが高いpＨおよび温度処理によ
り破壊された場合に予想される結果であった(図１)。反
応「Ｅ」(ＵＤＧで処理されたプローブ、およびpＨおよび
加熱によるＵＤＧ不活化後に加えられた標的)は、プロ
ーブの大多数(約７０％)がライゲーションされて産物を
形成したことを示した。この結果は、プローブがＵＤＧ
処理により影響されず、プローブがライゲーション反応
へ関与し得ることを立証した。反応Ｃ、ＤおよびＥで生
成された産物の量は、ＵＤＧが、標的オリゴヌクレオチ
ド配列に位置する(すなわち、末端ではない)ウラシルに
対しては活性を呈するが、オリゴヌクレオチドの３'末
端のウラシルに対しては不活性であることを示してい
る。また、ＵＤＧは、オリゴヌクレオチドの５'末端に
位置するウラシルに対しては比較的小さい活性しか示さ
ないことが立証された。プローブ＃１０８８の３'末端
のウラシルの存在を確認するため、反応ＣおよびＥの産
物をプールし、エタノールにより沈澱させ、２０μlの
水に溶かした。１モルのトリスＨＣl(pＨ８.０)１μlお
よび２０ミリモルのＥＤＴＡ１μlをプールしたオリゴ
ヌクレオチドに加え、２つの５μlアリコートを管中に
入れた。一方の管には、０.５μl(０.５単位)のＢＲＬ
ＵＤＧを加えた。他方には、０.５μlの水を加えた。両
管を３７°で１５分間インキュベーションし、各々に１
μlの１Ｎ ＮaＯＨを加えた。管を９５°で１５分間イ
ンキュベーションし、１μlの１２.５％酢酸を加えて混
合物を中和した。各反応物の約３分の１を１２％シーク
エンスゲルに適用した。オリゴヌクレオチド＃１０８８
の３'dＵの存在は、ＬＣＲ産物のＵＤＧ−特異的開裂に
より確認された。開裂産物のサイズは、まさしく関与し
ているオリゴヌクレオチドの構造から予測されるもので
あった。言い替えれば、オリゴヌクレオチド１０８８お
よび１０８９のライゲーション産物は、ＵＤＧおよび高
いpＨおよび温度の組み合わせにより開裂されたもの
で、ウラシルが関与しているオリゴヌクレオチドのライ
ゲーション接合点に存在することを示していた。

【００４４】要旨 オリゴデオキシヌクレオチド内のある位置、特に５'お
よび３'末端またはそれらの付近に存するウラシル塩基
は、酵素ウラシルＤＮＡグリコシラーゼにより除去され
なかった。オリゴデオキシヌクレオチド(複数もあり得
る)がＬＣＲ産物に組み込まれるときに、これらの位置
にあるウラシル塩基がＵＤＧに対して感受性を示す場
合、これはライゲーション連鎖反応増幅の繰り越し汚染
を制御する方法の基礎であり得る。本明細書に記載され
ている実施例では、オリゴデオキシヌクレオチドの３'
末端のデオキシウラシル塩基はＵＤＧにより認識されな
い。一旦３'デオキシウラシルを含むオリゴヌクレオチ
ドがＬＣＲにより接合またはライゲーションされると、
ライゲーション産物はＵＤＧによる開裂およびアルカリ
性加水分解に対して感受性を示すようになった。すなわ
ち、この処理によって、増幅産物は後続のＬＣＲ反応で
増幅不可能になった。

【００４５】実施例６ 実施例５に記載されているＬＣＲの修正を行うことによ
り、ＵＤＧが単独で（糖燐酸バックボーンのアルカリ性
加水分解無し）ウラシル含有増幅産物の増幅を阻止する
能力を測定した。２０μl反応物は、指示通り１００フ
ェムトモルのプローブオリゴ(５'ＯＨおよび３'dＵ随伴
１０８８および１０９１、５'燐酸随伴１０８９および
１０９０、³²Ｐで標識した１０８９)、５フェムトモル
の標的＃１０９２(内部dＵ)または＃１０５８(dＵ無
し)、５単位のＴaqリガーゼおよび０.２５μlのＢＲＬ
ＵＤＧを含んでいた。反応物を集め、シータス／パーキ
ン-エルマー・サーマル・サイクラー中鉱油下で、３７
℃９０分、８５℃５分、次いで８５℃３０秒、５５℃２
分間の２０サイクルでインキュベーションし、次に０℃
でインキュベーションした。１.２５μlアリコートの各
反応物を１２.５％ポリアクリルアミド／８モル尿素ゲ
ルに適用し、７０ワット電力で約９０分間電気泳動させ
た。補力スクリーンを用いて−７０℃で湿潤ゲルのオー
トラジオグラフを作製した。標的の非存在下で、プロー
ブオリゴの約５％を大きな産物にライゲーションした。
