JPH0772195B2 - ミクロビスポラから単離された新規エンドセリンレセプター拮抗剤 - Google Patents
ミクロビスポラから単離された新規エンドセリンレセプター拮抗剤Info
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- JPH0772195B2 JPH0772195B2 JP4009593A JP959392A JPH0772195B2 JP H0772195 B2 JPH0772195 B2 JP H0772195B2 JP 4009593 A JP4009593 A JP 4009593A JP 959392 A JP959392 A JP 959392A JP H0772195 B2 JPH0772195 B2 JP H0772195B2
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Description
【０００１】本発明はエンドセリン（endothelin) のレ
セプター拮抗剤の分野に属する。エンドセリン（ＥＴ−
１）自体は２１アミノ酸からなる内皮由来の強力な血管
収縮ペプチドである。細胞外Ｃa2+ の存在下又は非存在
下でエンドセリンにより誘導される並はずれて長い血管
収縮は、このペプチドの作用が正常及び異常生理条件下
で血圧調節にかなり影響を与えていることを示唆してい
る。後で更に記載するように、エンドセリンは他に多く
の生理学的効果も有し、このためそのレセプターと結合
する拮抗剤は役に立つ薬理学的性質及びそれに対応した
治療効果を有すると予想される。
セプター拮抗剤の分野に属する。エンドセリン（ＥＴ−
１）自体は２１アミノ酸からなる内皮由来の強力な血管
収縮ペプチドである。細胞外Ｃa2+ の存在下又は非存在
下でエンドセリンにより誘導される並はずれて長い血管
収縮は、このペプチドの作用が正常及び異常生理条件下
で血圧調節にかなり影響を与えていることを示唆してい
る。後で更に記載するように、エンドセリンは他に多く
の生理学的効果も有し、このためそのレセプターと結合
する拮抗剤は役に立つ薬理学的性質及びそれに対応した
治療効果を有すると予想される。
【０００２】エンドセリンははじめにブタ大動脈内皮細
胞を培養した培地から精製された；ヤナギサワら，１９
８８年，ネーチャー（Nature),第３３２巻，第４１１−
４１５頁。更にエンドセリンの活性の研究が下記のよう
な論文で記載されていた：−タカギら，１９８８年，バ
イオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・
コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commu
n.),第１５７巻，第１１６４−１１６８頁 − スギウラら，１９８９年，バイオケミカル・アンド
・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
ズ，第１５８巻，第１７０−１７６頁 − ミラーら，１９８９年，ジャーナル・オブ・クリニ
カル・インベスティゲーション，第８３巻，第３１７−
３２０頁〔Miller et al. （１９８９） J. Clin. Inve
st.,８３，３１７−３２０ − デュポン・バイオテック・アップデート（Du Pont
Biotech Update) １９９０年 − ワーナーら，１９８９年，ジャーナル・オブ・カル
ジオバスキュラー・ファーマコロジー，第１３巻，補巻
第５号，Ｓ８５−Ｓ８８〔Warner et al. （１９８９）
J. Cardiovasc. Pharmacol.,１３（Suppl.５），Ｓ８５
−Ｓ８８〕 − ヨシザワら，１９９０年，サイエンス（Science)，
第２４７巻，第４６２−４６４頁 − ブーソ・ミットラー（Bousso-Mittler) ら，１９８
９年，バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーションズ，第１６２巻，第９５２
−９５７頁 − サイトーら，１９８９年，ハイパーテンション（Hy
pertension) ，第１４巻，第３３５−３３６頁 − トミタら，１９８９年，ニューイングランド・ジャ
ーナル・オブ・メディシン（New Engl. J. Med.)，第３
２１巻，第１１２７頁 − クリハラら，１９８９年，ジャーナル・オブ・カル
ジオバスキュラー・ファーマコロジー，第１３巻，補巻
第５号，Ｓ１３−Ｓ１７ − スギウラら，１９８９年，バイオケミカル・アンド
・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
ズ，第１６１巻，第１２２０−１２２７頁
胞を培養した培地から精製された；ヤナギサワら，１９
８８年，ネーチャー（Nature),第３３２巻，第４１１−
４１５頁。更にエンドセリンの活性の研究が下記のよう
な論文で記載されていた：−タカギら，１９８８年，バ
イオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・
コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commu
n.),第１５７巻，第１１６４−１１６８頁 − スギウラら，１９８９年，バイオケミカル・アンド
・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
ズ，第１５８巻，第１７０−１７６頁 − ミラーら，１９８９年，ジャーナル・オブ・クリニ
カル・インベスティゲーション，第８３巻，第３１７−
３２０頁〔Miller et al. （１９８９） J. Clin. Inve
st.,８３，３１７−３２０ − デュポン・バイオテック・アップデート（Du Pont
Biotech Update) １９９０年 − ワーナーら，１９８９年，ジャーナル・オブ・カル
ジオバスキュラー・ファーマコロジー，第１３巻，補巻
第５号，Ｓ８５−Ｓ８８〔Warner et al. （１９８９）
J. Cardiovasc. Pharmacol.,１３（Suppl.５），Ｓ８５
−Ｓ８８〕 − ヨシザワら，１９９０年，サイエンス（Science)，
第２４７巻，第４６２−４６４頁 − ブーソ・ミットラー（Bousso-Mittler) ら，１９８
９年，バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーションズ，第１６２巻，第９５２
−９５７頁 − サイトーら，１９８９年，ハイパーテンション（Hy
pertension) ，第１４巻，第３３５−３３６頁 − トミタら，１９８９年，ニューイングランド・ジャ
ーナル・オブ・メディシン（New Engl. J. Med.)，第３
２１巻，第１１２７頁 − クリハラら，１９８９年，ジャーナル・オブ・カル
ジオバスキュラー・ファーマコロジー，第１３巻，補巻
第５号，Ｓ１３−Ｓ１７ − スギウラら，１９８９年，バイオケミカル・アンド
・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
ズ，第１６１巻，第１２２０−１２２７頁
【０００３】米国特許第４，８１０，６９２号明細書で
は５５１８５ＲＰ及び５９４５１ＲＰと表示される２種
のみの免疫抑制シクロデプシペプチドについて開示して
おり、それらは更に一般的な式で表示されるが、それに
はその式で特定されない多数の立体異性体を含んでい
る。５５１８５ＲＰ及び５９４５１ＲＰは第４，８１
０，６９２号特許明細書において様々な化学／物理デー
タで特徴付けられているが、それにもかかわらずそれら
は本発明の環状デプシペプチドＩ、II及びIII と異なる
特定されない立体異性体であることが見出された。この
ように本発明は、たとえ４，８１０，６９２特許の一般
式に属するとしても、上記特許で単離どころか示唆すら
なされておらず、４，８１０，６９２特許で開示された
場合と異なる微生物で産生される立体異性体である化合
物Ｉ、II及びIII に関する。更に、化合物Ｉ、II及びII
I は４，８１０，６９２特許の化合物群に関しては開示
されていない、強力なエンドセリンレセプター拮抗活性
を有しており、それに基づきそれらは区別することがで
きる。更に、本発明の２種の立体異性体II及びIII は有
意の免疫抑制活性を有していないようであるが、これは
アッセイ法の違いによるかも知れない。
は５５１８５ＲＰ及び５９４５１ＲＰと表示される２種
のみの免疫抑制シクロデプシペプチドについて開示して
おり、それらは更に一般的な式で表示されるが、それに
はその式で特定されない多数の立体異性体を含んでい
る。５５１８５ＲＰ及び５９４５１ＲＰは第４，８１
０，６９２号特許明細書において様々な化学／物理デー
タで特徴付けられているが、それにもかかわらずそれら
は本発明の環状デプシペプチドＩ、II及びIII と異なる
特定されない立体異性体であることが見出された。この
ように本発明は、たとえ４，８１０，６９２特許の一般
式に属するとしても、上記特許で単離どころか示唆すら
