JPH07504038A - 白血球類縁体用の血液対照組成物，およびその調製方法および使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 白血球類縁体用の血液対照組成物； およびその調製方法および使用方法 本発明は、電気的および光学的手段を使用する装置用の参照白血球類縁体、この ための懸濁媒体、および対照生成物中の類縁体および懸濁媒体を調製および使用 する方法に関するものである。

医療血液学においては、長らく、品質管理が必要であり、通常の手順であり続け てきた。白血球の副集団中での区別を含む、赤血球および白血球の計数の正確さ は、部分的には、十分な対照生成物の使用に依存している。現在入手可能な、粒 子の計数用の多数の装置について、対照生成物を使用して品質管理することが必 要であり、なぜなら、この装置が誤動作する可能性がまだあるからである。自動 粒子計数装置用の品質管理プログラムを維持する伝統的な方法は、新鮮なヒト血 液を全血標準として供給することからなる。しかし、こうした新鮮な血液は一日 しか使用することができないため、従って、持続可能な血液生成物が開発された 。

血液細胞計数装置の正確さと精密さとを監視する、参照血液細胞類縁体を含有す る血液対照生成物が、特に重要である。こうした血液細胞計数装置を使用すると きに、白血球の区別および他のパラメーターの正確さを維持するための新しい参 照血液細胞類縁体に対して、要望が存在していることが分かる。

対照生成物は、新鮮な全血のものに対してできる限り近づいていなければならな い。ラグウィード（ｒａｇｗｅｅｄ＋ぶたくさの一種）の花粉、ポリスチレン、 ラテックス、種々の有機材料および固定化されたヒト赤血球を使用することによ って、安定なり濁液中に適当なサイズ（寸法）の粒子を与える試みがなされてき た。これらの懸濁液のいずれも、白血球の少なくとも四種の副集団の白血球の区 別に対して、対照生成物として使用することに適していないことが分かった。

品質管理を維持するのに使用する材料は、以下は血液対照生成物または対照生成 物と呼ぶが、特定の環境下には、血液装置を較正するのにも使用することができ る。本発明の目的のために、この対照生成物は、液状媒体中に懸濁された少なく とも１種の類縁体を含有しているであろうし、これは、分析すると、この装置が 分析する能力を有する血液の少なくとも一つの物理的または生物学的特性をシミ ュレートする。ここで使用したように、「類縁体」は、標的集団の有する少なく とも一つの物理的または生物学的特性をシミュレートする粒子として、定義する 。このように、自動機械の幾つかは、この対照生成物が他の機械による分析に対 して感受性の他のパラメーター成分を有していたとしても、対照生成物のある特 性だけしか分析することができない。これまでは、白血球の少なくとも四種の副 集団、即ち、リンパ球、単球、好中球および好酸球に対する検査をもたらす対照 生成物中で使用するためには、類縁体や懸濁媒体は開発されてきていない。

対照生成物が、目的とする測定に対して、新鮮な血液からなる試験試料が構成し ているものを、比較の基礎の上で正確に示さなければならないことは、明白であ る。この対照生成物が新鮮な血液をシミュレートすることが、いかに重要である かは更に明白であるが、なぜなら、赤血球のような血液成分は、血液供与体から 除去した後には、ゆっくりと溶血し、数時間のうちにサイズおよび形状が変化を 受けるからである。同様に、白血球は劣化的な変化を受ける。

一般的には、類縁体を製造するための従来技術の方法は、固定化に先立って赤血 球のもとの容積が維持されたまたは減少した赤血球を使用することに、焦点を合 わせている。固定化に先立って赤血球の浸透環境を操作することによる赤血球の 膨張または収縮は、その限界を有していた。以前は、非ヒト赤血球が約３０％か ら５０％以上膨張または収縮すると、この赤血球の過剰な細胞会合または溶菌が 引き起こされた。

ハント（ｌ（ｕｎＬ）の米国特許第３，８７３，４６７号が教示する血液参照対 照物は、ヒト血液の血漿を置き換える非タンパク質の水性懸濁液中に、洗浄され 、安定化されたヒト赤血球を含む懸濁液からなる。この参照対照物における安定 化は、これらの赤血球に球状をとらせる傾向のある材料の水性懸濁液中に包含さ せることによって赤血球を調整することによって達成されており、赤血球の平均 細胞容積に大きな変化をもたらすことはなく、しかも時間によって劣化する通常 の傾向に対してこれらの赤血球に耐性を与えている。この水性懸濁液は、更に、 赤血球に対して、生体活性を阻害する環境を与える。好適例においては、この参 照対照物中に、実質的に増大した平均細胞容積を有するように処理された、固定 化された少量のヒト赤血球が、更に含まれている。この固定化された赤血球は、 細胞の容積の変化に対して耐性があり、この安定化された赤血球の溶菌を生じさ せる溶菌剤の作用の下で溶解に対して耐性がある。この参照対照物中の固定化さ れた赤血球は、ヒト血液中の白血球集団を置換する。

カーブ７−　（（ａｒｖｅｒ）等の米国特許第４．７０４，３６４号においては 、ｒｃ。

ＵＬＴＥＲＣ０ＵＮＴＥＲ＠　Ｍｏｄｅｌ　Ｓ　Ｐｌｕｓ　Ｔｙｐｅ　Ｊ分析装 置によって典型化された電子的粒子計数装置用の、しきい値と更なる操作特性と のための対象物が開示されている。しかし、現在は、このｒｃＯＵＬＴＥＲ＠　 Ｖ　ＣＳ　Ｊ分析装置によって典型化された電子光学的粒子計数装置用の全血液 細胞対照生成物に対して、要望がある。この「■Ｃ３」分析装置によって、白血 球の少なくとも四種の集団の区別が可能になる。

ヒト白血球を自動的に区別して計数する装置であって、白血球の少なくとも四種 の集団を、血液中の他の細胞から、サイズの範囲、容積の分布、光の散乱の範囲 、および電気的な不透明性および伝導の感度に基づいて識別する、あらゆる装置 は、この対照生成物が、正常なヒト血液中の各細胞の前記の範囲、分布および感 度特性を正確にシミュレートすることか必要である。この問題は、所定のサイズ 、容積および光散乱特性を有する細胞を、商業的に入手するのに十分な再生産可 能な量で、自動電子光学的粒子計数装置用の対照生成物中に使用するために、正 確に生産しつるであろう方法を発見することである。

ヒトリンパ球、単球、好中球、好塩基球および好酸球は、特定のサイズの分布範 囲および光学特性を有しており、安定化（例えば、グルタルアルデヒドのような 固定化剤による）の後には、懸濁媒体中のこれらの反応性によって、適当な識別 をすることはできない。このため、装置の作動状態について適当な評価をするこ とができなくなるという結果になる。白血球の各集団に対する、サイズの上限と 下限との双方は、参照対照生成物中に存在していなければならない。更に、この 対照生成物中の各白血球側集団の平均細胞容積は、正常なヒト血液の平均細胞容 積に近くなければならない。更に、対照生成物用の液状懸濁媒体は、細胞の顕著 な収縮または膨張を引き起こしてはならない。更には、この対照生成物の老化に よって、容積分布ヒストグラム特性または他のパラメーターに、劣化がもたらさ れてはならない。複数パラメーター装置用の対照生成物中の白血球類縁体につい ての更なる要求として、計数されて識別されるためには、この全血対照生成物中 の類縁体細胞が、溶菌剤によって完全に溶菌されてはならない。

種々の媒体が、血液細胞類縁体と共に使用されてきた。米国特許第４．２９９゜ ７２６号においては、多目的の希釈液と媒体とが開示されている。この希釈液は 、赤血球を予備調整するのに使用されており、実質的に、乳糖、アジ化ナトリウ ムおよび非イオン性界面活性剤からなっており、ｐＨ調整されており、浸透圧が 調整されている。この媒体は、全血対照生成物の担体として使用されており、乳 糖、殺菌剤および抗生物質を含んでいる。また、これは、赤血球膜を変化させる 他の成分をも含んでおり一胆汁塩およびコール酸誘導体、抗ヒスタミン特性を有 するフェノチアジン化合物およびその塩、および局部麻酔特性を有する４−アミ ノ安息香酸エステル誘導体およびその塩を含んでいる。

従来技術の媒体の不利益の一つは、赤血球および固定化されたヒト白血球または 白血球類縁体と共に使用するときに、この対照生成物が、白血球の少なくとも四 種の副集団を識別する装置内において、全血試料をシミュレートしないことであ る。測定が望まれる赤血球および白血球の特定のパラメーターが、全血参照対照 生成物用に適した媒体の必要な特性の幾つかを決定する。この赤血球の容積を知 ることか望ましい。ひとたびこの測定が確定し、この赤血球を計数すると、バッ クされた赤血球の容積またはヘマトクリットを算出することができる。従って、 この対照生成物の懸濁媒体は、この試料中の赤血球の容積を平衡させ、安定化さ せる能力を有していなければならず、これによってその平均細胞容積（ＭＣＶ） を測定することができる。

