JPH07503604A - Ｔｐｏの疾患関連ｂ−細胞エピトープ及びそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＴＰＯの疾患関連Ｂ−細胞エピトーブ及びそれらの使用発明の背景 本発明を導く一部の研究は、米国政府の基金により行われた。米国政府は、本発 明において一定の権利をもつ。

発明の分野 本発明は、分子生物学及び免疫学の分野に関する。さらに特に、本発明は、非− 甲状腺真核細胞内での組換えヒト甲状腺ペルオキシダーゼ（ｔｈｙｒｏｉｄ　ｐ ｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の製造に関する。本発明は、さらに、組換えヒト甲状腺ペ ルオキシダーゼの使用方法、そして特に、免疫疾患、例えば、橋本甲状腺炎（Ｈ ａｓｈｉｍｏｔｏ’ｓ　ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）の診断における組換えヒト甲 状腺ペルオキシダーゼの使用方法に関する。

関連技術の簡単な説明 橋本甲状腺炎は、少なくとも臨床下において、成人女性集団の１５％が患ってい る、最も一般的な自己免疫性内分泌障害（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｅｎｄｏｃｒｉ ｎｏｐａｔｈｙ）である（Ｖｏｌｐｅ、　Ｒ，、Ｉｎ　Ｗｅｒｎｅｒ’ｓ　Ｔｈ ｅ　Ｔｈｙｒｏｉｄ、　５ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　（ｌｎｇｂａｒ、　Ｓ、Ｈ， 、ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｄｓ、）、　Ｊ、Ｂ、　Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ、。

Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ｐｐ、　１２６６−１２９１　（１９８６）：　 Ｇｏｒｄｉｎ、　Ａ、、　ｅｔ　ａｔ、、　Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、 　９０：３３−４２　（１９７９乃。多数の甲状腺抗原に対する抗体が、それら の患者の血清中に存在し、サイログロブリン（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）及 びその甲状腺の”　ミクロソームの（ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ）“抗原を含８４） ）。より少ない、又は不確かな重要性を有する他の抗原は、第二のコロイド抗原 （Ｄｏｎｉａｃｈ、　Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ ｏｌ、　Ｍｅｔａｂ。

８：６３−８０　（１９７９））、チューブリン（ｔｕｂｕｌｉｎＸＲｏｕｓｓ ｅｔ、　Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｌ１ｎ、　ＥＸＰ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　５２二３２５−３３２　（１９８３ ））　、　ＤＮＡ（Ｋａｔａｋｕｒａ、　Ｍ、。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　６ ４：４０５−４０８　（１９８７））及び自己免疫性甲状腺疾患関連抗原１（Ａ ＴＲＡ　［）（Ｈｉｒａｙｕ、　Ｈ，、ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎ ｄｏＣｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　６４：５７８−５８４　（１９８７））を 含んでいる。

上記のミクロソームの抗原に対する抗体は、細胞表面上で発現され（Ｋｈｏｕｒ ｙ、　Ｅ、Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｘｐ、　ＩｍｍｕｎｏＬ、　４５：３１ ５−３２８　（１９８１）：Ｎｉ１ｓｓｏｎ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ １ｅｃ、　ｃｅｌｌ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　５３：１７７−１８５　（１ ９８７））、橋本甲状腺炎の病因におけるサイログロブリンに対するものよりも 大きな重要性を有していると信じられている。そのため、抗ミクロソーム抗体（ ＭＳＡ）は、上記疾患の活性期に、より密接に関連しており（Ｖｏｌｐｅ、　Ｒ ，、Ｉｎ　Ｗｅｒｎｅｒ’ｓ　Ｔｈｅ　Ｔｈｙｒｏｉｄ、　５ｔｈ　Ｅｄｉｔｉ ｏｎ　（［ｎｇｂａｒ、　Ｓ、Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｄｓ、）、　Ｊ、Ｂ、 　Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ、、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ。

６３：８０−８６　（１９８６））　、そして補体−固定される（ｋｈｏｕｒｙ 、　Ｅ、Ｌ、、　ｅｔａｌ、、　Ｅｘｐ、　ｒｍｍｕｎｏｌ、　４５：３１５− ３２８））　。これらの抗体は、それ故、甲状腺細胞の損傷を開始させるようで ある。

橋本甲状腺炎に関する主要な最近の発見は、先に間違って定義されたミクロソ− ム抗原が、少なくとも一部において、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）　、す なわち、甲状腺ホルモン合成に関係するプライマリ−酵素であるということであ る。この結論は、免疫学的な証−９９３（１９８７乃、そしてそれらの蛋白質の ためのｃＤＮＡの分子クローニングにより（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、　Ｒ，Ｐ、、 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２：１３８８５５５５ ９　（１９８７））、そしてそれらの誘導されたアミノ酸配列が同一であるとい う発見により（Ｌｉｂｅｒｔ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、　６：４１ ９３−４１７６（１９８７）；　５ｅｔｏ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　 Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８０：１２０５−１２０８　（１９８７））、実 質的に確認された。

本発明に先立ち、組換えＴＰＯの好適な製造は、橋本甲状腺炎における免疫調節 において推定される異常性に関する研究のためには、又はこの病気に関係する特 異・的Ｂ−細胞及びＴ−細胞の証明のためには、利用できなかった。この点に関 して、橋本甲状腺炎の病因に関係する分子機構の理解は、他の免疫失調、例えば 、重症筋無力症軸ｙａｓ　ｔｈｅｎｉａ　ｇｒａｖｉｓ）　、すなわち、純粋な 抗原（アセチルコリン・レセプタ）が得られ、そしてエピトープが既に決定され ている（Ｔｚａｒｔｏｓ。

Ｓ、Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＬＩＳＡ　８５：２８９９−２９０３　（１９８Ｂ）；　Ｈｏｈｌｆｅｌｄ、 　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　８１：６５７−６ ６０　（１９８８））病気の理解に遥に遅れている。

モノクロナール抗体（ｍＡｂｓ）により免疫精製されたヒトＴＰＯ（ｈＴＰｏ） は、入手可能であるが、限定された価値を有している。なぜなら、（ａ）ヒト甲 状腺組織の十分でない供給：（ｂ）この膜−結合抗原の精製の困難性：及び（Ｃ ）他の甲状腺自己抗原、例えば、サイログロブリン（非常に多い）による汚染、 があるからである。

ｈＴＰＯの断片は、組換えバクテリアの（β−ガラクトシダーゼ）融合蛋白とし て製造されており、そして、多くの橋本患者血清と、融合蛋白として発現された ＴＰＯの小さな断片との反応性が報告されている（Ｌｉｂｅｒｔ、　Ｒ，、ｅｔ 　ａｔ、、　ＥＭＢＯＪ、　６：４１９３−４１７６　（１９８７））。それら のデータは、しかしながら、翻訳するのが困難である。なぜなら、使用されるプ ラーク検定が、ポリクロナール抗血清の高価な前−吸着（ｐｒｅ−ａｄｓｏｒｐ ｔｉｏｎ）を必要としくＨｉｒａｙｕ、　Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　６４：５７８−５８４　（１９８ ７））　、そして偽陽性の結果をもたらすからである。

例えば、２０の橋本患者血清の中の１９と反応すると元に記載されている報告さ れた融合蛋白（Ｌｉｂｅｒｔ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　６：４ １９３−４１７６　（１９８７）　、クローンＣ２）は、抗−β−ガラクトシダ ーゼｍＡｂｓによる免疫精製上で、ＥＬｔＳＡ検定において、より少ない橋本患 者血清と反応することが見つけられた（Ｄｉｎｓａｒｔ、　Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、 、　１７ｔｈ　Ａｎｎｕａ１Ｍｅｅｔｉｒ＋ｇｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ 　Ｔｈｙｒｏｉｄ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ、　Ａｂｓｔｒａｃｔ　＃２３５（ １９８８））。

したがって、バクテリアの融合蛋白も、限定された価値を有している。なぜなら 、（ａ）全ての橋本患者血清と反応する断片の組み合わせが見つかっておらず、 （ｂ）その融合蛋白の立体配置が生来の蛋白質のものと異なることができ；そし て（Ｃ）そのバクテリアの生成物が培養液中の免疫細胞に添加されなとき毒性で あることができる、からである。

発明の要約 他の潜在的甲状腺抗原を含まない完全−長のｈＴＰＯを得るために、本発明者は 、非−甲状腺真核細胞における組換えｈＴＰＯの発現を達成した。生来のｈＴＰ Ｏと同様に、この組換えｈＴＰＯは、酵素的に活性であり、細胞表面で発現され 、そして融合蛋白ではない。

本発明の組換えｈＴＰＯは、”抗ミクロソームの（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｓｏｍａ ｌ）”抗体を含む橋本甲状腺炎を患う患者からの血清により、特別なやり方で、 認識される。この病気において見られる抗ミクロソーム抗体レベルの範囲を表す ために選択された３６の橋本患者血清の全てが、本発明の真核−発現組換えｈＴ ＰＯと反応した。

次いで、本発明の目的は、免疫精製生来蛋白に又は以前に利用できた組換え融合 蛋白に関連した欠点に煩わされない、便利でそして経済的な組換えｈＴＰＯの源 を提供することである。したがって、本発明は、ヒト甲状腺ミクロソーム抗原の 特徴付けにおける数多（の重要な利点を提供し、そして当該分野におけるさらな る実質的な発展への道を開いている。

組換えの、酵素活性を有する、ヒト甲状腺ペルオキシダーゼは、非−甲状腺真核 細胞内で製造された。先に報告されたバクテリアの融合蛋白とは異なり、この蛋 白のコンフォメーションは、β−ガラクトシダーゼ融合パートナ−により、じゃ まされていない。さらに、バクテリア製造蛋白とは異なり、このＴＰＯは、グリ コジル化されている。機能的ＴＰＯ活性の証明は、以前にクローン化されたｃＤ ＮＡ　（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、Ｒ，Ｐ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、２６２：１３８８５−１３８８８　（１９８７）；Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、　 Ｒ，Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　１：８５６ −８６１　（１９８７）、Ｌｉｂｅｒｔ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ 、　６：４１９３−４１７６　（１９８７）：　Ｋｉｍｕｒａ、　Ｓ、。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８ ４：５５５５−５５５９　（１９８７））が実際にＴＰＯであることを明瞭に示 している。

本発明は、また、自己免疫疾患に関連する甲状腺ベルオキシダーセ上のβ−細胞 エピトープの同定をも提供する。さらに、本発明のこの態様は、甲状腺ペルオキ シダーゼのβ−細胞認識の原因である分子間相互作用を同定するための方法を提 供する。

非真核細胞内で発現された本発明の組換えｈＴＰｏを使用した実験は、他の潜在 的な甲状腺抗原とは独立しているＴＰＯが、橋本甲状腺炎における主要な自己抗 原であることを証明した。したがって、テストされた３６の橋本患者血清の全て が、ウェスタン・プロット検定により例示されるような、はとんど定量的なやり 方で組換えｈＴＰＯと特異的に反応した。以前の免疫学的研究は、抗ミクロソー ム抗体がｈＴＰ。

ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　６２：９２８−９３３　（１９ ８６）；　Ｍａｒｉｏｔｔｉ、　Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ。

、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　６５：９８７ −９９３　（１９８７））、他の、未同定の、甲状腺抗原による免疫精製ｈＴＰ Ｏ抗原の汚染の可能性を排除することは困難であった。本発明のＣＨＯ−ＴＰＯ 細胞により製造され、又はその中に在る、唯一の甲状腺（又は、もちろん、ヒト の）澤白質が、ｈＴＰＯである。正常検体及び橋本甲状腺炎をもつ患者の両方か らのヒト血清が、非感染ＣＨＯ細胞のいくつかの抗原と反応する抗体を含んでい たとしても、橋本患者血清のみが、木組換えｈＴＰｏと反応する。

本発明は、また、ミクロソーム抗原が、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（Ｐ ＡＧＥ）及びウェスタン・プロットにより分析されたとき、ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒ ｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　６１：１２０−１２８　（１９８５）；　Ｈａｍａ ｄａ、　Ｎ、、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７９：８１９−８２５　（１９８７））の 上に光を投げかけている。

上記の二重線が２つの別の蛋白質又は単一蛋白質の部分的分解産つのどちらを表 しているか分からなかった。Ｋｉｍｕｒａ他は、ｈＴＰＯのｍＲＮＡ及びｃＤＮ Ａの２つの形態を観察し、そして最初のＴＰＯ転写の他のスプライシングの可能 性を示唆した（Ｋｉｍｕｒａ、　Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：５５５５−５５５９　（１９８７））。

Ｎａｇａｙａｍａ他は、ＴＳＨ刺激の後、培養Ｇｒａｖｅ’　ｓ甲状腺細胞にお いて、４つの異なる形態のｔ、ｒｐ。

ａｔ　Ｔｈｙｒｏｉｄ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、　Ｔｏｋｙｏ、　Ｊａｐａｎ、　 Ａｂｓｔｒａｃｔ　＃４２　（１９８８乃。単一の、イントロンのない、ｈＴＰ Ｏ遺伝子と同時の二重線の本発見は、他のスプライシングの見込みに対して強く 反対する。

蛋白質の還元後、上記の二重線の単一線への明らかな変換は、粗ヒト甲状腺抽出 物によるＰｏｒｔｍａｎｎ他のデータの記憶（Ｐｏｒｔｍａｎｎ、　Ｌ、。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８１：１２１７−１２２ ４　（１９８８））は、膜結合ｈＴＰＯがジスルフィド結合を介して、他の未同 定の蛋白質に結合されていることを示唆している。Ｔａｕｒｏｇ他のモデルの主 義（Ｙｏｋｏｙａｍａ、　Ｎ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏｃｒｉ ｎｏｌ、　２：８３８−８４４　（１９８８））における、他の解釈は、ＴＰＯ 内の鎖間のジスルフィド結合がＴＰＯのゲル移動の挙動を変化させることができ 、多形態の外観をもたらすということである。

その中で一次抗原が１０７ｋＤのサイズであるヒト甲状腺ミクロソームの観察に 反して（Ｈａｍａｄａ、　Ｎ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄ ｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　６１：１２０−１２８　（１９８５））　、 本発明者は、同一の条件下で、トランスフェクトＣＨＯ細胞内の組換えｈＴＰＯ の主要な免疫原の形態が質量において約２００ｋＤであり、約１１０ｋＤの単一 バンドに還元上で変換されることを観察した。この違いは、異なる細胞型（ヒト 及びＣＩ（０）におけるｈＴＰＯの変化した発現に関係しているがもじれない。

しかしながら、２００ｋＤ蛋白が抽出ヒト甲状腺ミクロソーム１０７ｋＤ蛋白の 主要なバンドを非還元条件下ＰＡＧＥに供されることにより製造されたことが報 告された（Ｈａｍａｄａ、　Ｎ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎ ｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　６１：１２０−１２８　（１９８５））　 、組換元ｈｒｐｏｉ白の還元後ノ減少すレタ１１ｏｋＤシクナルの本発見は、生 来のミクロソーム抗原を使用しての他の一見に３：１５−２３　（１９８７）） 。したがって、その生来の状態においては、ヒトＴＰＯは、多量体としてか又は 同様のサイズの他の膜蛋白と一緒になってのどちらかで存在している。自己抗体 によるエピトープ認識は、フンフォメーション依存性かもしれない。

ｈＴＰＯの誘導アミノ酸配列は、本発明者に、単一ペプチドの、組換え完全−長 のｈＴＰＯでの、そしてそれ故、天然ｈＴＰＯの存在を、並びに、その蛋白質の カルボキシル末端（アミノ酸残基８４６−８７０）における、推定の疎水性の膜 −スパニング領域（トランスメンプラン領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｄ ｏｍａｉｎ））の存在を示した（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、　Ｒ，Ｐ、、　ｅｔ　ａ ｌ、。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２：１３８８５−１３８８８　（１９８７ ）；　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、　Ｒ，Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏ ｃｒｉｎｏｌ、１：８５６−８６１　（１９８７）：　Ｋｉｍｕｒａ、Ｓ、、ｅ ｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：５ ５５５−５５５９　（１９８７）；　Ｌｉｂｅｒｔ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５：６７３５　（”１９８７））　。

天然のｈＴＰＯは、甲状腺細胞の表面蛋白であることが示された。また、組換え の、酵素活性を有するｈＴＰｏは、安定してトランスフェクトされた非−甲状腺 真核細胞において、細胞膜を伴っている（ｋａｕｆｍａｎ、　Ｋ、Ｄ、、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８４：３９４−４０３　（１９８９））。

特別の理論により結合されることを意図していないが、本発明者は、シグナル・ ペプチドがその細胞膜を通して本ヒトＴＰＯに向けられているが、ｈＴＰｏの疎 水性領域が細胞膜内に埋め込まれてるようになり、これにより、その細胞からの 分泌を防いでいるということを仮定した。

これまでには、ｈＴＰＯ疎水性領域８４６−８７０がトランスメンブラン領域に 一致するするという機能的な証明はなかった。本発明は、ｈＴＰ。

内のトランスメンブラン領域の存在を、そしてｈＴＰＯが優先的に細胞外の方向 をもつ酵素であることを証明している。この推定のトランスメンプラン領域のま さに上流の終止コドンの、部位特異的突然変異誘発による挿入は、ｈＴＰＯを酵 素的に活性でありそして免疫学的に無傷の分泌蛋白に変換する。この終止コドン の導入により、ｈＴＰｏは、８５残基切り詰められ、そのカルボキシル末端が除 去される（９３３アミノ酸）。真核発現ベクターに挿入された、突然変異された ｈＴＰｏ　ｃＤＮＡは、安定的にＣＨＯ細胞にトランスフェクトされた。橋本患 者血清による、細胞の３ＳＳ−メチオニン−ラベル蛋白の免疫沈殿及びＰＡＧＥ は、１０５−１０１　ｋＤの二重線を現した。これに反して、野性型ｈＴＰＯに よりトランスフェクトされた細胞は、１１２−１０５　ｋＤの二重線をもたらし た。

パルス−チェイス実験（ｐｕｌｓｅ−ｃｈａｓｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）に おいて、上記の切り詰められたｈｒｐｏ蛋白を発現するＣＩＯ細胞は、チェイス の４時間後、その培養培地中に、免疫沈殿性のＴＰＯを分泌し、レベルは漸進的 に２４時間の期間にわたり蓄積した。反対に、野性型のｈＴＰＯを発現するＣＨ Ｏ細胞は、その培養培地中に、全く免疫沈殿性のＴＰＯを分泌しなかった。分泌 され、切り詰められたｈＴＰｏの形態は、細胞内で発現された二重線とは反対し 、より少ない電気泳動の易動性を有する単一バンドとして現れた。ＴＰＯ酵素活 性は、上記の突然変異されたｈＴＰＯによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞 からの調節培地中に存在したが、野性型ｈＴＰｏを発現する細胞からの調節培地 中には存在しなかった。上記の突然変異蛋白の安定性は、野性型のものと同じで あった。

ｈＴＰｏの分泌形態は、構造的及び免疫学的研究における使用、並びに診断的使 用のために、多量の可溶性ＴＰＯ蛋白を製造するために使用されることができる 。

したがって、１つの態様においては、本発明に従って、組換えの、酵素活性のあ る、ＴＰＯｌ又はそれらの機能的又は化学的誘導体を提供する。

他の態様においては、非−甲状腺真核細胞により作られたｈＴＰｏを提供する。

他の態様においては、本発明に従って、酵素活性があり、免疫学的に無傷の、そ して分泌可能な、組換えｈＴＰＯ，又はそれらの機能的又は化学的誘導体を提供 する。

本発明ノサラニ他ノ態様は、ｐＥＣＥ−ＨＴＰＯ、ｐＨＴＰｏ（Ｍｌ）−ＥＣＥ −３Ｖ２−ＤＩ（ＰＲ，ｐＨＴＰｏ−ＤＨＰＲ−２８、ｐＨＴＰＯ−ＤＨＰＲ− ４Ｃ及びｐＨＴＰｏ−ＤＨＰＲ−４Ｃ−ＭＴＸがら成る群から選ばれたプラスミ ドを含んで成る。

また、本発明に従って、これらのプラスミドのいずれかにより形質転換された非 甲状腺真核細胞、並びに、そのｈＴＰＯの発現及びそのｈＴＰＯの回収を許容す る条件下で、その形質転換細胞を培養することを含んで成るｈＴＰｏの製造方法 をも、提供する。

さらに他の態様においては、本発明は、本発明のｈＴＰＯに対する抗体を提供す る。

さらに、本発明に従って、サンプル中のｈＴＰＯの検出方法であって、完全長の 組換えｈＴＰＯに対する抗体又は分泌ｈＴＰＯに対する抗体と、そのサンプルを 接触させ、そのサンプル中のｈＴＰｏと検出可能となるようにラベルされた抗体 との間で複合体を作るように、その抗体を検出可能となるようにラベルし、そし て複合体を形成した又は形成しなかったラベル抗体を検出することを含んで成る 方法を提供する。

追加の態様においては、サンプル中のｈＴＰＯを検出するためのキットであって 、１以上の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ）を含んで成る容器手段であってその容 器の中の１つがｈＴＰＯに対する検出可能となるようにラベルされた抗体を含ん で成るようなキットを提供する。

さらに、本発明に従って、サンプル中のｈＴＰｏに対する抗体の検出方法であっ て、そのサンプル中のｈＴＰｏ特異的抗体と組換えｈＴＰＯとの間で複合体を作 るように、完全長の組換えｈＴＰｏ又は分泌組換えｈＴＰＯと、そのサンプルを 接触させ、そして複合体を形成した抗体を検出することを含んで成る方法を提供 する。追加の態様においては、サンプル中のｈＴＰＯに対する抗体の検出のため のキットであって、ｌ以上の容器を含んで成る容器手段であってその容器の中の １つが組換えｈＴＰｏを含んで成るようなキットを提供する。

