JPH0751077A

JPH0751077A - Ｌ−α−アミノ酸の製造方法

Info

Publication number: JPH0751077A
Application number: JP13934594A
Authority: JP
Inventors: Charles J Sih; チャールズ・ジェイ・シー
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1993-05-28
Filing date: 1994-05-30
Publication date: 1995-02-28

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は、高光学純度高収率有用な反応率を
もつ各種天然及び非天然アミノ酸を、前駆体から直接得
るための改良された酵素接触合成方法を提供することを
目的とする。【構成】５（４Ｈ）−オキサゾロン前駆体からＬ−α
−アミノ酸を製造する方法である。前駆体は二段階処理
される。まず、前駆体を無極溶媒中の、メチルアルコー
ルを含むメチルアルコール活性リパーゼに接触させ、エ
ナンチオ選択的に前駆体を加溶媒分解し、望ましいα−
アミノ酸の中間である光学活性メチルエステルを生成す
る。このエステルを次に水分を含むプロテアーゼと接触
させ、エステルをエナンチオ選択的にへき開し、これに
より、酵素動的分解が実現するので、高光学純度のＬ−
α−アミノ酸を製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、５（４Ｈ）−オキサゾ
ロン前駆体を派相条件下でリパ−ゼと接触させ、次にプ
ロテアーゼと接触させることにより、該前駆体から光学
純度の高いＬ−α−アミノ酸酵素を製造する方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】高純度の光学的活性アミノ酸が、製薬の
調合や食品、農業化学薬品の調整の中間体として重要な
ものとなっている。例えば、アミノ酸の中には半合成の
ペニシリン、アンピシリン、アモキシシリン等のための
側鎖前駆体のものがある。

【０００３】また、低カロリー甘味料のアスパラチーム
の最も重要な成分としてＬ−フェルニアラインがある。
Ｄ−バリンは、例えばピルトロイド系殺虫剤のフリュバ
リネートに含まれる中間体である。

【０００４】またＤ−フェルニアラニンは鎮痛剤として
の性質を有し、将来アスピリンに取って変わるかもしれ
ない。更に人間の栄養補給に重要な必須光学活性アミノ
酸が数多くある。

【０００５】多くの場合、反応開始物質として要求され
る特別な光学活性アミノ酸を使用する際には、そのアミ
ノ酸は少なくとも６５％の光学純度が必要で、少なくと
も約９０％の純度があることが好ましい。このような純
度の度合は、とりわけ光学活性アシルアミノ酸の場合に
必要とされる。

【０００６】また商業上の実用性のため、特に必要な光
学活性アミノ酸が反応開始前駆体から経済的収率で形成
されることが要求される。例えばアミノ酸鏡像異性体
（エナンチオマー）の少なくとも約５０％の収率が望ま
しいとされる。

【０００７】溶媒中の加水分解された活性リパーゼをオ
キサゾロン前駆体と接触させる過程を含む光学活性アミ
ノ酸誘導体の調整方法については、既に本発明者により
提供されている。

【０００８】この場合の前駆体とは特に５（４Ｈ）−オ
キサゾロンをいう（特許出願第７８６７３１号参照）。
この方法を用いて実質的にエナンチオマーの多い方のア
ミノ酸が得られる。

【０００９】本出願は１９９１年１１月１日出願の特許
出願第７８６，７３１号の一部継続出願である。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】上記の方法は非常に有
用ではあるが、前駆体である５（４Ｈ）−オキサゾロン
に存在するＣ−４置換基により反応率やエナンチオ選択
度が変化してしまう。

【００１１】そこで高光学純度高収率有用な反応率をも
つ各種天然及び非天然アミノ酸を、前記のような前駆体
から直接得るための改良された酵素接触合成方法が好ま
れる。本発明はそのような改良された方法を提供する。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、光学活性アミ
ノ酸、特に高光学純度、高収率、有効な反応率のＬ−α
−アミノ酸を５（４Ｈ）−オキサゾロンから直接に製造
する方法に関する。

【００１３】即ち、第一の段階では、求核としてのメチ
ルアルコールと触媒としての指定されたメタノール系活
性リパーゼを含む非極性有機液中で、指定の５（４Ｈ）
−オキサゾロンアミノ酸前駆体の開裂が行われる。前駆
体はエナンチオ選択的に加溶媒分解化され、中間体であ
るα−アミノ酸メチルエステルのＳ形のエナンチオマー
過剰量が生産される。

【００１４】次に第二段階では、指定された加水分解活
性プロテアーゼを含む水性相状態で、メチルエステルの
開裂が行われる。この第二の開裂処理後、少なくとも約
９０％の光学純度と約５０％より高い収率（反応開始の
５（４Ｈ）−オキサゾロン前駆体に基づいて）で、Ｌ−
α−アミノ酸が得られる。

【００１５】

【作用】本発明は、光学活性アミノ酸、特に高光学純
度、高収率、有効な反応率のＬ−α−アミノ酸を５（４
Ｈ）−オキサゾロンから直接に製造する方法に関する。

【００１６】性質上、得られる光学活性Ｌ−α−アミノ
酸は少なくとも約９０％の光学純度を有する。また、こ
のアミノ酸は少なくとも約５０％の収率（オキサゾロン
前駆体に基づいて）で作られる。従って、Ｌ−α−アミ
ノ酸は実用的な収率で作られ、一般には、介在する純化
処理なしに多くの用途で使われる。

【００１７】すなわち、本発明の処理方法では二段階の
連続した酸素不対称反応が行われる。

【００１８】第一の段階では、求核としてのメチルアル
コールと触媒としての指定されたメタノール系活性リパ
ーゼを含む非極性有機液中で、指定の５（４Ｈ）−オキ
サゾロンアミノ酸前駆体の開裂が行われる。

【００１９】前駆体はエナンチオ選択的に加溶媒分解化
され、中間体であるα−アミノ酸メチルエステルのＳ形
のエナンチオマー過剰量が生産される。

【００２０】次に第二段階では、指定された加水分解活
性プロテアーゼを含む水性相状態で、メチルエステルの
開裂が行われる。

【００２１】この第二の開裂処理後、少なくとも約９０
％の光学純度と約５０％より高い収率（反応開始の５
（４Ｈ）−オキサゾロン前駆体に基づいて）で、Ｌ−α
−アミノ酸が得られる。第一及び第二段階の処理は比較
的短時間で行なうことができる。

【００２２】本発明の処理方法は相対的に簡単で信頼性
の高い経済的な方法である。

【００２３】本処理方法は、各種の４−置換−２−置換
−オキサゾリン−５−１前駆体を対応する光学活性Ｎ−
置換−Ｌ−α−アミノ酸に変換するのに特に採用され
る。５（４Ｈ）−オキサゾロン前駆体のＣ−２置換体は
フエニルが望ましい。

【００２４】本発明に従い調整できるＬ−α−アミノ酸
の多くは、今までのところ、単独の直接処理では高光学
純度、高収率及び高反応率を有するようには合成されな
かった。

【００２５】上記アミノ酸は本発明によれば実用的方法
で作られ、そのまま用いることができる。従来は、様々
なＬ−α−アミノ酸が高反応率、高光学純度、高収率で
調整されるような単独の酵素処理は存在しなかった。

【００２６】本発明の目的、特長、有利点、実施例及び
変形例等は、以下の明細書及び図面により当業者にとっ
ては明らかであろう。

【００２７】

【実施例】

（ａ）定義ここでは、「エナンチオ選択度」、又は符号「Ｅ」はラ
セミ基質からラセミ混合物中の一つのエナンチオマーと
他のエナンチオマーに対して発生させるような酵素の選
択された容量をいう。エナンチオ選択度は、量的には次
の

