JPH0769327B2

JPH0769327B2 - 酵素免疫測定法

Info

Publication number: JPH0769327B2
Application number: JP33211389A
Authority: JP
Inventors: 恒男羽生
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1989-12-20
Filing date: 1989-12-20
Publication date: 1995-07-26
Anticipated expiration: 2010-07-26
Also published as: JPH03191863A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、抗原抗体反応を利用して体液中の微量成分を
測定する方法に関し、特に測定対象物質が２つのサブユ
ニットよりなる生理活性物質を一回の免疫反応により、
測定するいわゆる１ステップ酵素免疫測定法に関する方
法であり、サブユニットよりなる種々の微量成分を測定
する体外診断用医薬品に、幅広く応用できる。

（従来技術との関係）従来、体液中に存在する微量成分である２つのサブユニ
ットよりなる生理活性物質を、抗原抗体反応を利用して
体液中の微量成分を測定する方法としては、種々存在す
る。固相を用いた方法としては、その生理活性物質に特
異的なサブユニットに対する抗体を固相に固定化し、さ
らに、測定対象物質としての生理活性物質を酵素やラジ
オアイソトープで標識した後、その一定量を測定対象物
質を含む試料とともに混合し、洗浄、分離後、その固相
上に結合した標識生理活性物質の標識活性を求めるいわ
ゆる競合性がある。しかし、この方法は、低濃度での精
度が悪いため感度が悪い、測定範囲が狭い、標識する対
象物質の精製度合が測定系に影響するため、対象物質の
純度管理を厳密にしなければならないという欠点があ
る。

さらに別の方法として、生理活性物質の１つのサブユニ
ットを認識する抗体を固相に結合した不溶化抗体と生理
活性物質を反応させた後、洗浄し、反応しない他の生理
活性物質を系より除き、次いで他方のサブユニットを認
識する抗体を酵素等で標識した標識抗体を加え２回目の
反応を行なわせた後、再び洗浄し、固相上の酵素活性等
の標識物の活性を求め、標準曲線よりその濃度を測定す
るサンドイッチ法、いわゆる２ステップサンドイッチ法
といわれている方法がある。この方法は、免疫反応を２
回行わなければならず且つ洗浄も２回になり、操作が非
常に煩雑になる。さらには、測定に要する時間もかかる
という欠点を有している。

このため、近年、細胞融合技術を用いたモノクローナル
抗体を用いてこれらの欠点を解消することが行われるよ
うになってきているが、２つのサブユニットよりなる生
理活性物質をそれぞれのサブユニットを認識するモノク
ローナル抗体を用いて１回の免疫反応で測定する場合、
測定試料中にサブユニットを共通する他の生理活性物質
が存在した場合は、その影響を受け測定値が正しく測定
されない欠点を有していた。

２つのサブユニットよりなる生理活性物質、特に甲状腺
刺激ホルモン（TSH）、黄体化ホルモン（LH）、卵胞刺
激ホルモン（FSH）、絨毛性ゴナドトロピン（HCG）と言
ったホルモンは、αサブユニットとβサブユニットより
成立ち、αサブユニットは、これらホルモンに共通であ
り、βサブユニットがそのホルモンに特異的である。こ
れらのホルモンの測定において、αサブユニットに対す
る抗体、またはβサブユニットに対するモノクローナル
抗体を用いて測定する場合は、αサブユニットを共有す
る他のホルモンの影響を回避するため２ステップサンド
イッチ法で測定されるのが一般的である。即ち、大過剰
に存在する他のαサブユニットを共通するホルモンは洗
浄により測定系より洗い流した後、標識抗体を加えるこ
とによりαサブユニットを共有するホルモンの影響を回
避している。これらのホルモンを１ステップサンドイッ
チ法で測定した場合には、例えば、TSH測定の際、妊婦
血清のように測定対象物質中にHCGが大過剰に存在する
場合、αサブユニットに対するモノクローナル抗体がHC
Gと結合して、測定対象としてのTSHに結合する量が少な
くなり、結果としてTSH測定値が低値を示すようにな
り、１ステップサンドイッチ法では、正確な値を求める
のは困難であった。

（発明が解決しようとする問題点）２つのサブユニットよりなる生理活性物質の特異的なサ
ブユニットを認識する抗体とその該ホルモンの２つのサ
ブユニットの結合部分を認識するモノクローナル抗体を
用いても１ステップサンドイッチ法が行ないうると考え
られる。しかし、この場合、それぞれの抗体の認識部位
の立体的関係により、それぞれの抗体が該ホルモンに結
合するのに一定の時間が必要なため測定時間がかかると
いった問題点があり、短時間にしかも精度よく測定する
には、該ホルモンに対し親和定数のより高い抗体を使用
しなければならないといった欠点がある。