これは標的非依存性基底値を表す。５フェムトモルの標
的の存在下で、約７０フェムトモルのプローブオリゴ
(反応物中に存在する合計の７０％)がライゲーションし
て産物を形成した。０.２５μlのＵＤＧがdＴ標的含有
反応物中に存在する場合、得られたライゲーション産物
(約７０フェムトモル)の量に対する影響は全く観察され
なかった。反対に、ＵＤＧをdＵ標的(模擬汚染物質)と
インキュベーションしたとき、約１０フェムトモルのラ
イゲーション産物しか得られなかった。これらの観察結
果は、オリゴ１０８８および１０９１の３'dＵがＵＤＧ
による影響を受けなかったこと、および９０％を越える
dＵ模擬汚染物質がＵＤＧインキュベーションによって
プローブオリゴヌクレオチドのライゲーションに関する
基質ではあり得ない形態に変換されたことを示してい
る。

【００４６】要旨 ウラシル含有「ライゲーション産物」(＃１０９２)のＵＤ
Ｇ処理は、リガーゼ連鎖反応中における増幅を実質的に
阻止された。しかしながら、ＵＤＧで処理されなかった
ウラシル含有「ライゲーション産物」は増幅された。すな
わち、それ以上処理を行わなくても、後続ＬＣＲ反応試
料中に存在し得るウラシル含有ライゲーション汚染物質
の増幅を実質的に阻止するためには、ＵＤＧインキュベ
ーション単独で充分である。本明細書で挙げられている
全参考文献を引用して説明の一部とする。上述したこと
は特定の好ましい態様に関するものであるが、本発明は
そのように限定されるわけではないものと理解される。
当業界の通常熟練者において、開示されている態様に様
々な修正が加えられ得ること、およびそれらの修正も本
発明の範囲内に含まれるものとされることは容易に想到
されるはずである。この発明によって下記の各事項が可
能となる。 １．（ａ）第１試料の核酸を増幅し、ここでその増幅は
１またはそれ以上の特異的なオリゴヌクレオチドに依存
して行われ、そのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ
は、その末端の少なくとも１つまたはその近くで外来試
料ヌクレオチドを含有し、それによって外来試料ヌクレ
オチドを含有する増幅された核酸を生産し、 （ｂ）外来試料ヌクレオチドを含有する増幅された核酸
を実質上増幅不能とし、外来試料ヌクレオチドを含有し
ない核酸の増幅を実質上妨げない処理を第２試料に行な
う段階を含み、ここで、段階（ａ）のオリゴヌクレオチ
ドは、外来試料ヌクレオチドを含有する増幅された核酸
より、その処理に対し実質上感度が一層乏しく、それに
よって第２試料の核酸配列の増幅中、第２試料を汚染す
る第１試料由来の外来試料ヌクレオチドを含有する増幅
された核酸をさらに実質上増幅しない、試料中の１また
はそれ以上の核酸配列のオリゴヌクレオチド依存性の増
幅方法。 ２．処理が物理的、化学的、酵素的、または生物学的処
理の群のうちから選ばれた１に記載の方法。 ３．処理が酵素的処理である２に記載の方法。 ４．酵素的処理がウラシルＤＮＡグリコシラーゼによる
処理である３に記載の方法。 ５．外来試料ヌクレオチドがデオキシウリジンである４
に記載の方法。 ６．酵素的処理がＲＮＡ分解酵素による処理である３に
記載の方法。 ７．外来試料ヌクレオチドがリボヌクレオチドである６
に記載の方法。 ８．さらに（ｃ）第２試料の核酸配列を増幅する段階を
含む１、５、または７の何れか１項に記載の方法。 ９．さらに（ｄ）段階（ｂ）の処理を終結させる段階を
含む１、５、または７の何れか１項に記載の方法。 １０．終結を加熱によって行う９に記載の方法。 １１．（ａ）試料の核酸を１本鎖核酸として提供し、 （ｂ）試料中に、少なくとも４種のＤＮＡプローブを提
供し、ここで （１）プローブの第１および第２は１次プローブであ
り、プローブの第３および第４は２次核酸プローブであ
り、 （２）第１プローブは標的核酸の１次鎖の第１セグメン
トへハイブリッド形成し得る１本鎖であり、 （３）第２プローブは標的核酸配列の１次鎖の第２セグ
メントへハイブリッド形成し得る１本鎖であり、 （４）標的の１次鎖の第１セグメントの５'末端は、そ
のプローブを標的核酸の１次鎖へハイブリッド形成した
