JPH07504165A - カゼインマクロペプチドのペプチド類,これらペプチド類の抗体と用途 - Google Patents
カゼインマクロペプチドのペプチド類,これらペプチド類の抗体と用途Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
カゼインマクロペプチドのペプチド類、これらペプチド類の抗体と用途
この発明は、乳及び乳製品の蛋白質分解変性の程度を評価することができる方法
に関する。
蛋白質分解現象特に細菌性プロテアーゼによる分解現象は、乳製品の品質の低下
の原因となる。
これらの現象を起す細菌は、本質的にグラム陰性菌、特にシュードモナス菌であ
る。これらは低温で発育しつる好論性細菌(psychrotrophic b
acteria)である。4℃で乳の貯蔵は、他の種を犠牲にしてこれらの細菌
の発育に有利に働(。
好論性細菌からのプロテアーゼの作用は本来カゼインに関して研究されている。
最も急速に分解されるフラクションはに一カゼインで、β−カゼインも実質的に
アタックされ、αsl−カゼインも低程度であるが分解されるとみられる。好論
性細菌プロテアーゼによるに一カゼインの蛋白分解では、約60のアミノ酸のペ
プチド(例えば牛乳では64アミノ酸)、グリコマクロペプチド(GMP)とも
称せられるカゼインマクロペプチド(CMP)で、K−カゼインのC末端に対応
するものを放出する。
好論性細菌のプロテアーゼ活性は耐熱性で、かつUHT滅菌処理に安定である。
UHT製品にこの活性が残存することは、これら製品の寿命及び感覚刺激性を減
少させる。従って、乳及び乳製品中の好論性細菌による蛋白質分解(又は蛋白質
分解力)を評価する試験を有することが望まれる。
牛乳工場に到着した牛乳にこのようなテストを行えば、受は取った牛乳の品質に
最も適する処理と加工操作を決めることが可能となる。それによりある種の製造
過失(UHT牛乳のシェリー化、苦味フレーバー、過酸、チーズ収量の減少)を
回避することができよう。
その上、このようなテストはチーズ製造上非常に有用である。
実際に、好論性細菌の蛋白質分解酵素は、チーズの熟成にある役割を明白に奏す
る。製造前に潜在的な蛋白質分解活性を測定することは、発育条件を変えること
により熟成をよりよくコントロールすることになろう。
結果として、牛乳中の蛋白質分解活性特に好論性細菌によるものを評価する目的
でいくつかの方法が報告されている。
例えば、蛋白質分解の原因となる好論性の生理的寄生菌(fl。
ra)を直接評価することが提案されている。この方法は、細菌を培養し計算す
ることを含むか、それに関連するあらゆる欠点がある。特殊な装置を比較的に多
く、かつ専門スタッフを必要とし、一方結果が細菌培養の生育に必要とする期間
後でのみ得られる。最近、迅速な間接法(バイオ蛍光、インベージメトリー等)
が提案されている。しかし、特殊な装置を必要とし、乳及び乳製品のような異質
培養物に多少適するもので、牛乳工場では殆んど実際に使用されていない。
プロテアーゼを直接的にアッセイすることも提案されており、このアッセイは、
酵素活性に基づくか、又はプロテアーゼの免疫化学定量によって直接的に行われ
る。
酵素活性のアッセイは、例えば、標識物質(着色、蛍光又は放射線)を放出する
天然又は人工物質の加水分解を測定することにより行われる。
例えば、HPA法(CLIFPE、 and LAW: J、 Dairy S
ci、、 49.209〜219 (1982))は、基体が、青色染料を共育
結合させて変性したコラーゲンであるものを挙げている。この方法は、約2×1
0’好冷菌/−で産生されたプロテアーゼを検出できる。
免疫化学法として、例えばシュードモナス フルオレッセンスからのブロティナ
ーゼP1が提案されている(BRIKELAND etal、、Appl、 E
nviron、 Microbiol、、 49.382〜387)) oこの
ブロティナーゼのELISA法によるアッセイでは約10’好冷菌/miの等価
を検出できる。
他の方法として、蛋白質分解により放出されるアミノ酸又は非蛋白窒素を測定す
るのがある。しかし、この方法は、加水分解の前分離を必要とするので実行が難
しい。この方法は、約5×101好冷菌/−を検出できる。
最後に、カゼイン加水分解物の検出に基づく他の方法がある。