【００２８】

【数１】のように表示される。

【００２９】ここで、Ｃは酵素触媒された生成物の基質
変換の程度であり、ｅｅ。は、基質の酵素変換開始時
の、（Ｒ）型及びそれに対応する（Ｓ）型構造のラセミ
混合物に含まれるひとつのエナンチオマーの他のエナン
チオマーに対するエナンチオマー過剰量であり、ｅｅ’
は酵素変換終了時のエナンチオマー過剰量である。

【００３０】また、“エナンチオマー過剰量”または、
符号“ｅｅ”は、（Ｐ）型及び（Ｓ）型エナンチオマー
のラセミ混合物中の片方のエナンチオマー（（Ｒ）型と
（Ｓ）型のどちらか一方）の、他方に対する量又は過剰
分を意味する。この値ｅｅは量的には下記の式

【００３１】

【数２】で表される。

【００３２】ここで、Ｒは（Ｒ）型エナンチオマーのモ
ル濃度、Ｓは（Ｓ）型エナンチオマーのモル濃度であ
る。

【００３３】更に、ここで用いられる「光学純度」又は
符号「〔α〕」は、（Ｒ）型構造とそれに対応する
（Ｓ）型構造のラセミ混合物中の片方のカンチオマーの
他方に対する％過剰量を指す。この％過剰は下記の式

【００３４】

【数３】で表される。

【００３５】ここでＲは一方のエナンチオマーのモル濃
度であり、Ｓは他方のエナンチオマーのモル濃度であ
る。

【００３６】また、「収率」とは、基質を重量％で表さ
れる生成物に酵素触媒変換することによって選択される
生成物の量を示す。

【００３７】（ａ）ソルボリシス（加溶媒分解）本発明の二段階処理方法では、第一段階は酵素不斉ソル
ボリシス法を用いる。ソルボリシス方法では、溶解した
オキサゾロン化合物を非極性溶液中にメチルアルコール
及び溶解されているメチルアルコール活性リパーゼ酵素
と接触させる。

【００３８】本発明の実施には各種５（４Ｈ）−オキサ
ゾロンを反応開始物質（つまり前駆体や基質）として用
いるのが望ましい。前記の前駆体としてラセミ混合物が
あげられる。

【００３９】現在、より好ましい５（４Ｈ）−オキサゾ
ロン基質として４−置換−２−置換−オキサゾリン−５
−生成物があり、それは以下の総称的ラセマーゼの公式

【化４】で特徴づけられる。

【００４０】ここでＲ１とＲ２は各々リパーゼとプロテ
アーゼ中の実質上不活性である一価の有機部分をいう。

【００４１】そこで、本発明の処理では、前記

【化４】式の前駆体のＲ１とＲ２は、上記で述べた非極
性有機液と接触した状態においてはメチルアルコール活
性のシュードモナス属リパーゼに対し実質的に不活性で
ある。

【００４２】同様に、

【化５】式の前駆体（下記に示す）のＲ１とＲ２も、上記で述べ
た水性液相に接触した状態においては、加水分解された
活性プロテアーゼであるプロジーム６とプロテアーゼ２
Ａに対し実質で不活性である。

【００４３】

【化４】式の化合物では、以下に示す構成の一価基群か
らＲ１及びＲ２がそれぞれ選択されることが望ましい。

【００４４】（ａ）６から１２個の炭素原子を有するア
リール（現在ではフエニルがより好ましい。）

【００４５】（ｂ）６から１８個炭素原子を有するアル
カリル（トリルとキシリルがより好ましい。）

【００４６】（ｃ）７から１８個の炭素原子を有するア
ラッキレン（ベンジルが現在のところより好ましい。）

【００４７】（ｄ）８から１８個の炭素原子を有するア
ラルキニレン（フエニルエテニレンが現在のところ望ま
しい。）

【００４８】（ｅ）１８個未満の炭素原子を有するアル
キル（低級アルキルが現在では好ましい。）

【００４９】（ｆ）１８個未満の炭素原子を有するアル
キニル（低級アルキニルが現時点では望ましい。）

【００５０】（ｇ）それぞれ３から１８個の炭素原子を
有するシクロアルキレン及びシクロアルキニレン（シク
ロヘキルが現時点では好ましい。）

【００５１】（ｈ）一環につき４から８個の原子を有
し、そのうち半分は炭素原子であるような複数の複素環
である。（窒素と任意で酸素も有する様な複素環が６個
あれば望ましい。）

【００５２】ここで用いた「低級」とは、７個未満の炭
素原子を含む指定の基を示す。「アリール」（「アルカ
リル」等で接尾語として用いる場合、又は「アリアルキ
レン」等で略語の「ａｒ−」として接頭語で用いる場合
を含む）は、芳香族一価炭化水素基を表す。

【００５３】アリール基は置換可能である。置換基とし
ては、例えば、ハロ（好ましくはクロロ）、アミノ（好
ましくは第１アミン）、アミド（好ましくは第１酸アミ
ド基）、ニトロ（−ＮＯ２）、カルボキシル（−ＣＯＯ
Ｈ）、カルボン酸の塩（望ましくはＭがアルカリ金属又
はアンモニウムであるような−ＣＯＯＭ）、カルボン酸
エステル（Ｒが望ましくは低級アルキル基であるような
−ＣＯＯＲ）、及び水酸（−ＯＨ）がある。

【００５４】上記（ｅ）及び（ｆ）群のアルキル及びア
ルケニル基は、必要に応じて、置換されたアリール部用
の上記に述べたような置換基でそれぞれ任意に置換を行
える。

【００５５】また、必要ならば、アルキル又はアルキニ
ル基を少なくともひとつのエーテル酸素（オキシ）ある
いは硫黄（メルカプト）によって分断化できる。（つま
りこれらを含有できる。）しかし、このような分断化さ
れた基は一基につきひとつだけオキシ又はメルカプト要
素を含有するのが望ましい。

【００５６】「複素環」とは、環を成す原子の少なくと
も１つは炭素以外のもの、例えば、酸素、硫黄、窒素等
であるような閉環構造を示している。

【００５７】複素環は実際は複素環式化合物から求めら
れる。適当な複素環式化合物の例としてはインドール、
ピロール、イソインドール、インドラジン、フラン、ベ
ンゾフラン、ピリダジン、Ｌリアゾール、チアゾール、
オキサゾール、ピラゾール、イソオキサゾール、イソチ
アゾール、チオフエン、ピリジン、プリン、インドリン
等が挙げられる。

【００５８】複素環基は必要に応じて、置換されたアリ
ール部用の上記置換基で置換することもできる。

【００５９】基が置換されると、その基は置換基は２つ
までしか有しないことが望ましく、炭素原子１個あたり
置換基を１つ有する。

【００６０】

【化４】式の化合物中、Ｒ１はフエニル基、またＲ２は
全体として６から１８個の炭素原子を有する、芳香族基
を含む基であることが望ましい。（Ｒ２がフエニルを含
む基であれば更に好ましい。）

【００６１】

【化４】式の化合物で、もしＲ１が水素の場合、不斉中
心がなく、上記の化合物を用いて光学的に不活性なグリ
シン誘導体を生成する目的も存在しない。

【００６２】一方、もし

【化４】式の化合物のＲ１が極端に大きい場合（つま
り、もしＲ１が、例えば、上記Ｒ１及びＲ２の望ましい
基のグループ中のどの基よりもはるかに大きい場合）、
リパーゼが存在する場合の反応率は低減してしまい、ほ
とんどゼロに近くなることさえある。

【００６３】Ｒ２はフエニル基であることが最も望まし
い。Ｒ２として例えばフエノキシメンチルなどは、リパ
ーゼが存在するとラセミ化率を極度に減少させる。一般
に、ラセミ化と開環比率への影響という観点から、Ｒ１
置換基の立体効果とＲ２置換基の電子的効果は重要なも
のである。