とき、第１プローブの３'末端が第２プローブの５'末端
へ接続できるように標的の１次鎖の第２セグメントの
３'末端に対して配置され、 （５）第３プローブは第１プローブヘハイブリッド形成
でき、 （６）第４プローブは第２プローブへハイブリッド形成
でき、 （７）少なくとも第１プローブの３'ヌクレオチドまた
は第２プローブの５'ヌクレオチドがデオキシウリジン
であり、 （８）少なくとも第４プローブの３'ヌクレオチドまた
は第３プローブの５'ヌクレオチドがデオキシウリジン
であり、そして （ｃ）（１）そのプローブを試料中の核酸でハイブリッ
ド形成し、 （２）ハイブリッド形成したプローブをライゲーション
して、連結したプローブ配列を形成し、 （３）試料中のＤＮＡを変性する反応サイクルを反復し
て実施し、 （ｄ）連結したプローブ配列を検出することによって、
連続した反応サイクルで連結された１次プローブおよび
連結された２次プローブの増加を検出する段階を含む試
料中の標的核酸を検出する方法。 １２．段階（ｂ）の（７）で、第１プローブの３'ヌク
レオチドおよび第２プローブの５'ヌクレオチドがデオ
キシウリジンである１１に記載の方法。 １３．段階（ｂ）の（８）で、第４プローブの３'ヌク
レオチドおよび第３プローブの５'ヌクレオチドがデオ
キシウリジンである１１に記載の方法。 １４．段階（ｂ）の（７）および（８）で、第１プロー
ブの３'ヌクレオチドおよび第４プローブの３'ヌクレオ
チドがデオキシウリジンである１１に記載の方法。 １５．段階（ｃ）の前に、さらに （ｅ）試料をウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理し、
それによって、連結しなかったプローブのデオキシウリ
ジンのウラシルとデオキシリボースの間のグリコシド結
合には実質上影響を与えず、連結したプローブのデオキ
シウリジンのウラシルとデオキシリボースの間のグリコ
シド結合を切断することにより核酸の糖−リン酸骨格に
アピリミジンデオキシリボースを形成する段階を含む１
１に記載の方法。 １６．さらに（ｆ）試料をエンドヌクレアーゼIVで処理
し、それによって糖−リン酸骨格を切断する段階を含む
１５に記載の方法。 １７．さらに（ｇ）試料をアルカリ性加水分解し、それ
によって糖−リン酸骨格を切断する段階を含む１５に記
載の方法。 １８．さらに（ｈ）その処理を終結させる段階を含む１
６および１７の何れか１項に記載の方法。 １９．処理を加熱によって終結させる１６に記載の方
法。 ２０．プローブをリガーゼによって連結する１１に記載
の方法。 ２１．標的核酸配列がＤＮＡである１１に記載の方法。 ２２．連結した核酸を加熱変性によって標的配列から分
離する１１に記載の方法。 ２３．反応サイクルを少なくとも２回反復する１１に記
載の方法。 ２４．反応サイクルを２０〜５０回反復する２３に記載
の方法。 ２５．第１プローブではなく第２プローブの５'末端を
リン酸化する１１に記載の方法。 ２６．段階（ａ）の前、標的配列が２本鎖である１１に
記載の方法。 ２７．プローブを含有する容器構造、核酸リガーゼを含
有する容器構造、およびウラシルＤＮＡグリコシラーゼ
を含有する容器構造を含んでなる１１に記載の測定を実
施するためのキット。 ２８．さらにエンドヌクレアーゼIVを含有する容器構造
を含んでなる２７に記載のキット。 ２９．（ａ）第１試料の核酸配列の増幅中に、第１試料
の核酸へ外来試料ヌクレオチドを挿入し、それによって
外来試料ヌクレオチドを含有する増幅された核酸を生産
し、 （ｂ）外来試料ヌクレオチドを含有する核酸を実質上増
幅不能とし、外来試料ヌクレオチドを含有しない核酸の
増幅に実質上影響を与えない処理を第２試料に行い、そ
れによって、第２試料の核酸配列の増幅中、第２試料を
汚染する第１試料由来の外来試料ヌクレオチドを含有す
る増幅された核酸を、さらに実質上増幅しない段階を含
む１またはそれ以上の核酸配列を増幅する方法。 ３０．（ａ）第１試料の核酸を増幅し、ここでその増幅
は１またはそれ以上の特異的なオリゴヌクレオチドに依
存して行われ、その特異的なオリゴヌクレオチドの少な