なされておらず、４，８１０，６９２特許で開示された
場合と異なる微生物で産生される立体異性体である化合
物Ｉ、II及びIII に関する。更に、化合物Ｉ、II及びII
I は４，８１０，６９２特許の化合物群に関しては開示
されていない、強力なエンドセリンレセプター拮抗活性
を有しており、それに基づきそれらは区別することがで
きる。更に、本発明の２種の立体異性体II及びIII は有
意の免疫抑制活性を有していないようであるが、これは
アッセイ法の違いによるかも知れない。
【０００４】要約すると本発明はエンドセリンレセプタ
ー拮抗剤として活性な３種の新規環状デプシペプチド
（Ｉ、II及びIII ）に関する。本発明はミクロビスポラ
（Microbispora) sp.ＭＡ６８５７，ＡＴＣＣ５５１４
０を培養して発酵ブロスから化合物を単離することによ
る３種の新規環状デプシペプチド（Ｉ、II及びIII ）の
製造方法に更に関する。本発明は新規微生物株ミクロビ
スポラ sp.ＭＡ６８５７，ＡＴＣＣ５５１４０にも関す
る。
ー拮抗剤として活性な３種の新規環状デプシペプチド
（Ｉ、II及びIII ）に関する。本発明はミクロビスポラ
（Microbispora) sp.ＭＡ６８５７，ＡＴＣＣ５５１４
０を培養して発酵ブロスから化合物を単離することによ
る３種の新規環状デプシペプチド（Ｉ、II及びIII ）の
製造方法に更に関する。本発明は新規微生物株ミクロビ
スポラ sp.ＭＡ６８５７，ＡＴＣＣ５５１４０にも関す
る。
【０００５】本発明はエンドセリン（ＥＴ−１）に起因
する又は関連した喘息、高血圧、腎不全、特に虚血後腎
不全、シクロスポリン腎毒性、血管痙攣、大脳及び心臓
虚血、心筋梗塞又は内毒素ショックの治療方法に関する
が、その方法はかかる治療の必要な患者に３種の新規シ
クロペプチド（Ｉ、II又はIII ）のうち１種の治療有効
量を投与することを特徴とする。
する又は関連した喘息、高血圧、腎不全、特に虚血後腎
不全、シクロスポリン腎毒性、血管痙攣、大脳及び心臓
虚血、心筋梗塞又は内毒素ショックの治療方法に関する
が、その方法はかかる治療の必要な患者に３種の新規シ
クロペプチド（Ｉ、II又はIII ）のうち１種の治療有効
量を投与することを特徴とする。
【０００６】本発明は更に、３種の新規シクロペプチド
（Ｉ、II又はIII ）のうち１種の治療有効量と薬学上許
容されるキャリアを含有する、エンドセリン（ＥＴ−
１）に起因する又は関連した喘息、高血圧、腎不全、特
に虚血後腎不全、シクロスポリン腎毒性、血管痙攣、大
脳及び心臓虚血、心筋梗塞又は内毒素ショック治療用の
医薬組成物にも関する。
（Ｉ、II又はIII ）のうち１種の治療有効量と薬学上許
容されるキャリアを含有する、エンドセリン（ＥＴ−
１）に起因する又は関連した喘息、高血圧、腎不全、特
に虚血後腎不全、シクロスポリン腎毒性、血管痙攣、大
脳及び心臓虚血、心筋梗塞又は内毒素ショック治療用の
医薬組成物にも関する。
【０００７】以下本発明を詳細に説明する。本発明によ
れば、下記式のエンドセリンレセプター拮抗剤環状デプ
シペプチドが提供される：
れば、下記式のエンドセリンレセプター拮抗剤環状デプ
シペプチドが提供される：
【化２】
【０００８】プロトン核磁気共鳴 (1H NMR) 前記式の３種の環状デプシペプチドに関するプロトン核
磁気共鳴（1H NMR) スペクトルは図１−３で示されてい
る。スペクトルはバリアン（Varian) ＸＬ４００ＮＭＲ
スペクトロメーターにおいてＤＭＳＯ−ｄ6 中４００ M
Hzで記録した。化学シフトは内部標準として２．４９pp
m の溶媒ピークを用いてゼロppm のテトラメチルシラン
（ＴＭＳ）に対応させたppm で示されている。便宜上、
データは下記表でも示されている。
磁気共鳴（1H NMR) スペクトルは図１−３で示されてい
る。スペクトルはバリアン（Varian) ＸＬ４００ＮＭＲ
スペクトロメーターにおいてＤＭＳＯ−ｄ6 中４００ M
Hzで記録した。化学シフトは内部標準として２．４９pp
m の溶媒ピークを用いてゼロppm のテトラメチルシラン
（ＴＭＳ）に対応させたppm で示されている。便宜上、
データは下記表でも示されている。
【０００９】 表 １ 400 MHz で記録された DMSO-d6中30℃における 環状デプシペプチドＩの1H NMRa,b 残 基 Ｈα Ｈβ Ｈγ ＮＨ 芳香環 D-Ala 4.22 dq 1.29d(3Ｈ） − 7.81 d − J＝7.5 J=7.5 J=7.5 D-allo 4.62 t 5.18 dq 0.84d(3Ｈ） 8.81 d − -Thr J≒9.5 J=10, 6.5 J=6.5 J=9 L-Phe 4.71 ddd 3.06 dd − 8.10d 7.1-7.34 (10Ｈ） J＝5,8.5, J=5, 13.5 J=8.5 10.5 2.92 dd J=-10.5,-14 D-Phe 4.33 dt 2.99 dd − 7.80d 7.1-7.34 (10Ｈ） J＝5.5,8 J=-8,-14 J=7.5 2.90 dd J=5.5,-14 D-DHPG 5.22 d − − 7.94d 6.07d (2Ｈ）c J＝8 J=8 J=2 6.11 tc J=2 D-DHPG 5.22 d − − 8.39d 6.02d (2Ｈ）c J≒10 J=9.5 J=2 6.09 tc J=2 ピロール − − − 11.32br.m 6.05 m 6.80 m 6.87 m ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ａ，ｂ，ｃ 表３以後参照
【００１０】 表 ２ 400 MHz で記録された DMSO-d6中30℃における 環状デプシペプチドIIの1H NMRa,b 残 基 Ｈα Ｈβ Ｈγ ＮＨ 芳香環 D-Ala 3.94 dq 1.32d(3Ｈ） − 8.17 d − J＝5,7.5 J=7.5 J=5 D-allo 4.45 t 4.96 dq 1.11d(3Ｈ） 8.60 d − -Thr J≒9.5 J=10, 6.5 J=6.5 J= ≒8 L-Phe 4.79 ddd 3.02 dd − 8.12d 7.15 m(5 Ｈ）c J＝5,9, J=5, 13.5 J=9 10 2.88 dd J=10.5,13.5 D-Phe 4.50 dt 3.04 dd − 8.62d 7.29 m(2 Ｈ) c J＝6,9 J=6,13.5 J= ≒8.5 7.22 m(2 Ｈ) c 2.94 dd 7.04 m(1 Ｈ) c J=9,13.5 D-DHPG 5.44 d − − 7.78d 6.23d (2 Ｈ） J＝9 J=9 J=2 6.15 t J=2 D-DHPG 5.25 d − − 8.27d 6.17d (2 Ｈ） J=8 J=8 J=2 6.20 t J=2 Cl- − − − 12.16br.s 6.04 d ピロール 6.87 d Ｊ＝４ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００１１】 表 ３ ４００ ＭＨｚ で記録された DMSO-d6中30℃における 環状デプシペプチドIII の1H NMRa,b 残 基 Ｈα Ｈβ Ｈγ ＮＨ 芳香環 D-Ala 4.22 dq 1.31d(3Ｈ） − 7.81 d − J＝7.5 J=7.5 J=7.5 D-allo 4.62 t 5.18 dq 0.85d(3Ｈ） 8.82 d − -Thr J≒9.5 J=10, 6.5 J=6.5 J=9.5 L-Phe 4.72 ddd 3.07 dd − 8.15d 7.1-7.33(5Ｈ） J＝4.5,8.5, J=4.5,13.5 J=8.5 10.5 2.89 dd J=10.5,13.5 D-Phe 4.33 dt 2.98 dd − 7.79d 7.1-7.33(10Ｈ） J＝5.5,8 J=8,13.5 J=8 2.89 dd J=5.5, 13.5 D-DHPG 5.23 d − − 6.08d 6.08d（２Ｈ）c J＝8 J=8 J=2 6.12 t c J=2 D-DHPG 5.23 d − − 8.39d 6.03d (２Ｈ）c J≒10 J=10 J=2 6.10 t c J=2 Cl- − − − 〜12.15br.s 6.87 d ピロール 6.02 d Ｊ＝４ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ａ カップリング定数±０．２Ｈｚ ｂ 他の指摘のないがきり、すべての化学シフト共鳴は
１プロトン強度に相当し、内部標準としてδ２．４９の
溶媒ピークを用いてppm で示されている。 ｃ 特定は相互交換できる。 略記：前記表１、２及び３において、下記略記が用いら
れた：ｓ＝シングレット； ｄ＝ダブレット； ｔ＝ト
リプレット； ｍ＝マルチプレット； ｂr ＝ブロード
１プロトン強度に相当し、内部標準としてδ２．４９の
溶媒ピークを用いてppm で示されている。 ｃ 特定は相互交換できる。 略記：前記表１、２及び３において、下記略記が用いら
れた：ｓ＝シングレット； ｄ＝ダブレット； ｔ＝ト
リプレット； ｍ＝マルチプレット； ｂr ＝ブロード