こららの、及び他の、本発明の非限定的な態様は、以下の発明の詳細な説明から 、当業者には明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 図１．　発現プラスミドｐｉ（ＴＰＯ−ＥＣＥの構築。ｐＨＴＰＯ−ＢＳ（上布 ）をＮＯ【Ｉにより消化し、その末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ 断片により平滑とし、そしてそのＤＮＡを次に、Ｘｂａｌ　Ｉにより処理する。

放出されたＢＩｕｅＳＣｒｉｐｔベクターをさらに、Ｓｅａ　Ｉにより処理し、 このベクター（２，９５ｋｂ）とＨＴＰＯｃＤＮＡ断片（３，１ｋｂ）のサイズ が似ていることによるアガロース・ゲル電気泳動上の良好な分離を得る。哺乳類 の発現ベクターｐＥＣＥ　（Ｅｌｌｉｓ、　Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１４ ５ニア２１−７３２　（１９８６）Ｘ土庄）を、Ｅｃｏ　Ｒ１により処理し、そ の末端をＤＮＡポリメラーゼＩのにｌｅｎｏｗ断片により平滑とし、そしてその ＤＮＡを次に、Ｘｂａｌ　［により処理する。処理されたｐＨＴＰＯ−ＢＳ及び ｐＥＣＥ断片を次に、Ｔ４　ＤＮＡリガーセ（＆１ａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ 。

ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

ＮＹ　（＋９８２））を使用して結合した。得られたプラスミド、ｐＨＴＰｏ− ＥＣＥ（下）を、コンピテントＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、 　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）にトランスフェクトした。

図２．　ｐＨＴＰｏ−ＥＣＥによりトランスフエフ１へされたＣＨＯ細胞の蛍光 −活性化セル・ソーター（ＦＡＣ３）分析。ＣＨＯ−ＨＴＰＯ１２ｂ細胞を本明 細書に記載するように加工する。

パネルＡ：　ヒト血清に前もって晒されることなく、フィコエリトリン（ｐｈｙ ｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）（ＰＥ）−ラベルされた第二抗体単独に晒された細胞。

パネルＢ：　ＰＥ−ラベルされた第二抗体中でのその後のインキユベーシヨンな しに橋本甲状腺炎をもつ患者からの血清（１：　１００）　（ＥＬＩＳＡ値１、 ７７９）中でインキュベートされた細胞。

パネルＣ：　パネルＢ中に記載した橋本患者血清中及びＰＥ−ラベル第二抗体中 で順次インキュベートされた細胞。

パネルＤ、パネルＣ中のものと同様であるが、抗ミクロソーム抗体を欠いている 正常患者からの血清を使用した。

パネルＥ及びＦ：パネルＣ及びＤ中のものと同じデータを、フォワード・スキャ タ−（ｆｏｗａｒｄ　５ｃａｔｔｅｒ）を示すためにプロットした。これらのデ ータは、正常及び橋本患者血清と反応する細胞集団の相対サイズが同じであるこ とを示している。

図３．　ヒト甲状腺ミクロソームに対する又は組換えヒトＴＰＯに対する抗体を 使用したＥＬＩＳＡの線型回帰分析。

図４．　ヒト甲状腺ミクロソームに対する又は組換えヒトＴＰＯに対する抗体、 １／１０００希釈、を使用したＥＬ［ＳＡの線型回帰分析。”Ｃａｒｄｉｆｆ” は、図３及び図４の両方のミクロソーム抗原の源を表している。

図５．　メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）濃度に対してプロット された、ｐＥＣＥ−ＨＴＰＯ、ｐＨＴＰＯ−ＤＨＰＲ−２８及びｐＨＴＰｏ−Ｄ ＨＰＲ−４ＣによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞内で観察された相対ＴＰ Ｏ活性。

図６．　部位特異的突然変異誘発後のヒトＴＰＯ遺伝子のヌクレオチド配列。こ の突然変異は、ヒトＴＰＯ遺伝子のトランスメンプラン領域から直ぐ上流の領域 内に、２つの終止コドン、並びに確認のためのＥｃｏ　Ｒ［部位を取り込んだ。

図７．　ヒト甲状腺ペルオキシダーゼのｃＤＮＡ配列及び誘導アミノ酸配列（Ｍ ａｇｎｕｓｓｏｎ、　Ｒ，Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏｃｒｉ ｎｏｌ、　１：８５６−８６１（１９８７））。

旺発現プラスミドｐＨＴＰＯ（Ｍｌ　）−ＥＣＥ−５Ｖ２−ＤＨＰＲを示す模式 図。

図９．　ブラスミＦ’ｐＨＴＰＯ（Ｍｌ）−εＣＥ−ＳＶ２−ＤＨＰＲの構築。

図１０．抗−ＭＳＡレベルのスペクトルを提供するために選ばれた、５１血清の 比較であって、Ｇｒａｖｅｓ’　甲状腺ミクロソーム及び非甲状腺真核細胞内て 作られた組換えの、酵素活性のあるヒトＴＰＯとの、それらの反応性に関しての もの。この抗−ＭＳＡ検定データは、標準血清に比較した、ＥＬＩＳＡインデッ クスとして表されている。抗−ｈＴＰＯ抗体検定のためのデータは、ブランクｗ ｅｌｌ値をｏ、　ｏｏｏに標準化した、絶対吸光度単位で表されている。（Ａ） 血清希釈！／１００（正常患者からの血清を、長方形で囲んである。）；　（Ｂ ）血清希釈１／１．０００；（Ｃ）血清希釈１／１０．０００゜ 図１１．ヒト甲状腺ミクロソーム（Ａ）及び組換えｈＴＰＯ（Ｂ）と矛盾して反 応する２つの血清（＃１１及び２７）を、標準（１／１００）血清希釈において パネルＡ中のｈＴＰｏ以外の抗原と反応させる。希釈曲線を、標準希釈における 同様の抗−ＭＳＡ活性をもつ２つの他の血清（＃１２及び２Ｂ）についても示す 。

図１２．　［準（１／１００）血清希釈における抗−ｈＴＰｏ抗体ＥＬＩＳＡの 検定間のばらつき。低い、中間の、及び高い自己抗体レベルを代表するために選 ばれた３つの自己免疫血清についての、１０回の抗−ｈＴＰＯ抗体ＥＬＩＳＡの 結果の平均値上標準偏差。

図１３．部位特異的突然変異誘発によるｈＴＰＯへ導入された突然変異の、ヌク レオチド配列による確認。二のヌクレオチド部分は、ヒトＴＰＯについて報告さ れたものと同じであると言及されている（ＲＯｕＳＳｅｔ、　Ｂ、、　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　５２：３２５−３３２　（１ ９８３））。この突然変異されたｈＴＰＯ−Ｍｌ中の、ＴＧＡ（２６２９−２６ ３１塩基対）及びＴＡＧ（２６４１−２６４３塩基対）終始コドン、並びにＥｃ ｏ　ＲＪ部位を、右に示す。野性型ｈＴＰＯのヌクレオチド配列を左側に示す。

１１Ｎ＋４．　（Ａ）　トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の異なるクローン中 の突然変異されたｈＴＰｏの免疫沈降。ＣＨＯ−非トランスフェクトＣＨＯ細胞 ；　ＣＨＯ−ＴＰＯ−野性型ｈＴＰｏによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞 ；　ＣＨＯ−ＴＰＯ−Ｍｌ−ＰＯＯＬＥＤ　−ｈＴＰＯの突然変異形態によりト ランスフェクトされたＣＨＯ細胞のプールされたコロニー；　ＣＨＯ−ＴＰＯ− Ｍｌ−Ｄ−Ｋ　−クローニング・シリンダーにより選択され、そして次に増殖さ れた、突然変異されたｈＴＰＯによりトランスフェクトされた、ＣＨＯ細胞の個 々のコロニー。細胞を、２Ｓ３−メチオニンにより放射ラベルし、そして、高い 抗−ｈＴＰＯ抗体レベルを含む橋本甲状腺炎血清により免疫沈殿させた。

（Ｂ）限界希釈により作られたＣ）ｔＯ−ＴＰＯ−１１１１−に細胞のクローン からの突然変異されたｈＴＰＯの免疫沈降。免疫沈降を、高い抗−ｈＴＰＯ抗体 をもつ橋本甲状腺炎を患った患者からの血清により行った。免疫沈降の特異性を 、正常患者（ＣＯＮ）からの血清が、図中の１０５−１０１ｋＤ二重線を沈降さ せることができないことにより示す。

図１５．　ＴＰＯの生合成及びプロセッシング。野性型ｈＴＰＯを発現するＣＨ Ｏ細胞（上図）と、及びｈＴＰｏの突然変異形態（下図）によりトランスフェク トされたＣＩＯ細胞と、免疫沈降試験を行った。２６Ｓ−メチオニンによる４時 間のパルス（０時間のチェース）の後に、図中に示した期間、非ラベル・メチオ ニンによるチェースを行った。次に、免疫沈降を、図に示すように細胞溶菌物及 び条件培地の両方に対して行った。

図１６．野性型ｈＴＰＯ（細胞系ＣＨＯ−ＴＰＯ１２ｇ）によりトランスフェク ション後のＣＨＯ細胞（Ｋｏｔａｎｉ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｃｌ１ ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　６２：９２８−９３３　（１９ ８６））及びｈＴＰＯの突然変異形態によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞 （ＣＨＯ−ＴＰＯ−Ｍｌ−Ｋｌ）の培地中のヒトＴＰＯ酵素活性。培地を、培養 ３日後に回収した。その培地中のＴＰＯ酵素活性を、グアヤコール（ｇｕａ　１ ａｃｏ　］　）検定により測定した。示された経過時間は、この検定において酸 化されたグアヤコール基質の蓄積に関係し、そしてその培地への酵素分泌の速度 とは関係しない。

図１７．　（Ａ）　抗原の非存在中に広がった、Ｇｒａｖｅｓ’　疾患における 甲状腺浸潤物からのＴ細胞は、組換えＴＰＯを認識する。クローン士自己放射Ｐ ＢＬ−黒捧：クローン十ＰＢＬ十対照（非トランスフェクト）ＣＨＯミクロソー ム−しま模様捧；クローン＋ＰＢＬ＋ＴＰＯによりトランスフェクトされたＣＨ Ｏミクロソーム−灰色捧。結果を、３連の培養から取り込まれた［２則チミジン の平均ｃｐｍとして表す。誤差捧は、平均値の襟章誤差（Ｓ、　Ｅ、　Ｍ）を示 している。同様の結果を、３以上の反復実験において得た。