くとも１つは外来試料ヌクレオチドを含有し、それによ
って外来試料ヌクレオチドを含有する増幅された核酸を
生産し、 （ｂ）外来試料ヌクレオチドを含有する核酸を実質上増
幅不能とし、外来試料ヌクレオチドを含有しない核酸の
増幅を実質上妨げない処理を第２試料に行い、それによ
って、第２試料の核酸配列の増幅中、第２試料を汚染す
る第１試料由来の外来試料ヌクレオチドを含有する増幅
された核酸を、さらに実質上増幅しない段階を含む 試料中の１またはそれ以上の核酸配列のオリゴヌクレオ
チド依存性の増幅方法。３１．外来試料ヌクレオチドが
デオキシウリジンである２９または３０の何れか１項に
記載の方法。 ３２．処理がウラシルＤＮＡグリコシラーゼによる処理
である３１に記載の方法。 ３３．外来試料ヌクレオチドがリボヌクレオチドである
２９または３０の何れか１項に記載の方法。 ３４．処理がＲＮＡ分解酵素による処理である３３に記
載の方法。 ３５．処理が物理的、化学的、酵素的、または生物学的
な処理の群のうちから選ばれた２９または３０の何れか
１項に記載の方法。 ３６．処理が酵素的処理である３５に記載の方法。 ３７．酵素処理がＤＮＡグリコシラーゼによる処理であ
る３６に記載の方法。 ３８．さらに（ｃ）第２試料の核酸配列を増幅する段階
を含む２９または３０の何れか１項に記載の方法。 ３９．さらに（ｄ）段階（ｂ）の処理を終結させる段階
を含む２９または３０の何れか１項に記載の方法。 ４０．終結を加熱によって行う３９に記載の方法。 ４１．（ａ）核酸鎖を、その核酸鎖に相補的な伸長生産
物を合成するような条件下でプライマーで処理し、ここ
でそのプライマーは外来試料ヌクレオチドを含有し、 （ｂ）段階（ａ）の伸長生産物に、その外来試料ヌクレ
オチドの塩基を除去する処理を行い、それによってその
伸長生産物中で、糖−リン酸骨格にアピリミジンデオキ
シリボースを形成する段階を含むＤＮＡ分子を生産する
方法。 ４２．さらに（ｃ）段階（ｂ）の伸長生産物に糖−リン
酸骨格を切断する処理を行うことを含む４１に記載の方
法。 ４３．処理がアルカリ性加水分解による処理である４２
に記載の方法。 ４４．処理がエンドヌクレアーゼIVによる処理である４
２に記載の方法。 ４５．外来試料ヌクレオチドがデオキシウリジンである
４１に記載の方法。 ４６．処理がウラシルＤＮＡグリコシラーゼによる処理
である４５に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【図１】リガーゼ連鎖反応の模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マーク・バーニンガー アメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイ ザーズバーグ、ハイアリー・ウェイ12513 番 (56)参考文献 特開 平３−91484（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−58785（ＪＰ，Ａ)

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）第１の試料中の第１の核酸を増幅
   してデオキシウリジンを含む増幅された核酸を調製し、 （ｂ）工程（ａ）の増幅生産物で汚染されていることも
   ある第２の試料をウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理に
   付し、ここで当該第２の試料は第２の核酸および当該第
   ２の核酸を増幅する際に特異的に使用する一つまたはそ
   れ以上のオリゴヌクレオチドを含有し、当該オリゴヌク
   レオチドの少なくとも一つはその少なくとも一方の端末
   またはその近傍にデオキシウリジンを含むものであり、
   および （ｃ）当該第２の核酸を増幅することを特徴とし、 上記オリゴヌクレオチドの少なくとも一つは、前記増幅
   されたデオキシウリジンを含む第１の核酸よりもウラシ
   ルＤＮＡグリコシラーゼ処理に対する感度が実質的に乏
   しく、従って第２の試料を汚染しているかもしれない工
   程（ａ）のウラシル含有増幅生産物は増幅しないものと