K−カゼインに対し、K−バラカゼインとカゼインマクロペプチドCCMP)の
2つの分解物をアッセイする方法が提案されている。
現在では、K−バラカゼインが、電気泳動でのみ検出できるが比較的つらい方法
である。
グリコペプチドであるCMPの場合に、サアリン酸(N−アセチルノイラミン酸
)を測定するか又はDEAEセルロースでのクロマトグラフィーによってアッセ
イすることが提案されている。しかし、これは、つらい方法であり、得られる結
果はあまり正確ではない。
この発明者らは、速度、使用容易性と信頼性をそなえる方法を見出すべく、CM
Pアッセイの免疫学的法の開発をした。
そのため、抗CMP抗体をめた(COLLIN et al、 Communi
cation at the XXth International Dai
ry Congress、 1990年10月8〜12日、モントリオール)。
しかし、CMPのに一カゼインの加水分解による製造は、非水分解のに一カゼイ
ンのコンタミを除去するため長くて費用のかかる精製工程を必要とする。加えて
、K−カゼインでコンタミしていない完全に精製したCMPを免疫源として使用
しても、非加水分解に一カゼインと交差反応をする抗体が得られ、この反応は、
いくつかの親和クロマトグラフィーでも減少しないことを観察した。
この発明の目的は、化学合成で容易に作られ、CMPの抗原決定因子を保持し、
抗CMP抗体の誘因に用いつる抗原分子を作ることである。
発明者らは、CMPがグリコペプチドであるが、CMP配列の断片を表わす、い
くつかの非グリコジル化ペプチドが所望の性質を有することを観察した。
この発明の主題は、アミノ酸配列がCMP配列の少なくとも1つの断片からなり
、そのペプチドがCMPの少なくとも1つのエピトープを担持し、かつSEQ、
10 No、lとして付表の配列リストで示される次の配列Met−Ala−
[1e−Pro−Proからなるペプチドおよび次の
5er−Pro−Pro−Glu−11e−Asn−Thr−Val−Gin−
Val。
Lys−Thr−Glu−11e−Pro−Thr−41e−Asn−Thr−
ile。
Thr−rle−Ala−8er−Gly−Glu−Pro−Thr−Ser−
Thr。
As p−5et−Pro−G 1u−Va l−[1e−Glu−Ser−P
ro−Pro。
の(これらは付表の配列リストでSEQ、 ID No、2.8EQ、 ID
No、3゜SEQ、ID No、4. SEQ、 10 No、5として表示)
1つは、少なくとも5つの連続アミノ酸からなるペプチドからなる群より選択さ
れることを特徴とする抗原ペプチドである。
この発明の好ましい具体例によれば、前記へブチドが配列SεQ、rD No、
2、SEQ、rD No、3、SEQ、rD No、4とSEQ、ID No、
5の1つの少なくとも8つの隣接アミノ酸からなる。
加えて、発明者は、得られたペプチド中、あるものは、K−カゼインとの交叉反
応を全くか又は殆ど示さないことを認めた。
これらのペプチドを免疫原として使用すると、特異な抗CMP抗体を得ることが
できる。
“特異な抗CMP抗体”とは、CMPを認識し、交叉反応を奏しない、又は親和
クロマトグラフィーによって除去することが容易であるに一カゼインとの反応の
みの抗体を意味すると理解すべきである。このような抗体のCMPの断片を用い
ての産生は、CMPを免疫原として使用したときに一カゼインとの交叉反応を除
去することは不可能とされていたので意外である。
この発明の他の好ましい具体例によれば、前記へブチドは、次の配列SEQ、
ID No、6
Me t −A la−11e−Pro−Pro−Ly 5−Lys−As n
−G In−As p−Lys。
から本質的になるペプチド、
次の配列
Met−Ala−[1e−Pro−Pro−Lys。
Met−Ala−11e−Pro−Pro−Lys−Lys。
Me t−A la−[1e−Pro−Pro−Lys−Lys−Asn。
Met−Ala−[1e−Pro−Pro−Lys−Lys−Asn−Gin。
Met−Ala−rle−Pro−Pro−Lys−Lys−Asn−Gin−
Asp。
の1つから本質的にペプチドからなる群より選択される。
この発明のなお他の好ましい具体例によれば、前記ペプチドは付加的にそのC末
端にシスティンからなる。
CMPの配列に関連して、配列SEQ、 10 Nos、1.2,3,4,5.