ＣＢ）患者及び正常検体の両方からの末梢血液リンパ球が、対照及びＴＰ叶トラ ンスフェクト・ミクロソームの両方に反応して増殖する。

ＰＢＬ単独−黒捧；　ＰＢＬ十対照ミクロソーム−しま模様捧；　ＰＢＬ＋ＴＰ Ｏトランスフェクト・ミクロソーム−灰色捧。結果を、３連培養の平均ｃｐｍ　 ［”旧チミジン取り込み物（誤差棒は、Ｓ、　Ｅ、　Ｍ、を示す。

）として、８１−　図１７Ａ中のＴ細胞クローンを得た患者：　ＲＧ　−Ｇｒａ ｖｅｓ’疾患をもつ他の女性：ＫＨ−正常対照女性。同様の結果を、別の実験に おける他の患者から得た。

ＩＮ　１８．抗ミクロソーム／ＴＰＯモノクロナール抗体２０．１０のためのエ ピトープの決定。その５′−及び３−末端のヌクレオチド配列を、ｈＴＰＯｃＤ ＮＡ断片ライブラリーから選択した１４クローンについて決定した。これらの範 囲を、先に報告されたｈＴＰＯに付けられた番号により、注釈する（Ｍａｇｎｕ ｓｓｏｎ、　Ｒ，Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、 　１：８５６−８６１（１９８７））。すべての１４クローンの間の最も小さい 重複領域は、８８１−９２７塩基対である。このスパン内の最初の２つのヌクレ オチドは、完全なコドンを構成していないので、エピトープ領域は、図中の誘導 アミノ酸配列に対応する、８８３−９２７塩基対の間として決定されることかて きる。

［ｍ１９．　ＴＰＯＭＡｂ　４７により認識されたエピトープの決定。

５−及び３′−プライム末端のヌクレオチド配列を、ＭＡｂ　４７により認識さ れたＴＰＯｃＤＮＡ断片ライブラリー中の１８クローン（材料及び方法を参照の こと）について決定した。すべての１８クローンの間の最小重複領域は、図中の アミノ酸をコードしている、ヒトＴＰＯｃＤＮＡ配列における２２１．９−２２ ４７塩基対からのものである。

ＩＵ２０．　ＴＰＯＭＡｂを使用した、ヒトＴＰＯのウェスタン・プロット分析 。チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞内で発現された組換えヒトＴＰＯを、変性 及び還元条件下、抗原として使用した（材料及び方法を参照のこと）。ポリアク リルアミド・ゲル電気泳動及び膜へ移した後、その膜を図中に示す抗体によりブ ロービングした。ＴＰＯＭＡｂｌ、２．９．１５．１８．２４．３０．４０．４ ７．５３．５９．６ｏ及び６４は、生来の非変性ヒトＴＰＯに対して作られたマ ウスＭＡｂ　（Ｒｕｆ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ 　１２５：１２１１−８　（１９８９））である。対照（Ｃｏｎ）は、変性ヒト ＴＰＯに対して作られたマウスＭＡｂ（Ｐｏｒｔｍａｎｎ、　Ｌ、、　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ。

［ｎｖｅｓｔ、　８１：１２１７−１２２４　（１９８８））　、（Ａ及びＢ） 及び対照マウス腹水液（Ｃ）である。分子量マーカーのサイズを左に示し、そし て矢印により組換えヒトＴＰＯの分子量を示す。

好ましい態様の説明 以降の説明においては、分子生物学及び免疫学の分野における熟練者に知られた 様々な方法を参照されよう。参照されるこのような公知の方法について記載して いる刊行物及び他のものを、あたかも全体が述へられたように完全なものとして 引用により本明細書に取り込む。

組換えＤＮＡ技術の一般的原理を記載している標準的な参照文献は、Ｗａｔｓｏ ｎ、Ｊ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｇｅ ｎｅ、Ｖｏｌｕｍｅｓ　［ａｎｄ　ＩＩ、Ｔｈｅ　Ｂｅｎｊａｍｉｎ／ＣｕＣｕ ｍｍ１ｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｉｎｃ、、ｐｕｂｌｉｓ ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：　Ａｎ　Ｉｎｔ ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２ｄ　 ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｐｒｅ ｓｓ、ｐｕｂｌｉｓｙ、　ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８２）を含む。

”クローニングは、特定の遺伝子又は他のＤＮＡ配列をベクター分子中に挿入す るためのインビトロにおける組換え技術の使用を意味する。所望の遺伝子を上手 くクローン化するために、その断片をベクター分子に結合させるための、複合Ｄ ＮＡ分子をそれを複製することができる宿主細胞に導入するための、そして、受 容宿主細胞の中から凛的遺伝子をもつクローンを選択するための、ＤＮＡ断片の 製造方法を使用することが必要である。

“ｃＤＮＡ”は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の働きにより ＲＮＡ鋳型から作られた、相補的又はコピーＤＮＡを意味する。したがって、” ｃＤＮＡクローン”は、クローニング・ベクター内に担持された、問題のＲＮＡ 分子に相補的な２本鎖ＤＮＡ配列を意味する。

”ｃＤＮＡライブラリー゛は、生物のゲノムの全体を一緒になって含んで成るｃ ＤＮＡ挿入物を含む組換えＤＮＡ分子の集まりを意味する。このようなｃＤＮＡ ライブラリーは、当業者に既知の方法により作られるＡは、そのゲノムから特定 の遺伝子をクローン化することが必要とされる生物の細胞から最初に単離される 。本発明の目的のために好ましいものは、哺乳類の、そして特にヒトの細胞系で ある。本目的のために好ましいベクターは、λ−ＺＡＰベクターである。

“ベクター”は、その中にＤＮＡ断片が挿入され又はクローン化されることがで きる、プラスミド又はバクテリオファージから得られたＤＮＡ分子を意味する。

ベクターは、１以上のユニーク制限部位を含むであろうし、そしてクローン化配 列が再生産されるように所定の宿主又は担体において自己複することができる。

したがって、”ＤＮＡ発現ベクター“は、ＤＮＡの追加の配列が自律因子ゲノム に取り込まれた後に、宿主染色体と独立して、宿主内で複製することができるい ずれかの自律因子（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　ｅｌｅｍｅｎｔ）を意味する。この ようなりＮＡ発現ベクターは、バクテリアのプラスミド及びファージを含む。

”実質的に純粋な″は、本発明のいずれかの抗原、又はこのような抗原をコード しいているいずれかの遺伝子であって他の抗原又は遺伝子を本質的に含まず又は 天然において正常に見られる他の汚染物をそれぞれに含まず、そして天然では見 られない形態で存在するようなもの、を意味する。”機能的誘導体”は、分子の 、”断片”、“変異体”、”同族体”又は“化学的誘導体”を意味する。分子の ”断片”、例えば、本発明のいずれかのｃＤＮＡ配列は、分子のいずれかのヌク レオチド・サブセット（Ｓｕｂｓｅｔ）を言及することを意味する。このような 分子の′変異体′は、その分子全体又はそれらの断片のいずれかに実質的に同じ 天然分子を言及することを意味する。

分子の”同族体゛は、その分子全体又はそれらの断片のいずれかに実質的に同じ 非天然分子を言及することを意味する。

両方の分子におけるアミノ酸配列が実質的に同じ場合に、分子は、他の分子に“ 実質的に同じ“であると言われる。実質的に同じアミノ酸分子は、同じ生物学的 活性を有しているであろう。したがって、２つの分子が同じ活性を有していれば 、それらは、変異体と考えられる、なぜなら、その分子の中の１つが他のものに おいて見られない追加のアミノ酸残基を含む場合、又はそのアミノ酸残基配列が 同一でない場合にも、その用語が本明細書中で使用されるからである。

本明細書中で使用されるとき、分子は、それが、正常な分子の一部でない追加の 化学的部分を含むとき、他の分子の″化学的誘導体”であると言われる。このよ うな分子は、その分子の可溶性、吸収性、生物学的半減期、等を改善することが できる。この部分は、あるいは、その分子の毒性を減少させ、その分子等の不所 望の副次的作用のいずれかを取り去り、又は弱めることができる。このような効 果を仲介する能力のある部分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒ ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　１６ｔｈ　ｅｄ、、　Ｍａｃｋ　 Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｅａｓｔｏｎ、　Ｐｅｎｎ、　（１９８０） 中に開示されている。

同様に、本発明のヒｌ−ＴＰＯ抗原の遺伝子の”機能的誘導体（ｆｕｎｃｔｉｏ ｎａｌ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）”は、その遺伝子の、”断片（ｆｒａｇｍｅ ｎｔｓ）”、“変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）”又は”同族体（ａｎａｌｏｇｕｅ ｓ）”てあってヌクレオチド配列において“実質的に同じ“であることいができ 、そして同様の活性を有している分子をコードするものを含むと意味される。

本発明のヒト甲状腺ペルオキシダーゼをコードしているＤＮＡ配列又はその機能 的誘導体は、結合のための平滑末端又はよろめき末端（ｓｔａｇｇｅｒｄ−ｅｎ ｄｅｄ　ｔｅｒｍｉｎｉ）、適切な末端を提供するための制限酵素処理、適切な 付着末端のフィル・イン、不所望の結合を避けるためのアルカリ性フォスファタ ーゼ処理、及び適切なりガーゼによる結合、を含む慣用技術に従って、ベクター ＤＮＡと組換えされることができる。このような操作のための技術は、Ｍａｎｉ ａｔｉｓ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、。

前記に開示されており、そして当分野においてよく知られている。

本発明の目的のための組換えｈＴＰＯの”分泌（ｓｅｃｒｅｔ　１ｏｎ）“は、 宿主細胞により発現された組換えｈＴＰＯがその宿主細胞膜を通して放出され（ ｄｉｒｅｃｔｅｄ）そして解離される（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ことを意味す る。

核酸分子、例えば、ＤＮＡは、それが、転写及び翻訳の調節常法によりを含むヌ クレオチド配列を含み、そしてその配列がそのポリペプチドをコードしているヌ クレオチド配列に”作用可能な状態で結合されている”場合に、ポリペプチドを “発現することができる”と言われる。作用可能な結合とは、その調節ＤＮＡ配 列及び発現されるよう要求されるＤＮＡ配列が遺伝子発現を可能にするような方 法で結合されているところの結合である。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な 性質は、生物間で変動することができるが、一般的に、プロモーター領域であっ て、原核細胞においては、プロモーター（ＲＮＡ転写の開始に向けられる）、並 びにＲＮＡに転写されたときに蛋白合成の開始に信号を与えるであろうＤＮＡ配 列を含むものを含むはずである。このような領域は、正常には、転写及び翻訳の 開始に関係するそれらの５゛−非コード配列、例えば、ＴＡＴＡボックス（ｂｏ ｘ）キャップ配列（ｃａｐｐｉｎｇ）　、ＣＡＡＴ配列等を含む。　゛所望によ り、蛋白質をコードしている遺伝子配列に対する非コード領域３゛は、先に記載 した方法により得られることができる。この領域は、その転写終止調節配列のた めに、例えば、終止（ｔｅｒｍｉｎａｔ　１ｏｎ）及びボリアデニレーンヨン（ ｐｏｌｙａｄｅｎｊ　Ｉａｔｉｏｎ）のために、保持されることができる。それ 故、蛋白をコードしているＤＮＡ配列に天然に近接した３−領域を保持すること により、転写終止シグナルを提供することができる。この転写終止シグナルがそ の発現宿主細胞において満足に作用しない場合には、その宿主細胞において作用 する３−領域と置換されることができる。