【００１２】カーボン１３核磁気共鳴（13C NMR) 環状デプシペプチドII及びIII を更に特徴付けるため、
13C NMR スペクトルもバリアンＸＬ４００スペクトロメ
ーターにおいて３０℃でＤＭＳＯ−ｄ6 中１００ MHzで
記録され、化学シフトが内部標準として３９．５ppm の
溶媒ピークを用いてゼロppm のテトラメチルシラン（Ｔ
ＭＳ）と比較したppm で示されている。スペクトルピー
クは以下で示されている：
13C NMR スペクトルもバリアンＸＬ４００スペクトロメ
ーターにおいて３０℃でＤＭＳＯ−ｄ6 中１００ MHzで
記録され、化学シフトが内部標準として３９．５ppm の
溶媒ピークを用いてゼロppm のテトラメチルシラン（Ｔ
ＭＳ）と比較したppm で示されている。スペクトルピー
クは以下で示されている：
【００１３】化合物II13C NMR 化学シフト：
【化３】
【００１４】化合物III 13C NMR 化学シフト：
【化４】
【００１５】立体化学 環状デプシペプチドＩ、II及びIII は部分的もしくは全
部の加水分解により得られた個々のアミノ酸又はこれら
アミノ酸の誘導体のクロマトグラフィー及び質量スペク
トル測定を、純正の対照標準品と比較して調べたとこ
ろ、下記式で示された立体化学を有している：
部の加水分解により得られた個々のアミノ酸又はこれら
アミノ酸の誘導体のクロマトグラフィー及び質量スペク
トル測定を、純正の対照標準品と比較して調べたとこ
ろ、下記式で示された立体化学を有している：
【化５】 1H/13C NMR 広範囲相互関係から得られかつ化合物Ｉ、I
I及びIII のアミノ酸配列決定に用いられたデータは下
記式で示される：
I及びIII のアミノ酸配列決定に用いられたデータは下
記式で示される：
【化６】
【００１６】全部で３種のシクロペプチドＩ、II及びII
I は同様の基本配列を有し、各１当量のＤ−allo−Ｔh
r、Ｄ−Ａla、Ｌ−Ｐhe、Ｄ−Ｐhe、５−クロロピロー
ルカルボン酸（又はＩにおいてピロールカルボン酸）＋
２当量のジヒドロキシフェニルグリシン（ＤＨＰＧ）を
含む。Ｐhe残基は一方のみのPhe 残基を含むメタノリシ
ス産物に基いて区別された。ＤＨＰＧ残基の決定はモデ
ル化合物としてフェニルグリシン及びチロシンを用いて
行った。双方のＤＨＰＧ残基はより活性な化合物Ｉ及び
III においてはＤ配置を有する。化合物IIはＤ及びＬ−
ＤＨＰＧの双方を含み、これらの残基はＤ−Ａlaメチル
共鳴よりもＤ−allo−Ｔhrメチル共鳴の化学シフトにお
いて大きなバリエーションを示す 1H NMR データに基づ
いて配列中で区別された。
I は同様の基本配列を有し、各１当量のＤ−allo−Ｔh
r、Ｄ−Ａla、Ｌ−Ｐhe、Ｄ−Ｐhe、５−クロロピロー
ルカルボン酸（又はＩにおいてピロールカルボン酸）＋
２当量のジヒドロキシフェニルグリシン（ＤＨＰＧ）を
含む。Ｐhe残基は一方のみのPhe 残基を含むメタノリシ
ス産物に基いて区別された。ＤＨＰＧ残基の決定はモデ
ル化合物としてフェニルグリシン及びチロシンを用いて
行った。双方のＤＨＰＧ残基はより活性な化合物Ｉ及び
III においてはＤ配置を有する。化合物IIはＤ及びＬ−
ＤＨＰＧの双方を含み、これらの残基はＤ−Ａlaメチル
共鳴よりもＤ−allo−Ｔhrメチル共鳴の化学シフトにお
いて大きなバリエーションを示す 1H NMR データに基づ
いて配列中で区別された。
【００１７】アミノ酸エナンチオマーはＤＨＰＧ以外は
標準参照アミノ酸と共にα−メチルベンジルイソチオシ
アネート（ＡＭＢＩ）法を用いて区別した。Ｄ及びＬ−
チロシンとＤ及びＬ−フェニルグリシンがＤＨＰＧのモ
デルとして用いられた。すべてのケースにおいて、Ｌ−
エナンチオマーが対応Ｄ−エナンチオマーよりも早く溶
出した。各ケースで観察された６ピークの大体の定量が
下記表４で示されている。 表 ４ ＡＭＢＩ誘導体の大体の定量 化合物 D-allo-Thr D-Ala L-DHPG D-DHPG L-Phe D-Phe Ｉ 0.9 * 1.0 0.3 1.8 1.3 1.4 II 0.8 1.0 1.0 1.3 1.4 1.3 III 0.8 1.0 0.4 1.7 1.6 1.6 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ＊ D-Ala＝１．０に対応させた値
標準参照アミノ酸と共にα−メチルベンジルイソチオシ
アネート（ＡＭＢＩ）法を用いて区別した。Ｄ及びＬ−
チロシンとＤ及びＬ−フェニルグリシンがＤＨＰＧのモ
デルとして用いられた。すべてのケースにおいて、Ｌ−
エナンチオマーが対応Ｄ−エナンチオマーよりも早く溶
出した。各ケースで観察された６ピークの大体の定量が
下記表４で示されている。 表 ４ ＡＭＢＩ誘導体の大体の定量 化合物 D-allo-Thr D-Ala L-DHPG D-DHPG L-Phe D-Phe Ｉ 0.9 * 1.0 0.3 1.8 1.3 1.4 II 0.8 1.0 1.0 1.3 1.4 1.3 III 0.8 1.0 0.4 1.7 1.6 1.6 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ＊ D-Ala＝１．０に対応させた値
【００１８】約１２及び１３分間で観察された２ピーク
はＤＨＰＧエナンチオマーとして同定される。化合物Ｉ
及びIII トレースは全く同様であって、２当量の１３分
エナンチオマーを含む。他方、成分IIは約１当量の各エ
ナンチオマーを含む。これらのトレースは異なる単離物
の一連の加水分解産物において再現性がある。Ｉ及びII
I において約１２分で観察されたピークは１３分目の主
なる２当量ピークが酸加水分解中部分的ラセミ化したこ
とに起因する。ＧＣ−ＭＳでは Thr及びallo−ＴhrがＴ
ＭＳ誘導体としてそれらのｍ／ｚ２１８／２１９フラグ
メントイオンの比率に基づき区別されうることから、al
lo−Ｔhrの同定が実証された。メタノール性HCl で化合
物II及びIII を処理すると他の成分とともにフラグメン
ト allo-Thr--Phe--Ala--DHPG--DHPG(Meエステル）が得
られたが、その配列はＭＳ−ＭＳで確認された。これら
ペプチドフラグメントの酸加水分解産物のＡＭＢＩ分析
は、II及びIII の双方がallo−ＴhrとＡlaの間にＤ−Ｐ
heを含むことを示した。それらのＮＭＲスペクトルが類
似することから、これらのＰhe残基はＩ及びIII で同一
である。
はＤＨＰＧエナンチオマーとして同定される。化合物Ｉ
及びIII トレースは全く同様であって、２当量の１３分
エナンチオマーを含む。他方、成分IIは約１当量の各エ
ナンチオマーを含む。これらのトレースは異なる単離物
の一連の加水分解産物において再現性がある。Ｉ及びII
I において約１２分で観察されたピークは１３分目の主
なる２当量ピークが酸加水分解中部分的ラセミ化したこ
とに起因する。ＧＣ−ＭＳでは Thr及びallo−ＴhrがＴ
ＭＳ誘導体としてそれらのｍ／ｚ２１８／２１９フラグ
メントイオンの比率に基づき区別されうることから、al
lo−Ｔhrの同定が実証された。メタノール性HCl で化合
物II及びIII を処理すると他の成分とともにフラグメン
ト allo-Thr--Phe--Ala--DHPG--DHPG(Meエステル）が得
られたが、その配列はＭＳ−ＭＳで確認された。これら
ペプチドフラグメントの酸加水分解産物のＡＭＢＩ分析
は、II及びIII の双方がallo−ＴhrとＡlaの間にＤ−Ｐ
heを含むことを示した。それらのＮＭＲスペクトルが類
似することから、これらのＰhe残基はＩ及びIII で同一
である。
【００１９】エンドセリン活性及びそのレセプター結合
に拮抗する効果 エンドセリン（ＥＴ−１）と２種の密接に関連した生物
活性ペプチドＥＴ−２及びＥＴ−３は哺乳動物組織に広
く分布しており、それらは少なくとも２種の異なるエン
ドセリンレセプターサブタイプと結合することにより非
管及び管組織において様々な生物学的応答を誘導するこ
とができる。平滑筋、神経及び心房部位に加えて、エン
ドセリンレセプターは胃腸、泌尿生殖、子宮及び胎盤組
織でもみられる。
に拮抗する効果 エンドセリン（ＥＴ−１）と２種の密接に関連した生物
活性ペプチドＥＴ−２及びＥＴ−３は哺乳動物組織に広
く分布しており、それらは少なくとも２種の異なるエン
ドセリンレセプターサブタイプと結合することにより非
管及び管組織において様々な生物学的応答を誘導するこ
とができる。平滑筋、神経及び心房部位に加えて、エン
ドセリンレセプターは胃腸、泌尿生殖、子宮及び胎盤組
織でもみられる。
【００２０】エンドセリンは強力な血管収縮ペプチドで
あり、このためインビボで動脈圧−容量ホメオスタシス
に働いている。末梢のみならず冠状の血管抵抗もエンド
セリンで増加する。拍出量は減少するが、血漿レニン活
性は増加する。腎血流及び糸球体濾過速度は減少し、一
方心房性ナトリウム利尿因子、バソプレシン及びアルド
ステロンは増加する。
あり、このためインビボで動脈圧−容量ホメオスタシス
に働いている。末梢のみならず冠状の血管抵抗もエンド