と6のペプチドの位置は、MAPの構築に使用されるペプチドと同様に図1に示
される。
この発明は、その構成が成分として上で定義した少なくとも1つのペプチドから
本質的になることを特徴とする抗原組成物を含む。
この発明による抗原組成物は、特に、上記したペプチドのみならず、上記ペプチ
ドから得られるMAPs(マルチ抗原ベブ(1988年)〕ならびにそのペプチ
ドをキャリヤー蛋白にカップリングさせて得られたより複雑な抗原を含む。
これらの組成物は、特に、抗CMP抗体誘因用の免疫原及びCMPの検出とアッ
セイ用の試薬の両方に使用できる。
配列SEQ、 rD No、1を含有するペプチドからなる組成物(例えばペプ
チドSEQ、 [D No、6又はその断片からなる組成物)は、特異抗CMP
抗体を得ることを可能とする。
配列SE0.10 No、2のペプチド又はその断片からなる組成物は、牛乳C
MPのみを認識する種特異性抗体を得ることを可能とし、これは、他の種(特に
羊乳、ヤギ乳及び野牛のようなウシからの乳でも)から得られたと想定される乳
又は他の乳製品の牛乳の存在の検出を可能とする。
この発明の主題は、また、動物が上記の抗原組成物で免疫化される工程からなる
ことを特徴とする抗CMP抗体の製法である。
この発明は、また、抗原として、この発明の組成物を用いて得られる抗CMP抗
体を含む。
この発明の好ましい具体例によれば、その抗体はモノクロナール抗体である。
この発明の他の好ましい具体例によれば、その抗体のポリクロナール抗体である
。
この発明の主題は、付加的に配列SEQ、 IONo、1からなるペプチドに対
し指向する特異性抗CMP抗体を検査すべき乳または乳製品と接触させる工程、
この工程中に生成される抗原/抗体コンプレックスを適当な手段で検出および/
またはアッセイする工程からなることを特徴とする乳または乳製品の蛋白分解を
評価しつる方法である。
この発明の方法の好ましい具体例では、使用される特異抗CMP抗体が、配列S
EQ、 ID No、6のペプチド又はその断片の1つに対して作られる。
K−カゼインとCMPの両方を認識する抗CMP抗体は、コントロールとして、
存在するに一カゼイン(加水分解又は非加水分解)の全量を評価するのに使用で
きる。
この発明による方法は、ヨーグルト中のに一カゼイン蛋白質分解の存在(その分
解の程度はヨーグルトの製造に用いた種により変化する)を検出できる。そのた
め、この方法は、種のに一カゼイン加水分解によるCMPの生産能に従って、種
の選択に有利に応用できる。
付加的に、この発明の主題は、配列SEQ、 ID No、2のペプチド又はそ
のペプチドの断片に対して産生された抗体を検査すべき乳又は乳製品と接触させ
る工程、この工程中に生成した抗原/抗体を適当な手段で検出および/またはア
ッセイする工程からなることを特徴とする乳および乳製品中の牛乳CMPの存在
を検出する方法に関する。
抗原/抗体コンプレックスの検出、アッセイの手段は、当業者に周知で、最も普
通に用いられる手段としてELISA、RIAなどの各種の方法が挙げられるが
、これに限定されない。
また、この発明の主題は、この発明による、少なくともlっのペプチド又は1つ