さらには、細胞融合技術を用いて作られるモノクローナ
ル抗体を用いて測定対象物質と交差反応を示す２つのサ
ブユニットよりなる生理活性物質の共通する１つのサブ
ユニットに対し、測定に使用する抗体と認識部位の異な
るモノクローナル抗体で処理して交差する生理活性物質
の共通する１つのサブユニットの部分をあらかじめモノ
クローナル抗体に結合させ、ブロッキングすることで、
交差反応する生理活性物質に対し使用している共通サブ
ユニットを認識する抗体が結合しなくなるようにし、測
定に対する影響を除くことも可能であると考えられる。
しかし、この方法を１ステップサンドイッチ法に適用し
た場合、多くの場合、ブロッキング用に用いるモノクロ
ーナル抗体が、測定対象物質にも結合し、測定に供した
共通サブユニットに対する抗体が結合しなくなるといっ
た欠点がある。そこで、これらの欠点を持たない２つの
サブユニットよりなる生理活性物質の１ステップサンド
イッチ法の確立が求められている。

（問題点を解決するための手段）本発明者は、鋭意研究の結果、本発明に達したものであ
る。即ち、本発明は２つのサブユニットよりなる生理活
性物質の１つのサブユニットに対する抗体を不溶性物質
に結合させて不溶性抗体とし、他のサブユニットに対す
る抗体を酵素で標識して標識抗体とし、２つのサブユニ
ットよりなる生理活性物質を、不溶性抗体および酵素標
識抗体と同時に反応させ、２つのサブユニットよりなる
生理活性物質を介して不溶性抗体に結合した酵素標識抗
体の酵素活性あるいは結合しなかった酵素標識抗体の酵
素活性を測定することにより、２つのサブユニットより
なる生理活性物質の濃度を測定する酵素免疫測定法にお
いて、該２つのサブユニットよりなる生理活性物質のサ
ブユニットの１つと共通するサブユニットを有する他の
生理活性物質の２つのサブユニットの結合している架橋
部分を認識するモノクローナル抗体を試料ともに共存さ
せ、該２つのサブユニットよりなる生理活性物質を特異
的に測定することを特徴とする酵素免疫測定法である。

本発明における２つのサブユニットよりなる生理活性物
質としては、例えば甲状腺刺激ホルモン（TSH）、黄体
化ホルモン（LH）、卵胞刺激ホルモン（FSH）、絨毛性
ゴナドトロピン（HCG）などのホルモンが例示される。
これらの生理活性物質における２つのサブユニットと
は、αサブユニットおよびβサブユニットである。

２つのサブユニットよりなる生理活性物質と該サブユニ
ットの１つと共通するサブユニットを有する他の生理活
性物質としては、例えばαサブユニットを共通するTSH
とHCGの例がある。本発明における他の生理活性物質も
２つのサブユニットを有する。

本発明は、２つのサブユニットよりなる生理活性物質の
それぞれのサブユニットに対する抗体を用いて１ステッ
プサンドイッチ法を実施する場合、構成している１つの
サブユニットが共通している他の生理活性物質、いわゆ
る交差反応物質の２つのサブユニット、αサブユニット
とβサブユニットの結合部分を認識するモノクローナル
抗体を存在させることにより、その影響度合いを回避す
るものである。具体的には１つのサブユニット、例えば
αサブユニットを認識する抗体あるいは他のサブユニッ
ト、例えばβサブユニットを認識する抗体を固相に結合
させ、固相とは別のサブユニットを認識する抗体を標識
する。測定対象生理活性物質を測定する際、あらかじ
め、共通するサブユニットを認識する抗体と交差反応す
る他の生理活性物質に対する親和定数あるいは交差反応
の程度を調べ、測定対象である生理活性物質より親和定
数の高い生理活性物質あるいは交差反応の程度が大きな
生理活性物質が存在するかどうかあらかじめ検討する。
そしてそのような生理活性物質が存在することを認識し
た場合には、その交差反応する生理活性物質の２つのサ
ブユニット、すなわちαサブユニットとβサブユニット
の結合部分を認識するモノクローナル抗体を共存させる
ことにより、交差反応する生理活性物質に対してモノク
ローナル抗体を選択的に結合させ、標識抗体の結合を立
体的に阻害させて目的である生理活性物質の測定系に対
して影響しないようにする。