また、対照生成物は、ヒト血小板のサイズおよび分布のしきい値に対して低いサ イズのしきい値で干渉をおそらく示すであろうあらゆる粒状物質からも、遊離さ れていなければならない。付随的に、この懸濁媒体は、必要に応じて、対照生成 物をパッケージングした後に微生物の成長を防止するために、静菌剤を含有して よい。

赤血球（エリスロサイト）と白血球（ロイコサイト）とは、名目上は異なるサイ ズを有しているけれども、これらのサイズの範囲は重複する傾向があり、または 少なくとも特定の健康状態の下ではｉ！ｒｕｌシつる。更に、これら二つの型の 血液細胞の不透明度もまた重複しうる。赤血球とリンパ質白血球とは、不幸にも 細胞のサイズにおいても顕著に重複しており、サイズの識別のみによって、他方 が存在しているときに一方を計数することは、実際的ではない。伝統的なプラク ティスでは、この赤血球をストロマドライズする強力な溶菌剤を使用し、これら を非常に小さな粒子にまで縮小させるか、または膜の溶解を生じさせ、これらを 計数から取り除き；およびこの白血球からの細胞質のすべてではないとしてもそ のほとんどを剥離させ、計数すべき白血球の溶菌耐性核のみを残す。もとの白血 球細胞容積が劇的に影響を受け、最小限まで減少するので、この古い形の血液細 胞のサイズの分析によっては、一つの白血球集団のみしか識別することができな い。

米国特許第３．７４１．８７５号〔アンズレ−（＾ｎ５ｌｅｙ）等〕には、識別 的な白血球計数を得る方法が記載されている。ホルムアルデヒドのようなモノア ルデヒドである細胞固定化剤を、血液試料に加える。この固定化工程の後に、溶 血剤を添加し、赤血球にそのヘモグロビン成分を溶液中へと放出させる。特異的 な細胞化学基質、色素形成沈殿カップリング剤、およびｐＨ緩衝液を添加するこ とによって、固定化酵素を含有する特定の型の細胞内に不溶性の染料の堆積が引 き起こされる。次いで、この染色された血液細胞を含有する溶液を、測光計数装 置に通過させる。特定の種類の細胞に含有されている異なる酵素に対する、異な る特異的基質を使用して、これらの異なる種類の細胞の絶対および相対計数が得 られる。この細胞固定化溶液は、モノアルデヒドのみを使用している。ジアルデ ヒドは、架橋して細胞外沈殿物を生ずるので、不適当であると述べられている。

米国特許第４．４８５．１７５号〔ルディス（Ｌｅｄｉｓ　）等〕は、白血球の リンパ球、卓球および顆粒球集団の三つの容積を識別する測定方法および試薬系 に関するものであり、溶菌剤としての四級アンモニウム塩とｒｃＯＵＬＴ［！Ｒ Ｃ０ＵＮＴＥＲＪＭｏｄｅｌ　Ｓ　ＰＩｕｓＪ自動血液計数装置とを使用してお り、この装置は直流電界励起のみを採用している。

米国特許第４．７５１．１７９号〔ルディス（Ｌｅｄｉｓ　）等〕に記載されて いる試薬系は、溶菌剤中にサポニンを含有しており、固定化剤としてグルタルア ルデヒドのような活性が迅速な架橋剤を含有しており、これが再生産可能に全血 に対して影響してこれらの赤血球をストロマドライズさせ、白血球を変化させて 、フロー分析装置による検出および分類のために四種の識別可能なりラスターを 定収するデータを生じさせる。これらのクラスターは、血液中に見いだされる四 種の主要な白血球型、リンパ球、単球、好中球および好酸球を示しており、従っ て、白血球を識別して分析する方法を提供している。ルディス等によれば、直流 、容積、または種々の角度での光の散乱を利用する従来のフロー分析方法は、白 血球のうち、リンパ球、単球および顆粒球に対応する、三種の集団のみを示して きた。

白血球を分類するために、ルディス等によって使用されたパラメーターには、直 流（クールター）容積、高周波（ＲＦ）サイズ、クールター不透明度（ｏｐａｃ ｉＬｙ：ＲＦサイズ／ＤＣ容積）、種々の角度での光の散乱および種々の波長の 照射に対する蛍光のうち、２つ以上の組み合わせが含まれる。

このクールター原理を採用した電子的計数装置は、最初には米国特許第２，６５ ６．５０８号に記載されているが、粒子の計数を正しく反映している。このクー ルター原理によれば、顕微鏡的サイズの粒子が電界液中に懸濁されている場合に は、電界液が、粒子の寸法に近いオーダーの小寸法の電界を通過すると、この電 界の電気的インピーダンスに瞬間的に変化が生ずるであろう。もしこの電界が直 流（ＤＣ）または低周波電流によって励起されていると、この電気的変化は、粒 子の容積に対する比例値に近づく。商業的な装置においては、この変化を、幾つ かの適当な手段によって検出し、計数装置および分析装置を作動させるのに利用 する。この装置と連結された分析装置は、粒子の容積に基づいて粒子を分類して 寸法に基づいて集団へと分級し、得られたデータを記録する。

このクールター原理による発明は、米国特許第３．５０２，９７４号（クールタ ー等）において重要な拡張をされており、直流電界励起に加えてラジオ周波数（ ＲＦ）電流を使用して、研究している粒子に関する直流容積情報をもたらすだけ でなく、この粒子を構成する材料の組成および特性についての情報をももたらす 。この特許で開示されている装置は、サイズが同じであっても、異なる材料から なる粒子を、識別することができる。低周波または直流（ＤＣ）とラジオ周波数 （ＲＦ）電流励起との双方によって電界を感知する粒子を生じさせることによて 、二種以上の互いに相関する出力信号が、この電界を一つの粒子が通過すること によって、引き出されつる。これは、血液細胞のような粒子が、低周波または直 流電界に対しては常にほぼ絶縁体であるけれども、これらは周囲の電解質とは異 なってラジオ周波数電流を伝搬または阻害しうるという事実に基づく。これは、 均一な粒子の場合には誘電体定数の相違に基づいているであろうし、または血液 細胞が、極端な薄膜中に包含されていて、電解質とは異なる導電性を有する内容 物を有している場合には、サック状構造に基づいているであろう。従って、すべ ての直流電流か血液細胞の周辺に行く一方、ＲＦ電流の幾らかは血液細胞を通過 するであろう。ＲＦＷ流か粒子を通過する容易さは、光の透過との連想から、そ の「電気的透明度ｊまたは単に「透明度」と呼ばれているものの測定であり；こ の一方、ＲＦｉｌ流を妨げる粒子の能力は、その［不透明度：　ｏｐａｃｔｔｙ 　Ｊと呼ばれている。後者の文献においては、「不透明度」は、ＤＣインピーダ ンスによって除したＲＦインピーダンスとして定義されている。

粒子の相対的な電気的不透明度は、その粒子の内容物、従って、分類目的のため のその粒子の型を同定できる特徴になっている。異なる型の粒子がそれぞれ異な る不透明度を有している限りにおいては、これらの間の相違を検出することがで きる。しかし、顕著に異なる粒子が、はぼ同し不透明度を有しうることがあり、 この方法でこうした粒子を仲効に分類することはできない。米国特許第３，８３ ６．８４９号（クールター等）において、粒子の処理によって粒子型の不透明度 を選択的に変化させて検出可能な変化をもたらしうることが、教示されている。

ｒｃＯＬＩＬＴＥＲＣ０ＵＮＴＥＲ＠　Ｍｏｄｅｌ　Ｓ　ＰＩｕｓＪ自動血液細 胞計数装置は、等張希釈液中で全血試料を希釈し、溶菌剤を添加し、この少し後 に計数を開始するように、設計されている。従って、希釈−溶菌糸は、この溶菌 時間の間に、赤血球（エリスロサイト）の完全なストロマトライゼーシジンを実 施するのに十分に急速な、赤血球溶菌反応速度を提供しなければならない。更に 、白血球の容積における変化は、このデータ収集工程の間は最小限にしなければ ならず、理想的には数分間の間安定でなければならない。