【００６４】本発明の実施に有用なリパーゼ酵素はメチ
ルアルコール活性リパーゼ酵素である。

【００６５】この酵素は溶媒中及び

【化４】の化合物とメチルアルコール中では、このよう
な化合物をエナンチオ選択的に加溶媒分解を行い、１及
び２の位置間で

【化４】の化合物の環構造の開裂を行い、また、５の位
置でカルボキシル基を後述する

【化６】及び

【化７】式の末端基であるメチルエステルへと変換もする。

【００６６】「メチルアルコール活性」とは、リパーゼ
酵素が非極性の有機媒体中の第４化合物とメチルアルコ
ール間で不斉ソルボリシス反応に触媒作用し、同時に

【化４】の化合物の環構造に開裂を行うことによって、
以下に示す

【化５】式の化合物を生成するための

【化４】式の化合物のメタソリシスをエナンチオ選択的
に実現できるという事実に関係して用いられている。

【００６７】本発明の実施に適当なリパーゼは、

【化４】式の化合物を完全に変換したものを特性を示し
つつ生成し、（Ｓ）型化合物の、少なくとも約６０％の
エナンチオマー量ｅｅを提供するようなバクテリアのシ
ュードモナス属リパーゼである。

【００６８】

【化５】式の中間体であるメチルエステルの収率は、

【化４】式の反応開始の化合物に基づくと、少なくとも
約５０％と特徴的である。上記値は変更可能で、所定の

【化４】式の基質に存在する特定のＣ−４置換基により
特に影響をうけると思われている。

【００６９】様々な適切なリパーゼが市販で入手可能で
ある。現在では、ＡＫ、Ｋ−１０、Ｐ−３０等のシュー
ドモナス属リパーゼが望ましい。

【００７０】下記に掲げる例として、シュードモナス属
リパーゼは、広範囲に渡り基質比を有する点、

【化４】式前駆体化合物に対するエナンチオ選択度が高
い点、及び通常、

【化４】式化合物に対して相対的に高い反応率を示す点
から、本発明の実施目的に有益である。

【００７１】本発明では、上記したように、リパーゼは

【化４】の反応開始化合物とメチルアルコールを含有す
る非極性の有機溶媒中で用いられる。

【００７２】上記「非極性溶媒」または「非極性液体」
は、正と負の電荷が実質上一致する有機液体に従来通り
関連するものである。非極性溶媒は従って電気伝導性を
イオン化したり与えたりはしない。非極性溶媒は水酸基
やカルボキシル基を含まない。

【００７３】本発明の実施にふさわしい非極性溶媒は少
なくとも部分的にメチルアルコールと混和でき、また、
所定の接触処理の際に用いられる各濃度で構成する

【化４】式化合物とリパーゼとの部分溶媒である。

【００７４】望ましい非極性溶媒の例として、第３ブチ
ルメチルエーテル、メチルエーテル及び低級アルキル基
を有する他のエーテル；ヘキサン、オクタン、シクロヘ
キサン、ベンゼン等の脂肪族及び芳香族炭化水素；四塩
化炭素等の対称性ハロ炭素；石油エーテル等がある。非
極性液体の混合物も使用できる。非極性溶媒は接触して
いる状況下では液体である点が便利である。

【００７５】非極性液体において水を任意に使用でき、
また場合においては、使用した方がよいこともある。し
かしながら、使用するにあたっても、水は全液体重量に
対して約１０重量％未満であることが望ましい。

【００７６】ソルボリシス処理においては、粗製リパー
ゼに対する

【化４】化合物の重量比は大きくても小さくてもかまわ
ないが、好ましくはその重量比が約１：０．１から１：
２の範囲がよい。最も望ましい重量比は約０．５：１か
ら約１：１の範囲である。

【００７７】ソルボリシス処理において、必要に応じ
て、

【化４】化合物に対するメチルアルコールのモル比を増
減できるが、好ましくは、モル比が約１：１から約１
０：１の範囲がよい。最も望ましいモル比は、約４．
５：１から５．５：１の範囲である。

【００７８】このソルボリシス処理を行う際は、非極性
液体中の

【化４】化合物の初期濃度が前駆体化合物及び非極性液
体の総重量に対し約１〜１０重量％の範囲であるような
回分操作を用いることが望ましい（この場合

【化４】化合物は非極性溶媒に溶解可能であること）。

【００７９】所定のソルボリシス処理において一種類以
上の

【化４】化合物を用いることは可能であるが、一般的に
は、そのような混合物は

【化５】に示す高純化されたエナンチオマー生成物の収
率を減少させるので望ましくはない。

【００８０】ＡＫやＰ−３０のようなシュードモナス属
リパーゼは、水の含有量が少ない場合の非極性有機溶媒
中で非常に安定している。

【００８１】しかしながら、溶媒の総重量に対する少な
くとも約２〜３重量％の酵素に比べて、核となる水の層
（つまり量）を形成するのに十分な量の水というもの
は、リパーゼの全体的構造や、触媒された活性配座を維
持するためには特に必要なものである。

【００８２】本発明の好ましい方法は、まずメチルアル
コールを含む溶媒にリパーゼ酵素を溶解し、次に指定の

【化４】の化合物を添加し混和する。これが終了する
と、回分反応媒体は下記表１に示す初期組成物を有す
る。

【００８３】

【表１】

【００８４】接触中は反応混合物は休まず掻き混ぜてい
ることが望ましい（つまり攪拌する）。

【００８５】

【化４】化合物とメチルアルコールとリパーゼが非極性
溶媒中で接触する処理は周囲温度が約２０〜６０℃の範
囲で行われ、好ましくは周囲温度が本発明の場合は約４
０〜５０℃がよい。しかし、必要ならば、これよりも高
温あるいは低温ででもこの処理を行うことができる。

【００８６】接触時間は変更が可能である。この接触処
理中に、例えば、

【化４】の化合物は実質上完全に変換されることが好ま
しい。完全変換を行うのに要する時間は、可変要素に依
存する。

【００８７】例えば、特定のリパーゼと特定の

【化４】化合物；メチルアルコール、リパーゼ及び

【化４】化合物の相対濃度；液状反応媒体の接触温度；
等がそれである。接触時間は具体的にはおよそ６から２
４０時間の範囲であるが、これよりも長くても短くても
よい。

【００８８】本発明の主な目的は、天然及び非天然Ｌ−
α−アミノ酸の不斉合成の一般的な方法を提供すること
であり、Ｐ−３０等のシュードモナス属リパーゼの独特
の性質を利用して有機溶媒中の

【化４】化合物に不斉開裂を行うことを実現できる。

【００８９】このような微環境において、非酵素加水分
解は緩慢に進むが、

【化４】化合物のＣ−４陽子のエノール化率は非常に高
く、

【化４】の基質化合物は、ほぼ１００％生成物に変換で
きる。

【００９０】水が水成媒体の求核として用いられている
場合は、環核分裂率が非常に低く有用ではない。しか
し、非水成媒体中のリパーゼの触媒反応の化学選択度と
反応率は異なるキラル求核を用いれば変更できる。

【００９１】メチルアルコールを求核として使用する
と、

【数１】式の化合物のメタノルシスが望ましい比率で進
み、反応開始体である５（４Ｈ）−オキサゾロンからＮ
−置換−Ｌ−α−アミノ酸のメチルエステルが供給され
ることが確認されている。

【００９２】

【化５】に示すメチルエステル生成物の光学純度は具体
的には約６６〜９８％の範囲である。

【００９３】

【化４】化合物のＣ−４陽子は、特にＣ−２置換基が例
えばフエニル基等の特に水成及び非水成媒体中で容易に
エノール化する。しかし他のＣ−２置換基を現在のデー
タに基づいて実際には使用している。