セリンで増加する。拍出量は減少するが、血漿レニン活
性は増加する。腎血流及び糸球体濾過速度は減少し、一
方心房性ナトリウム利尿因子、バソプレシン及びアルド
ステロンは増加する。
【００２１】本発明によれば、エンドセリンレセプター
の拮抗剤は血管形成後の表皮剥脱に続く再狭窄を防止又
は抑制する上でも有用と考えられる。このような表皮剥
脱は血管形成後の脈管内膜肥厚に起因しているが、これ
はエンドセリン放出増加により生じる。エンドセリンは
平滑筋及び繊維芽細胞とおそらく他のタイプの細胞に関
しても増殖因子として作用する。
の拮抗剤は血管形成後の表皮剥脱に続く再狭窄を防止又
は抑制する上でも有用と考えられる。このような表皮剥
脱は血管形成後の脈管内膜肥厚に起因しているが、これ
はエンドセリン放出増加により生じる。エンドセリンは
平滑筋及び繊維芽細胞とおそらく他のタイプの細胞に関
しても増殖因子として作用する。
【００２２】エンドセリンは下垂体後葉で作用する神経
ペプチドでもあり、そこでは神経分泌ホルモンバソプレ
シン及びオキシトシンの放出を調節する。下垂体後葉か
ら放出されたエンドセリンは前記のような広範囲の作用
を有する循環ホルモンとしても作用する。これには内分
泌系、特に副腎に対する作用を含む。エンドセリンはエ
ピネフリンの血漿レベルを増加させる。したがって、エ
ンドセリンのレセプター拮抗剤である本発明の環状デプ
シペプチドＩ、II及びIII はエンドセリンがそのレセプ
ターに接近するのを全部又は一部阻止することにより前
記エンドセリンの様々な生理学的効果を防止、減少又は
調節する治療有用性を有する。
ペプチドでもあり、そこでは神経分泌ホルモンバソプレ
シン及びオキシトシンの放出を調節する。下垂体後葉か
ら放出されたエンドセリンは前記のような広範囲の作用
を有する循環ホルモンとしても作用する。これには内分
泌系、特に副腎に対する作用を含む。エンドセリンはエ
ピネフリンの血漿レベルを増加させる。したがって、エ
ンドセリンのレセプター拮抗剤である本発明の環状デプ
シペプチドＩ、II及びIII はエンドセリンがそのレセプ
ターに接近するのを全部又は一部阻止することにより前
記エンドセリンの様々な生理学的効果を防止、減少又は
調節する治療有用性を有する。
【００２３】ミクロビスポラ sp.ＭＡ６８５７の発酵 本発明のシクロペプチドＩ、II及びIII は sp.ＭＡ６８
５７と名付けられた新規なミクロビスポラ株の培養物か
ら単離された。この微生物のサンプルはブダペスト条約
に従い１２３０１パークローン・ドライブ，ロックビ
ル，メリーランド州２０８５２のアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９９１年１
月１７日付で寄託され、受理No. ＡＴＣＣ５５１４０と
決定された。マクロ及びミクロの形態に基き、その微生
物は気中菌糸上の対胞子の形成を特徴とするミクロビス
ポラ属の１つである。しかしながら、この微生物はミク
ロビスポラ属の公知株とは異る分類学的及び他の特徴を
有し、新規と考えられる。したがって、ここではミクロ
ビスポラ sp.ＭＡ６８５７と表示された。
５７と名付けられた新規なミクロビスポラ株の培養物か
ら単離された。この微生物のサンプルはブダペスト条約
に従い１２３０１パークローン・ドライブ，ロックビ
ル，メリーランド州２０８５２のアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９９１年１
月１７日付で寄託され、受理No. ＡＴＣＣ５５１４０と
決定された。マクロ及びミクロの形態に基き、その微生
物は気中菌糸上の対胞子の形成を特徴とするミクロビス
ポラ属の１つである。しかしながら、この微生物はミク
ロビスポラ属の公知株とは異る分類学的及び他の特徴を
有し、新規と考えられる。したがって、ここではミクロ
ビスポラ sp.ＭＡ６８５７と表示された。
【００２４】微生物ミクロビスポラ sp.ＭＡ６８５７は
インドのコチンで採取された土壌サンプルから常法に従
い得られた培養物から単離された。更に多量のシクロペ
プチドＩ、II及びIII を供給する大規模培養バッチを作
成するため、２５０ml容三個のバッフル付エーレンマイ
ヤーフラスコ中の水性栄養培地ＡＴＣＣ５０mlに冷蔵さ
れた又は解凍された凍結増殖性菌糸２mlを接種すること
により種菌を調製した。栄養培地ＡＴＣＣは下記組成を
有する：
インドのコチンで採取された土壌サンプルから常法に従
い得られた培養物から単離された。更に多量のシクロペ
プチドＩ、II及びIII を供給する大規模培養バッチを作
成するため、２５０ml容三個のバッフル付エーレンマイ
ヤーフラスコ中の水性栄養培地ＡＴＣＣ５０mlに冷蔵さ
れた又は解凍された凍結増殖性菌糸２mlを接種すること
により種菌を調製した。栄養培地ＡＴＣＣは下記組成を
有する：
【００２５】 ＡＴＣＣ グルコース １０．０ｇ 可溶性デンプン ２０．０ｇ 酵母エキス ５．０ｇ pHは CaCO3添加前に NaOH で Ｎ−ＺアミンＥ ５．０ｇ ７．０に調整する CaCO3 １．０ｇ ビーフエキス ３．０ｇ バクト−ペプトン ５．０ｇ 産生培地に接種するのに充分な菌体を得るため、培養容
器を２８℃でインキュベートし、２２０rpm で９６時間
振盪した。産生培地として用いたＳＡＭ−４は培養物増
殖用の資化性有機栄養素源としてデキストリン、大豆粉
及びペプトンを含有していた。その組成は以下で示され
る：
器を２８℃でインキュベートし、２２０rpm で９６時間
振盪した。産生培地として用いたＳＡＭ−４は培養物増
殖用の資化性有機栄養素源としてデキストリン、大豆粉
及びペプトンを含有していた。その組成は以下で示され
る：
【００２６】 ＳＡＭ−４ デキストリン ５０．０ｇ 大豆粉 ３０．０ｇ pHは CaCO3添加前に NaOH ディフコ（Difco)ペプトン １．０ｇ で７．０に調整する CaCO3 ５．０ｇ 蒸留水 １０００ml ２５０ml溶のバッフルなしエーレンマイヤーフラスコ当
たり産生培地４４mlに種培養物２ml／フラスコを接種
し、２８℃でインキュベートし、２２０rpm で６〜１０
日間振盪した。前記種培養物から、下記のような３種の
異なる産生培地を調製した：
たり産生培地４４mlに種培養物２ml／フラスコを接種
し、２８℃でインキュベートし、２２０rpm で６〜１０
日間振盪した。前記種培養物から、下記のような３種の
異なる産生培地を調製した：
【００２７】２Ｅ０１−（２５０ml容バッフル付エーレ
ンマイヤーフラスコ当たりＡＴＣＣ培地５０mlを解凍し
た凍結菌糸を接種し、２８℃及び２２０rpm でインキュ
ベートすることにより得られた）４日間種培養物からの
細胞懸濁液２mlをＳＡＭ−４産生培地４４mlに接種する
ために用い、２８℃及び２２０rpm で１０日間インキュ
ベートして回収した。
ンマイヤーフラスコ当たりＡＴＣＣ培地５０mlを解凍し
た凍結菌糸を接種し、２８℃及び２２０rpm でインキュ
ベートすることにより得られた）４日間種培養物からの
細胞懸濁液２mlをＳＡＭ−４産生培地４４mlに接種する
ために用い、２８℃及び２２０rpm で１０日間インキュ
ベートして回収した。
【００２８】３Ｇ０１−（ＢＡＭ−２寒天斜面からかき
取った細胞をＡＴＣＣ培地に接種することにより得られ
た）４日間種培養物からの細胞懸濁液２mlをＳＡＭ−４
産生培地４４mlに接種し、６日間インキュベートして回
収した。種及び産生双方の培地は２８℃及び２２０rpm
でインキュベートした。５Ｌ０１ −（１０％グリセロール中で保持された解凍凍
結菌糸をＡＴＣＣ培地に接種することにより得られた）
４日間種培養物からの細胞懸濁液２mlを用いＳＡＭ−４
産生培地４４mlに接種し、回収前に１０日間インキュベ
ートした。種及び産生双方の培地は２８℃及び２２０rp
m でインキュベートした。
取った細胞をＡＴＣＣ培地に接種することにより得られ
た）４日間種培養物からの細胞懸濁液２mlをＳＡＭ−４
産生培地４４mlに接種し、６日間インキュベートして回
収した。種及び産生双方の培地は２８℃及び２２０rpm
でインキュベートした。５Ｌ０１ −（１０％グリセロール中で保持された解凍凍
結菌糸をＡＴＣＣ培地に接種することにより得られた）
４日間種培養物からの細胞懸濁液２mlを用いＳＡＭ−４
産生培地４４mlに接種し、回収前に１０日間インキュベ
ートした。種及び産生双方の培地は２８℃及び２２０rp
m でインキュベートした。
【００２９】培養物２Ｅ０１及び３Ｇ０１からシクロペ
プチドＩ、II及びIII の単離 ２Ｅ０１及び３Ｇ０１培養物をプールし（全ブロス１１
５ml）、メチルエチルケトンで抽出した。有機層をロー
ト（roto) エバポレーターにおいて真空下４０℃以下で
フラッシュ蒸発させ（乾燥重量＝８９mg）、しかる後Ｄ
ＭＳＯ ０．２mlに溶解し、１サンプルとしてワットマ
ン・パーティシル（Whatman partisil)１０ ＯＤＳ−
３カラム（０．９４×５０cm）上室温、５ml／min 、水
中アセトニトリル０−１００％の勾配（０−１０min ま
で０％；１０−６０min は０−１００％（直線勾配）を