ｒｃＯＵＬＴＥＲＭｏｄｅｌ　ＶＣ３Ｊは、半自動化された分析装置であり、Ｄ Ｃ（クールター）容積、クールター不透明度および種々の範囲の角度での光の散 乱を利用することによって、血液を分析している。このｒｃＯＵＬＴＥＲＭｏｄ ｅｌＶＣ３Ｊが利用する試薬系は、全白血球計数中で五つの部分の識別が得られ 、リンパ球、単球、好中球、好酸球および好塩基球集団の定量的分析をもたらす 。この試薬系は、弱い「酸性」溶菌の後に添加されるクエンチを含んでおり、こ の作用が白血球に対する溶菌作用を大きく減少させる。このクエンチの少し後に 、この装置は、残留する白血球の容積、不透明度および光散乱特性の測定を開始 する。このｒＭｏｄｅｌＶＣ３Ｊは、この溶菌時間の間に、赤血球の完全なスト ロマトライゼーションを実施するのに十分に急速な、赤血球溶菌反応速度を提供 しなければならず、この一方、白血球の容積、クールター不透明度および光散乱 特性に関して、白血球細胞に影響してはならない。ｒｃＯＵＬＴＥＲＣ０ＵＮＴ ＥＲ＠Ｊ装置は、これによって本発明を実施することができるのは、この［■Ｃ ３］　「５ＴＫＳ」およびｒＭＡＸＭＪである。しかし、このモデル「Ｓノおよ びｌ５−ＰｌｕｓＪ型は、全血対照生成物中に存在している本発明の白血球類縁 体の副集団のすべてを識別することはできないが、しかしむしろ白血球類縁体の 全計数をもたらすことができる。このｒＳ−ＰＩｕｓＪ型のあるものは、更に二 種の白血球側集団を識別することができる。

新しい電子光学的粒子計数装置は、全血試料を更に近くシミュレートする安定な 全血対照生成物のための、白血球類縁体および懸濁媒体を提供することを必要と する。本明細書は、主としてこのｒｃＯＵＬＴＥＲ■」型の粒子計数装置につい て有用な血液対照生成物の例に関するものであろうけれども、本明細書で開示し た懸濁媒体、類縁体および対照生成物、および本明細書に記載したこれらの使用 方法は、一般的に粒子計数装置について、広範な応用を見い出していることを、 理解すべきである。従って、この用語「電子光学的粒子計数装置」は、ｒｃＯＵ ＬＴＥＲＣ０ＵＮＴＥＲ＠Ｊ装置に加えて、粒子のサイズ、重量、容積、不透明 度または光の散乱を示す信号に対して電子的に応答する電子的識別回路（しきい 値）を使用することによって、種々のサイズの粒子を識別する、あらゆる他の型 の粒子計数装置をも含んテイルコとを理解するべきである。ｒｃＯＵＬＴＥＩＩ 　ＪおよびｒｃＯｌｌＬＴＥＲＣ０ＵＮＴＥＲＪは、クールター社の登録商標で ある。

本発明に従って提供する血液対照生成物は、処理された血液細胞が血液試験方法 において使用する溶菌剤による劣化に対して耐性であるように処理された処理血 液細胞を何しており、この対照生成物が、少なくとも二種の異なるヒト白血球を シミュレートし、それぞれがヒト白血球の少なくとも二種の物理的特性を有して おり、これらの特性が、ａ、直流電流によって測定された容積、ｂ、高周波（Ｒ Ｆ）サイズ、Ｃ１不透明度、およびｄ、光散乱からなる群より選択されているこ とを特徴とする。

本発明は、粒子計数装置内で使用するための、血液対照生成物に関するものであ る。本発明が提供する新規な対照生成物は、種々の装置内で使用するための液状 媒体中に一種以上の血液細胞類縁体を含有しており、好ましくは、この装置が少 なくとも四種の異なる白血球集団を識別することができる。この対照生成物は、 血液試験方法において使用する溶菌剤による劣化に対して耐性であるように処理 された処理血液細胞を含有しており、ここで前記の対照生成物が、ヒト白血球の 少なくとも二種の物理的特性をシミュレートし、これらの特性が、直流電流によ って測定された容積、高層ｌ！１（ＲＦ）サイズ、不透明度、および光散乱から なる群より選択されている。更に好ましくは、前記対照生成物が、ヒト白血球の 少なくとも二種の物理的特性をシミュレートし、これらの特性が、光の散乱と、 容積、サイズおよび不透明度からなる群より選択された特性とからなる。

これらの白血球類縁体を製造するには、赤血球を低浸透圧溶液と混合して赤血球 の容積を膨張させ、この赤血球のヘモグロビン内容物を変化させて、ヒト白血球 の光散乱および不透明度特性をシミュレートさせ、および、これらの細胞を固定 化することによって血液試験方法において使用する溶菌剤による劣化に対して耐 性であるようにし、この固定化された細胞が、ヒト白血球と同様に、直流電流に よって測定された容積、高周波（ＲＦ）サイズ、不透明度および光散乱特性から なる群より選択されている、少なくとも二つの特性を有している。この好酸球血 液細胞類縁体を製造する方法は類似しているが、しかしこのヘモグロビン内容物 の変化は、細胞から内容物を漏出させるよりも、むしろ細胞内で内容物を変性す ることによって、達成する。この更なる態様が、ヒト白血球の容積および光散乱 特性を有する類縁体をもたらす。

これらの独自な類縁体は、光散乱、不透明度および容積の測定を利用してヒト白 血球集団の間で識別を行う装置内で、ヒト白血球をシミュレートする白血球類縁 体を含有する血液対照生成物として、特に応用を見いだす。

更に、本発明は、粒子計数装置内で使用するための少なくとも一種の白血球類縁 体を含有する、血液対照生成物を使用する品質管理方法に関するものである。

この方法は、自動装置内に血液対照生成物を配置し、この血液対照生成物が、処 理された血液細胞に由来する少なくとも一種の白血球類縁体を含有しており、こ こで前記の対照生成物が、ヒト白血球の少なくとも二種の物理的特性をシミュレ ートしており、これらの特性が、直流電流によって測定された容積、高周波（Ｒ Ｆ）サイズ、不透明度、および光散乱からなる群より選択されており、この対照 生成物の前記物理的特性を測定し、および、自動装置内でのこの測定の結果を記 録して、この装置が仕様書の範囲内で機能しているかどうかを測定することを含 む。

白血球集団を多重的に分析する現代の方法は、品質管理として使用するための、 特定のサイズおよび容積増加および特定の光散乱特性を有する類縁体を必要とし ている。従って、電気光学的粒子計数装置のしきい値の設定を検査するために、 少なくともリンパ球、単球、好中球、および好酸球を含む主要な白血球成分の各 々に対して、類縁体を調製することが、現在は必要である。これに先立って、容 積の増加が、光の散乱の増加と相関しており、この光散乱が、ヒト白血球以外か ら、少なくとも四種の異なる集団の白血球類縁体を調製することを妨げている。

本発明は、多くの型の血液計数装置についての多数のしきい値の設定に適合する ように、異なる源からの血液細胞を処理する方法を提供する。血液細胞の選択に 際しては、主要な制限は、もとの細胞の平均細胞容積であり、なぜならこれが所 望の類縁体の平均細胞容積に関係しているからである。本発明の範囲を制限する ことなしに、他の動物からの赤血球および白血球も本発明において使用できると いう理解の下に、特定の参照を、特定の動物からの赤血球に対して行う。

一つの態様においては、本発明によって、赤血球をもとの容積の５０％以上膨張 させることが可能になり、これによって所望の類縁体を製造するのに動物細胞の 選択を広い範囲で行える。好適な態様においては、これらの赤血球が、そのもと の容積の７５％以上膨張する。

本発明の好適な態様を目的として、発見したところでは、七面鳥、鶏、アヒル、 および好ましくはガチョウの赤血球のような家＾の赤血球を、アルデヒド安定化 工程に供して、より小さなリンパ球類縁体を生産する。また発見したところでは 、「魚類Ｊ、特に鮫族の種や、爬虫類、好ましくはアリゲータ−（アメリカわに ）を含む、他の非ヒトを椎動物が、適当に処理したときには、より大きなサイズ のヒト単球、好中球および好酸球に類似した類縁体をもたらす、所望のサイズの 範囲の赤血球を有している。これらの赤血球は、一般的には、優秀な懸濁安定性 を示し、高度に再生可能な容積分布特性を有している。しかし、適切な費用で量 を入手できることといった考慮を行わなければならない。

これらの安定化された赤血球類縁体細胞は、対照生成物中でヒト赤血球細胞に対 する、満足できる代替物を提供する。更に、この赤血球を固定化することによっ て、全血対照生成物中で白血球のパラメーターを測定するときに、血液試験方法 において使用する溶菌剤による劣化に対して耐性であるようにしている。

１−リ、アリゲータ−およびナースシャークの細胞を核形成するが、しかし核が 存在していることは、ヒト白血球の代替物としてこれらを使用するのに不可欠で もなければ、不利益でもなく、赤血球の制御された溶血を可能とする本発明の方 法を提供する。細胞中の、好ましくは２０〜８０重量％、および最も好ましくは ３０〜７０重量％のヘモグロビンが、放出される。更に、これらの細胞を、有機 アルデヒドのような固定化剤によって安定化し、固定家財が細胞膜の破壊を防止 し、更にヘモグロビンの損失を防止する。