の抗原組成物又は別に少なくとも1つの抗CMP抗体からなることを特徴とする
CMPのアッセイ用の診断剤に関する。その抗体又はそのペプチドは、反応物を
可視化させる適当なマーカー(化学的、酵素的又は放射線的)に任意に結合され
る。
この発明は、下記の付加的記載、すなわち抗CMP抗体の産生用のこの発明の抗
原組成物を用いる実施例及び乳蛋白質分解の評価用の前記抗体の使用に関する記
載の助けでより明らかに理解されるであろう。
しかし、これらの実施例は発明の主題を例示するためのもので、それによって限
定されないことは勿論である。
■、−抗CMP抗体の産生
ペプチドを、メリフィールドの方法、分冊“抗原としての合成ポリペプチド類”
(VAN REGENMOR置、 BRIAND、 MULLER,PLAN
E、 Ed、 Elsevier(1988))に記載の手順を用いて合成し、
クロマトグラフィーで精製する。精製後に、ペプチドをキャリヤー蛋白に結合さ
せる。
すなわち、カップリング剤MBS(M−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシ
サクシンイミドエステル)を用いアミノ酸システインーオバアルブミン又はカッ
プリング剤BDB (ビスジアゾベンジジン)を用いアミノ酸チロシン上牛の血
清アルブミンの何れか。
実施例1−ポリクロナール血清の作成
ウサギを合成ペプチドで免疫化する。すなわち、第1の注入は、生理食塩水と完
全フロインドアジュバントの等量混合物1−に200μgのペプチドを溶解させ
たもので行う。ブースター注入は、200μgのペプチドの不完全フロインドア
ジュバント懸濁液で各3週ごとに行う。
血液サンプルを第1の注入後10日で採取し、血清を回収する。
K−カゼインとの交叉反応を少なくするため、血清を200■牛血清アルブミン
を補充した10■のに一カゼインとカップリング剤(2,5%グルタルアルデヒ
ド)からなるに−カゼインゲルに吸着させた。重合したゲルは、0.1Mリン酸
塩緩衝液(PH7,2)中4℃で保存する。第1の場合に、ゲルを4°C,18
600gで15分間遠心分離して、緩衝液を除去する。
リン酸塩緩衝液1ml中凍結乾燥血清310■の量で、抗CMP血清をゲルに加
える。この混合物を室温で2時間、次いで4°Cで一夜攪拌する。上澄液を回収
し、ゲルをリン酸塩緩衝液0.25−で洗浄する。次に、23600 gで15
分間再び遠心分離して、全てのエントラップされた血清を回収する。得られる上
澄液を第1の上澄液に加える。
実施例2−抗CMPモノクロナール抗体の産生Ba1b/c BYJICOマウ
スを完全フロイント アジュバント中でエマルジョンにした卵白アルブミン連結
ペプチド100μgを第1の腹腔内注射で免疫化する。17日日月、卵白アルブ
ミン連結ペプチド50μgの腹腔内注射を不完全なフロイント アジュバント存
在下で行い、卵白アルブミン連結ペプチド10μgの静注をアジュバントなしで
行った。20日l;こ、マウスを犠牲にし、膵臓を除去し、牌細胞(splen
ocyles)をミルスティンとコーラ−の方法[:Nature、 256.