【００９４】更に、５（４Ｈ）−オキサゾロンの化学反
応度は活性エステルと同じなので、本発明の処理方法に
従っての

【化４】化合物の酵素触媒環開処理は簡単で相対的に容
易に行える。

【００９５】

【化４】の化合物は特にアルカル性状態において水成媒
体中では不安定ではあるが、特にＣ−４の位置で相対的
に中位から大きい置換基を保つ

【化４】化合物にとって、酵素触媒が非酵素加水分解よ
りもかなり速く起こるような状況下では、上記のような
望ましい反応状態が得られる。

【００９６】リパーゼ接触は適当な処理によって従来通
りに終了する。例えば、塩酸のような強い鉱酸を用いて
酸性化したり、エチルアセテートのような非極性非水性
混和可能な有機溶媒と共に抽出したりする。エステル生
成物は従って単離される。

【００９７】

【化４】の前駆体から上記のように生成された中間体の
メチルエステルは下記に示すような属特有のラセマート
式により特徴付けられる。ここでＲ１とＲ２は

【化４】で定義した通りである。

【００９８】

【化５】

【００９９】ソルボリシスによって生成された

【化５】の中間体メチルエステルはに二種の異なる光学
活性異性体の混合物である。この異性体構造は以下の属
特有のエナンチオマー式により、それぞれ特徴付けられ
る。

【０１００】

【化６】

【０１０１】

【化７】

【０１０２】ここで、各

【化６】及び

【化７】式において、Ｒ１及びＲ２は

【化４】に関する記述で定義した通りである。

【化６】式の化合物は（Ｓ）形式であり、具体的に混合
物全体の約８０〜９５重量％である。

【０１０３】また、同様に第

【化７】式の化合物発明（Ｒ）形式であり、具体的には
混合物全体の約１５〜２０重量％である。

【０１０４】

【化６】式の化合物と対応する

【化７】式の化合物を含有するメチルエステル・エナン
チオマー混合物は適切に純化される。従来のどの純化処
理方法を用いてもよい。

【０１０５】有益な処理方法のひとつにシリカゲル・フ
ラッシュクロマトグラフィを用いるものがある。

【０１０６】これは、

【化６】及び

【化７】式中のＲ１及びＲ２の異なった置換基により変
化する重量比率で生成されたヘキサンとエチルアセテー
トのような混合物などの非極性溶媒と極溶媒との混合物
を使用している。

【０１０７】以下に示す実験例１〜１５に述べるよう
に、様々な

【化４】の４−置換−２−フエニル−オキサゾリン−５
−誘導体が、５当量の水分の有無にかかわらず５当量の
メチルアルコールを含む第３基ブチルメチルエーテル中
のＰ−３０リパーゼに５０°Ｃの温度でさらされた。結
果は後述の表３に示す。

【０１０８】一般に、反応率は５当量の水分がある方が
高かった。しかし、非酵素加水分解も上記条件で起こ
り、多くの実験例では生成収率が低減した。

【０１０９】エナンチオ選択度は６６〜９５％ｅｅであ
り、これは

【化４】第４構造式の反応開始基質中のＣ−４置換基の
規模が増加したため増進したものと思われる。

【０１１０】オキサゾロンに対するＰ−３０リパーゼの
（Ｓ）−選択キラリティーは数個の生成物の光学回転を
公知のＮ−ベンゾイル−Ｌ−α−アミノ酸メチルエステ
ルのそれと比較することにより決定した。

【０１１１】また、実験例１６〜３０に示すように、

【化４】構造をもつ数種の他の２−フエニル−オキサゾ
リン−５化合物につい三種のシュードモナス属リパーゼ
のエナンチオ選択性質を評価した。その結果を後述する
表４に表す。

【０１１２】使用された３つのリパーゼ全てが表４の実
験例２５〜２７及び２８〜３０で用いた二つの基質に相
似的に反応を示したが、４−Ｐ−ヒドロキシフエニル−
２−フエニル−オキサゾリン−５−化合物（表４の実験
例２２〜２４）に対してはそれぞれ異なった反応を示し
た。

【０１１３】ＡＫリパーゼのみが後者の基質のメタノリ
シスに高いエナンチオ選択度（７５％ｅｅ）で触媒作用
を及ぼした。一方、Ｐ−３０及びＫ−１０のリパーゼは
この基質に対しゆっくりと、低いエナンチオ選択度で触
媒作用を及ぼした。

【０１１４】４−メチル−２−フエニル−オキサゾリン
−５−基質（表４の実験例１６〜２１）において、５当
量の水が存在すると、量リパーゼ、Ｐ−３０とＡＫは
（Ｓ）−エナンチオマーのメタノリシスに優先的に触媒
作用を及ぼしたことは注目に値する。

【０１１５】しかし、外因的な水分が存在しないと、酵
素は（Ｒ）選択キラリティーへ変化した。これは微環境
下で酵素配座に大きな変化が起きることを意味する。

【０１１６】一方、リパーゼＫ−１０は、いずれか一方
の環境下で（Ｒ）−立体化学優先を保った。この結果
は、これらバクテリアリパーゼの立体化学反応の相違点
を表す。しかし、このリパーゼは本発明の実施にあたり
やはり有用である。

【０１１７】これらの酵素のエナンチオ選択度をより増
進させることができるかどうか調べるために、

【化４】構造式の反応開始化合物中のＣ−２の位置の置
換基を変化させた。このために

【化４】の三つの置換基を合成し、バクテリアリパーゼ
の作用にさらされた。

【０１１８】その結果は以下の表５に示す。エナンチオ
選択度に何も目立った増加は見られなかった。

【０１１９】２−〔４−クロロフエニル〕−オキサゾリ
ン−５−組成物（実験例３１及び３２）のエナンチオ選
択度が２−フエニル−オキサゾリン−５−組成物のエナ
ンチオ選択度と同様であるのに、２−メチル（実験例３
５）のメタノリシスと２−トリフルオロメチル−オキサ
ゾリン−５−組成物（実験例３３及び３４）のエナンチ
オ選択度はリパーゼに対し相対的に低かった。

【０１２０】しかしながら、全てのリパーゼに対し
（Ｓ）選択のキラリティーは保持した。

【０１２１】従ってソルボリシス処理中は、シュードモ
ナス属リパーゼは広範囲で基質比を有することがわか
る。各種基質の５（４Ｈ）−オキサゾロン誘導体に対す
るエナンチオ選択度は変化したが、一般には、少なくと
も６０％である。

【０１２２】上記実験例のエナンチオマー過剰量は約６
６〜９５％ｅｅの範囲内にあるが、その正確な値は

【化４】構造式の化合物のＣ−４置換基に依存する。

【０１２３】

【化５】構造式の中間体であるメチルエステルは、具体
的には約６６〜９５％の範囲内のｅｅ値を有し、約３０
〜９１％の範囲の収率で生成される。

【０１２４】（ｂ）加水分解本発明の加水分解処理方法では、上記に述べた組成物を
有する

【化５】の構造物の溶解されたエナンチオマー混合物
が、指定の加水分解された活性プロテアーゼを含む水成
媒体に接触する。

【０１２５】本発明の実施に用いる、加水分解された活
性プロテアーゼは、水分が存在すると、エナンチオ選択
的に

【化５】の化合物に対し開裂を行い、それによりその化
合物を対応する、下記に示す

【０１２６】

【化８】

【０１２７】式構造のＬ−α−アミノ酸へ変換する酵素
である。

【０１２８】ここで用いる「加水分解的活性」とは、プ
ロテアーゼ酵素が不斉加水分解反応に蝕媒作用を及ぼし

【化５】の化合物を水成溶媒中の

【化８】式の化合物へ変換してしまう事実を参照してい
る。必要ならば、ここで述べたような性質を有するプロ
テアーゼの混合物を使用してもよい。

【０１２９】適当なプロテアーゼは各種市販で入手可能
である。現時点では、加水分解の反応に対して高いエナ
ンチオ選択度で蝕媒作用を及ぼすプロテアーゼがよく用
いられる。従って、プロテアーゼのエナンチオ選択度Ｅ
は少なくとも約１００の値であることが好しい。