より具体的に２つのサブユニットよりなるホルモンで説
明すると、TSH測定の場合、固相にTSHのβサブユニット
に対する抗体を使用し、標識抗体としてTSHのαサブユ
ニットに対する抗体を使用する。TSHのαサブユニット
に対する抗体の他のホルモンに対する交差比率が、HCG1
00％、TSH27.8％である場合には、測定に供したαサブ
ユニットを認識する標識抗体が、HCGにより多く結合
し、TSHとの結合が弱いと考えられる。したがってHCGの
αサブユニットとβサブユニットの結合部分を認識する
モノクローナル抗体を添加することにより、TSH測定
時、高濃度HCGの影響を回避するものである。

また目的である生理活性物質の抗体と交差反応する生理
活性物質の２つのサブユニットの結合部分を認識するモ
ノクローナル抗体は常法に従い生産される。その添加量
は特に限定されない。このモノクローナル抗体は、一般
の細胞融合技術を用いて作製することができる。即ち、
交差反応を生じる２つのサブユニットよりなる生理活性
物質をアジュバンドとともにマウスに免疫し、得られた
脾細胞とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコー
ルのような細胞融合剤を用いて融合させ、HAT培地で培
養後、生き残った融合細胞の中より、それぞれのサブユ
ニットに対し反応せず、２つのサブユニットよりなる生
理活性物質のみを認識するハイブリドーマを見いだし、
培養することにより、モノクローナル抗体を得ることが
できる。

また、測定に使用する生理活性物質に対する抗体として
は、２つのサブユニットよりなる生理活性物質のそれぞ
れのサブユニットを一般の抗血清を得る方法に準じて動
物に免疫し、必要であればさらに追加免疫して得ること
が可能である。さらに細胞融合技術によって得られるモ
ノクローナル抗体を使用することもできるが、特異性の
観点より、好ましくはモノクローナル抗体を使用するほ
うがよい。

測定に使用する生理活性物質に対する抗体を結合させる
固相は一般に水に不溶であって、取扱いが容易であれば
どのような固相でも良いが、特に好ましいのは、ポリス
チレンボール、ポリスチレンチューブ、ガラスビーズ、
シリコン片などが好適である。

標識に使用する酵素としては、どのような起源のもので
も良いが安価で容易に入手できる酵素として、β−ガラ
クトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシ
ダーゼ、グリコースオキシダーゼなどを挙げることがで
きる。これらの酵素を抗体に標識する方法も公知の標識
化技術を用いればよい。例えば、良く知られた二官能性
試薬であるグルタルアルデヒドやマレイミドなどで、架
橋結合させてもよいし、ペルオキシダーゼのように分子
内に糖鎖を持っている酵素ならば、その糖鎖を過ヨウ素
酸で酸化し、アルデヒド基を露出させ、抗体のアミノ基
と結合させれば良い。このようにして得た標識抗体は、
透析、ゲル濾過などの適当な精製操作を施して、酵素活
性、抗体活性が共に高い区分を使用すると有利である。

本発明では不溶性抗体、酵素標識抗体と試料を上記他の
生理活性物質の２つのサブユニットの結合している架橋
部分を認識するモノクローナル抗体の共存下に反応さ
せ、不溶性抗体に結合した酵素標識抗体の酵素活性ある
いは結合しなかった酵素標識抗体の酵素活性を測定する
ことにより、目的である２つのサブユニットよりなる生
理活性物質の濃度を測定する。

（実施例）次に実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発
明は、実施例に限定されるものではない。TSH測定の場
合対照例固相結合抗体として、TSHβサブユニットに対し特異的
に反応するモノクローナル抗体（米国、ケンブリッジ社
製）をリン酸緩衝生理食塩水（pH7.2,0.01M）を用いて1
0μg/ml濃度に調製し、1/4インチポリスチレンボールに
対し物理吸着により結合させた。標識抗体としてのαサ
ブユニットに対するモノクローナル抗体（米国、ケンブ
リッジ社製）の他のホルモンに対する交差反応は次のよ
うである。

HCG:100％ TSH:27.8％ LH:33.7％ FSH:5.4％このようなαサブユニットに対するモノクローナル抗体
を過ヨウ素酸酸化によるナカネ法にてペルオキシダーゼ
（東洋紡績製、グレードＩ−Ｃ）を標識し、セファデッ
クＧ−200で精製し、標識抗体とした。標準TSHとして、
米国カルバイオケム社のヒトTSHを用いて、１％BSAを含
むリン酸緩衝生理食塩水（pH7.2,0.01M）で所定量にな
るように希釈し、標準TSHとした。試験管にこの標準TSH
100μｌと、あらかじめ予備試験にて適当な吸光度の得
られる希釈倍率に希釈した酵素標識抗体500μｌと抗体
結合ボール１個を入れ、37℃、２時間インキュベート
後、蒸留水で３回洗浄後、過酸化水素0.02％、3mg/ml濃
度のオルトフェニレンジアミンを含むクエン酸−リン酸
緩衝発色液300μｌにボールを移し、30分酵素反応を行
わせ、１規定硫酸1mlで反応を停止させ、フォトメータ
にて、492nmの吸光度を求めた。測定対象物質中にHCGが
存在しない時は、正しく測定されるが、共存するHCGが
妊婦レベルの10,000〜50,000mIU/mlまで高くなると、TS
Hの測定値は表１に示すように低値を示した。