２つのＤＮＡ配列（例えば、プロモーター領域配列及びヒト甲状腺ペルオキシダ ーゼ・コード配列）は、その２つのＤＮＡ配列の間の連結の性質が、（＋）フレ ーム・シフト突然変異の導入をもたらさず、（２）甲状腺ペルオキシダーゼ遺伝 子配列の転写に向けるためのプロモーター領域配列の能力を邪魔せず、又は（３ ）甲状腺ベルオキシダーセ遺伝子配列がそのプロモーター領域配列により転写さ れる能力を邪魔しない場合に、作用可能な状態て結合されていると言われる。

プロモーター領域は、そのプロモーターがそのＤＮＡ配列の転写を行うことがで きる場合に、ＤＮＡ配列に作用可能な状態で結合されるであろう。従って、蛋白 を発現するために、適切な宿主により認識される転写及び翻訳シグナルが必要で ある。

本発明は、原核又は真核細胞のいずれかにおけるヒト甲状腺ペルオキシダーゼ蛋 白（又はそれらの機能的誘導体）の発現を包含する。

但し、真核の（そして特に、非甲状腺真核の）発現が好ましい。

好ましい原核宿主は、バクテリア、例えば、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ）、バチ ルス（Ｂａｃｉ　ｌ　Ｉｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎ ｅｌ　ｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉの腸内細菌、例えば、サルモネラ・チ フィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）又はセラチア −フルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、そして様々なシ ュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ口ａＳ）種を利用することもできる。このよう な条件下で、蛋白をグリコジル化することもできる。

原核宿主は、発現プラスミド内のレプリコン（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）及び制御配列 （ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓ；ｅｑｕｅｎｃｅ）と適合しなければならない。

原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）、バチルス・サブチリス（Ｂ。

５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、ストレ プトミセス痰ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、等）内で、ヒト甲状腺ペルオキシダー ゼ蛋白（又はそれらの機能的誘導体）を発現させるために、機能的原核プロモー ターにヒトＴＰＯコード配列を作用可能な状態で結合することが必要である。こ のようなプロモーターは、構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）又は、より好ま しくは、調節的（ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅＸすなわち、誘導的（ｉｎｄｕｃｉｂ ｌｅ）又は抑制的（ｄｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ））てあってもよい。構成的プロモ ータフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーター 等を含む。誘導的原核プロモーターの例は、バクチリオファ１、、　Ｊ、　Ｂａ ｃｔｅｒｉｏｌ、　１６２：１７６−１８２　（１９８５））の及びσ−２８− 特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ、　Ｍ、Ｚ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ 　３２：１１−２０　（１９８４））、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のバクテ リオファージのプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、Ｊ、。

６））を含む。原核プロモーターは、Ｇ１１ｃｋ、　Ｂ、Ｒ，、（Ｊ、［ｎｄ、 　Ｍｉｃｒｏｂ８４））によりレビューされている。

原核細胞における適当な発現は、その遺伝子コード配列の上流のリポソーム結合 部位の存在をも必要とする。このようなリポソーム最も好ましい宿主は、インビ ボにおいて又は組織培養においてのどちらかにおいて、酵母、昆虫、真菌類、及 び哺乳類の細胞を含む真核宿主である。哺乳類細胞は、正しい部位における正し い折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）又はグリコジル化を含む蛋白分子に翻訳後修飾を 提供する。宿主として有用であることができる哺乳類細胞は、繊維芽細胞起源の 細胞、例えば、ＶＥＲＯ又はＣＦ（０−Ｋｌ、又はリンパ球起源の細胞、例えば 、バイブリド−７５Ｐ２１０−ＡＧ１４又は骨髄腫Ｐ３ｘ６３Ｓｇ８、及びそれ らの誘導体である。ＣＩ（Ｏ細胞が目下好ましい哺乳類宿主細胞である。

ＣＨＯ細胞は、ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ発現のために、並びにヒト甲状腺ペ ルオキシダーゼの調節の研究のために、便利な真核宿主でもある。

哺乳類宿主のためには、多くに可能性のあるベクター系を、ヒトＴＰＯの発現の ために利用することができる。多種多様な転写及び翻訳調節配列を、宿主の性質 に依存して使用することができる。この転写及び翻訳調節シグナルは、ウィルス 源、例えば、アデノウィルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ウシ乳頭腫（ｂｏｖｉ ｎｅ　ｐａｐｉｌｌｏｍａ）ウィルス、シミアン（Ｓｉｍｉａｎ）・ウィルス等 であって、その調節シグナルが高いレベルの発現をもつ特定の遺伝子と関係して いるものから得られることができる。あるいは、哺乳類の発現生成物、例えば、 アクチン（ａｃｔｉｎ）、コラーゲン、ミオシン（ｍｙｏｓｉｎ）等からのプロ モーターを使用することができる。その遺伝子の発現が調節されるように、抑制 又は活性化を可能にする転写開始調節シグナルを選ぶことができる。

興味があるのは、調節シグナルであって、温度の変化により発現が抑制又は開始 されることができ、又は化学的調節、例えば、代謝に供されるような温度感受性 であるものである。

酵母は、それが、グリコジル化を含む翻訳後ペプチド修飾をも行うことができる という実質的な利点を提供する。

酵母内で所望の蛋白質の製造のために使用することができるプラスミドの強力な プロモーター配列及び高いコピー数を利用する、多数の組換えＤＮＡの戦略が在 る。酵母は、クローン化哺乳類遺伝子生成物に対するリーダー配列及びペプチド 含有リーダー配列（すなわち、プレーペプチド）を認識する。

さらに、例えば、酵母のユビキチン・ヒドロラーゼ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｈｙ ｄｒｏｌａｓｅ）系の使用により、ユビキチンーヒトＴＰＯ融合蛋白のインビボ における合成を達成することができる。このように製造された融合蛋白は、イン ビボにおいて加工され、又はインビトロにおいて精製及び加工されることができ 、特定アミノ末端配列をもつヒトＴＰＯ蛋白の合成を可能にする。その上、直接 の酵母（又はバクテリア）発現における開始コドン−誘導メチオニン残基の保持 に関係す９８９）。

酵母がグルコースの豊富な培地内で増殖するとき、大量に製造される解糖酵素を コードしている活性発現遺伝子由来のプロモーター及び終止因子を取り込んでい る、いずれかの一連の酵母発現系を利用することができる。公知の解糖遺伝子は 、非常に効果的な転写制御シグナルを提供することもできる。例えば、ホスホグ リセレート・キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ　ｋｉｎａｓｅ）の プロモーター及びターミネータ−・シグナルを利用することができる。

昆虫におけるヒトＴＰＯ又はそれらの機能的誘導体の製造を、例えば、当業者に 知られた方法によりヒトＴＰＯを発現するように操作されたバキュロウィルスに より昆虫宿主を感染させることにより、達成することができる。したがって、１ つの態様においては、ヒトＴＰＯをコードしている配列を、ウィルス多角体蛋白 の調節領域に作用可能な状態で結合することができる（Ｊａｓｎｙ、　５ｃｉｅ ｎｃｅ　２３８：　１６５３　（１９８７）　）。組換えバキュロウィルスによ り感染され、培養された昆虫細胞又は生きた昆虫それ自体は、全蛋白製造の２０ 〜５０％と同じくらい多い量でヒトＴＰＯ蛋白を製造することができる。生きた 昆虫を使用できるときは、毛虫（ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）が、目下、本発明に 記載の大規模ヒトＴＰＯ製造のために好ましい宿主である。

先に討議したように、真核宿主におけるヒト甲状腺ペルオキシダーゼ蛋白の発現 は、真核調節領域の使用を必要とする。このような領域は、一般的に、ＲＮＡ合 成の開始に向けるのに十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核プロモータ ーは、マウスのメタロチオネイン［遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ、　Ｄ、 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ。

母Ｈａ１４遺伝子プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、　Ｓ、Ａ、、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

れらの中で、目下、最も好ましいのは、ＳＶ４０プロモーターである。

広く知られているように、真核ｍＲＮＡの翻訳は、最初のメチオニンをコードし ているコドンにおいて開始される。この理由のために、真核プロモーターと、ヒ トＴＰＯ蛋白（又はそれらの機能的誘導体）をコードしているＤＮＡ配列との間 の結合が、メチオニンをコードすることができるいずれかの介在コドン（すなわ ち、ＡＵＧ）を含まないことを確保することか好ましい。このようなコドンの存 在は、融合蛋白の形成（ＡｔＪＧコドンがヒトＴＰＯコードＤＮＡ配列と同じ読 み取り枠内にある場合）又はフレーム・シフト突然変異（ＡＵＧコドンがヒトＴ ＰＯコード配列と同じ読み取り枠内にない場合）のいずれかをもたらす。

上記のヒトＴＰＯコード配列及び作用可能な状態で結合されたプロモーターは、 受容体の原核又は真核の細胞のどちらかに、非複製ＤＮＡ（又はＲＮＡ）分子で あって、線状分子又はより好ましくは閉共有結合環状分子のどちらかであること ができるものとして、導入されることができる。このような分子は、自己複製が できないので、ヒトＴＰＯ蛋白の発現は、導入された配列の過渡的発現を通して 生じることができる。あるいは、永久的な発現が、その導入配列のその宿主染色 体への組み込みを通して生じることができる。

１つの態様においては、所望の遺伝子配列を宿主細胞の染色体に組み込むことが できるベクターを使用する。導入されたＤＮＡをそれらの染色体に安定して組み 込んだ細胞を、その発現ベクターを含む宿主細胞の選択を許容する１以上のマー カーをも導入することにより選択することかできる。このマーカーは、栄養要求 性宿主に原栄養性を、生物致死の、例えば、抗生物質、又は重金属、例えば、銅 環耐性を提供することができる。選択マーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ 遺伝子配列に直接結合されることができるか、又は共同トランスフェクションに より同一細胞に導入されることができるかのいずれかである。追加の要素（ｅｌ ｅｍｅｎｔｓ）も、１本鎖結合蛋白ｍＲＮＡの最適合成のために必要である。こ れらの要素は、スプライシング・シグナル、並びに転写プロモーター、エンハン サ−１及び終止シグナルを含むことができる。このような要素を取り込んでいる ｃＤＮＡ発現ベクターは、Ｏｋａｙａｍａ、　Ｈ，、Ｍｏ１．　Ｃｅ１．　Ｂｉ ｏｌ、　３：２８０　（１９８３）により記載されているようなものを含む。