【０１３０】前駆体が

【化５】の複合物である時は、プロテアーゼは、Ｌ−α
−アミノ酸の少なくとも約９０％のエナンチオマー過剰
量を、する生成物を作るのが望しく、更には、少なくと
も９５％の値がより望しく、もっとも好しい値は少なく
とも９９％である。

【０１３１】また、約５０％より多く、好しくは約８５
％より多い収率のＬ−α−アミノ酸を生成するプロテア
ーゼが適当である。

【０１３２】予期しなかったことには、市販のプロテア
ーゼ酵素のプロジーム６及びプロテアーゼＮが、中位の
規模の側鎖と比べてやや大きい、又は小さい程度の

【化５】化合物のＲ１の側鎖を有していることがわかっ
た。

【０１３３】従ってこのプロテアーゼは、

【化５】のエナンチオマー混合物のＲ１及びＲ２をいろ
いろと有する。更に、このプロテアーゼは、高エナンチ
オ選択度（Ｅ）、エナンチオマーの過剰量及び収率の望
しい特性をもっている。

【０１３４】また、該プロテアーゼは商業上有用な反応
率で蝕媒作用を起こすこともできる。そこで、このプロ
テアーゼは本発明の実施にあたり特に使用すべきもので
ある。

【０１３５】任意ではあるが、やはり望しくは、少なく
とも一種類の極性溶媒を含むものが水成媒体に存在した
方がよい。

【０１３６】ここで用いられている「極性溶媒」または
「有極性液体」は、正及び負の電荷が分離し、化合物が
電気的モーメントを有するような有機液体をさす。

【０１３７】有極性液体は水酸基、カルボキシル基、ニ
トリル等を含む。このような液体は誘電率と、通常は相
対的に強い極性を有する。用いる極性溶媒は水に混和可
能であることが望しい。

【０１３８】極性溶媒としては、ジオキソン、テトラヒ
ドロフラン、アセトニトリル、アセトン、メチルアルコ
ール等がある。

【０１３９】最も好しい極性溶媒はアセトニトリルであ
る。プロテアーゼの遅い反応率を、アセトニトニル（Ｃ
Ｈ３ＣＮ）のような極性溶媒を反応媒体に加えることに
より増加をする。

【０１４０】本発明における水成プロテアーゼ接触処理
に用いる極性溶媒の総量は広範囲に渡り変化できる。具
体的には、有極性液体の量は水成媒体の総重量に対し約
１〜１０重量％の範囲が望しい。

【０１４１】水成接触媒体に存在する

【化５】のエナンチオマー混合物の量は変更できる。

【化５】の基質及び水成接触媒体の総重量に対し

【化５】の基質の初期濃度は、約１〜１．５重量％とし
て用いることが望ましい。ただし、必要ならば、この

【化５】の化合物濃度はこれより上でも下でもよい。

【０１４２】また、水成媒体において、エナンチオマー
混合物のプロテアーゼに対する重量比は約１：０．５か
ら１：１として用いるのが望しい。しかし、必要に応じ
てこの比よりも上、もしくは下の比を使用してもよい。

【０１４３】任意ではあるが、好ましくは公知のリン酸
塩緩衝が水成媒体に含まれている方がよい。水成媒体中
のこの緩衝体のモル（Ｍ）量は約０．１〜０．４の範囲
が望しい。最も適当な量は約０．２Ｍである。しかし、
リン酸塩緩衝体の量は必要ならばこの範囲以外の量を用
いてもよい。

【０１４４】水成媒体の適当なＰＨ値は約６〜９の間で
維持される。最も適当なＰＨ値は約６．８である。しか
し、この値よりも大きい、又は小さい値でも用いること
ができる。

【０１４５】ＰＨ値は、ＨＣＬのような水成鉱酸かＮａ
ＯＨのような水成アルカリ性金属水酸化物を用いて望む
値に調節が可能である。この反応性媒体のＰＨ値は約
６．５〜７の範囲にとどめるべきで、約６．８が理想的
な値である。接触処理中は反応性混合物は常に撹拌され
ていることが望しい。

【０１４６】加水分解処理において、回分状態を利用す
るのが適当である。

【０１４７】まず、水成接触媒体に、プロテアーゼ酵素
を、もし他にも用いる要素があれば（リン酸塩緩衝体と
有機極性溶媒）それと一緒に溶解させる。次に

【化５】の基質を、攪拌しながら加える。この添加が終
了すると、回分反応媒体は表２に示すような初期組成物
を有する。

【０１４８】

【表２】

【０１４９】

【化５】の基質と水及びプロテアーゼとの接触処理は、
周囲温度が約２０゜Ｃ〜４０゜Ｃの間で行なわれる。こ
の際周囲温度が約２５゜Ｃ〜３０゜Ｃの間であれば尚望
しい。これよりも高いあるいは低い温度でもこの処理は
必要に応じて可能である。

【０１５０】全体の接触時間は可変である。

【化５】の基質はこの処理中に完全に変換されることが
適当である。そこで完全に変換するのに要する時間は、
様々な可変要素に依存する。

【０１５１】例えば、特定のプロテアーゼと特定の

【化５】の基質；水成媒体中のこれらの濃度；アセトニ
トリル等の極性化合物の存在；反応液中の接触処理温度
等である。具体的には接触時間は約６〜３６時間の範囲
であるが、これより長くても短くてもよい。

【０１５２】プロテアーゼ接触は、従来の手順で終了す
る。たとえば、ある方法では反応系統をＰＨ値約２に酸
性化し酸性物質を単離することができる。酸性物質は酸
性化された反応系統から沈殿する。

【０１５３】リパーゼ及びプロテアーゼ酵素は従来の方
法で回復そして再使用できる。ある回復処理において
は、例えば、高分子量酵素をメンブランフィルター上で
保持力を介し回復させ、エチルアセテート等の溶媒で洗
う。

【０１５４】別の回復方法では、酵素を遠心分離により
沈殿物として固定化させ回復させる。この処理において
上澄液は化合物を含むことができる。

【０１５５】

【化５】の基質からこうして生成されたα−アミノ酸は
以下の属特有のラセメート式で特徴付けられる。

【０１５６】

【化８】

【０１５７】ここでＲ１及びＲ２は上記

【化４】で定義した通りである。

【０１５８】加水分解により生成されたこのα−アミノ
酸は二つの異なる光学活性異性体の混合物であり、この
異性体の構造はそれぞれ以下に示す属特有のエナンチオ
マー式により特徴付けられる。

【０１５９】

【化９】

【０１６０】

【化１０】

【０１６１】ここで、各式

【化９】及び

【化１０】においてＲ１及びＲ２は上記

【化４】で説明した通りである。

【０１６２】

【化９】式の化合物は（Ｓ）形式であり、具体的には、

【化１０】式の化合物との混合物の総量（１００重量
％）に対し約１００重量％であることが望しく、一方、

【化１０】式化合物は（Ｒ）形式であり、この対応重量
が混合物総量に対し１重量％より少ないことが望しい。

【０１６３】

【図８】式の化合物は反応性混合物から望しくは分離し
た方がよい。様々な分離方法が適用できる。

【０１６４】例えば、得られた水成混合物をエチルアセ
テート等の極性溶媒と共に連続して抽出し、残っている
未変換の

【図８】式構造の基質化合物を取り除く。

【０１６５】エチルアセテートと共に余分な容積（総水
成相容積に対する）を数度続けて抽出し、その後残った
有機液体を蒸発させ乾燥し、それにより残りの

【化５】前駆体化合物を回復させることができる。

【０１６６】得られた水性位相は、３Ｎ塩酸等の水成鉱
酸を用いてＰＨ値が約２になるように酸性化されること
が適当である。その後、得られた水成媒体をエチルアセ
テート等の極性溶媒と共に抽出する。