実施例１対照例の測定系の中に、即ち酵素標識抗体液中にHCGの
αサブユニットとβサブユニットの結合部分を認識する
モノクローナル抗体（米国、ケンブリッジ社製）を10μ
g/ml濃度存在させた。対照例と同様にして吸光度を求め
た。その結果を表１に示す。測定対照物質中に妊婦レベ
ルの10,000〜50,000mIU/mlのHCGが存在しても、その影
響がほとんどなくなることが表１から明らかである。

LH測定の場合対照例固相結合抗体として、LHβサブユニットに対し特異的に
反応するモノクローナル抗体（米国、ケンブリッジ社
製）をリン酸緩衝生理食塩水（pH7.2,0.01M）を用いて1
0μg/ml濃度に調製し、1/4インチポレスチレンボールに
対し物理吸着により結合させた。標識抗体としてのαサ
ブユニットに対するモノクローナル抗体（米国、ケンブ
リッジ社製）の他のホルモンに対する交差反応は次のよ
うである。

HCG:100％ TSH:85.0％ LH:90.0％ FSH:16.0％このようなαサブユニットに対するモノクローナル抗体
をTSH測定の場合とおなじくナカネ法にてペルオキシダ
ーゼ（東洋紡績製、グレードＩ−Ｃ）を標識し、標識抗
体とした。標準LHとして、米国カルバイオケム社のヒト
LHを用いて、１％BSAを含むリン酸緩衝生理食塩水（pH
7.2,0.01M）で所定量になるように希釈し、標準LHとし
た。試験管にてこの標準LH100μｌと、あらかじめ予備
試験にて適当な吸光度の得られる希釈倍率に希釈した酵
素標識抗体500μｌと抗体結合ボール１個を入れ、37
℃、２時間インキュベート後、蒸留水で３回洗浄後、過
酸化水素0.02％、3mg/ml濃度のオルトフェニレンジアミ
ンを含むクエン酸−リン酸緩衝発色液300μｌにボール
を移し、30分酵素反応を行わせ、１規定硫酸1mlで反応
を停止させ、フォトメータにて、492nmの吸光度を求め
る。測定対象物質中にHCGが存在しない時は、正しく測
定されるが、HCGが妊婦レベルの10,000〜50,000mIU/ml
まで高くなると、LHの測定値は表２に示すように低値を
しめす。

実施例２対照例の測定系の中に、即ち酵素標識抗体液中にHCGの
αサブユニットとβサブユニットの結合部分を認識する
モノクローナル抗体（米国、ケンブリッジ社製）を50μ
g/ml濃度存在させた。対照例と同様にして吸光度を求め
た。その結果を表２に示す。測定対照物質中に妊婦レベ
ルの10,000〜50,000mIU/mlのHCGが存在しても、その影
響がほとんどなくなることが表２から明らかである。

発明の効果従来、２つのサブユニットよりなる生理活性物質を、抗
原抗体反応を利用して体液中の微量成分を測定する方法
としては、２ステップサンドイッチ手法といわれている
方法が主であったが、操作の煩雑さや、反応時間が長く
かかるといった欠点かあった。本発明を用いることで、
１ステップサンドイッチ法で、測定対象物中に共存する
サブユニットを共通するホルモンが存在しても、その影
響を受けずに簡便に、短時間に測定が可能になる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/577 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】２つのサブユニットよりなる生理活性物質
の１つのサブユニットに対する抗体を不溶性物質に結合
させて不溶性抗体とし、他のサブユニットに対する抗体
を酵素で標識して標識抗体とし、２つのサブユニットよ
りなる生理活性物質を、不溶性抗体および酵素標識抗体
と同時に反応させ、２つのサブユニットよりなる生理活
性物質を介して不溶性抗体に結合した酵素標識抗体の酵
素活性あるいは結合しなかった酵素標識抗体の酵素活性
を測定することにより、２つのサブユニットよりなる生
理活性物質の濃度を測定する酵素免疫測定法において、
該２つのサブユニットよりなる生理活性物質のサブユニ
ットの１つと共通するサブユニットを有する他の生理活
性物質の２つのサブユニットの結合している架橋部分を
認識するモノクローナル抗体を試料とともに共存させ、
該２つのサブユニットよりなる生理活性物質を特異的に
測定することを特徴とする酵素免疫測定法。