好ましい態様においては、導入された配列は、その受容体宿主内で自己複製する ことができるプラスミド又はウィルス・ベクターに取り込まれるであるい。多種 多様なベクターのいずれかを、本目的のために使用することができる。特定のプ ラスミド又はウィルス・ベクターの選択においての重要な要素は：そのベクター を含む受容体細胞がそのベクターを含まない受容体細胞から認識され又は選択さ れることができるという容易性；特定の宿主内で要求される多数のそのベクター のコピー：及び異なる種の宿主細胞の間でそのベクターが”シャトル“すること かできることが必要であるかどうかということを含む。好ましい原核ベクターは 、プラスミド、例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏ！ｉ）内で複製可能なものを含む（例 えば、ｐＢＲ３２２、Ｃｏ１Ｅ１　、　ｐｓｃＩｏｌ、ｐＡＣＹＣ＋８４　、π ＶＸ）　。コｔ：Ｄようなプラスミドは、例えば、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、 ｅｔ　ａｌ、（Ｉｎ：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉＢ、Ａ　Ｉ、ａｂｏｒ ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓ ｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８２）　）によ り開示されている。バチルス（Ｂａｃｉ　Ｉ　Ｉｕｓ）　プラスミドは、ｐｃ１ ９４　、ｐｃ２２１　、ｐＴ１２７等を含む。このようなプラスミドは、Ｇｒｙ ｃｚａｎ、Ｔ、（Ｉｎ：　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ 　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　ＮＹ　（＋９８２ ）、　１１１１．３０７−３２９）により開示されている。好適なスブトモセス ・バクテリオファージ、例えば、φＣ３１（Ｃｈａｔｅｒ、　Ｋ、Ｆ、。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎ：　５ｉｘｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐ ｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓＢｉｏｌｏｇｙ、　Ａｋａ ｄｅｍｉａｉ　Ｋａｉｄｏ、　Ｂｕｄａｐｅｓｔ、　Ｈｕｎｇａｒｙ　（１９８ ６）、　ｐｐ、　４５−５４）を含む。シュードモナス・プラスミドは、Ｊｏｈ ｎ、　Ｊ、Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ。

（Ｒｅｖ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　８：６９３−７０４　（１９８６）） 、反引ｚａｋｉ、　Ｋ、　（Ｊｐｎ、　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　３３ニア２９−７４２　（１９７８））によりレビュー されている。

好ましい真核プラスミドは、ＢＶＰ　、ワクシニア（ｖａｃｃｉｎｉａ）、ＳＶ ４０．２−ミクロン環等又はそれらの誘導体を含む。このようなブラスミｒ　Ｂ ｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：　Ｌ ｉｆｅ　Ｃｙｃｌｅ　ａｎｄ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ、　ＮＹ。

ｐ、　４４５−４７０　（１９８１）＋　Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、Ｒ，、Ｃｅ１ｌ 　２８：２０３−２０４　（１９８２）；　Ｂ。

１ｉｏｎ、　Ｄ、Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｈｅｍａｔｏｌ 、　０ｎｃｏ１．１０：３９−４８　（１９８０）；　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ 、、Ｉｎ：　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　 Ｔｒｅａｔｉｓｅ。

Ｖｏｌ、３．　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ、　ＮＹ、　ｐｐ、　５６３−６０８　（１９８０））。

一旦、構築物を含むベクター又はＤＮＡ配列が発現のために合成されると、その ベクター又はＤＮＡ構築物は、適切な宿主細胞内に、様々な好適な手段の中のい ずれがであって、形質転換、トランスフェクション、接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉ ｏｎ）　、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、及びポリカチオン、例 えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストランによる使用を含むような 生物化学的な手段、並びに、エレクトロポレーション、直接マイクロインジェク ション、ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）ｂｏｍｂａｒ ｄｍｅｎｔ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ２４０（４８ ５８）：１５３８　（１９８８））等のような機械的な手段を含むものにより、 導入されることができる。

ベクターの導入後、受容体細胞を、ベクター含有細胞の増殖について選択する選 択培地中で増殖′させる。クローン化遺伝子配列の発現は、ヒトＴＰＯ蛋白の製 造、又はこの蛋白断片ｐ製造をもたらす。

このことは、形質転換細胞それ自体の中で、又はそれらの細胞の分化を誘導した 後に、生じることができる。

発現蛋白は、慣用条件、例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニテ ィー・クロマトグラフィー、電気泳動等に従って、単離及び精製されることがき る。例えば、細胞は、遠心分離により回収され、又は好適なバッファーにより溶 菌され、そしてその蛋白がカラム・クロマトグラフィーにより、例えば、ＤＥＡ Ｅ−セルロース、ホスホセルロース、ポリリボシチジル酸アガロース（ｐｏｌｙ ｒｉｂＯｃ）Ｉｔｉｄｙｌｉｃ　ａｃｉｄ−ａｇａｒｏｓｅ）、ヒドロキシアパ タイト上で、又は電気泳動又は免疫沈降により単離されることかできる。あるい は、ヒトＴＰＯ又はそれらの機能的誘導体は、抗−ヒトＴＰＯ抗体の使用により 単離されることができる。このような抗体は、よく知られた方法、すなわち、い くつかの本明細書中で述へられるものにより、得られることができる。

ｈＴＰＯに特異的な抗体 本明細書中で使用する用語”抗体”（Ａｂ）又は”モノクロナール抗体”（ｍＡ ｂ）は、無傷の分子並びにそれらの断片（例えば、例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ ’　）２断片）であって、抗原に結合することができるものを含むと意味される 。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’　）２断片は、その循環からより速く清澄になる、無傷 の抗体のＦ。断片を欠いており、そして、無傷の抗体の非特異的組織結合を殆と もたないことかできる（Ｗａｈｌ　ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｎｕｃｌ、λｌｅｄ、 　２４：３１６−３２５　（１９８３乃。

本発明に記載の抗体は、様々な方法の中のいずれかにより製造されることができ る。例えば、ヒトＴＰＯ蛋白又はそれらの機能的誘導体を発現する細胞は、ヒト ＴＰＯを結合することができるポリクロナール抗体を含む血清の生産を誘導する ために、動物に投与されることかできる。

好ましい方法においては、本発明に記載の抗体は、ｍＡｂである。

このようなｍＡｂは、ハイプリドーマ技術（ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ ａｔｕｒｅ　２５６：４９５　（１９７５）；　ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６：５１１　（１９７６）：Ｋｏｈｌｅｒ 　ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、６：２９２　（１９７６）；　 Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ　ｅｔａｌ、、Ｉｎ：　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉ ｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、　Ｅｌｓｅｖｉ ｅｒ、　Ｎ、Ｙ、、　ｐ９．５６３−６８１　（１９８１））を使用して製造さ れることができる。一般的に、このような手順は、ヒトＴＰＯ抗原により動物を 免疫化することを含む。このような動物の牌臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ） を抽出し、そして好適な骨髄腫細胞系と融合する。いずれかの好適な骨髄腫細胞 系を、本発明に従って使用することができる。融合の後、得られたハイプリドー マ細胞を、ＨＡＴ培地中で選択的に維持し、そして次いで、Ｗａｎｄｓ、　Ｊ、 Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　８０：２２５−２３ ２（１９８１）により記載されているような限定希釈によりクローン化する。

このような選択を通して得られたハイプリドーマ細胞を、次に、ヒ）　ＴＰＯを 結合することができる抗体を分泌するクローンを同定するために分析する。

本発明に記載の抗体は、ポリクロナールの、又は好ましくは、領域特異的ポリク ロナール抗体であってもよい。領域特異的ポリクロナール抗体及びそれらの使用 方法は、１９８５年５月７日に出願された、同時係属中の米国出願第０６／７３ １．４７０号中に記載されており、これを、引用によりあたかも全部を述べる如 く本明細書中に取り込む。

本発明に記載のヒトＴＰＯに帯する抗体は、ｆｏｒｗａｒｄサンドイッチ、ｒｅ ｖｅｒｓｅサンドイッチ、及び同時サンドイッチ検定のような、免疫計量の（ｉ ｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ）又は”サンドイッチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）”の検定を 含む、当業者に知られた標準的な免疫診断検定における使用に非常に好適である 。この抗体は、ヒトＴＰＯ抗原又はそれらの等個物についての、許容される特異 性、感度、及び正確さを存する免疫検定を行うだめの過度な実験を伴わずに、当 業者により測定されることができるような、数種類の組み合わせにおいて使用さ れることができる。

免疫学の一般的な原理について記載している標準的な参照文献は、Ｒｏｉｔｔ、 　１．、　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　５ｉｘｔｈ　Ｅｄ、 、　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、 　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、　０ｘｆｏｒｅｄ　（１９８８）；にｉｍｂａｌｌ、　 Ｊ、Ｗ、。

５）；　Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ａ、、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ 　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、”　ｉｎ、Ｂｕｒｄｅｓｓ、　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、 　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８０）を含む。

”検出“は、基質の存在の有無を決定し又は基質の量を定量することを含むこと を意図している。それ故、この用語は、定性的及び定量的測定のために本発明の 、物質、組成物及び方法を使用することをさしている。

本明細書中に記載されたものと同じ特異性をもつｍＡｂを分泌する他のハイブリ ドーマの単離は、抗−イディオタイプ（ｉｄｉｏｔｙｐｅ）スクリーニングの技 術により達成されることができる。Ｐｏｔｏｃｍｊａｋ、　ｅｔａｌ、、　５ｃ ｉｅｎｃｅ　２１５：１６３７　（１９８２）。簡単に言えば、抗−イディオタ イプ（抗−［ｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位に一般的に関係するユニーク抗原 決定基を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、そのｍＡｂに対し”Ｃ抗−１ｄが作 られているところのｍＡｂをもつｍＡｂ源と同じ種及び遺伝子型の動物（例えば 、マウス株）を免疫化することにより製造される。免疫化された動物は、それら のイディオタイプ決定基に対する抗体（抗−［ｄ抗体）を生産することにより、 免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識し、そしてそれと反応するであろう。

与えられたｍＡｂ上のイディオタイプ決定基に特異的な抗−Ｉｄ抗体を使用する ことにより、次に、そのイディオタイプを共有する他のＢ細胞又はハイブリドー マ・クローンを同定することが可能である。

２つのクローンの抗体産物間のイディオタイプの同一性は、その２つのクローン の抗体産物が同じ抗原エピトープを認識するということを非常に起こり易くする 。

抗−［ｄ抗体は、さらに他の動物において免疫反応を誘導するだの”免疫原”と して使用されることもでき、いわゆる、抗−抗−［ｄ抗体を作り出す。この抗− 抗−［ｄ抗体は、抗−１ｄを誘導した元のｍＡｂとエピトープについて同一であ ることができる。

それ故、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することにより、同 一の特異性をもつ抗体を発現する他のクローンを同定することができる。