更に本発明か体現している組成物を製造するには、固定化されたガチョウ赤血球 の懸濁液を混合してヒトリンパ球をシミュレートし、固定化されたアリゲータ− 赤血球の懸濁液を混合してヒト単球、好中球、および好酸球をシミュレートし、 すべてを懸濁媒体中に集め、ヒト白血球をシミュレートする単独の組成物を提供 するような割合で混合する。次いで、この白血球類縁体組成物を、溶菌可能なヒ ト赤血球、および安定化された血小板または血小板類縁体と混合し、単独の多重 分析対照生成物を提供する。

この収集工程において、赤血球を、生理食塩水（塩化ナトリウム）中に溶解され たエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のアルカリ金属塩のような抗凝固剤 中に懸濁する。他の抗凝固剤や塩類も、不適当な溶血や細胞の会合を引き起こさ ない限りは、働くであろうことを意図している。

新鮮な赤血球を洗浄して供与体特異的な血漿蛋白質を除去しなければならない。

これは、複数の血液細胞供与体からの赤血球を混合するときに、細胞が凝集する 可能性を減少させるであろう。これらの細胞を一緒にプールし、均一な組成物を 得る。

この細胞のプールを処理剤としての血清物質によって、予め処理することができ る。この血清物質を予備処理することによって、細胞の破裂を引き起こすことな しに、細胞を膨張させることができる。この赤血球を低浸透圧環境に晒すことに よって、その平均細胞容積を増大させ、その光散乱ヒストグラムの幅を減少させ るという主要な効果がある。細胞の溶質１度から減少した溶質１度を有している 低浸透圧環境の結果として、この赤血球のサイズが増大する。この細胞の内側で の溶質濃度がこの細胞の外側の溶質濃度よりも大きいときには、平衡濃度へと向 かって水が細胞中へと移動する傾向がある。このようにして、細胞の内側での水 の移動が膨張を引き起こす。この低浸透圧環境としては、所望の溶質１度を提供 できるような、ナトリウム化合物、カリウム化合物、またはナトリウムおよびカ リウムの双方、または本分野に習熟した者に知られている他の組成物の溶液を挙 げることができる。

この血清物質は、血清脂質の水溶液を含有している。ここで定義したように、血 清脂質は、コレステロール、コレステロールエステルおよび血清血漿中に見いだ される一種以上の他の化合物と結合されたコレステロールおよびこれらの混合物 を含有している。好ましくは、こうした他の化合物は、更にリポタンパク質、リ ン脂質およびこれらの混合物を含有している。本分野に習熟した者であれば理解 できるように、典型的には、コレステロールが約３０％のエステルを含有するで あろう。更に本分野に習熟した者であれば理解できるように、このリポタンパク 質は、水溶液中にコレステロールを維持していることが必要である。好ましくは 、予備処理中の血清物質は、コレステロール、コレステロールエステル、リポタ ンパク質コレステロール、リポタンパク質コレステロールエステル、リン脂貿と 結合されたコレステロールおよびこれらの混合物からなる群より選択する。更に 好ましくは、この血清物質は、リン脂質と結合しているコレステロールである。

こうした最も好ましい態様の商業的に入手可能な例は、マイルズ社（Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ、）によるｒＰｃｎｔｅｘ＠　コレステロール　スーパートレード」であ り、これは高富度すポタンパク質コレステロール、およびリン脂質と結合したり ボタンバク質コレステロールエステルである。このように、より小さな細胞を、 そのもとの容積の３０％から５０％以上膨張させるためには、この予備処理が必 要である。更に信じられているところでは、使用した血清物質の１度は、低浸透 圧溶液によって生した細胞の膨張量の関数であると共に、細胞ヘモグロビンが細 胞から漏出するのを可能とする固定化反応の工程条件の関数でもある。室温で主 としてアルデヒドの１度によって約２時間以下で細胞を固定する工程においては 、この低浸透圧が約１５０Ｗｉｌｌｉｏｓｍｏｌｅよりも大きいときには、予備 処理は不要なように見える。この予備処理を使用するときには、コレステロール の濃度は、１ミリリツトル当たりｌＸｌ０’個の細胞の細胞計数に対して、０． 　１〜５．０ミリグラムであることか好ましい。採用したコレステロール濃度が 高すぎる場合には、そのときには細胞か溶菌する傾向か生じうる。採用したコレ ステロール濃度が低すぎる場合には、細胞が膨張するときに破裂しつる。

細胞を破裂させることなしに細胞を膨張させる従来技術の試みは、細胞膜を強化 するように作用する、酒石酸カリウムナトリウムのような処理剤を使用すること に焦点か当てられていた。しかし、このアプローチによっては、予期される３０ 〜５０％以上の膨張は可能にはならないし、調節された溶血に対して細胞を供す ることもできない。

本発明を、一工程のプロセスによって細胞を同時に膨張および固定化するという 態様において開示したけれども、二以上の工程を採用することによって、細胞を 血清物質によって予備処理し、細胞を膨張させてヘモグロビンの調整された放出 を可能とし、この後に細胞を固定することは、本発明の意図の範囲内である。

しかし、この手順は、各工程におけるプロセスの条件の調節、更に詳しくは、血 液細胞を固定するタイミングの調節という問題を有しているものと予期すること かできる。本発明の方法の好適な態様においては、リン酸ナトリウムの水溶液を 、固定化剤と混合して所望の浸透圧とすることによって、低浸透圧溶液を生じさ せる。自然血液の正常な緊張力に対してこの浸透圧が低いほど、細胞の内側から 細胞の外側へと水が移動することに部分的に起因して、細胞が更に膨張するであ ろう。この浸透圧は、初期細胞サイズ、細胞計数、および所望の最終細胞サイズ に依存して、０〜Ｉ　５０ｍ１ｌｌｉｏｓ＋＊ｏｌｅで変更することが好ましく ；好酸球類縁体に対しては６５〜９５劃１１ｉｏｓｍｏｌｅとすることが更に好 ましく；単球類縁体に対しては０〜２０ｍｉｌｌｉｏｓｍｏｌｅとすることが更 に好ましく；リンパ球類縁体に対しては５〜３５ｍ１１１ｉｏｓ＋５ｏｌｅとす ることが更に好ましく；好中球類縁体に対しては４５〜６５ｍ１ｌｌｉｏｓ曽ｏ １ｅとすることが更に好ましい。上記の好ましい範囲は、等張塩溶液によって洗 浄された血液細胞に基づいており、更にはｉミリリットル当たり約２０．０００ 〜５０．０ＯＯＷの細胞の固定化反応物中の細胞計数に基づいている。

これに伴って、温度は、細胞の膨張速度に対して独立して影響をしているように は見えないが、しかし固定化反応の速度に対しては影響している。この細胞が膨 張するのにつれて、ヘモグロビンが、調整された速度で、この固定化反応が更な るヘモグロビンの漏出を防止するまで、細胞の外へと漏出する。このヘモグロビ ンの大部分は、低浸透圧処理の後、最初の五分間の間に放出されるであろう。

従って、細胞を同時に膨張および固定化させる際には、溶液中での固定温度を低 くすることにより、細胞が膨張している時間の間、固定化プロセスとヘモグロビ ンの放出速度との調整が可能になる。固定化反応が終了したときには、血液試験 手順において使用される通常の溶菌剤の影響下で溶解または劣化に対して細胞が 耐久性となる。

更に好ましい態様においては、血液細胞を、グルタルアルデヒドを含有する冷却 等張溶液へと添加する。この冷却された固定化溶液は、０℃から１５℃の温度で あり、更に好ましくは、１℃から１０℃の温度である。最も好適な態様において は、この固定化処理は、リンパ球および卓球類縁体に対しては２℃〜８℃で行い 、好中球および好酸球類縁体に対しては室温で行う。この温度の低下によって、 ｒｃＯＵＬＴＥＲＣ０ｔｌＮＴＥＲ＠　Ｍｏｄｅｌ　ＶＣ３Ｊ分析装置のような 、分級装置上で測定したときに、定量的に異なった細胞がもたらされることが示 された。この定員的な相違には、室温での固定化と比較して、より大きな平均細 胞容積と、より低い光散乱とが含まれる。

膨張した細胞を固定化することは、細胞膜を強化し、この膜の劣化を防止するた めに、重要である。これは、ホルムアルデヒドのようなモノアルデヒド、または グルタルアルデヒドのようなジアルデヒドを含む、有機アルデヒドの溶液に対し て細胞を接触させることによって、達成される。グルタルアルデヒドか好ましい アルデヒドであるが、なぜならホルムアルデヒドよりも急速に体心するからであ る。グルタルアルデヒドをその最終濃度よりも高い１度で添加することができ、 ただしこの最終濃度が、１マイクロリツトル当たり約２０，０００〜５０．００ ０個の細胞の細胞計数に基づいて、約０．０５％〜０．８％の範囲内にあり、更 に好ましくはＯ】％〜０，６％の範囲内にある。適当なアルデヒドおよびその１ 度の選択についての実際的な限定は、細胞数、不適当な細胞の会合の防止、およ び固定化反応を調節するパラメーターとしての機能的限定である。この固定化反 応の条件は、使用する特定の動物細胞と、製造した白血球類縁体とによって、変 更されるであろう。