495〜497 (1975))により骨髄細胞と融合する。得られるハイブリ
ットのスクリーニングを牛血清アルブミンに連結した免疫化用に供されたペプチ
ドで行う。
実施例3−CMPからの各種ペプチドの抗原性の比較図1中、1〜9で表わされ
た牛乳CMPの配列の断片からなる合成ペプチド(ペプチド7はペプチドSEQ
、 10 No、6に対応し、ペプチド8はその配列の最初の6つのアミノ酸に
相当し、CyS残基はこれら2つのペプチドのC末端に添加された)を、実施例
1に記載の方法による抗体を作るのに用いた。
アッセイは、次の方法によるELISAで行い、CMPの2ttg/rrdj溶
液100μl又はに−カゼインの6μg/1all溶液100μmをマイクロ遠
足プレートのくぼみに入れる。これらの抗原の吸着は、プレートを4°Cで一夜
培養して行われる。次いで、くぼみをPBS−ツイーン350μmで3回洗浄し
、PBS−ツイーン+1%ゼラチンの250μmで飽和する。プレートを37°
Cで1時間培養する。ペプチド1〜8の1つに対して産生された抗体(1/10
00希釈)の100μmを各プレートのくぼみに入れ、次いで37°Cで1時間
30分インキュベートする。
350μmのPBS−ツイーンで3回洗浄し、各くぼみにペルオキシダーゼ結合
抗つサギIgG抗体でPBS−ツイーンにl/2000に希釈したもの1008
mを添加し、プレートを37°Cで45分培養する。
PBS−ツイーンで新たに3回洗浄し、反応を可視化する。
使用した基質は、0.1Mクエン酸塩緩衝液pi(5+ LOxは1/10希釈
の3.3′、5,5−テトラメチルベンジジン(TMB)である。各くぼみに7
5μmを加え、プレートを37°Cで15分培養する。
ペルオキシダーゼとTMBとの反応で青色を呈する。この反応は、各(ぼみにI
N−塩酸25μlを加え停止する。次いで基質は黄色になる。結果は、450n
+nでのODを測定して評価する。
結果を下記表1に示す。(+)は陽性反応、(−)は陰性反応、士印の数は観察
された着色反応の強度をそれぞれ示す。
表1
■、−乳及び乳製品中のCMPのアッセイへの抗CMP抗体の使用
くぼみに吸着により、CMP吸着に干渉する乳蛋白の最大量を除去しつるよう前
もって限外濾過したテストサンプルの溶液を用いて、アッセイを行う。このアッ
セイは、上記実施例3に記載のELISA法によって行う。
精製抗原の既知量(例えば、CMPの2μg/dの溶液100μm、この発明に
よるペプチド又はMAPはCMPの代りに用いることができる)をプレートに吸
着させる。
アッセイを限外濾過なしサンプルで行いたいときは、競合ELISAアッセイで
行うのが好ましい。
プレートの洗浄と飽和の後に、アッセイすべき抗原液の連続希釈液の存在下で抗
原−抗体反応を行う。
反応産物は上記実施例3に示すように可視化される。
検体サンプル中のCMPの量は、CMPの既知希釈液で得られた連続目盛との比
較で評価される。
実施例4−乳中のCMPのアッセイ
このアッセイに使用された抗体はペプチド7 (SEQ、rD No、6十Cy
s)に対して産生された。
4つのチーズ工場からの110の乳サンプルについての研究で、これらのサンプ
ルが研究室に到着した際、その13%が平均2×10’微生物/mlを含み、C
MPは一当たり5μg以上含有した。
+4°Cで2日間保存後、平均微生物数は、4X10@微生物/−に増加し、こ
のサンプルの26%がCMPを一当たり5μg以上含有した。
加えて、9UHT乳サンプルを遠心分離前後に実験する。そしてその脱安定化を
評価する遠心分離後安定性が残ったサンプルは60〜100°Cに加熱し、その
非安定化温度を記した。
非常に脱安定化した乳は高いCMP濃度(〉80μg / d )で一方安定な
乳は一当たりCMPIOμg又はそれ以下を含むことが観察される。遠心分離後
に安定であるが加熱後に脱安定化される乳は、−当たりCM P 43.4μg
を含む。この結果は、CMPをアッセイして評価したに一カゼインの蛋白分解と
UHT乳の脱安定化の間の関係を明らかにする。
実施例5−この発明の抗体をチーズ中のCMPのアッセイとペプチドSεQ、
10 No、2に指向した抗体の種特異性の例証への使用実施例1に記載の方法
で作ったペプチドSEQ、 10 No、2に指向したウサギポリクロナール抗
体を用いる。
チーズ5gを0.05Mリン酸塩緩衝液pH7,2i0mj’での水性抽出をビ
ータ−を用いて混合して行う。牛CMPの存在又は非存在を、混合後に得た溶液