したがって、ｈＴＰｏに対して作られたｍＡｂは、好適な動物、例えば、ＢＡＬ Ｂ／ｃマウスにおいて、抗−］ｄ抗体を誘導するために使用されることができる 。このような免疫化マウスからの牌臓細胞を、抗−［ｄ　ｍＡｂを分泌する抗− １ｄハイブリドーマを作るために使用する。さらに、この抗−［ｄ　ｍＡｂは、 担体、例えば、Ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔヘモシアニン（ＫＨＬ）と結合さ れることができるし、そして追加のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化するために使用 されることができる。これらのマウスからの血清は、ｈＴＰｏエピトープに特異 的な元のｍＡｂの結合性質をもつ抗−抗−［ｄ抗体を含むであろう。したがって 、この抗−１ｄ　ｍＡｂは、それら自体のイディオタイプのエピトープを、又は 評価されているエピトープ、例えば、ｈＴＰＯに構造的に類似した”イディオト ーブ（ｉｄｉｏｔｏｐｅ）”をもっている。

複製のために、本発明のハイブリドーマ細胞を、インビトロ又はインビボにおい て培養することができる。インビボ製造における高い力価のｍＡｂの製造は、こ れを、目下のところ好ましい製造方法にする。簡単に言えば、個々のハイブリド ーマからの細胞を、高い濃度の所望のｍＡｂを含む腹水液を作り出すために、ｐ ｒｉＳｔａｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ　ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射する。イソ タイプ［ｇＭ又は［ｇＧのｍＡｂを、このような腹水液から、又は培養上澄液か ら、当業者によく知られたカラム・クロマトグラフィー法を使用して、精製する ことができる。

本発明に記載の抗体は、それらが液相において使用され又は固相担体に結合され ることができるところの免疫検定における使用に特に好適である。さらに、これ らの免疫検定における抗体は、各種の方法で検出できるようにラベルされること ができる。

当業者に知られた多くの異なるラベル及びラベリング法が在る。

本発明において使用されることができるラベルのタイプの例は、それに限定され ないが、酵素、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、化学発光（ｃｈｅｍｉ　ｌｕ ｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）化合物、生物発光（ｂｉｏｌｕｍｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）化 合物及び金属キレートを含む。当業者は、抗体への結合に好適な他のラベルを知 るであろうし、又は定例的な実験作業の使用により上記と同じものを確定するこ とができるであろう。さらに、それらのラベルの抗体への結合は、当業者に一般 的に知られた標準的な技術を使用して行われることができる。

本発明に記載の抗体が検出可能なものとしてラベルされることができる方法の中 の１は、抗体を酵素に結合することによるものである。この酵素は、今度は、そ の後その基質に晒されたとき、例えば、分光光度計又は蛍光計手段により、同様 に検出されることができる化学的部分を作り出すようなやり方でその基質と反応 するであろう。

検出可能なものとして抗体をラベルするために使用されることができる酵素の例 は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスのヌクレアーゼ、デルタ− Ｖ−ステロイド・イソメラーゼ、酵母アルコール・デヒドロゲナーゼ、アルファ ーグリセロホスフェート・デヒドロゲナーゼ、トリオース・ホスフェート・イソ メラーゼ、ビオチン−アビジン・ペルオキシダーゼ、ホースララディッシュ・ペ ルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース・ オキシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼ、リボヌクレアー七（ｒｉｂｏｎｕｃ ｌｅａｓｅ）、ウレアーゼ（ｕｒｅａｓｅ）、カタラーゼ、グルコース−Ｖ［− ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリン・エス テラーゼを含む。

検出可能なものとしてラベルされた抗体の存在は、その抗体を放射性アイソトー プによりラベルすることにより検出されることもでき、これは次いて、ガンマ・ カウンター又はシンチレーション・カウンターを使用するような手段にり測定さ れることができる。本発明の目的のために特に有用なアイソトープは、２１．１ ．ｓ　ｌ、　３２ｐ、”Ｓ　、”Ｃ、”Ｃｒ、　”ＣＬ　”Ｃｏ、Ｓ＠Ｃｏ、　 ６１Ｆｅ及び７６Ｓｅである。

抗体を蛍光化合物によりラベルすることにより、検出可能なものとしてラベルさ れた抗体の結合を検出することもできる。蛍光ラベルされた抗体が適当な波長の 光に晒されたとき、次に、その存在が、その染料の蛍光により検出されることが できる。最も一般的に使用される蛍光ラベル化合物中には、フルオレセイン（ｆ 　１ｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、イソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔ ｅ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒ ｙｔｈｒｉｎ）　、フィコシア、ニン（ｐｈｙｃｏｃｙａｎ　ｉｎ）、アロフィ コシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）　、ｏ−フタルアルデヒド（ｏ −ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ）及びフルオレサミン（ｆ　ｌｕｏｒｅｓｃａ ｍｉｎｅ）がある。

本発明の抗体は、蛍光発光金属−２例えば、＋６１１：ｕ、又はランタナイド（ Ｉａｎｔｈａｎｉｄｅ）族の他のものを使用して検圧可能なものとしてラベルさ れることもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰ Ａ）又はエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を使 用して抗体分子に付着されることができる。

抗体は、それらを化学発光化合物に結合することにより検出可能なものとしてラ ベルされることもできる。化学発光の札を付けらゎた抗体の存在は、次に、化学 反応の経過の間に生じる発光の存在を検出することにより測定される。特に有用 な化学発光ラベリング化合物の例は、ルミナール（ｌｕｍｉｎａｌ）　、イソル ミノール（ｉｓｏｌｕｍｉｎｏｌ）、　ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃアクリジニウム・ エステル、イミダゾール、アクリジニウム（ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ）塩、オギザ レート（ｏｘａｌａｔｅ）　・エステル、及びジオキセタン（ｄｉｏｘｅｔａｎ ｅ）である。

同様に、生物発光化合物が、本発明に記載の抗体をラベルするために使用される ことができる。生物発光は、触媒蛋白が化学発光反応の効率を増加させるところ の生物系内で見つかった化学発光の１つのタイプである。生物発光抗体の存在は 、発光の存在を検出することにより測定される。ラベリングの目的のために重要 な生物発光化合物は、ルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）　、ルシフェラーセ （ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）及びエクオり二ノ（ａｅｑｕｏｒ　ｉｎ）を含む。

本発明の抗体及び実質的に精製された抗原は、理想的には、キットの調製に好適 である。このようなキットは、そこに、１以上の容器手段、例えば、バイアル、 チューブ等を閉じ込めて入れ込むために仕切られている担体手段であって、上記 の容器手段のそれぞれが使用される検定の別個の要素を含んで成るものを含んで 成ることができる。

キット形態に取り込まれることができる検定のタイプは、多く、そして、例えば 、競合的及び非競合的検定を含むことができる。本発明の抗体を使用することが できる検定の典型的な例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＡＧ）　、酵素イムノア ッセイ（ＩＥＩＡ）　、酵素結合イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）　 、及び免疫計量の、又はサンドイッチの免疫検定である。

上記の用語“免疫計量検定（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ　ａｓｓａｙ）”又は“ サンドイッチ免疫検定”は、同時サンドイッチ、ｆｏｗａｒｄサンドイッチ及び ｒｅｖｅｒｓｅサンドイッチ免疫検定を含むことを意味している。これらの用語 は、当業者にはよく知られている。当業者は、本発明に記載の抗体が現在公知で あり又は将来発展することができる検定の他の変法及び形態において有用であろ うことを理解することもできるであろう。これらは、本発明の範囲内に含まれる ことを意図されている。

Ｆｏｗａｒｄサンドイッチ検定は、例えば、米国特許第３．８６７、５１７号： 第４．０１２．２９４号及び第４．３７６、１１０号中に記載されている。Ｒｅ ｖｅｒｓｅサンドイッチ検定は、例えば、米国特許第４．０９８．８７６号及び 第４，３７６．１１０号中に記載されている。

上記の検定を行うために好ましい態様においては、特定の”遮断薬（ｂｌｏｃｋ ｅｒｓ）“がインキュベーション培地（普通には、ラベルされた可溶化抗体を添 加されている）中に存在することが重要である。

この”遮断薬“は、偽陽性又は偽陰性結果を作りだすために、非特異的蛋白、プ ロテアーゼ、又は実験サンプル中に存在するマウス免疫グロブリンに対するヒト 抗体が、固相支持体上の抗体、又は放射ラベルされた指示薬抗体と架橋し又は破 壊しないことを確保するために添加される。それ故、”遮断薬”の選択は、実質 的に、本発明中に記載された検定の特異性を増加させる。

検定において使用されるものと同じクラス又はサブクラス（イソタイプ）の多数 の無関係な（すなわち、非特異的な）抗体（例えば、ＩｇＧ　ｌ、　ＩｇＧ　２ −２−１Ｉ　、等）は、”遮断薬“とじて使用されることができる。”遮断薬” の濃度（正常には、ｌ−１００μｇ／μｌ）は、適当な感度を維持しそれにもか かわらずヒト血清中で相互に生じる交差反応蛋白による不所望の妨害のいずれを も阻害するために、重要である。さらに、”遮断薬”を含むバッファー系は、最 適化される必要がある。好ましいバッファーは、生理学的ＰＨ範囲における、弱 い有機酸、例エバ、イミダソール、ＨＥＰＰＳ　、　ＭＯＰＳ、　ＴＢＳ　、　 ＡＤＡ　、　ＡＣＢＳ、ＨＥＰＥＳ　、　ＰＩＰＥＳ　、　ＴＲｌ５、等に基づ くものである。幾分少なく好まれるのバッファーは、無機バッファー、例えば、 リン酸塩、ホウ酸塩又は炭酸塩である。最後に、公知のプロテアーゼ阻害剤を、 上記の”遮断薬“を含むバッファーに添加しなければならない（正常には、０． ０１−１０　μｇ／ｍｌ）。

従来使用されてきた、そして本発明において使用されることができる多くの固相 イムノソルベントが在る。よく知られたイムノソルベントは、ガラス、ポリスチ レン、ポリプロピレン、デキストラン、ナイロン及び他の物質であって、それら の物質等から作られ又はそれで被覆されたチューブ、ビーズ、及びマイクロタイ ター・プレートの形態のものを含む。固定化された抗体は、アミド又はエステル 結合を介しての共有結合のような技術により、又は吸収により、上記固相イムノ ソルベントに、共有結合か又は物理的にかのいずれかで結合されることができる 。当業者は、多くの他の好適な固相イムノソルベント及びそれらの上に抗体を固 定する方法を知るであろうし、又は、定例的な実験作業以上のものを使用するこ となくそれを確認することができるであろう。