グルタルアルデヒドによる室温での固定化反応のほとんどは、工時間以内に起こ るけれども、赤血球を、ｒｃＯＩＪＬＴＥＲＣ０ＵＮＴＥＲＪ　Ｉｆｌｌ液装置 内において使用する通常の赤血球溶菌剤に対して全体として耐久性にするには、 更に時間が必要である。

赤血球を注意深く選択して、グルタルアルデヒドの固定化のための時間の長さは 、温度、グルタルアルデヒドの１度、細胞数および放出されるヘモグロビンの所 望量に依存して、２〜７２時間、好ましくは３〜３０時間の間で変動しうる。最 も好適な態様においては、１マイクロリツトル当たり約２０．０００〜５０，０ ００１１１ｉｌの細胞の細胞ＪＪ数に対する固定化時間は、単球およびリンパ球 類縁体に対しては１０〜２４時間であり、好酸球および好中球類縁体に対しては ３〜１８時間である。アンダーフィクゼーンヨンは、標的であるヒト白血球集団 に対する平均細胞容積よりも小さな平均細胞容積を有する部分的に固定化された 赤血球をもたらしうる。一般的には、固定化時間の上限は、製造上の便宜に基づ いている。固定化の後には、細胞を遠心分離またはグラビテー７シン手段によっ て液相から分離し、次いでリン酸緩衝溶液によって洗浄する。

この固定化溶液のｐＨは、７．０〜９．０で変動する。もしこの固定化溶液のｐ Ｈか低すぎると、凝集が生じつる。もし高すぎると、細胞が破裂しうる。更に、 このｐＨは、ヘモグロビンの放出に影響する。もしこの固定化反応の生起が急速 すぎると、細胞かヘモグロビンを放出することができないであろう。従って、本 発明によって、このｐＨの範囲を、約７．９〜９．０とし、好ましくは７５〜８ ５とする。最も好適な態様においては、この固定化溶液のｐＨは、好中球および 好酸球類縁体に対しては８．０±０．２であり、単球およびリンパ球類縁体に対 しては７．８±０．１である。

同様の方法において好酸球類縁体を製造するが、ただし、等張グルタルアルデヒ ド溶液か好ましくは室温であり、この等張グルタルアルデヒド溶液を最初に使用 して、この細胞を完全に固定するよりも、血液細胞中でヘモグロビンを軽く架橋 させる。このようにして、１マイクロリツトル当たり約２０，０００〜５０゜０ ００個の細胞の細胞３１数に対するグルタルアルデヒドの濃度は、約０．　１〜 ０゜４％の間であり、更に好ましくは０．２〜０．３％の間である。ヘモグロビ ンを軽く架橋させ、リン酸緩衝溶液によって洗浄した後に、これらの細胞を、四 級アンモニウム化合物のようなタンパク質変性剤、または本分野に習熟した者に 既知の他の変性剤によって更に処理することで、細胞の内部にヘモグロビンを沈 殿させる。この変性溶液のｐＨは、９．０〜１２，０の間でなければならず、好 ましくはｌＯ１θ〜１１．０の間である。この処理によっては、細胞の容積は減 少しない。このタンパク質変性剤による処理によって、膨張した細胞の光散乱特 性が増大し、ヒト好酸球に類似した必要な光散乱特性を有する膨張細胞が得られ る。

このヘモグロビンの変性と、ヘモグロビンの調整された放出との双方は、細胞中 のヘモグロビン組成物を変化させる能力を有している。しかし、光散乱特性は、 単球およびリンパ球類縁体中におけるヘモグロビンの調節された放出と、好酸球 類縁体中のヘモグロビンの変性との間で、顕著に異なっている。一般的に、細胞 からのヘモグロビンの漏出は、細胞の光散乱と不透明度とを減少させる。細胞中 のヘモグロビンを変性させることは、細胞の光散乱を増大させうる。

好酸球類縁体を製造するのに好ましい方法は、赤血球プールを水性血清物質で前 処理し、細胞を膨潤させ、細胞中のヘモグロビンを変性させ、細胞を固定するこ とを含む。当業者に知られているように、血清物質による前処理を必要とする膨 潤の量を必要としない適切な大きさの赤血球を選択することができることは本発 明から予想される範囲内である。このような場合において、方法は、細胞中のヘ モグロビンを変性させてヒト白血球の光散乱特性を擬態させ、血液学的試験手順 において用いられる溶解剤による劣化に対する耐性を有するように細胞を固定す ることを含む。このようにして、処理した赤血球は、ヒト白血球に類似した光散 乱および容積特性を有する。しかし、細胞がある程度まで膨潤されない場合には 、赤血球が自然な球形によらないため、光散乱の標準偏差は標的細胞集団の限界 内ではないことが予想される。球形化剤を用いることにより、この困難を除去す ることができる。

上記した加工手順、細胞の膨潤の組み合わせ、細胞からのヘモグロビンの浸出、 細胞中のヘモグロビンの変性および、当業者に知られている方法による細胞の収 縮を用いることにより、複数の異なる物理的パラメータであるり、Ｃ，容積、Ｒ Ｆサイズ、透明度および光散乱を有する類縁体を設計する方法を有効に提供する ことができる。さらに特に、細胞の収縮および膨潤は上記したパラメータのすべ てに影響しうる一方、細胞中のヘモグロビンを変化させることは、ＲＦサイズ、 透明度および光散乱特性に影響しつる。

基準赤血球対照生成物は、１つ以上の白血球類縁体を含むことができる。白血球 類縁体を、任意の適切な懸濁液媒体中に貯蔵することができる。このような媒体 の例は、リン酸緩衝塩性溶液および血漿物質の水溶液を含む。ここで定義した血 漿物質の水溶液は、血清物質の水溶液（前記したように）、血清物質と血漿タン パク質との組み合わせおよびこれらの混合物を含む。さらにここで定義する血漿 タンパク質は、血漿中に含まれる１種以上のタンパク質を含む。好ましくは、こ のような血漿タンパク質は、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン、フィブ リノーゲンおよびこれらの混合物を含む。これらの媒体は、当業者に知られてい る他の成分を含んで長期間安定性が確実になる。適切な媒体の他の例は、米国特 許第４．２１３．８７６；４．２９９．７２６；４．３５８．３９４および３゜ ８７３．４６７号明細書にさらに十分に記載されている。

以下の特定の例は、米国特許第４．２９９．７２６号明細書に記載されているも のである： ２、　プロピルパラベン　０．３〜１．０　ｇ３、　メチルパラベン　０．５〜 １．０　ｇ４、　プロカイン塩酸塩　０．１〜０．５ｇ５、　デオキシコール酸 　０．１〜０．９ｇ６、　ラクトース　ｌＯ１θ〜５０．０　ｇ７、　アクチジ オン　０．１〜０．６ｇ８、　クエン酸三ナトリウムニ水和物　３．０〜８．０ ｇ９、　クエン酸−水和物　０．３〜０．９ｇ１０、リン酸二水素ナトリウム− 水和物　０．８〜２．５ｇ１ｔ　ツェナーガン塩酸塩　０．１〜１．０　ｇ１２ 、コリスチメテートナトリウム　０．２〜０．９ｇ１３、ペニシリンＧ、ナトリ ウム　０．５ＸＩＯ’〜３ＸＩＯ’単位１４、カナマイシンサルフェート０．２ 〜０．８ｇ１５、ネオマイシンサルフェート０．２〜１．０　ｇ１６、　５’　 −ＡＭＰ　０．４〜１．０ｇ１７、アデニン　０．２〜０．８ｇ １８、イノシン　０．４〜１．０　ｇ １９、ジヒドロストレプトマイシンサルフェート　０．２〜１．０　ｇ２０、テ トラサイクリン塩酸塩　０．２〜１．０　ｇ２１．３０％ウシアルブミン　１０ ０〜３５０　鳳Ｉ２２、Ｉｆとするのに十分量の蒸留水 上記した化学物質の多くかいくつかの商品名により市場で知られているため、示 した名称は、アメリカ合衆国ニューシャーシｍｍターウエイ所在のＭｅｒｃｋ　 ａｎｄＣｏ、、　Ｉｎｃ、により出版されたＭｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ、　ｌ！１ ｅｖｅｎｔｌ＋　Ｅｄｉｔｉｏｎ　（１０８９）に列挙された一般名である。