用いクロマトグラフィーを行った。１分間画分８０画分
を集めてから、アセトニトリル２００mlで洗浄した。画
分３８−４４はウシ大動脈組織を用いた 125Ｉ−ＥＴ−
１結合アッセイにおいて活性を示した。画分３８−４４
をプールし、前記のように蒸発させ（乾燥重量＝１６．
６mg）、メタノール／ジメチルスルホキシド（２：３）
の溶液０．２５mlに溶解し、同様のカラムにおいて室温
で再クロマトグラフィーに付した。このとき水中メタノ
ール２０−７０％の勾配を用いた（２０％で０−１０mi
n ；直線勾配２０−７５％で１０−６５min ；直線勾配
７５−１００％で６５−７５min ）。画分５７−６４は
活性を有しており、プールされた。これらの画分の分析
ＨＰＬＣ分析（ワットマン・パーティシル５ ＯＤＳ−
３ ０．４６×１０cm；４０℃、流速１ml／min で５０
％水性メタノール；２１５nmのＵＶ吸収モニターにより
検出）を行い３種の活性成分を得た：５８−５９（１．
５mg）、６０−６１（４．５mg）及び６３−６４（１．
６mg）。更に、トリフルオロ酢酸／メタノール／ジクロ
ロメタン１：５：９５を用いたＥ．メルクシリカゲル６
０Ｆ ＴＬＣプレート（１０×２０cm、０．２mm厚）に
より精製すると各ケースにおいて活性は原点に認められ
た。次いでワットマン・パーティシル１０ ＯＤＳ−３
（０．４６×２５cm）により４０℃でこれら各活性原点
領域を精製し、各画分についてそれぞれ１ml／min で４
５％メタノール／水、５０％メタノール／水、５０％メ
タノール／水による均等溶出を行い、１min 画分を集め
た。結合データと分析ＨＰＬＣ（ワットマン・パーティ
シル５ ＯＤＳ−３ ０．４６×１０cm；４０℃、流速
１ml／min でMeOH−H2O ４５：５５；２１５nmのＵＶ吸
収モニターにより検出）で示される均質性から、画分１
３−１７（０．２５mg、成分Ｉ）、画分１０−１３
（３．２mg、成分II）及び画分１７−１９（０．６４m
g、成分III ）が活性を示した。ＵＶ、ＦＴ−ＩＲ及び
1H-NMR （CD3OD)データでは３種の成分が構造的に関連
していることを示した。
プチドＩ、II及びIII の単離 ２Ｅ０１及び３Ｇ０１培養物をプールし（全ブロス１１
５ml）、メチルエチルケトンで抽出した。有機層をロー
ト（roto) エバポレーターにおいて真空下４０℃以下で
フラッシュ蒸発させ（乾燥重量＝８９mg）、しかる後Ｄ
ＭＳＯ ０．２mlに溶解し、１サンプルとしてワットマ
ン・パーティシル（Whatman partisil)１０ ＯＤＳ−
３カラム（０．９４×５０cm）上室温、５ml／min 、水
中アセトニトリル０−１００％の勾配（０−１０min ま
で０％；１０−６０min は０−１００％（直線勾配）を
用いクロマトグラフィーを行った。１分間画分８０画分
を集めてから、アセトニトリル２００mlで洗浄した。画
分３８−４４はウシ大動脈組織を用いた 125Ｉ−ＥＴ−
１結合アッセイにおいて活性を示した。画分３８−４４
をプールし、前記のように蒸発させ（乾燥重量＝１６．
６mg）、メタノール／ジメチルスルホキシド（２：３）
の溶液０．２５mlに溶解し、同様のカラムにおいて室温
で再クロマトグラフィーに付した。このとき水中メタノ
ール２０−７０％の勾配を用いた（２０％で０−１０mi
n ；直線勾配２０−７５％で１０−６５min ；直線勾配
７５−１００％で６５−７５min ）。画分５７−６４は
活性を有しており、プールされた。これらの画分の分析
ＨＰＬＣ分析（ワットマン・パーティシル５ ＯＤＳ−
３ ０．４６×１０cm；４０℃、流速１ml／min で５０
％水性メタノール；２１５nmのＵＶ吸収モニターにより
検出）を行い３種の活性成分を得た：５８−５９（１．
５mg）、６０−６１（４．５mg）及び６３−６４（１．
６mg）。更に、トリフルオロ酢酸／メタノール／ジクロ
ロメタン１：５：９５を用いたＥ．メルクシリカゲル６
０Ｆ ＴＬＣプレート（１０×２０cm、０．２mm厚）に
より精製すると各ケースにおいて活性は原点に認められ
た。次いでワットマン・パーティシル１０ ＯＤＳ−３
（０．４６×２５cm）により４０℃でこれら各活性原点
領域を精製し、各画分についてそれぞれ１ml／min で４
５％メタノール／水、５０％メタノール／水、５０％メ
タノール／水による均等溶出を行い、１min 画分を集め
た。結合データと分析ＨＰＬＣ（ワットマン・パーティ
シル５ ＯＤＳ−３ ０．４６×１０cm；４０℃、流速
１ml／min でMeOH−H2O ４５：５５；２１５nmのＵＶ吸
収モニターにより検出）で示される均質性から、画分１
３−１７（０．２５mg、成分Ｉ）、画分１０−１３
（３．２mg、成分II）及び画分１７−１９（０．６４m
g、成分III ）が活性を示した。ＵＶ、ＦＴ−ＩＲ及び
1H-NMR （CD3OD)データでは３種の成分が構造的に関連
していることを示した。
【００３０】培養物５Ｌ０１からシクロペプチドＩ、II
及びIII の単離 培養物５Ｌ０１（全ブロス２７００ml、pH８．４）を希
HCl でpH７．２に調整し、メチルエチルケトン（３８０
０ml）で抽出した。不活性な水層は捨てた。活性な有機
層はロート−エバポレーターを用いて真空下４０℃以下
でフラッシュ蒸発させ（乾燥重量１．３４ｇ；ＥＣ50＝
２５μｌＷＢＥ／ml）、CH2Cl2中Ｅ．メルクシリカゲル
６０（５０ｇ、４０−６３μm ）のカラムにおいてCH2C
l2（１８０ml）、５％MeOH／CH2Cl2（５×１００ml）、
１０％MeOH／CH2Cl2（２×１００ml及び２００ml）及び
各２００mlの２０、３０、５０、１００％MeOH／CH2Cl2
による段階的溶出でクロマトグラフィーを行った。ＨＰ
ＬＣ分析では画分８及び９（即ち、第二及び第三の１０
％MeOH／CH2Cl2溶出液）に望ましい成分が存在したが、
これは 125Ｉ−ＥＴ−１／ウシ大動脈結合データ（９０
０μｌＷＢＥ／mlにおいて各々９１及び７４％阻害）に
より確認した。これらの画分はプールし、ロート−エバ
ポレーターを用いて真空下４０℃以下でフラッシュ蒸発
させ、ワットマン・パーティシル１０ ＯＤＳ−３カラ
ム（２．２１×２５cm）において４０−５５−１００％
MeOH／H2O 勾配溶出（４０％で０−５min ；直線勾配４
０−５５％で５−６５min ；直線勾配５５−１００％で
６５−１２０min ）を用い４０℃、流速１５ml／min で
クロマトグラフィーを行った。１分間画分を集めた。分
析的ＨＰＬＣ（ワットマン・パーティシル５ ＯＤＳ−
３ ０．４６×１０cm；４０℃、流速１ml／min でMeOH
−H2O ４５：５５；２１５nmのＵＶ吸収モニターによる
検出）から画分４１−４６，５１−５５及び６４−７２
をプールした。これら画分のフラッシュ蒸発により化合
物Ｉ ８．８mgを得た（画分 ）。
及びIII の単離 培養物５Ｌ０１（全ブロス２７００ml、pH８．４）を希
HCl でpH７．２に調整し、メチルエチルケトン（３８０
０ml）で抽出した。不活性な水層は捨てた。活性な有機
層はロート−エバポレーターを用いて真空下４０℃以下
でフラッシュ蒸発させ（乾燥重量１．３４ｇ；ＥＣ50＝
２５μｌＷＢＥ／ml）、CH2Cl2中Ｅ．メルクシリカゲル
６０（５０ｇ、４０−６３μm ）のカラムにおいてCH2C
l2（１８０ml）、５％MeOH／CH2Cl2（５×１００ml）、
１０％MeOH／CH2Cl2（２×１００ml及び２００ml）及び
各２００mlの２０、３０、５０、１００％MeOH／CH2Cl2
による段階的溶出でクロマトグラフィーを行った。ＨＰ
ＬＣ分析では画分８及び９（即ち、第二及び第三の１０
％MeOH／CH2Cl2溶出液）に望ましい成分が存在したが、
これは 125Ｉ−ＥＴ−１／ウシ大動脈結合データ（９０
０μｌＷＢＥ／mlにおいて各々９１及び７４％阻害）に
より確認した。これらの画分はプールし、ロート−エバ
ポレーターを用いて真空下４０℃以下でフラッシュ蒸発
させ、ワットマン・パーティシル１０ ＯＤＳ−３カラ
ム（２．２１×２５cm）において４０−５５−１００％
MeOH／H2O 勾配溶出（４０％で０−５min ；直線勾配４
０−５５％で５−６５min ；直線勾配５５−１００％で
６５−１２０min ）を用い４０℃、流速１５ml／min で
クロマトグラフィーを行った。１分間画分を集めた。分
析的ＨＰＬＣ（ワットマン・パーティシル５ ＯＤＳ−
３ ０．４６×１０cm；４０℃、流速１ml／min でMeOH
−H2O ４５：５５；２１５nmのＵＶ吸収モニターによる
検出）から画分４１−４６，５１−５５及び６４−７２
をプールした。これら画分のフラッシュ蒸発により化合
物Ｉ ８．８mgを得た（画分 ）。
【００３１】 表 ５ 成分Ｉ 成分II 成分III tR (min) * 4.75 6.08 9.40 UV(MeOH) ： λmax nm（E%) 209 (378.4) 213 (483) 212 (470.6) 270.5 (115) 274.5 (218.8) 273.5 (207.4) λmin nm（E%) 245 (53.9) 246 (64) 245.5 (72.2) FT-IR ：** υmax cm-1 3287 3304 3304 1733 1734 1733 1668 1657 1662 1563 1607 1558 1521 1521 1519 ＊ 分析ＨＰＬＣ：カラム−ワットマン・パーティシル
