JPH0795898A - かび細胞内のアデノシン三リン酸測定方法 - Google Patents
かび細胞内のアデノシン三リン酸測定方法Info
- Publication number
- JPH0795898A JPH0795898A JP24274293A JP24274293A JPH0795898A JP H0795898 A JPH0795898 A JP H0795898A JP 24274293 A JP24274293 A JP 24274293A JP 24274293 A JP24274293 A JP 24274293A JP H0795898 A JPH0795898 A JP H0795898A
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- cells
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 糸状菌（かび）のアデノシン三リン酸量を測
定する場合において、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反
応の阻害を起こさずに精度良く発光量を測定するための
方法を提供する。 【構成】 糸状菌（かび）を含む試料の細胞内のアデノ
シン三リン酸を生物化学発光法を用いて測定する方法に
おいて、アデノシン三リン酸を抽出後、液中の菌体を除
去した後に生物化学発光法を用いて測定することよりな
る細胞内のアデノシン三リン酸測定方法。
定する場合において、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反
応の阻害を起こさずに精度良く発光量を測定するための
方法を提供する。 【構成】 糸状菌（かび）を含む試料の細胞内のアデノ
シン三リン酸を生物化学発光法を用いて測定する方法に
おいて、アデノシン三リン酸を抽出後、液中の菌体を除
去した後に生物化学発光法を用いて測定することよりな
る細胞内のアデノシン三リン酸測定方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、糸状菌（かび）の細胞
内のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の測定方法に関す
る。
内のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の測定方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】糸状菌（かび）の量の測定は、細菌、酵
母、その他の微生物量の測定とともに、環境衛生、食品
衛生、臨床検査等の分野で極めて重要である。従来、微
生物量の測定方法としては、生きた微生物中に存在する
ＡＴＰを生物化学発光法を用いて測定する方法が用いら
れている。この方法は、微生物中に必ず含まれているＡ
ＴＰの量がその微生物の量に比例して存在することを利
用するものであり、測定時間が短く、また高感度である
ため、有用な手段として汎用されている。
母、その他の微生物量の測定とともに、環境衛生、食品
衛生、臨床検査等の分野で極めて重要である。従来、微
生物量の測定方法としては、生きた微生物中に存在する
ＡＴＰを生物化学発光法を用いて測定する方法が用いら
れている。この方法は、微生物中に必ず含まれているＡ
ＴＰの量がその微生物の量に比例して存在することを利
用するものであり、測定時間が短く、また高感度である
ため、有用な手段として汎用されている。
【０００３】この方法では、微生物の細胞中に存在する
ＡＴＰを、微生物の細胞を破壊することにより抽出し、
その液中の菌体成分を除去することなくこれにルシフェ
リン−ルシフェラーゼを作用させて、発光量を測定す
る。細菌、酵母の場合には、液中に菌体成分が混入した
状態のままルシフェリン−ルシフェラーゼによって発光
量を測定しても、ＡＴＰの定量は行うことができる。
ＡＴＰを、微生物の細胞を破壊することにより抽出し、
その液中の菌体成分を除去することなくこれにルシフェ
リン−ルシフェラーゼを作用させて、発光量を測定す
る。細菌、酵母の場合には、液中に菌体成分が混入した
状態のままルシフェリン−ルシフェラーゼによって発光
量を測定しても、ＡＴＰの定量は行うことができる。
【０００４】しかしながら、糸状菌（かび）の場合、液
中に菌体成分が混入していると、著しいルシフェリン−
ルシフェラーゼ反応阻害が起こる。従って、従来の方法
のように細胞を破壊してＡＴＰを抽出した後に何らの操
作もせずにルシフェリン−ルシフェラーゼによる発光法
をとったとしても、感度が低下して精度良く測定するこ
とが困難であった。
中に菌体成分が混入していると、著しいルシフェリン−
ルシフェラーゼ反応阻害が起こる。従って、従来の方法