好ましくは、対照生成物は、血漿物質水溶液中に１種以上の白血球類縁体を含む 。本発明のさらに好ましい例において、１種以上の白血球類縁体が溶解可能なヒ ト赤血球と混合されて、溶解剤を用いる装置用の単一の複数分析基準血球対照生 成物を提供する際には、血漿物質は、コレステロール、コレステロールエステル 、リボタノバク質コレス・チロール、リポタンパク質コレステロールエステル、 リン脂質と結合したコレステロール、アルブミンと結合したコレステロール、ア ルブミンと結合したコレステロールエステル、リン脂質と結合したりボタンバク 質コレステロール、アルブミンと結合したりボタンバク質コレステロールおよび これらの′６１合物から成る群から選ばれる。最も好ましくは、血漿物質は、結 合コレステロールを含む。最も好ましい血漿物質の市場で入手できる適切な例は 、Ｍｌｌｅｓ、Ｉｎｃ、に付与された米国特許第４．２９０．７７４号明細書に 記載されたモデュサイト（ＭｏｄｕｃｙＬｅ）　（登録量１ｊｉ）であり、これ はアルブミンと結合した高密度リポタンパク″Ｒコレステロールである。懸濁液 媒体中のコレステロールの最終濃度は、最終対照生成物中の細胞カウントに依存 して４００〜１．２（１（Ｉミリグラム／リットル、好ましくは６００〜１．０ ００ミリグラム／リツトルの範囲内である。

不十分な１度のコレステロールを、本発明の比較的好ましい例の媒体中で用いた 場合には、基準血球対照生成物中の赤血球は、サポニン溶解剤系を用いる際にノ イズおよび残滓がないように細胞膜が能率的に溶解されず、白血球類縁体は、溶 解反応による必要な大きさより小さい平均細胞容積を有する。媒体が高すぎる１ 度のコレステロールを含む場合には、基準血球対照中の赤血球は、ノイズおよび 残滓かないように細胞膜か能率的に溶解されない。

さらに特に、対照生成物の比較的好ましい例を装置、例えば米国特許第４，７５ １．１７９号明細書に記載されているような試薬系を用いるクールターモデルＶ Ｃ３技術を用いて少なくとｂ２つの白血球集団、（１）リンパ球および（２）骨 髄細胞（好中球、単球、好酸球および好塩基球）を区別する際には、水性血漿物 質（前記した）は、比較的弱い溶解剤と固定されていない赤血球との間の反応を 可能にして、白血球類縁体かほとんど変化していない間に赤血球を溶解し、それ ぞれのタイプの白血球類縁体をカウントすることを可能にする。米国特許第４゜ ７５１．１７９号明細書に教示されているように、溶解剤は、２つの形態を有す る。（１）サポニンを含む溶解希釈剤、これは同時に全血試料を希釈し、赤血球 をストロマドライズする（ｓＬｒｏｍａＬｏｌｙｓｅ）作用を有する；または（ ２）サポニンを含む溶解剤に続く非溶解性血液希釈剤から成る２部系。

従来技術媒体、例えば米国特許第４，２１３，８７６；４，２９９．７２６；ま たは４．３５８，３９５号明細書に記載されているものを、本発明の比較的好ま しい例において用いた際には、上記した方法により製造された白血球類縁体は標 的白血球集団に望ましいより容積か小さい。

最も好ましい例において、対照生成物中で用いられる懸濁液媒体はさらに非イオ ン性界面活性剤が添加されている。界面活性剤は、高い親水性親油性バランス（ ＨＬＩ３）を有する。Ｉ−Ｉ　Ｌ　Ｂは代表的に１５より大きい、好ましくはＩ ７より大きい値を有する。代表的に、界面活性剤は、白血球類縁体に悪影響を及 ぼすことなく溶解作用をより赤血球に特異的にするのに有効な量である。さらに 、界面活性剤は、対照生成物中のすべての遊離コレステロールを安定化し、従っ てこれは溶液中で分離しない。当業者に知られているように、界面活性剤の有効 量は経験的に決定されるか、代表的には対照生成物の０．　５重量％より小さい 。

適切な非イオン性界面活性剤は次の一般式：　Ｒ−Ｘ　−（ｙ）、、　−Ｈ（式 中ＲはＣ＝−Ｃ＋ｇｌｊ！油性鎖であり、Ｘは一〇−１−ＣＯＯ−であり；Ｙは ＣＨ，ＣＨ，Ｏ−またはＣＨＩ　ＣＨＩ　ＣＨｆｆ　Ｏであり；！〕は１５〜５ ０の整数である）で表されるアルキルポリエーテルアルコールを含む。これらの 界面活性剤の市場で入手できる適切な例は、ＧＡＦ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社により 供給されるジアゾパン（Ｄｉａｚｏ９ａｎ）　（登録量１１１）ＳＳ−８３７、 Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａａｓにより供給されるトライトン（ＴｒｉＬｏｎ）　（ 登録量＄１）Ｘ４０５およびＢＡＳＦ　ＷｙａｎｄｏＬｔｅ社により供給される プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）　Ｆ　（登録商標）−１２７ＰＲｒＬ［。

を含む。

本発明の任意の理論に束縛されることを望まないが、現在、赤血球、弱い溶解剤 （例えばサポニン）および懸濁液媒体中の血漿物質の間に相互作用があり、これ により赤血球が溶解すると考えられている。さらに特に、現在、血漿物質は細胞 膜コレステロールに影響を与え、これがさらに溶解剤に対する白血球類縁体の応 答に影響を与えると考えられている。さらに、界面活性剤が溶解反応をより赤血 球に特異的にし、なお測定されたパラメータに関して白血球類縁体に悪影響を及 ぼさないと考えられている。さらに、界面活性剤が細胞膜中または血漿物質中に 見出されたコレステロールに影響しうると考えられている。

本発明の白血球類縁体の製造方法を以下に実施例により示す。実施例１は、ガチ ョウ細胞を処理するのに好ましい試薬および方法の特定例であり、配合は例示的 であるのみであることを理解されたい。実施例２．３およびは、アリゲータ−細 胞を処理するのに好ましい試薬および方法の特定例であり、配合は例示的である のみであることを理解されたい。実施例５は４種の白血球集団のアセンブリを示 し、これは例示的であるのみである。記載した試薬および／または方法はまた、 ガヂョウおよびアリゲータ−以外の動物からの血球に用いることができる。この 開示に従って、他の成分および割合を用いることができる。

以下のものは、ガチョウ白血球を処理して欅準化された大きさを有する白血球類 縁体を得るための、好ましい試薬および好ましい特定の操作手順の特定例である 。配合および方法は例示的であるのみであり、本発明の開示に従って他の成分、 割合および方法を用いることができることを理解されたい。

１　第１リン酸ナトリウム二０２ｇ ２　第２リン酸すｌ・リウム・７Ｈ，Ｏ：２．０ｇ３７ン化ナトリウム：０．Ｉ ｇ ４　塩化ナトリウム。９４ｇ ５　ｌリットルとするのに十分量の蒸留水：ｐＨ約７．４；浸透圧重量モル濃度 ３１５〜３４５ｍ０５ｍ／ｋｇ。

リンパ球低張性溶液 １、第１リン酸ナトリウム：０．２ｇ ２、第２リン酸ナトリウム・７Ｈ！　Ｏ：２．０ｇ３、　１リツトルとするのに 十分量の蒸留水：ｐＨ約７．８；浸透圧重量モル濃度１５〜２５ｍ０５ｍ／ｋｇ 。

手順 １、約１４０〜１７０ｆＬの範囲の平均細胞容積を有する鳥類赤血球を選択した 。

充填した鳥類赤血球をリン酸緩衝塩性溶液（ＰＩＩＳ）で洗浄した。

２、マイクロリットルあたり２ＸＩＯ’の細胞カウントに対して１．０〜５．０ ｍｇのコレステロールを加え、室温で２〜６時間インキュベートした。

３、市販の２５％グルタルアルデヒド製品を冷却したリンパ球低張性溶液に加え ることにより、約０．１〜０．８％のグルタルアルデヒド含量を有するグルタル アルデヒド固定試薬を調製した。好ましくは、温度は２〜８℃であった。グルタ ルアルデヒドの好ましい１度は約０．３５％であった。

４、洗浄した赤血球を、手順３の測定量の固定液に、■＝３５の希釈度で加えた 。

密封した容器に移し、これを１８〜２４時間２〜８℃でゆっくり回転させた。

ヘモグロビン含量の減少は、約６０重量％であると計算された。

５、上澄み液を除去し、細胞を数回ＰＢＳで洗浄し、次に適切な貯蔵溶液中に再 Ｖ濁させた。

６、スタンドアローン（ｓｔａｎｄ　ａｌｏｎｅ）リンパ球類縁体に関して、洗 浄した固定細胞を適切な懸濁液媒体中に再懸濁させ、濃度を調整して正常のヒト 血液中のヒトリンパ球のものに擬態させた。

７、対照生成物に対する複数の血液学的パラメータに関して、手順６の洗浄した 固定細胞に、複数のパラメータ血液学的対照生成物に望ましい他の血液学的組成 物および類縁体を加え、細胞カウントはリンパ球割合を測定するのに適切であっ た。