５ ＯＤＳ−３ ０．４６×１０cm；移動相−MeOH−H2
O ４５：５５、１ml／min 、４０℃；検出−ＵＶ２１５
nm** パーキン−エルマー・モデル（Perkin-Elmer Model)
１７５０赤外線フーリエ変換スペクトル測定器；環境温
度においてセレン化亜鉛結晶上においたサンプル
５ ＯＤＳ−３ ０．４６×１０cm；移動相−MeOH−H2
O ４５：５５、１ml／min 、４０℃；検出−ＵＶ２１５
nm** パーキン−エルマー・モデル（Perkin-Elmer Model)
１７５０赤外線フーリエ変換スペクトル測定器；環境温
度においてセレン化亜鉛結晶上においたサンプル
【００３２】エンドセリンレセプター結合アッセイ結果 エンドセリンレセプターに対するシクロペプチドＩ、II
及びIII の結合を以下で詳細に記載されたアッセイに従
い調べた。それはアンバー (Ambar)ら，１９８９年，バ
イオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・
コミュニケーションズ，第１５８巻，第１９５−２０１
頁；ホーグら，１９８９年，フェブス・レターズ，第２
５３巻，第１９９−２０２頁〔Khoog et al.（１９８
９）Febs Letters, ２５３、１９９−２０２〕で記載さ
れたアッセイと類似している。エンドセリン−１（ＥＴ
−１）はペプタイズ・インターナショナル（PeptidesIn
ternational）（ケンタッキー州ルイスビル）から購入
した。 125Ｉ−ＥＴ−１（２０００Ci／mmol）はアマー
シャム（Amersham) （イリノイ州アーリントンハイツ）
から購入した。膜はラット海馬及びラット又は雌ウシ大
動脈から調製した。切り裂いた組織をブリンクマン・ポ
リトロン（Brinkman Polytron)〔セッティング１０、ジ
ェネレーターＰＴＡ２０ＴＳ（ニューヨーク州ウェスト
バリー）〕で７μｇ／mlペプスタチンＡ及び０．５μｇ
／mlロイペプチン含有の氷冷２５０ mM スクロース、５
０ mM トリス−HCl 、pH７．４中３０秒間にわたり２回
ホモジナイズした。粗粒物質を７５０xgで１０分間の遠
心により除去した。４８，０００xgで３０分間の遠心に
より膜を上澄画分から沈降させた。膜ペレットをプロテ
アーゼ阻害剤含有の上記緩衝液に再懸濁した。これら懸
濁液を分けて−７０℃で貯蔵した。125Ｉ−ＥＴ−１と
の結合試験は、１２穴スカトロン（Skatron)（ノルウェ
ー、リア）セルハーベスターチューブストリップを用い
て０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有pH７．５の
５０ mM リン酸カリウム中で行った。 125Ｉ−ＥＴ−１
濃度は海馬の場合２５pM、大動脈の場合１５０pMとし
た。サンプルをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶
解した。サンプルの添加後、最終ＤＭＳＯ濃度は３％と
なった。最後に膜を加えて結合反応を開始させた。反応
混合液を３７℃で３０又は６０分間インキュベートし
た。スカトロンセルハーベスターを用い、前もって２％
ＢＳＡに浸漬したガラス繊維フィルターパッドで濾過し
て結合反応を終結させた。パッド上のサンプルを直ちに
０．１％ＢＳＡ含有１５０ mM NaCl で洗浄した。パッ
ドを打ち抜き、放射能をベックマン・ガンマ（Beckman
Gamma)５５００ガンマカウンター（カリフォルニア州フ
ラートン）で評価した。非特異的結合は１００ nM ＥＴ
−１の存在下で調べた。この結合アッセイの結果は下記
数値の表で示されている：
及びIII の結合を以下で詳細に記載されたアッセイに従
い調べた。それはアンバー (Ambar)ら，１９８９年，バ
イオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・
コミュニケーションズ，第１５８巻，第１９５−２０１
頁；ホーグら，１９８９年，フェブス・レターズ，第２
５３巻，第１９９−２０２頁〔Khoog et al.（１９８
９）Febs Letters, ２５３、１９９−２０２〕で記載さ
れたアッセイと類似している。エンドセリン−１（ＥＴ
−１）はペプタイズ・インターナショナル（PeptidesIn
ternational）（ケンタッキー州ルイスビル）から購入
した。 125Ｉ−ＥＴ−１（２０００Ci／mmol）はアマー
シャム（Amersham) （イリノイ州アーリントンハイツ）
から購入した。膜はラット海馬及びラット又は雌ウシ大
動脈から調製した。切り裂いた組織をブリンクマン・ポ
リトロン（Brinkman Polytron)〔セッティング１０、ジ
ェネレーターＰＴＡ２０ＴＳ（ニューヨーク州ウェスト
バリー）〕で７μｇ／mlペプスタチンＡ及び０．５μｇ
／mlロイペプチン含有の氷冷２５０ mM スクロース、５
０ mM トリス−HCl 、pH７．４中３０秒間にわたり２回
ホモジナイズした。粗粒物質を７５０xgで１０分間の遠
心により除去した。４８，０００xgで３０分間の遠心に
より膜を上澄画分から沈降させた。膜ペレットをプロテ
アーゼ阻害剤含有の上記緩衝液に再懸濁した。これら懸
濁液を分けて−７０℃で貯蔵した。125Ｉ−ＥＴ−１と
の結合試験は、１２穴スカトロン（Skatron)（ノルウェ
ー、リア）セルハーベスターチューブストリップを用い
て０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有pH７．５の
５０ mM リン酸カリウム中で行った。 125Ｉ−ＥＴ−１
濃度は海馬の場合２５pM、大動脈の場合１５０pMとし
た。サンプルをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶
解した。サンプルの添加後、最終ＤＭＳＯ濃度は３％と
なった。最後に膜を加えて結合反応を開始させた。反応
混合液を３７℃で３０又は６０分間インキュベートし
た。スカトロンセルハーベスターを用い、前もって２％
ＢＳＡに浸漬したガラス繊維フィルターパッドで濾過し
て結合反応を終結させた。パッド上のサンプルを直ちに
０．１％ＢＳＡ含有１５０ mM NaCl で洗浄した。パッ
ドを打ち抜き、放射能をベックマン・ガンマ（Beckman
Gamma)５５００ガンマカウンター（カリフォルニア州フ
ラートン）で評価した。非特異的結合は１００ nM ＥＴ
−１の存在下で調べた。この結合アッセイの結果は下記
数値の表で示されている：
【００３３】 表 ６ ＥＴ−Ａ及びＥＴ−Ｂレセプターに対する親和性 Ki(nM)vs.[125I]-ET-1 ラット大動脈 ラット海馬 (ET-A) (ET-B) 化合物Ｉ １００ ２００ 化合物II ３０００ ３０００ 化合物III ２００ ５００ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 本発明によれば、本発明の環状デプシペプチドＩ、II及
びIII はヒト療法においてエンドセリンに起因する又は
関連した喘息、高血圧、腎不全、特に虚血後腎不全、シ
クロスポリン腎毒性、血管痙攣、大脳及び心臓虚血、心
筋梗塞又は内毒素ショックの治療に有用であり、かかる
治療の必要なヒト患者に治療有効量の環状デプシペプチ
ドＩ、II又はIII を投与する。
びIII はヒト療法においてエンドセリンに起因する又は
関連した喘息、高血圧、腎不全、特に虚血後腎不全、シ
クロスポリン腎毒性、血管痙攣、大脳及び心臓虚血、心
筋梗塞又は内毒素ショックの治療に有用であり、かかる
治療の必要なヒト患者に治療有効量の環状デプシペプチ
ドＩ、II又はIII を投与する。
【００３４】このような治療中に投与される具体的投薬
量は治療される具体的症状、投与経路、治療される患者
の年令、性別、体重及び一般的症状並びに短期又は長期
いずれの治療が考えられるかというようないくつかの因
子の結果である。それらを考慮にいれると、一般的事項
として、本発明の環状デプシペプチドＩ、II及びIIIは
１〜２００mg／kg／day の投薬量で患者に経口投与さ
れ、０．５〜１００mg／kg／day の投薬量で患者に非経
口投与されると述べることができる。
量は治療される具体的症状、投与経路、治療される患者
の年令、性別、体重及び一般的症状並びに短期又は長期
いずれの治療が考えられるかというようないくつかの因
子の結果である。それらを考慮にいれると、一般的事項
として、本発明の環状デプシペプチドＩ、II及びIIIは
１〜２００mg／kg／day の投薬量で患者に経口投与さ
れ、０．５〜１００mg／kg／day の投薬量で患者に非経
口投与されると述べることができる。
【００３５】本発明はエンドセリンに起因する又は関連
した喘息、高血圧、腎不全、特に虚血後腎不全、シクロ
スポリン腎毒性、血管痙攣、大脳及び心臓虚血、心筋梗