   する、 １つまたはそれ以上の核酸配列のオリゴヌクレオチド依
   存性増幅方法。
2. 【請求項２】 （ａ）試料中の核酸を１本鎖核酸として
   提供し、 （ｂ）当該試料に少なくとも４つのＤＮＡプローブを提
   供し、ここで （１）第１と第２プローブは１次プローブであり、第３
   と第４プローブは２次核酸プローブであり、 （２）第１プローブは標的核酸の１次鎖の第１セグメン
   トにハイブリダイズすることが出来る１本鎖であり、 （３）第２プローブは標的核酸配列の１次鎖の第２セグ
   メントにハイブリダイズすることが出来る１本鎖であ
   り、 （４）標的の１次鎖の第１セグメントの５'末端は、プ
   ローブを標的核酸の１次鎖にハイブリダイズさせると
   き、第１プローブの３'末端が第２プローブの５'末端に
   連結できるように標的の１次鎖の第２セグメントの３'
   末端に相対的に位置しており、 （５）第３プローブは第１プローブにハイブリダイズす
   ることができ、 （６）第４プローブは第２プローブにハイブリダイズす
   ることができ、 （７）少なくとも第１プローブの３'ヌクレオチドまた
   は第２プローブの５'ヌクレオチドがデオキシウリジン
   であり、 （８）少なくとも第４プローブの３'ヌクレオチドまた
   は第３プローブの５'ヌクレオチドがデオキシウリジン
   であり、そして （ｃ）当該試料をウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理
   し、それによって非連結プローブのデオキシウリジンの
   ウラシル部分とデオキシリボース部分間のグリコシド結
   合は本質的に影響されることなく、連結プローブのデオ
   キシウリジンのウラシル部分とデオキシリボース部分間
   のグリコシド結合は本質的に開裂され、その結果、核酸
   の糖−リン酸バックボーン中にアピリミジン性デオキシ
   リボースを形成させ、 （ｄ）（１）プローブを試料中の核酸でハイブリダイズ
   させ、 （２）ハイブリダイズしたプローブをライゲーションし
   て連結したプローブ配列を形成させ、 （３）試料中のＤＮＡを変性させる サイクルを反復して実施し、 （ｅ）連結したプローブ配列を検出することを特徴とす
   る、 試料中の標的核酸を検出する方法。
3. 【請求項３】 工程（ｂ）の（７）において、第１プロ
   ーブの３'ヌクレオチドと第２プローブの５'ヌクレオチ
   ドの両者がデオキシウリジンであり、 工程（ｂ）の（８）において、第４プローブの３'ヌク
   レオチドと第３プローブの５'ヌクレオチドの両者がデ
   オキシウリジンであり、および／または 工程（ｂ）の（７）と（８）において、第１プローブの
   ３'ヌクレオチドと第４プローブの３'ヌクレオチドの両
   者がデオキシウリジンである、請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 更に、 （ｆ）試料をエンドヌクレアーゼＩＶで処理するかおよ
   び／または試料をアルカリ性加水分解処理することによ
   って糖−リン酸バックボーンを開裂し、および（ｇ）必
   要に応じ、上記処理をたとえば加熱によって停止させ
   る、 請求項２または３記載の方法。
5. 【請求項５】 プローブをリガーゼで連結させるか、標
   的核酸配列がＤＮＡであるか、連結核酸を熱変性により
   標的配列から分離させるかおよび／またはサイクルを少
   なくとも２回、特に２０〜４０回反復実施する、請求項
   ２〜４項記載の方法。
6. 【請求項６】 第１プローブの５'末端ではなく、第２
   プローブの５'末端をリン酸化するかおよび／または標
   的配列を工程（ａ）の前に二本鎖化する、請求項２〜５
   のいずれかに記載の方法。
7. 【請求項７】 プローブを収容する容器と核酸リガーゼ
   を収容する容器とウラシルＤＮＡグリコシラーゼを収容
   する容器と必要に応じエンドヌクレアーゼＩＶを収容す
   る容器を含むことを特徴とする、請求項２の検出法を実
   施するためのキット。