のように細胞を破壊してＡＴＰを抽出した後に何らの操
作もせずにルシフェリン−ルシフェラーゼによる発光法
をとったとしても、感度が低下して精度良く測定するこ
とが困難であった。
【０００５】特開平２−２８６０９６号公報によれば、
グラム陰性菌についてＡＴＰ量を測定する場合に、ＡＴ
Ｐと他の細胞成分を分離するために遠心分離機により遠
心分離した後上澄液を発光の試料とする実施例が記載さ
れている。しかしながら、これはグラム陰性菌について
の実施例であって糸状菌（かび）についての実施例では
なく、しかもここには、遠心分離をした場合としない場
合とを比較して、菌体成分除去がＡＴＰ測定に効果的で
ある旨が記載されているわけではない。よって、本発明
における菌体除去過程がこの公報に開示されているわけ
ではない。
グラム陰性菌についてＡＴＰ量を測定する場合に、ＡＴ
Ｐと他の細胞成分を分離するために遠心分離機により遠
心分離した後上澄液を発光の試料とする実施例が記載さ
れている。しかしながら、これはグラム陰性菌について
の実施例であって糸状菌（かび）についての実施例では
なく、しかもここには、遠心分離をした場合としない場
合とを比較して、菌体成分除去がＡＴＰ測定に効果的で
ある旨が記載されているわけではない。よって、本発明
における菌体除去過程がこの公報に開示されているわけ
ではない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】上記に鑑み、本発明
は、糸状菌（かび）のＡＴＰ量を測定する場合におい
て、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の阻害を起こさ
ずに精度良く発光量を測定するための前処理方法を提供
することを目的とするものである。
は、糸状菌（かび）のＡＴＰ量を測定する場合におい
て、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の阻害を起こさ
ずに精度良く発光量を測定するための前処理方法を提供
することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、糸状菌
（かび）を含む試料からＡＴＰを抽出した後、菌体成分
を遠心分離、濾過等の方法を用いて除去した後にルシフ
ェリン−ルシフェラーゼ反応に掛ければ、反応阻害物質
の影響を受けることなく発光量を測定することができる
ことを見いだし、本発明を完成した。
（かび）を含む試料からＡＴＰを抽出した後、菌体成分
を遠心分離、濾過等の方法を用いて除去した後にルシフ
ェリン−ルシフェラーゼ反応に掛ければ、反応阻害物質
の影響を受けることなく発光量を測定することができる
ことを見いだし、本発明を完成した。
【０００８】本発明の対象となる糸状菌（かび）として
は、例えば、アスペルギルス属、クラドスポリウム属、
アルテルナリア属、ペニシリウム属、ウロクラディウム
属等に属するもの等が挙げられる。
は、例えば、アスペルギルス属、クラドスポリウム属、
アルテルナリア属、ペニシリウム属、ウロクラディウム
属等に属するもの等が挙げられる。
【０００９】細胞内のＡＴＰ量を測定するためには、細
胞になんらかの処理を施し、細胞膜を破壊し、細胞外に
その物質を放出させる操作、つまり、抽出操作を行う必
要がある。本発明においては、糸状菌（かび）からＡＴ
Ｐを抽出する方法として、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）等
の酸水溶液と菌体を混合して抽出する方法、界面活性剤
水溶液で抽出する方法、エタノール等の有機溶媒で抽出
する方法、熱トリス緩衝液で抽出する方法、リゾチーム
等の溶菌酵素を用いる方法、超音波破砕処理による方法
等を用いることができる。
胞になんらかの処理を施し、細胞膜を破壊し、細胞外に
その物質を放出させる操作、つまり、抽出操作を行う必
要がある。本発明においては、糸状菌（かび）からＡＴ
Ｐを抽出する方法として、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）等
の酸水溶液と菌体を混合して抽出する方法、界面活性剤
水溶液で抽出する方法、エタノール等の有機溶媒で抽出
する方法、熱トリス緩衝液で抽出する方法、リゾチーム
等の溶菌酵素を用いる方法、超音波破砕処理による方法
等を用いることができる。
【００１０】トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）等の酸水溶液と
菌体を混合して抽出する方法では、菌体をバイアル瓶に
入れ、緩衝液／ＴＣＡ混合溶液を加えてボルテックスミ
キサー等の振盪器による処理や超音波処理により細胞膜
を破壊して細胞内ＡＴＰを溶液中に抽出する。酸として
ＴＣＡの代わりに過塩素酸等を用いることもできる。