を遠心分離し、その水層について上記の阻止ELTSA法を用いて測定する。
結果は図2に示す。X軸は水性抽出物の希釈を示し、〔■〕ウシ、〔口〕ヒツジ
、(*)ヤギ、Y軸に0D450を示す。
配列のリスト
SEQ、 ID No、1ペプチド
牛乳のに一カゼインのアミノ酸106〜110Met−Ala−rle−Pro
−Pr。
SEQ、IONo、2ペプチド
牛乳のアミノ酸155〜164
Ser−Pro−Pro−Glu−11e−Asn−Thr−Val−Gln−
ValSEQ、 rD No、3ペプチド
牛乳のアミノ酸116〜125
Lys−Thr−Glu−11e−Pro−Thr−11e−Asn−Thr−
rleSEQ、 rD No、4ペプチド
牛乳のアミノ酸124〜133
Thr−11e−Ala−Ser−Gly−Glu−Pro−Thr−Ser−
ThrSEQ、ID、No、5ペプチド
牛乳のアミノ酸148〜157
Asp−5er−Pro−Glu−Valile−Glu−Ser−Pro−P
r。
SEQ、 10 No、6ペプチド
牛乳のアミノ酸106〜116
Me t −A la−r 1e−Pr o−P ro−Ly s −Ly 5
−Asn−G In−As p−Lys図1
一一一一州C7を
己2
補正書の翻訳文提出書
(特許法第184条の8)
平成、6年7月11a囚
Claims (15)
- 1.アミノ酸配列がCMP配列の少なくとも1つの断片からなり、そのペプチド が次の配列SEQ.IDNo.1【配列があります】からなるペチッドおよび次 の【配列があります】 (これらは、それぞれSEQ.IDNo.2,SEQ.IDNo.3,SEQ. IDNo.4とされる)の少なくとも5つの連続アミノ酸からなるペプチドから なる群より選択されることを特徴とする抗原ペプチド。
- 2.次の配列SEQ.IDNo.6 【配列があります】 から本質的になるペプチド、 次の配列 【配列があります】 の1つから本質的になるペプチドからなる群より選択されることを特徴とする請 求項1によるペプチド。
- 3.配列SEQ.IDNo.2,SEQ.IDNo.3,SEQ.IDNo.4 およびSEQ.IDNo.5の1つの少なくとも8つの連続アミノ酸からなるこ とを特徴とする請求項1によるペプチド。
- 4.付加的にC−末端にシステインを有することからなることを特徴とする請求 項1〜3の何れか1つによるペプチド。
- 5.請求項1〜4の何れか1つによるペプチド、そのペプチドとキャリヤー蛋白 との結合産物及びそのペプチドから誘導されたMAPsからなる群より選択され た少なくとも1つのペプチド又はペプチド誘導体を必須成分として含有すること からなることを特徴とする抗原組成物。
- 6.動物を請求項5による抗原組成物が免疫化する工程からなることを特徴とす る抗CMP抗体の製法。
- 7.抗原として請求項5による組成物を使用して得ることができることを特徴と する抗CMP抗体。
- 8.モノクロナール抗体であることを特徴とする請求項7による抗体。
- 9.ポリクロナール抗体であることを特徴とする請求項7による抗体。
- 10.配列SEQ.IDNo.1からなるペプチドに対し指向する特異性抗CM P抗体を検査すべき乳または乳製品と接触させる工程、この工程中に生成される 抗原/抗体コンプレックスを適当な手段で検出および/またはアッセイする工程 からなることを特徴とする乳または乳製品の蛋白分解を評価しうる方法。
- 11.使用する特異性抗CMP抗体が配列SEQ.IDNo.6のペプチド又は その断片の1つに対して産生されることを特徴とする請求項10による方法。
- 12.配列SEQ.IDNo.2のペプチド又はそのペプチドの断片に対して産 生された抗体と検査すべき乳または乳製品と接触させる工程、この工程中に生成 した抗原/抗体を適当な手段で検出および/またはアッセイする工程からなるこ とを特徴とする乳および乳製品中の牛乳CMPの存在を検出する方法。
- 13.請求項7〜9の何れか1つによる少なくとも一つの抗CMP抗体又は請求 項4による抗原組成物からなることを特徴とするCMPの検出・アッセイ用の試 薬。
- 14.請求項1〜4の何れか1つによるペプチドを抗CMP−抗体の製造への使 用。
- 15.請求項1〜4の何れか1つによるペプチドをCMPの検出および免疫アッ セイの試薬としての使用。
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