【０１６７】抽出処理は、未変換のメチルエステルの回
復のために上記に述べたように行われる。この抽出物の
蒸発により

【化８】式のＬ−α−アミノ酸が得られる。

【０１６８】従って、本発明の加水分解処理では、少な
くともエナンチオ選択度Ｅが約１００であり少なくとも
エナンチオマー過剰量ｅｅが約６０％であるような酵素
を用いて、

【化５】の前駆体をＬ−α−アミノ酸に変換する。

【０１６９】生成物収率は通常、少なくとも約８０％で
あり、光学純度は具体的には約１００％で望しい値を示
す。しかしながら、本発明の処理方法ではこれらの値
は、上述したようにより最適化できる。

【０１７０】（Ｃ）一段階処理の利点本発明によれば、酵素不斉ソルボリシス処理は酵素動的
分析の加水分解処理と結合して

【化４】の基質化合物から高光学純度のＬ−α−アミノ
酸を調製する。

【０１７１】実験及びその評価によれば、様々な種類の

【化４】のオキサゾロンに対してそれぞれの高エナンチ
オ調整度でエナンチオ選択的に開裂を行い、非常に高い
光学純度のＬ−α−アミノ酸をそれぞれ生成するよう
な、単一酵素を発見する可能性は薄い。

【０１７２】しかし、メチルアルコールが非極性溶媒の
求核として用いられる際には、ある種のリパーゼ、特に
上記のシュードモナス属リパーゼは

【化４】オキサゾロンのメタノリシスに蝕媒作用するた
めの比を広範囲に渡って有する。

【０１７３】変換処理では、以下の実験例で示す通り、
このリパーゼはエナンチオ選択度の予期しなかった容量
を示している。このエナンチオ選択度は実際には増加さ
れた方がよい。

【０１７４】このような増加は本発明に従い更に確認さ
れており、エナンチオ選択度は、

【化５】のメチルエステルを第２の酵素であるプロテア
ーゼ、特にプロジーム６及びプロテアーゼＮと接触させ
ることにより、実質的に増加する。

【０１７５】この第２接触処理においては水成媒体で加
水分解が行われる。これにより、初期のメタノリシス処
理で得られた、エナンチオマー的に濃縮された生成物を
動的分解できるという効果がある。この状態は以下に示
すシーケンスを見ればわかりやすい。

【０１７６】

【化１１】

【０１７７】ここで、Ａは上記

【化４】化合物、Ｂはリパーゼにより実現されるＡのメ
タノリシスにより生成される光学活性メチルエステルの
（Ｓ）形式、Ｃは、リパーゼにより実現されるＡのメタ
ノリシスにより生成される光学活性メチルエステルの
（Ｒ）形式、Ｄは、プロテアーゼにより実現されるＢ及
びＣの動的分解により生成される濃縮Ｌ−α−アミノ酸
である。

【０１７８】シーケンス（７）では、更に、Ｋ１はＢを
生成する、リパーゼ蝕媒のメタノリシスの割合、Ｋ２
は、Ｃを生成するリパーゼ蝕媒のメタノリシスの割合、
Ｋ３及びＫ４は、Ｄを生成するためのＢ及びＣのプロテ
アーゼ蝕媒の加水分解の割合である。

【０１７９】シーケンス（７）において、Ｋ１はＫ２よ
り大きく、Ｋ３はＫ４よりはるかに大きい。シーケンス
（７）は下記の特定の反応性により例証される。

【０１８０】

【化１２】

【０１８１】リパーゼ触媒のメタノリシスによる生成物
とエナンチオマー過剰量の関係は以下の式の通りであ
る。

【０１８２】

【数４】

【０１８３】最終的に得られるＮ−ベンゾイル−Ｌ−α
−アミノ酸のエナンチオマー純度ｅｅ’とプロテアーゼ
のエナンチオ選択度の値Ｅ（Ｅ＝１００）は以下の数式
で表される。ここでＣはプロテアーゼ触媒のメチルエス
テル加水分解の変換度を示す。

【０１８４】

【数５】

【０１８５】添付の図は

【数５】より得られたものである。図表は固定要素ｅ
ｅ’（０．９８に設定）とＥ＝１００に対しての可変要
素ｅｅ。及びＣに関して有益かつ理論的曲線を描いてい
る。

【０１８６】仮に、オキサゾロンにリパーゼ触媒のソル
ボリシスを行って得た生成物がｅｅ。が０．７０である
対掌体混合物を含んでおり、それがプロテアーゼ（Ｅ＝
１００）により、エナンチオン選択的に加水分解される
とする。

【０１８７】ｅｅ’が０．９８以上のＮ−ベンゾイル−
Ｌ−α−アミノ酸を確保するためには、Ｃが０．８５６
以下の時点で反応を止めることが必要である。

【数５】は概略的なものである。

【０１８８】当業者にとってはｅｅ。、ｅｅ’、Ｅ及び
Ｃの異なった値を関係付けるため図表が用いられること
についてはたやすく判断できる。

【０１８９】本発明の教示に従って、二酵素シナジェテ
ィクス的連続重合を行い、これにより約５０％より大き
い収率を有する高エナンチオ純度のＬ−α−アミノ酸は
ほぼ全てが容易に調整できる。これはＬ−α−アミノ酸
の公知の分解処理の固有の利点である。

【０１９０】上記のように、本発明の二段階処理が実施
されると、少なくとも約９０％のエナンチオマー量（ｅ
ｅ）を有する

【化９】式の化合物が生成される。より望ましいエナン
チオマー量は約９５％、最も適当なものは約９９％であ
る。

【０１９１】第

【化６】及び

【化７】式のエナンチオマー化合物の混合物に望ましい
動的分解を行うためには、ＢＣのメチルエステルに開裂
を行う際にエナンチオマー選択度が高いような酵素を有
することが必要である。

【０１９２】ＢＣは、シーケンス（７）で定義した通
り、

【化４】の化合物であるシーケンス（７）の化合物Ａに
対し、リパーゼ触媒した不斉開裂を行って生成した化合
物である。

【０１９３】Ｐ−３０のようなリパーゼは水成媒体中で
シーケンス（７）に示すＢＣのメチルエステルの開裂に
対し触媒作用を及ぼすことができるのにもかかわらず、
反応率が非常に低いため実用向きではない。

【０１９４】代わりに動的分解にプロテアーゼを使用す
ると満足する結果が得られることが確認された。表４
（実験例３６〜４１）の結果は、２つのプロテアーゼの
どちらか一方が、少なくとも約１００という高いエナン
チオ選択度（Ｅ）で加水分解反応に対し触媒作用を及ぼ
すことに非常に適しているという事実を示している。

【０１９５】小規模なアミノ酸側鎖も大規模なそれも（

【化４】、

【化５】、

【化８】式のＲ１）市販の酵素であるプロジーム６及び
プロテアーゼＮにより提供される。

【０１９６】本発明の二段階処理によれば、リパーゼと
プロテアーゼ反応が結合し、ほとんどの天然及び非天然
のＬ−α−アミノ酸が高エナンチオマー量（少なくとも
約９０％）及び高収率（少なくとも約５０％）で調整す
ることができる。