菌体を混合して抽出する方法では、菌体をバイアル瓶に
入れ、緩衝液／ＴＣＡ混合溶液を加えてボルテックスミ
キサー等の振盪器による処理や超音波処理により細胞膜
を破壊して細胞内ＡＴＰを溶液中に抽出する。酸として
ＴＣＡの代わりに過塩素酸等を用いることもできる。
【００１１】界面活性剤水溶液で抽出する方法では、バ
イアル瓶に入れた菌体にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）等の界面活性剤を含む溶液を加えて、可溶化作用に
より菌体細胞膜を弱めておいて、ボルテックスミキサー
等の振盪器による処理等で細胞膜を破壊して細胞内ＡＴ
Ｐを溶液中に抽出する。
イアル瓶に入れた菌体にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）等の界面活性剤を含む溶液を加えて、可溶化作用に
より菌体細胞膜を弱めておいて、ボルテックスミキサー
等の振盪器による処理等で細胞膜を破壊して細胞内ＡＴ
Ｐを溶液中に抽出する。
【００１２】界面活性剤としては、例えば、陰イオン性
界面活性剤、非イオン性界面活性剤又はステロイド骨格
を有する界面活性剤等を使用することができる。上記の
界面活性剤を単独で用いる代わりに、界面活性剤とクロ
ロホルム等の有機溶媒との混合溶媒を抽出溶媒として用
いることもできる。上記の界面活性剤を用いる方法等に
おいて、リゾチーム等の溶菌酵素を用いても同様に細胞
内ＡＴＰを溶液中に抽出することができる。
界面活性剤、非イオン性界面活性剤又はステロイド骨格
を有する界面活性剤等を使用することができる。上記の
界面活性剤を単独で用いる代わりに、界面活性剤とクロ
ロホルム等の有機溶媒との混合溶媒を抽出溶媒として用
いることもできる。上記の界面活性剤を用いる方法等に
おいて、リゾチーム等の溶菌酵素を用いても同様に細胞
内ＡＴＰを溶液中に抽出することができる。
【００１３】有機溶媒で抽出する方法では、バイアル瓶
に入れた菌体にエタノール等の有機溶媒を混合し、室温
下又は加温条件下で振盪しながら細胞内ＡＴＰを溶液中
に抽出する。有機溶媒としては、エタノールの他に、例
えば、ブタノール等のアルコール、アセトン、クロロホ
ルム等を用いることができる。
に入れた菌体にエタノール等の有機溶媒を混合し、室温
下又は加温条件下で振盪しながら細胞内ＡＴＰを溶液中
に抽出する。有機溶媒としては、エタノールの他に、例
えば、ブタノール等のアルコール、アセトン、クロロホ
ルム等を用いることができる。
【００１４】超音波破砕処理による方法では、バイアル
瓶に入れた菌体溶液に超音波を照射し、細胞膜を破壊し
て細胞内ＡＴＰを溶液中に抽出する。
瓶に入れた菌体溶液に超音波を照射し、細胞膜を破壊し
て細胞内ＡＴＰを溶液中に抽出する。
【００１５】熱トリス緩衝液で抽出する方法（日本下水
道協会：「下水道試験方法」に示されているボイリング
トリス法）では、超音波で前処理した試料と沸騰させた
トリス緩衝液を混合し、この混合溶液を沸騰水浴中で攪
拌して、細胞内ＡＴＰを溶液中に抽出する。
道協会：「下水道試験方法」に示されているボイリング
トリス法）では、超音波で前処理した試料と沸騰させた
トリス緩衝液を混合し、この混合溶液を沸騰水浴中で攪
拌して、細胞内ＡＴＰを溶液中に抽出する。
【００１６】本発明において、上記のようにＡＴＰを抽
出した後に、液中から菌体を除去する方法としては、遠
心分離法等を用いることができる。上記のＡＴＰ抽出操
作を行った後、試料を、例えば、数千〜１万回転程度の
回転数で５分間程度遠心処理する。遠心操作後、上澄み
液を別容器に回収して試料を得る。
出した後に、液中から菌体を除去する方法としては、遠
心分離法等を用いることができる。上記のＡＴＰ抽出操
作を行った後、試料を、例えば、数千〜１万回転程度の
回転数で５分間程度遠心処理する。遠心操作後、上澄み
液を別容器に回収して試料を得る。
【００１７】本発明においては、その後、生物化学発光
法を用いてＡＴＰの量を測定する。生物化学発光法とし
ては、例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を適
用することができる。この方法は、ルシフェリン−ルシ
フェラーゼ系においてＡＴＰを消費して発光が生じる現
象を利用したものである。測定時間内の発光量の積分値
がＡＴＰ量に比例する。逆に、積分値を測定し、濃度既
知のＡＴＰ量について得た発光量と比較することで、試
料中のＡＴＰ量を知ることができる。本発明は、上記一
連の工程によって構成されるものである。
法を用いてＡＴＰの量を測定する。生物化学発光法とし
ては、例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を適
用することができる。この方法は、ルシフェリン−ルシ