塞又は内毒素ショック治療用の医薬組成物にも関し、そ
れは治療有効量の環状デプシペプチドＩ、II又はIII を
そのための薬学上許容されるキャリアと共に含有してい
る。本発明の医薬組成物が経口投与用、例えば錠剤であ
る場合、活性成分、即ち環状デプシペプチドＩ、II又は
III はタルク、植物油、ポリオール、ベンジルアルコー
ル、ガム、ゼラチン、デンプン及び他のキャリアのよう
な他の配合成分と組合せて用いられるが、それらはすべ
て当業界で周知である。本発明の医薬組成物が非経口投
与用である場合、活性成分が適切な液体キャリアに溶解
もしくは分散されるか、又はエマルジョンが適切な乳化
剤を用いて形成される。
した喘息、高血圧、腎不全、特に虚血後腎不全、シクロ
スポリン腎毒性、血管痙攣、大脳及び心臓虚血、心筋梗
塞又は内毒素ショック治療用の医薬組成物にも関し、そ
れは治療有効量の環状デプシペプチドＩ、II又はIII を
そのための薬学上許容されるキャリアと共に含有してい
る。本発明の医薬組成物が経口投与用、例えば錠剤であ
る場合、活性成分、即ち環状デプシペプチドＩ、II又は
III はタルク、植物油、ポリオール、ベンジルアルコー
ル、ガム、ゼラチン、デンプン及び他のキャリアのよう
な他の配合成分と組合せて用いられるが、それらはすべ
て当業界で周知である。本発明の医薬組成物が非経口投
与用である場合、活性成分が適切な液体キャリアに溶解
もしくは分散されるか、又はエマルジョンが適切な乳化
剤を用いて形成される。
【図１】化合物Ｉの 1H-NMR スペクトルを示す図であ
る。
る。
【図２】化合物IIの 1H-NMR スペクトルを示す図であ
る。
る。
【図３】化合物III の 1H-NMR スペクトルを示す図であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＵ ＡＣＤ ＡＣＵ Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＵ ＡＣＤ ＡＣＵ (72)発明者 オットー デー．ヘンセンズ アメリカ合衆国，07701 ニュージャーシ ィ，レッド バンク，リヴァー プラザ, アレキサンダー ドライヴ 65 (72)発明者 ジェラルド エム．リーシュ アメリカ合衆国，08550 ニュージャーシ ィ，プリンストン ジャンクション，シャ ーブルック ドライヴ 10 (72)発明者 デボラ エル．ツィンク アメリカ合衆国，07728 ニュージャーシ ィ，マナラパン，ブレンヘイム ロード 37 (72)発明者 リーユアン フアング アメリカ合衆国，07060 ニュージャーシ ィ，ウォッチュング，ウィル レーン 33 (72)発明者 ディヴィッド エル．ウィリアムス，ジュ ニア アメリカ合衆国，19440 ペンシルヴァニ ア，ハットフィールド，ピーチ ツリー レーン 1545 (72)発明者 オルガ アール．ジェニロウド スペイン国，28006 マドリッド，カステ ロ 107
Claims (4)
- 【請求項１】 下記式の環状デプシペプチドであるエン
ドセリンレセプター拮抗剤： 【化１】 - 【請求項２】 ミクロビスポラ sp.ＭＡ６８５７、ＡＴ
ＣＣ５５１４０を培養し、発酵ブロスから望ましい化合
物を単離することからなる、請求項１記載のエンドセリ
ンのレセプター拮抗剤である環状デプシペプチドの製造
方法。 - 【請求項３】 新規微生物株ミクロビスポラ sp.ＭＡ６
８５７、ＡＴＣＣ５５１４０。 - 【請求項４】 請求項１記載の環状デプシペプチドI、I
I又はIIIの治療有効量と薬学上許容されるキャリアを含
有する、エンドセリンに起因する又は関連した喘息、高
血圧、腎不全、特に虚血後腎不全、シクロスポリン腎毒
性、血管痙攣、大脳及び心臓虚血、心筋梗塞又は内毒素
ショック治療用の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US645535 | 1975-12-31 | ||
| US64553591A | 1991-01-24 | 1991-01-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06135992A JPH06135992A (ja) | 1994-05-17 |
| JPH0772195B2 true JPH0772195B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=24589397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4009593A Expired - Lifetime JPH0772195B2 (ja) | 1991-01-24 | 1992-01-23 | ミクロビスポラから単離された新規エンドセリンレセプター拮抗剤 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0496452A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0772195B2 (ja) |
| CA (1) | CA2059380A1 (ja) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5571821A (en) * | 1993-05-20 | 1996-11-05 | Texas Biotechnology Corporation | Sulfonamides and derivatives thereof that modulate the activity of endothelin |
| US5594021A (en) * | 1993-05-20 | 1997-01-14 | Texas Biotechnology Corporation | Thienyl-, furyl- and pyrrolyl sulfonamides and derivatives thereof that modulate the activity of endothelin |
| US5962490A (en) | 1987-09-25 | 1999-10-05 | Texas Biotechnology Corporation | Thienyl-, furyl- and pyrrolyl-sulfonamides and derivatives thereof that modulate the activity of endothelin |
| US5591761A (en) * | 1993-05-20 | 1997-01-07 | Texas Biotechnology Corporation | Thiophenyl-, furyl-and pyrrolyl-sulfonamides and derivatives thereof that modulate the activity of endothelin |
| US5736509A (en) * | 1990-12-14 | 1998-04-07 | Texas Biotechnology Corporation | Cyclic peptide surface feature mimics of endothelin |
| US5240910A (en) * | 1992-04-17 | 1993-08-31 | Merck & Co., Inc. | Antihypertensive compounds produced by fermentation |
| US5352800A (en) * | 1993-03-11 | 1994-10-04 | Merck & Co., Inc. | Process for the production of a novel endothelin antagonist |
| US5374638A (en) * | 1993-03-19 | 1994-12-20 | Merck & Co., Inc. | Six membered ring fused imidazoles substituted with phenoxyphenylacetic acid derivatives used to treat asthma |
| US5767310A (en) * | 1993-03-19 | 1998-06-16 | Merck & Co., Inc. | Phenoxyphenylacetic acid derivatives |
| US5401745A (en) * | 1993-03-19 | 1995-03-28 | Merck & Co., Inc. | Quinazolinones substituted with phenoxyphenylacetic acid derivatives |
| US5334598A (en) * | 1993-03-19 | 1994-08-02 | Merck & Co., Inc. | Six-membered ring fused imidazoles substituted with phenoxyphenylacetic acid derivatives |