８、適切な安定剤と共に、固定した細胞を６か月より長期間貯蔵することができ る。

上記の実施例において、しかし他のタイプの哺乳類の赤血球から開始して、比較 可能な結果が得られた。

以下のものは、アリゲータ−赤血球を処理して単球類縁体を得るための、好まし い試薬および好ましい特定の操作手順の特定例である。配合および方法は例示的 であるのみであり、本発明の開示に従って他の成分、割合および方法を用いるこ とができることを理解されたい。

単球低張性溶液 １、第１リン酸ナトリウム：Ｏ，１ｇ ２、第２リン酸ナトリウム：１．０ｇ ３　ｌリットルとするのに十分量の蒸留水：　ｐ　＋−１約７．８．浸透圧重量 モル濃度５−１５ｍ０５ｍ／ｋｇ。

実施例１に記載した、細胞の洗浄溶ｌα（Ｐ　Ｂ　Ｓ）。

ニー岬 １　約３５０〜４５０ｆＬの範囲の平均細胞容積を有するアリゲータ−赤血球を 選択した。充填したアリゲータ−赤血球をＰＢＳで洗浄した。

２　マイクロリットルあたりｉ　ｘ　＋　ｏ’の細胞カウントに対してｌ、０〜 ５．０Ｉｎｇのコレステロールを加え、室温で３〜５時間インキュベートした。

３、市販の２５％グルタルアルデヒド製品を冷却した単球低張性溶液に加えるこ とにより、約０．　１〜０．８％のグルタルアルデヒド含量を有するグルタルア ルデヒド固定試薬を調製した。好ましくは、温度は２〜８℃であった。グルタル アルデヒドの好ましい濃度は約０．１５％であった。

４、洗浄した赤血球を、手順３の測定量の固定液に、１・５０の希釈度で加えた 。

密封した容器に移し、これを１８〜２４時間室温でゆっくり回転させた。ヘモグ ロビン含量の減少は、約４０重量％であると計算された。

５　上澄み液を除去し、細胞を数回ＰＢＳで洗浄し、次に適切な貯蔵溶液中に再 す濁させた。

６、スタンドアローン単球類縁体に関して、洗浄した固定細胞を適切な懸濁液媒 体中に再懸濁させ、濃度を調整して正常のヒト血液中のヒト単球のものに擬態さ せた。

７、複数の血液学的対照生成物に関して、手順６の洗浄した固定細胞に、複数の パラメータ対照生成物に望ましい他の血液学的組成物および類縁体を適切な濃度 で加えて単球を測定した。

８　適切な安定剤と共に、固定した細胞を６か月より長期間貯蔵することができ る。

以下のものは、アリゲータ−赤血球を処理して好酸球類縁体を得るための、好ま しい試薬および好ましい特定の操作手順の特定例である。配合および方法は例示 的であるのみであり、本発明の開示に従って他の成分、割合および方法を用いる ことができることを理解されたい。

好酸球低張性溶液 １、第１リン酸すトリウム：０．３２ｇ２　第２リン酸ナトリウム：８．０８ｇ ３、　１リツトルとするのに十分量の蒸留水：ｐＨ約８．０；浸透圧重量モル濃 度７５〜８５ｍ０５ｍ／ｋｇ。

好酸球ヘモグロビン変性処理溶液 １、ジメチルジコファンモニウムクロリド　２．５ｇ２、トリス（ヒドロキシメ チル）アミノメタン　６．　０６ｇ（有機緩衝液） ３．１リツトルとするのに十分量の蒸留水：ｐＨ約１Ｏ８５゜好酸球後処理洗浄 溶液 １、ポリオキシエチル化アルキルフェノール　５ｇ（ＧＡＦ　Ｃｈｅｍｉｃａ１ 社により供給されるジアゾパン（登録商標）ＳＳ−８３７）２、　１リツトルと するのに十分量の蒸留水。

実施例１に記載した、細胞の洗浄溶１ｆｆｌ（ＰＢＳ）。

１、約４００〜５００ｆＬの範囲の平均細胞容積を有するアリゲータ−赤血球を 選択した。充填したアリゲータ−赤血球をＰＢＳで洗浄した。

２、マイクロリットルあたりｌＸｌ０’の細胞カウントに対してｏ、２５〜１゜ ２５ｍｇのコレステロールを加え、室温で２〜５時間インキュベートした。

３、市販の２５％グルグルアルデヒド製品を好酸球低張性溶液に加えることによ り、約０．　１〜０．８％のグルタルアルデヒド含量を有するグルタルアルデヒ ド架橋試薬を調製した。グルタルアルデヒドの好ましい濃度は約０．　２％であ った。

４、洗浄した赤血球を、手順３の測定量の架橋剤に、１：５０の希釈度で加えた 。

密封した容器に移し、これを１８〜２４時間室温でゆっくり回転させた。

５、上澄み液を除去し、細胞を数回ＰＢＳで洗浄した。

６、洗浄した赤血球を、好酸球ヘモグロビン変性処理溶液に、１：１０の希釈度 で加えた。密１・１シた容器に移し、これを２〜４時間室温でゆっくり回転させ た。

７、上澄み液を除去し、細胞を数回好酸球後処理洗浄溶液で洗浄して好酸球ヘモ グロビン変性処理溶液を除去した。次に、適切な貯蔵溶液中に再懸濁させた。

８、スタンドアローン好酸球類縁体に関して、洗浄した固定細胞を適切な懸濁液 媒体中に再懸濁させ、濃度を調整して正常のヒト血液中のヒト好酸球のものに擬 態させた。

９、複数の血液学的対照生成物に関して、手順８の洗浄した固定細胞に、複数の パラメータ対照生成物に望ましい他の血液学的組成物および類縁体を適切な１度 で加えて好酸球を測定した。

１０、ａ切な安定剤と共に、固定した細胞を６が月より長期間貯蔵することがで きる。

以下のものは、アリゲータ−赤血球を処理して単球類縁体を得るための、好まし い試薬および好ましい特定の操作手順の特定例である。配合および方法は例示的 であるのみであり、本発明の開示に従って他の成分、割合および方法を用いるこ とができることを理解されたい。

好中球低張性溶液 １、第１リン酸ナトリウム：０．２３ｇ２、第２リン酸ナトリウム：５．３２ｇ ３、　１リツトルとするのに十分量の蒸留水：ｐＨ約８．０：浸透圧重量モル濃 度４５〜６５ｍＯｓ、ｍ／ｋｇ。

実施例１に記載した、細胞の洗浄溶液（ＰＢＳ）。

手順 １、約４００〜５００ｆＬの範囲の平均細胞容積を有するアリゲータ−赤血球を 選択した。充填したアリゲータ−赤血球をＰＢＳで洗浄した。

２、市販の２５％グルタルアルデヒド製品を好中球低張性溶液に加えることによ り、約０．　１〜０．８％のグルタルアルデヒド含量を有するグルタルアルデヒ ド固定試薬を調製した。グルタルアルデヒドの好ましい濃度は約０．４％であっ た。

３、ｌＸｌ０’のカウントである洗浄した赤血球を、手順３の測定量の固定液に 、１：５０の希釈度で加えた。密封した容器に移し、これを１８〜２４時間室温 でゆっくり回転させた。

４、上澄み液を除去し、細胞を数回ＰＢＳで洗浄し、次に適切な貯蔵溶液中に再 懸濁させた。

５、充填した細胞を、非イオン性界面活性剤溶液に加えた。上記溶液は、供与体 細胞の容積を標準化させる傾向がある。この溶液は、ｌリットルの蒸留水中に、 約１３．５のＨＬＢを有する０、５ｇのオクチルフェノキンポリエトキシエタノ ール（Ｒｏｈ＋ｎ　ａｎｄ　１ｌａａｓ社により供給されるトライトン（登録商 標）Ｘ−１００）を含む。

６、上澄み液を除去し、細胞を数回Ｐ［（Ｓで洗浄し、次に適切な貯蔵溶液中に 再懸濁させた。

７　スタンドアローン好中球類縁体に関して、洗浄した固定細胞を適切な懸濁液 媒体中に再懸濁させ、濃度を調整して正常のヒト血液中のヒト好中球のものに擬 態させた。

８、複数の血液学的対照生成物に関して、手順７の洗浄した固定細胞に、複数の パラメータ対照生成物に望ましい他の血液学的組成物および類縁体を適切な濃度 で加えて好中球を測定した。

９、適切な安定剤と共に、固定した細胞を６か月より長期間貯蔵することができ る。

実施例５ 正常のヒト血液試料中の白血球の標的組成を擬態するためのサブアセンブリ（Ｓ ｕｂ−ａｓｓｅｍｂ　ｌ　ｙ）において、以下の量の各成分を用いた。

０．１５ＯＬ　実施例１　１Ｊ：／ハ球　５００　ｘｔｏ”　μＬ０．０４ＯＬ 　実施例２　単球　５００　ｘｌＯ３μＬ０．０３ＯＬ　実施例３　好酸球５０ ０　ｘｌＯ”　ｕ　Ｌｏ、２８ＯＬ　実施例４　好中球　５００　ＸＩＯ３μＬ ０．５０ＯＬ　希釈剤　リン酸緩衝塩性溶液４つの白血球集団の最終的なアセン ブリにおいて、上澄み液を除去し、次に細胞を、コレステロールの最終１度が８ ００ｍｇであるモデュサイト（登録商標）の水溶液１リツトルに再懸濁させた。