【０１９７】＜実施例＞ ──反応開始物質── 以下のリパーゼは^*天野株式会社から購入した：シュー
ドモナス属セパシア（Ｐ−３０）、シュードモナス属Ｓ
Ｐ．（ＡＫ及びＫ−１０）及びアスペルギルスニガー
（ＡＰ）。ポルシン膵臓リパーゼ（フェルミリパーゼＰ
Ｌ）はジェネンカー社製である。

【０１９８】プロテアーゼであるプロジーム６、Ｎ及び
２４は天野株式会社より購入し、α−キモトリプシンは
^*シグマ化学株式会社製である。

【０１９９】反応開始基質は周知の方法で合成した。す
なわち、５（４Ｈ）−オキサゾリン−５−基質誘導体
は、チェンｅｔａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、
１０４，７２９４−７２９９（１９８２）；^*ローマー
（Ｌｏｈｍｅｒ）ｅｔａｌ．，ＬｉｅｂｉｇｓＡｎ
ｎ．Ｃｈｅｍ．，６５８，１２８〜１５０（１９６
２）；及びカーター，Ｈ．Ｅ．，Ｏｒｇ．Ｒｅａｃｔｉ
ｏｎｓ，３，１９８−２３９（１９４６）に述べられて
いる方法で合成した。

【０２００】５（４Ｈ）−チアゾリン−５−基質誘導体
は、^*カー（Ｋｊａｅｒ）Ａ．，ＡｃｔａＣｈｅｍ，
Ｓｃａｎｄ．４，１３４７−１３５０（１９５０）；^*
ストロヴィズ（Ｓｔｏｌｏｗｉｔｚ）ｅｔａｌ．，Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８１，１１３−１１９（１
９８９）；及び^*バレット（Ｂａｒｒｅｔｔ）ｅｔａ
ｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，（Ｃ），１１１７〜１
１１９（１９６９）に記述されているように合成した。

【０２０１】他の全ての化学物質及び溶媒は、入手でき
る限り最高の質のものを用意した。アルドリッチ化学株
式会社製又はシグマ化学株式会社製である。

【０２０２】−分析方法及びその装置− １ＨＮＭＲスペクトルを、ＷＭ−２００分光計を用い
て、テトラメチルシランを含む重陽子クロロホルムの内
標準として記録した。上記の溶媒中の光学回転をパーキ
ンーエルマー型２４１ｃ施光計で測定した。

【０２０３】薄層クロマトグラフィ−（ＴＬＣ）を０．
２５ｍｍのシリカゲルで被覆したガラス板に対して行っ
た。フラッシュカラム展開クロマトグラフィーをシリカ
ゲル（４０μｍ）を用いて行った。

【０２０４】用いた溶媒は全て予め蒸留してあるガラス
である。全ての混合有機抽出物はＭｇＳＯ４により乾
燥、及び低圧力でろ過そして蒸発させた。エナンチオマ
ー量を決めるため、メチルエステル基を、キラルシフト
試薬Ｅｕ（ｈｆｅ）３と共に１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
により分解した。

【０２０５】全ての生成物（アミノ酸）は、まずメチル
エステルに変換し次に上述した様に分解した。

【０２０６】酵素反応から得たＮ−ベンゾイル−Ｌ−ア
ミノ酸メチルエステル及びＮ−ベンゾイル−Ｌ−アミノ
酸の絶対配置は、その光学回転をＬ−アミノ酸から調製
された対応する周知の誘導体とを比較することにより決
めた。ここで述べる収量は全て単離収量である。

【０２０７】以下に述べる実験例において、Ｒ１及びＲ
２については断りがない限り

【化１】式を参照している。

【０２０８】−実験例− 実験例１〜３５〔リパーゼ媒媒を含む有機溶媒中の５−（４Ｈ）−オキ
サゾロン誘導体のエナンチオ選択メタノリシス処理〕

【０２０９】通常手順：５０ｍｇの粗製リパーゼを、５
ｅｇ．のメチルアルコールを含む時には５ｅｇ．の水を
含む２ｍｌの第３ブチル基メチルエーテル中の５０ｍｇ
のラセミ基質の溶液に加えた。

【０２１０】混合物は変換が完全に終了するまで５０℃
で培養された。反応の進行は溶媒系を用いてＴＬＣによ
り調べた。

【０２１１】ここでいう溶媒系とはエチル・アセテート
−ヘキサンである。（この溶媒の割合はＲ₁とＲ２の特
別な置換基により左右され、例えば、移動相として１：
１の割合でエチルアセテート／ヘキサンを含んだＮ−ベ
ンゾイルフエニルアラニン・メチルエステルの場合、Ｒ
ｆ値は０．６である）。

【０２１２】粗製リパーゼはろ過処理により反応混合物
より分離され、エチルアセテートで洗った。生成物はシ
リカゲル閃光クロマトグラフィーにより純化された。
（例えば、Ｎ−ベンゾイルアミノ酸メチルエステルのヘ
キサンとエチルアセテートの比が４：１の場合、この比
は異なるＲ２の置換基により変化する。）

【０２１３】４−置換−２−フエニル−オキサゾリン−
５−化合物のリパーゼＰ−３０が蝕媒されたエナンチオ
選択の不斉メタノリシス以下に示す式により要約され
る。

【０２１４】

【化１３】

【０２１５】様々なバクテリアリパーゼで蝕媒された４
−置換−２−フエニル−オキサゾリン−５−化合物のエ
ナンチオ選択の不斉メタノリシスは以下の式で要約され
る。

【０２１６】

【化１４】

【０２１７】種々のバクテリアリパーゼにより蝕媒され
る様な４−ベンジル−２−置換−オキサゾリン−５−化
合物のエナンチオ選択不斉メタノリシスは以下の式によ
り要約される。

【０２１８】

【化１５】

【０２１９】エナンチオ選択メタノリシスの結果は表
３、４及び５に表わされている。

【０２２０】

【表３】

【０２２１】

【表４】

【０２２２】

【表５】

【０２２３】実験例３６〜４１〔プロテアーゼ蝕媒を有する水成溶媒における、Ｎ−ベ
ンゾイルアミノ酸メチルエステルのエナンチオ選択的
加水分解処理〕

【０２２４】通常手順：実験例１〜３５の手順で生成さ
れ、０．２Ｍの水成リン酸塩緩衝体（ｐＨ６．８）に浮
遊させた（±）Ｎ−ベンゾイルアミノ酸メチルエステル
５０ｍｇに、粗製プロテアーゼ（プロジーム６又はプロ
テアーゼＮ）５０ｍｇを加えた。

【０２２５】この混合物は基質の約５０％が生成物に変
換されるまで（ＴＬＣを用いて観察）、２５℃の温度で
磁気撹拌器でよく撹拌した。

【０２２６】ここで飽和ＮａＨＣＯ₃を添加することに
より反応をとめ、エチルアセテート（３×２０ｍｌ）と
共に反応物質を抽出した。

【０２２７】有機抽出物を蒸発・乾燥させてＮ−ベンゾ
イル−Ｄ−アミノ酸メチルエステルを得た。

【０２２８】水成相を３ＮＨＣｌを用いてＰＨ２に酸性
化し、エチルアセテート（３×２０ｍｌ）と共に抽出し
た。有機抽出物を蒸発させ、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−α−
アミノ酸を得ることができた。