フェラーゼ系においてＡＴＰを消費して発光が生じる現
象を利用したものである。測定時間内の発光量の積分値
がＡＴＰ量に比例する。逆に、積分値を測定し、濃度既
知のＡＴＰ量について得た発光量と比較することで、試
料中のＡＴＰ量を知ることができる。本発明は、上記一
連の工程によって構成されるものである。
【００１８】
【実施例】以下に、実施例を示して本発明を更に詳しく
説明する。
説明する。
【００１９】実施例１ 試験菌としてアルテルナリア属を用いた。ポテト−デキ
ストロース−寒天培地上で３０℃、２週間培養した菌体
をバイアル瓶に入れ、ＨＥＰＥＳ緩衝液／トリクロロ酢
酸混合溶液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液：０．１％
トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）＝４：１）を、菌体０．５ｍ
ｇ当たり１ｍｌ添加し、超音波破砕処理を行って細胞壁
を破壊しＡＴＰを抽出した。この試料を１００００ｒｐ
ｍ、５分間遠心した。遠心後の上澄み液５０μｌを測定
バイアルに分取し、これにルシフェリン、ルシフェラー
ゼを含む発光試薬（ルシフェール−ＫＰ、キッコーマン
社製）１００μｌを添加して、発光量を発光測定装置
（ルミネッセンスリーダー ＢＬＲ−１０２Ｂ型、アロ
カ社製）を用いて、１分毎に４分間計測した。測定中、
菌体の沈降防止と試薬の混和のために測定バイアルを２
秒間隔で左右に回転させた。発光試薬添加直後から１分
毎の発光量の積算値を表１に示した。
ストロース−寒天培地上で３０℃、２週間培養した菌体
をバイアル瓶に入れ、ＨＥＰＥＳ緩衝液／トリクロロ酢
酸混合溶液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液：０．１％
トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）＝４：１）を、菌体０．５ｍ
ｇ当たり１ｍｌ添加し、超音波破砕処理を行って細胞壁
を破壊しＡＴＰを抽出した。この試料を１００００ｒｐ
ｍ、５分間遠心した。遠心後の上澄み液５０μｌを測定
バイアルに分取し、これにルシフェリン、ルシフェラー
ゼを含む発光試薬（ルシフェール−ＫＰ、キッコーマン
社製）１００μｌを添加して、発光量を発光測定装置
（ルミネッセンスリーダー ＢＬＲ−１０２Ｂ型、アロ
カ社製）を用いて、１分毎に４分間計測した。測定中、
菌体の沈降防止と試薬の混和のために測定バイアルを２
秒間隔で左右に回転させた。発光試薬添加直後から１分
毎の発光量の積算値を表１に示した。
【００２０】比較例１ ＡＴＰ抽出後の遠心処理を行わなかったこと以外は、実
施例１と同様にして試料を調製し、ルシフェリン−ルシ
フェラーゼ系による発光反応にかけた。発光試薬添加直
後から１分毎の発光量の積算値を表１に示した。
施例１と同様にして試料を調製し、ルシフェリン−ルシ
フェラーゼ系による発光反応にかけた。発光試薬添加直
後から１分毎の発光量の積算値を表１に示した。
【００２１】
【表１】
【００２２】実施例１と比較例１の発光量の測定値を比
較すると、菌体を除去した試料の方が除去していない試
料より発光量が大きい。このことは菌体を除去すること
により酵素反応の阻害が抑制されたことを示している。
また図１に、実施例１と比較例１の試料について、ルシ
フェリン−ルシフェラーゼを含む発光試薬を被試験液に
添加した直後から４分後までの発光量の経時変化を示し
た。
較すると、菌体を除去した試料の方が除去していない試
料より発光量が大きい。このことは菌体を除去すること
により酵素反応の阻害が抑制されたことを示している。
また図１に、実施例１と比較例１の試料について、ルシ
フェリン−ルシフェラーゼを含む発光試薬を被試験液に
添加した直後から４分後までの発光量の経時変化を示し
た。
【００２３】実施例１と比較例１の発光量の経時変化を
比較すると、発光量のピーク値は実施例１の試料の方が
比較例１の試料より大きい。また、発光量がピーク値に
達した後、比較例１の試料では急激に値が下がっている
が、実施例１の試料では消光の経時変化が緩やかであ
る。このことは、ＡＴＰ抽出後に遠心処理した試料で
は、遠心しない試料に比べて酵素反応の阻害を受ける程
度が小さいことを示している。以上のように、ＡＴＰ抽
出後の被試験液から菌体を除去することによって、酵素
反応阻害を抑制する効果があることは明白である。
比較すると、発光量のピーク値は実施例１の試料の方が
比較例１の試料より大きい。また、発光量がピーク値に
達した後、比較例１の試料では急激に値が下がっている
が、実施例１の試料では消光の経時変化が緩やかであ
る。このことは、ＡＴＰ抽出後に遠心処理した試料で
は、遠心しない試料に比べて酵素反応の阻害を受ける程