このアセンブリを、既知の適切な安定剤と共に約６か月まで貯蔵することができ る。

白血球集団の比率および全細胞カウントを調整して、ヒト血液にお（ｆる病理状 態および正常の状態を示すことができる。これらの組成物は同様に、クールター 原理を用いる自動粒子分析装置用の対照および補正生成物に部分的に有用である 。

その後、白血球を擬態した未処理ヒト赤血球の懸濁液および安定化されたかまた は擬態した血小板を、最終的な赤血球、白血球および血小板カウントの比率並び にヘモグロビン含量およびヘマトクリットが所望の範囲内となるような割合で加 えることができる。

安定化された血小板を当業者に知られている方法により供給する。有用な方法は 、以下の工程を含む。

１、米国特許第４，４０５．７１９号明細書に記載されている、ヨードアセトア ミドと、イミノジ酢酸またはこの塩との組み合わせ並びに、水溶液中の相溶性静 菌剤。これを、所定のｐＨおよび浸透圧重量モル濃度に維持する。

２、米国特許第４．３８９．４９０号明細書にさらに十分に記載されている、０ ゜１〜５％のグルタルアルデヒド濃度および非イオン性界面活性剤を含む固定− 安定化組成物。これはある異性直鎖状アルコールのエトキシレートの混合物であ る。

３、米国特許第４．２Ｇ４，４７０号明細書に記載されている、ヒト血小板に近 い大きさの範囲および容積分布を有するように混合し配合したヤギ赤血球安定化 ヒト血小板類縁体。

それぞれの血液学的パラメータの値を変化させて異常に低い、および異常に高い 状態を表すことができる。正常の血液の白血球カウントはマイクロリットル（μ Ｌンあたり５．０００〜ＩＩ、０００であり、リンパ球値は２０〜４０％であり 、単核細胞値は１０％より小さく、顆粒球値は６０〜８０％であり、好酸球値は 約５％より小さく、好塩基球値は約２％より小さい。赤血球に関するヒト血液に おける正常の範囲はマイクロリットルあたり４．０００，０００〜５，０００゜ ０００細胞である。正常のヘモグロビン値は１２〜１６ｇ／１００ミリリットル である。「ヘマトクリット」という用語は、充填した赤血球の容積対全血の容積 の比率として定義される。ヒトにおける通常の比率は約４５％である。平均小体 容積は、血液リットルあたりの充填した赤血球の容積（ミリリットル）の容積対 マイクロリットルあたりの赤血球（百方）の比率である。平均小体ヘモグロビン １度は、充填した赤血球１００ミリリツトルあたりのヘモグロビンの平均重量を ％で示す係数である。平均小体ヘモグロビンは、ヘモグロビン含量（ｇ／ｌリッ トル対赤血球（百方／マイクロリットル）の比率である。

対照生成物は、新鮮な全血の試験試料が上記のすべての決定に関して構成する比 較基準を正確に示さなければならない。

前記の明細書において、本発明の詳細な記載は例示のために示した一方、ここに 示した詳細の多くの変化は、本発明の本意および範囲を逸脱することなく当業者 に可能である。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成　６年　８月２４ 日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血液対照生成物が、処理された血液細胞が血液試験方法において使用する溶 菌剤による劣化に対して耐性であるように処理された処理血液細胞を有しており 、この対照生成物が、少なくとも二種の異なるヒト白血球をシミュレートする血 液対照生成物であって、それぞれがヒト白血球の少なくとも二種の物理的特性を 有しており、これらの特性が、 ａ．直流電流によって測定された容積 ｂ．高周波（ＲＦ）サイズ ｃ．不透明度および ｄ．光散乱 からなる群より選択されていることを特徴とする、血液対照生成物。 ２．前記の物理的特性の一つが光散乱であることを特徴とする、請求項１記載の 血液対照生成物。 ３．ヒト白血球の一種をシミュレートするのに使用する処理血液細胞が、そのも との容積の３０％以上膨張したことを特徴とする、請求項２記載の血液対照生成 物。 ４．前記血液対照生成物が、少なくとも四種の異なる分析境界の中に分布してい る少なくとも四種の白血球類縁体を含有しており、この分析境界が、光散乱、容 積および不透明度に基づいて作られていることを特徴とする、請求項１、２また は３のいずれか一つの項に記載の血液対照生成物。 ５．前記の処理血液細胞が、変化されたヘモグロビン内容物を含有していること を特徴とする、請求項１または２記載の血液対照生成物。 ６．前記血液細胞のヘモグロビンが、処理血液細胞内で変性されたことを特徴と する、請求項５記載の血液対照生成物。 ７．前記処理血液細胞のヘモグロビンが、処理血液細胞から漏出したことを特徴 とする、請求項５記載の血液対照化成物。 ８．２０％〜８０％のヘモグロビンが、処理血液細胞から漏出したことを特徴と する、請求項７記載の血液対照生成物。 ９．少なくとも二種の白血球類縁体集団を含有する血液対照生成物を使用する方 法であって： ａ．血液対照生成物を装置内に配置し、前記対照生成物が、血液試験方法におい て使用する溶菌剤による劣化に対して耐性であるように処理された血液細胞に由 来した少なくとも二種の異なる白血球類縁体集団を含有しており、前記の白血球 類縁体集団が、それぞれヒト白血球の少なくとも二種の物理的特性を有しており 、これらの特性が、 （１）直流電流によって測定された容積（２）高周波（ＲＦ）サイズ （３）不透明度および （４）光散乱 からなる群より選択されており； ｂ．この対照生成物の前記の物理的特性を測定し；およびｃ．この測定の結果を 記録して、前記装置が仕様の範囲内で作動しているかどうかを測定することを特 徴とする、血液対照生成物の使用方法。 １０．前記物理的特性の一つが光散乱であることを特徴とする、請求項９記載の 血液対照生成物の使用方法。 １１．前記対照生成物が、前記装置の少なくとも四種の異なる分析境界の中に分 布している少なくとも四種の白血球類縁体を含有しており、この分析境界が、光 散乱、容積および不透明度に基づいて作られていることを特徴とする、請求項９ または１０記載の血液対照生成物の使用方法。 １２．前記白血球類縁体が、変化されたヘモグロビン内容物であることを特徴と する、請求項９または１０記載の血液対照生成物の使用方法。 １３．前記白血球類縁体が、血液細胞から漏出した２０％〜８０％のヘモグロビ ンを含有していることを特徴とする、請求項１２記載の血液対照生成物の使用方 法。 １４．前記白血球類縁体のヘモグロビンが、細胞内で変性したことを特徴とする 、請求項１２記載の血液対照生成物の使用方法。 １５．白血球類縁体を製造する方法であって：ａ．赤血球を低浸透圧溶液と混合 してこの赤血球の容積を膨張させ；ｂ．この細胞中のヘモグロビン内容物を変化 させてヒト白血球細胞の光散乱特性をシミュレートさせ；および、 ｃ．血液試験方法で使用する溶血剤による劣化に対して耐性であるようにこの細 胞を固定化し、この固定化された細胞が、ヒト白血球に類似している光散乱特性 および容積特性を有していることを特徴とする、白血球類縁体の製造方法。 １６．前記ヘモグロビン内容物の変化を、細胞中のヘモグロビンを変性すること によって達成することを特徴とする、請求項１５記載の白血球類縁体の製造方法 。 １７．前記ヘモグロビン内容物の変化を、細胞からヘモグロビン内容物を漏出さ せることによって達成することを特徴とする、請求項１５記載の白血球類縁体の 製造方法。 １８．前記細胞のヘモグロビン内容物を、２０％〜８０％まで減少させることを 特徴とする、請求項１７記載の白血球類縁体の製造方法。 １９．前記混合が、細胞を血清物質と混合し、次いで低浸透圧溶液と混合するこ とによって特徴付けられている、請求項１５記載の白血球類縁体の製造方法。 ２０．血清物質が、コレステロール、コレステロールエステル、リボタンパク質 コレステロール、リボタンパク質コレステロールエステル、リン脂質と結合され たコレステロールおよびこれらの混合物からなる群より選択されていることを特 徴とする、請求項１９記載の白血球類縁体の製造方法。 ２１．前記細胞が７５％以上膨張していることを特徴とする、請求項１５、１９ または２０のいずれか一つの項に記載の白血球類縁体の製造方法。 ２２．前記赤血球が、同時に膨張および固定化されていることを特徴とする、請 求項１５記載の白血球類縁体の製造方法。