【０２２９】Ｎ−ベンゾイル−アミノ酸メチルエステル
の動的分解の際のプロテアーゼ蝕媒のエナンチオ選択加
水分解処理は次式で要約される。

【０２３０】

【化１６】

【０２３１】この加水分解の結果を表４にまとめて表
す。

【０２３２】

【表６】

【０２３３】実験例４２〔動的分解処理によるエナンチオ選択ソルボリシス処
理〕

【０２３４】反応性混合物は、第３ブチル基メチルエー
テル２０ｍｌに（±）−４−ベンジル−２−フエニルオ
キサゾリン−５−化合物２５０ｍｇと粗製リパーゼＰ−
３０を２５０ｍｇ含む。この混合物を５０℃の温度で４
８時間浮遊させた。

【０２３５】リパーゼＰ−３０はろ過処理により反応性
混合物から分離し、エチルアセテートで洗った。組成さ
れた有機層は低圧力で乾燥され凝縮し、Ｎ−ベンゾイル
−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル（９９収量％、
６５％ｅｅ）２８０ｍｇを得た。

【０２３６】この複合物２８０ｍｇと粗製プロジーム６
２８０ｍｇを０．２Ｍリン酸塩緩衝体（ｐＨ６．８）
２０ｍｌに浮遊させ、温室で４３時間、よく撹拌した。
ＮａＨＣＯ₃を添加して反応を終了させ、エチルアセテ
ート（３×３０ｍｌ）と共に抽出した。

【０２３７】有機複合層を凝縮すると基質４３ｍｇ（１
５．３％）が残った。水成分は、３ＮＨＣｌを開いてｐ
Ｈ₂に酸性化させてエチルアセテート（３×３０ｍｌ）
と共に抽出した。

【０２３８】有機複合層を凝縮、乾燥させ、２２０ｍｇ
のＮ−ベンゾイル−Ｌ−フエニルアラニン（８２収量
％、ｅｅ＞９５％の場合、８２．１％、〔α〕＝−３
０°（Ｃ，１．０，ＣＨ₃ＯＨ）を得られた。

【０２３９】本発明の特許請求範囲を逸脱することなし
に、上記に述べたもの以外の実施例及び変形例が考えら
れるであろうことは当業者にとっては自明である。

【０２４０】

【発明の効果】本発明によれば、アミノ酸は高反応率、
高光学純度、高収率で、実用的な方法で作られ、そのま
ま用いることができる。

【０２４１】また、本発明の処理方法は相対的に簡単で
信頼性の高い経済的な方法である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図は、初期の％エナンチオマー過剰量（ｅｅ）
と％変換（Ｃ）との関係を示したもので、最終％エナン
チオマー過剰（ｅｅ’）が酵素の９０％で固定されエナ
ンチオマー率（Ｅ）は１００で固定されている図であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（Ａ）非極性溶媒中で、５（４Ｈ）−オ
キサゾロンで構成される群から選択されたアミノ酸前駆
体を、メチルアルコールの存在下で触媒有効量のメチル
アルコール活性リパーゼと接触させ、エナンチオ選択的
に該前駆体を加溶媒分解し、該アミノ酸のメチルエステ
ルを生成し、（Ｂ）水性媒体中で、上記メチルエステルを、メチルエ
ステルに対し水中で少なくとも約１００のエナンチオ選
択度を有する加水分解活性プロテアーゼの蝕媒有効量と
接触させ、エナンチオ選択的に上記メチルエステルの開
裂を行い、少なくとも約９０％の光学純度を有するＬ−
α−アミノ酸を生成するという連続した手順により該Ｌ
−α−アミノ酸を製造する酵素処理方法。
【請求項２】上記リパーゼは少なくともひとつのシュ
ードモナス属リパーゼであることを特徴とする請求項１
記載の酵素処理方法。
【請求項３】前記シュードモナス属リパーゼは、Ａ
Ｋ、Ｋ−１０及びＰー３０で構成される群から選ばれる
ことを特徴とする請求項２記載の酵素処理方法。
【請求項４】前記プロテアーゼはプロジーム６及びプ
ロテアーゼＮで構成される群より選ばれることを特徴と
する請求項１記載の酵素処理方法。
【請求項５】前記前駆体は４−置換−２−置換−オキ
サゾリン−５−オンであることを特徴とする請求項１記
載の酵素処理方法。
【請求項６】前記前駆体は一般式【化１】で特徴づけられ、式中Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、メチル
アルコール活性リパーゼの存在下で実質上不活性である
一価の有機部分であること特徴とする請求項１記載の酵
素処理方法。
【請求項７】前記メチルエステルは、二種類の異なる
光学活性異性体の混合物で、前記異性体の１つは（Ｓ）
形式であり、以下の一般式【化２】で特徴付けられており、ここでＲ１及びＲ２はそれぞ
れ、メチルアルコール活性リパーゼの存在下で実質的に
不活性である一価の有機部分であり、また、前記混合物
中の（Ｓ）形式の異性体のエナンチオマー過剰量は少な
くとも約６０％であることを特徴とする請求項１記載の
酵素処理方法。
【請求項８】前記Ｌ−α−アミノ酸は一般式【化３】で特徴付けられ、ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、メ
チルアルコール活性リパーゼ存在下では実質上不活性で
ある一価の有機部分であり、また、前記Ｌ−α−アミノ
酸の光学純度は少なくとも約９５％であることを特徴と
する請求項１に記載の酵素処理方法。
【請求項９】前記前駆体は４−置換−２−フエニル−
オキサゾリン−５−オンであり、前記アミノ酸メチルエ
ステルはＮ−ベンゾイル−Ｌ−α−アミノ酸メチルエス
テルであり、前記Ｌ−α−アミノ酸はＮ−ベンゾイル−
Ｌ−α−アミノ酸であることを特徴とする請求項８記載
の酵素処理方法。
【請求項１０】前記Ｌ−α−アミノ酸は５０％より大
きい収率で生成され、少なくとも約９９％の光学純度を
持つことを特徴とする請求項９記載の酵素処理方法。
【請求項１１】前記第１の接触処理はバッチ方式で行
なわれ、また初期の反応混合物の組成成分が、非極性有
機溶媒１００重量部中に、約２〜約５重量部の前記前駆
体、約０．５〜約２重量部の前記メチルアルコール、及
び約２〜約５重量部の前記シュードモナス属リパーゼを
含むことを特徴とする請求項１記載の酵素処理方法。
【請求項１２】前記第１の組成物は更に約０．５〜約
１重量部の水を含むことを特徴とする請求項１１記載の
酵素処理方法。
【請求項１３】前記第２の接触処理はバッチ方式で行
なわれ、また初期の反応混合物の組成成分が、水の１０
０重量部中に、約１〜約１．５重量部の前記メチルエス
テル及び約１〜約１．５重量部の前記プロテアーゼを含
むことを特徴とする請求項１に記載の酵素処理方法。
【請求項１４】前記第２の組成物は更に約１〜約３重
量部のリン酸塩緩衝剤を含むことを特徴とする請求項１
３記載の酵素処理方法。
【請求項１５】前記第２の組成物は更に約１〜約１０
重量部の極性有機溶媒を含むことを特徴とする請求項１
３記載の酵素処理方法。
【請求項１６】Ｒ₁及びＲ₂は、それぞれ、（ａ）６〜１２の炭素原子のアリール、（ｂ）６〜１８の炭素原子のアルカリール、（ｃ）７〜１８の炭素原子のアラルキレン、（ｄ）８〜１８の炭素原子のアラルケニレン、（ｅ）１８未満の炭素原子のアルキル、（ｆ）１８未満の炭素原子のアルケニル、（ｇ）それぞれ３〜１８の炭素原子のシクロアルキレン
基及びシクロアルケニレン、及び（ｈ）一環につき４〜８原子で、その内の少なくとも半
分の原子は炭素原子である複素環からなる一価基の群から選択されることを特徴とする請
求項６記載の酵素処理方法。
【請求項１７】請求項１の処理により生成された少な
くとも約９５％の光学純度を有するＬ−α−アミノ酸。