度が小さいことを示している。以上のように、ＡＴＰ抽
出後の被試験液から菌体を除去することによって、酵素
反応阻害を抑制する効果があることは明白である。
【００２４】
【発明の効果】本発明により、従来、ＡＴＰ抽出後に残
存する菌体の影響を受けて酵素反応が阻害され正確にで
きなかった糸状菌（かび）の細胞内ＡＴＰ量の測定を、
正確に行うことができるようになった。
存する菌体の影響を受けて酵素反応が阻害され正確にで
きなかった糸状菌（かび）の細胞内ＡＴＰ量の測定を、
正確に行うことができるようになった。
【図１】アルテルナリア属の糸状菌からＡＴＰを抽出し
た後、菌体を除去しなかった試料（比較例１の試料）と
菌体を除去した試料（実施例１の試料）の発光量の経時
変化を示す図である。
た後、菌体を除去しなかった試料（比較例１の試料）と
菌体を除去した試料（実施例１の試料）の発光量の経時
変化を示す図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 糸状菌（かび）を含む試料の細胞内のア
デノシン三リン酸を生物化学発光法を用いて測定する方
法において、アデノシン三リン酸を抽出後、液中の菌体
を除去した後に生物化学発光法を用いて測定することを
特徴とするかび細胞内のアデノシン三リン酸測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24274293A JPH0795898A (ja) | 1993-09-29 | 1993-09-29 | かび細胞内のアデノシン三リン酸測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24274293A JPH0795898A (ja) | 1993-09-29 | 1993-09-29 | かび細胞内のアデノシン三リン酸測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0795898A true JPH0795898A (ja) | 1995-04-11 |
Family
ID=17093587
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24274293A Pending JPH0795898A (ja) | 1993-09-29 | 1993-09-29 | かび細胞内のアデノシン三リン酸測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0795898A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6372446B1 (en) | 1997-02-04 | 2002-04-16 | Mycometer Aps | Method of selectively determining a fungal biomass |
| WO2002053767A1 (fr) * | 2000-12-27 | 2002-07-11 | Zeon Information Systems Co., Ltd. | Marqueur, agent de detection de contrefaçons, procede de distinction entre produits authentiques et contrefaçons, procede pour prevenir la distribution de contrefaçons, et produit |
-
1993
- 1993-09-29 JP JP24274293A patent/JPH0795898A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6372446B1 (en) | 1997-02-04 | 2002-04-16 | Mycometer Aps | Method of selectively determining a fungal biomass |
| WO2002053767A1 (fr) * | 2000-12-27 | 2002-07-11 | Zeon Information Systems Co., Ltd. | Marqueur, agent de detection de contrefaçons, procede de distinction entre produits authentiques et contrefaçons, procede pour prevenir la distribution de contrefaçons, et produit |
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