| US5420133A (en) * | 1993-03-19 | 1995-05-30 | Merck & Co., Inc. | Quinazolinones substituted with phenoxyphenylacetic acid derivatives |
| EP0626174A3 (en) | 1993-04-21 | 1996-01-03 | Takeda Chemical Industries Ltd | Method and composition for the prophylaxis and / or treatment of underactive organs. |
| US6541498B2 (en) | 1993-05-20 | 2003-04-01 | Texas Biotechnology | Benzenesulfonamides and the use thereof to modulate the activity of endothelin |
| US6613804B2 (en) | 1993-05-20 | 2003-09-02 | Encysive Pharmaceuticals, Inc. | Biphenylsulfonamides and derivatives thereof that modulate the activity of endothelin |
| US6030991A (en) * | 1993-05-20 | 2000-02-29 | Texas Biotechnology Corp. | Benzenesulfonamides and the use thereof to modulate the activity of endothelin |
| US6342610B2 (en) | 1993-05-20 | 2002-01-29 | Texas Biotechnology Corp. | N-aryl thienyl-, furyl-, and pyrrolyl-sulfonamides and derivatives thereof that modulate the activity of endothelin |
| US5686478A (en) * | 1993-07-20 | 1997-11-11 | Merck & Co. Inc. | Endothelin antagonists |
| US5538991A (en) * | 1994-09-14 | 1996-07-23 | Merck & Co., Inc. | Endothelin antagonists bearing 5-membered heterocyclic amides |
| US5559135A (en) * | 1994-09-14 | 1996-09-24 | Merck & Co., Inc. | Endothelin antagonists bearing pyridyl amides |
| US5977117A (en) | 1996-01-05 | 1999-11-02 | Texas Biotechnology Corporation | Substituted phenyl compounds and derivatives thereof that modulate the activity of endothelin |
| US5958905A (en) | 1996-03-26 | 1999-09-28 | Texas Biotechnology Corporation | Phosphoramidates, phosphinic amides and related compounds and the use thereof to modulate the activity of endothelin |
| US5804585A (en) * | 1996-04-15 | 1998-09-08 | Texas Biotechnology Corporation | Thieno-pyridine sulfonamides derivatives thereof and related compounds that modulate the activity of endothelin |
| US5783705A (en) | 1997-04-28 | 1998-07-21 | Texas Biotechnology Corporation | Process of preparing alkali metal salys of hydrophobic sulfonamides |
| US6432994B1 (en) | 1997-04-28 | 2002-08-13 | Texas Biotechnology Corporation | Sulfonamides for treatment of endothelin-mediated disorders |
| KR20010034461A (ko) | 1998-01-28 | 2001-04-25 | 요시다 쇼지 | 시기능 장해의 예방 또는 치료제 |
| US7566452B1 (en) | 1999-05-04 | 2009-07-28 | New York University | Cancer treatment with endothelin receptor antagonists |
| PL197782B1 (pl) | 1999-12-31 | 2008-04-30 | Encysive Pharmaceuticals Inc | Sulfonoamidy, środek farmaceutyczny i zastosowanie sulfonoamidów |
| WO2001068121A1 (fr) * | 2000-03-17 | 2001-09-20 | Ajinomoto Co., Inc. | Remedes contre des maladies allergiques |
| CA2430934C (en) | 2000-12-01 | 2011-06-21 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | A method of producing sustained-release preparations of a bioactive substance using high-pressure gas |
| US7041657B2 (en) * | 2001-02-12 | 2006-05-09 | Marine Polymer Technologies Inc. | Compositions and methods for modulation of vascular structure and/or function |
| GB0326632D0 (en) | 2003-11-14 | 2003-12-17 | Jagotec Ag | Dry powder formulations |
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| WO2014010586A1 (ja) | 2012-07-10 | 2014-01-16 | 武田薬品工業株式会社 | 注射用製剤 |
| JP6024880B2 (ja) * | 2012-09-03 | 2016-11-16 | 国立大学法人東北大学 | 環状デプシペプチドの新規使用方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2599039B1 (fr) * | 1986-05-22 | 1988-08-05 | Rhone Poulenc Sante | Nouvelle substance immuno-suppressive, sa preparation par culture de streptomyces sp. (cbs 162.86) et les compositions pharmaceutiques qui la contiennent |
-
1992
- 1992-01-15 CA CA002059380A patent/CA2059380A1/en not_active Abandoned
- 1992-01-16 EP EP92200111A patent/EP0496452A1/en not_active Withdrawn
- 1992-01-23 JP JP4009593A patent/JPH0772195B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0496452A1 (en) | 1992-07-29 |
| JPH06135992A (ja) | 1994-05-17 |
| CA2059380A1 (en) | 1992-07-25 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19960124 |