インビボ、インビトロ又はその場における診断のために、放射性核種（ｒａｄｉ ｏｎｕｃｌｉｄｅｓ）のようなラベルを、直接的にか又は仲介官能基の使用のい ずれかにより本発明に記載の抗体に結合することができる。金属カチオンとして 存在するラジオアイソトープを抗体に結合させるためにしばしば使用される仲介 基は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）である。このように結合さ れる金属カチオンの典型的な例は＝９Ｇ′″Ｔｃ、＋２１１　、　ＩＩＩ　ＩＮ 、＋２１　［、１７Ｒｕ、　＠ＩＣｕ、　＠７Ｇａ及び６　＠　Ｇａである。本 発明の抗体は、診断目的のためには、非放射性アイソト−プによりラベルされる こともできる。このやり方において特に有用なの元素は、ＩＳ？　Ｇｄ、　６Ｓ Ｍｎ、＋１２　［１，５２Ｃｒ及び５ａｐｅである。

本発明のｈＴＰＯコードＤＮＡ配列又はそれらの断片を、よく知られたハイブリ ダイゼーション方法に従い相補的なりＮＡ配列を単離し又は検出するためのＤＮ Ａプローブとして使用することができる。ヒト抗原遺伝子を、次に、クローン化 し、そして宿主内で発現させ、ヒト抗原を与える。このヒト抗原を、次に、その 対応する自己抗体についての診断検定において使用することができる。

本発明の抗原を、本発明に記載の抗体を使用する実質的に純粋な形態において単 離することができる。したがって、本発明の態様は、それが本発明の抗−ｈＴＰ Ｏ抗体により認識されそしてそれに結合することを特徴とする、実質的に純粋な ｈＴＰＯを提供する。他の態様においては、本発明は、ｈＴＰＯに対して向けら れた１以上の抗体と複合体を形成することにより、ｈＴＰｏを単離又は精製する 方法を提供する。

本発明の実質的に純粋なｈＴＰＯは、今度は、サンプル、例えば、血清又は尿中 のｈＴＰＯに対する抗体を検出又は測定するために使用されることができる。し たがって、本発明の１つの態様は、ｈＴＰｏに対する抗体を含むサンプルを検出 可能なものとしてラベルされたｈＴＰｏと接触させ、そしいてそのラベルを検出 することを含んで成る、サンプル中のｈＴＰｏに対する抗体の存在又は量を検出 する方法を含んで成る。

ｈＴＰＯの免疫反応性分画及び免疫反応性同族体を使用することもできることは 、理解されるであろう。用語”免疫反応性分画”は、ｈＴＰＯに対して向けられ た抗体による等価な認識又はそれへの結合を示すｈＴＰＯのいずれかの部分を意 図している。用語”免疫反応性同族体“は、抗−ｈＴＰＯ抗体による等価な認識 又はそれへの結合を示すが１以上のアミノ酸についてｈＴＰｏから異なっている 蛋白を意図している。

ＴＰＯに特異的なＴ細胞 自己免疫疾患は、自己抗原によるＴ細胞の執拗な活性化を、少な炎の場合には、 このような自己抗原は、Ｂ細胞が抗−ＴＰＯ抗体を作るのを助けることができる Ｔ細胞、又は他のいずれかの知られた機構による自己免疫過程（以降を参照のこ と）に関係するＴ細胞の上のレセプタにより認識されるＴＰＯのいずれかのエピ トープであることができる。

本発明者によりもくろまれるような、自己免疫甲状腺疾患の治療への１つのアプ ローチは、この疾患過程に関係するＴリンパ球の働きを破壊することに焦点を合 わせている。Ｔ細胞は、例えば、甲状腺摘出標本から抽出された浸潤物の形態に おけるＧｒａｖｅｓ’　疾患にける、甲状腺から難なく入手することができる。

このような浸潤物を研究することにより、それ、らの病因関連性について、イン ビボにおいて選択されたＴ細胞の抗原特異性を検査することができる。

例えば、上記の浸潤Ｔ細胞（並びに、循環内及びリンパ器官、例えば、リンパ節 及び牌臓内に存在するＴ細胞）は、ＴＰＯエピトープと反応し、モしてＢ細胞が 特異的抗−ＴＰＯ抗体を作ることを助けるＴヘルパー細胞として働くことができ る。あるいは、又はさらに、このようなＴ細胞は、細胞仲介免疫反応を仲介し、 そして直接的にか又はサイトカインの局所放出を介してのどちらかにより甲状腺 上皮細胞上に作用することができる。これは、ＴＰＯに特異的な細胞毒性Ｔ細胞 が活性化され、又は炎症反応を介して異なるＴ細胞クラスにより仲介されたとき 、甲状腺上皮細胞の破壊を導くことができる。

このようなＴ細胞の活性化又は作用の破壊は、一方において抗−ＴＰＯ抗体の生 産を、又は他方において甲状腺上皮損傷Ｔ細胞の生産を抑制するのに役立つであ ろう。

それ故、１つの態様は、ＴＰＯ−特異的Ｔ細胞のＴ細胞レセプタ（ＴＣＰ）に結 合することができるペプチドを提供する。このようなＴＰＯ−関連ペプチドは、 少なくとも、ＴＰＯのＴ細胞エピトープの一部（例えば、例Ｘ［［のＮＰ−７エ ピトーブ）を含む。作用なペプチドは、ＴＰＯ−特異的Ｔ細胞のＴＣＲに結合す ることができる、ＴＰＯの約５以上のアミノ酸の配列、又はそのようなペプチド の誘導体を含む。生来の自己抗原のための競合的な拮抗物質として作用する、上 記のペプチドは、抗原がＴ細胞に現れることを抑制し、あるいは抗−ＴＰＯ抗体 又はＴＰＯ−特異的細胞仲介免疫性のどちらかを作り出すために必要な免疫系に おける他の抗原−特異的細胞−細胞（例えば、Ｔ−Ｔ又はＴ−Ｂ）相互作用を抑 制することができる。（自己免疫疾患の免疫治療へのこのようなペプチドに基づ くアプローチの討議については、例えば：引用により本明細書中に取り込む）を 参照のこと。）。

本発明の他の態様は、上記のペプチドを含んで成る医薬調製物を提供する。本発 明のさらに他の態様においては、橋本甲状腺炎に限定されないがこれを含む自己 免疫疾患の治療方法であって、そのような疾患を患っている患者にＴＰＯ関連ペ プチドを含んで成る医薬調製物を投与することを含んで成るものを提供する。

本発明の範囲内でもくろまれたの他のペプチドに基づいた治療的）；５ｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒ、２５８：５２−６０　（１９８８）：　Ｈｏ５ｐ、Ｐｒ ａｃ、ｐｐ、５７−６４　（Ｆｅｂｒｕａｒｙ　１５．　１９８９）；　Ｃｏｈ ｅｎ、［、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、［ｍｍｕｎｏｌ、　Ｔｏｄａｙ　９：３３２− ３３５　（１９８８））及びそのようなＴＰＯ特異的Ｔ細胞のＴＣＰを真似るペ ブる。このような調製物は、′抗−自己免疫性（ｃｏｕｎｔｅｒ−ａｕｔｏｉｍ ｍｕｎｉｔｙ）”の状態を誘導することによりＴＰＯに対する自己免疫反応を予 防又は抑制するために患者に投与される。このような抗−自己免疫性は、自己免 疫性（すなわち、ＴＰＯ特異的）Ｔ細胞に特異的なＴ細胞により仲介されると考 えられる（Ｃｏｈｅｎ、前記、Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ　ｅｔ　ａｌ、。

それ故、本発明は、”ワクチン“とじて作用し、そして抗−自己免疫性の状態を 誘導することができる、ＴＰＯに特異的なＴ細胞に向けられている。他の態様は 、そのようなＴ細胞のＴＣＲ−模倣ペプチドを含む。さらに他の態様は、上記の ＴＰＯ特異的Ｔ細胞により誘導されたＴ細胞、及び上記の抗−自己免疫効果を仲 介し又はＴＰＯ特異的Ｔ細胞をダウン・レギュレート（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａ ｔｅ）するＴＣＲペプチド・ワクチンに向けられている。本発明の他の態様は、 上記のＴ細胞ワクチン、ＴＣＰペプチド、又は統一自己免疫Ｔ細胞を含んで成る 医薬調製物を提供する。本発明のさらに他の態様においては、ＴＰＯ特異的Ｔ細 胞ワクチン、ＴＣＰペプチド・ワクチン、又はＴＰＯ特異的Ｔ細胞に特異的な抗 −自己免疫性Ｔ細胞のいずれかを含んで成る医薬調製物の使用を含む、自己免疫 疾患、例えば、橋本甲状腺炎の治療方法を提供する。

本発明の追加の態様は、抗−８細胞又はＴ細胞と特異的に相互作用することがで きるＴサプレッサー（Ｔｓ）リンパ球であって、抗−ＴＰＯ免疫反応を抑制を導 くものに向けられている。このような抑制は、ＴＰＯ−特異的抗体の生産につい てのもの、又は例えば、細胞毒性Ｔ細胞により仲介された又はＴＰ叶特異的遅延 型過敏症における、ＴＰＯ−特異的Ｔ細胞−仲介甲状腺損傷についてのものであ ることができよう。

それ故、１つの態様においては、本発明は、抗原−特異的Ｔｓ細胞を誘導するこ とができるＴＰＯのエピトープに、そしてＴｓ細胞の製造における及び自己免疫 甲状腺炎の治療におけるその使用に向けられている。他の態様は、医薬調製物に おけるＴＰＯ−特異的Ｔｓである。さに他の態様は、自己免疫性甲状腺炎、例え ば、橋本疾患の治療方法であって、Ｔｓ細胞を誘導することができるＴＰＯエピ トープを含んで成る医薬１１ｍ物を投与することを含んで成るもの、に向けられ ている。

追加の態様は、抗−ＴＰＯ反応を抑制することができるＴＰＯ＝特異的ＴＳ細胞 を含んで成る医薬調製物を投与することによる自己免疫性甲状腺炎の治療方法で ある。サプレッサー細胞の討議については、例えば、Ｇｒｅｅｎ、　Ｄ、、　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、　ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１：４３９　（１，９８３ ）及びＢｅｎａｃｅｒｒａｆ、Ｂ、、Ｉｎ、、Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　 １ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅ、ＨＰ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ 、、　Ｉｎｃ、、　ＮＹ、　ｐｐ、　４９−６２　（１９８３）を参照のこと。

本発明は、当業者に一般的に知られている標準的な技術を使用して、Ｔ細胞のエ ピトープ又はＴＰＯのエピトープ（以降の例Ｘ［Ｉを参照のこと）を決定するこ とを可能にする。さらに、本発明は、例えば、Ｂｕｒｎｓ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６９：　２７　（１９８９）に記載され ているような方法を使用して、ＴＰＯに特異的な自己免疫ＴＣＰの特徴付けを可 能にする。自己免疫Ｔ細胞かＴＰＯとの反応から取り除かれ又は回避されること ができる場合には、甲状腺炎の効果を、非常に和らげることができる。この目的 を達成するであろう、ＴＰＯのための自己免疫ＴＣＰに特異的な、Ｔ細胞を、例 えば、Ａｃｈａ−Ｏｒｂｅａ、　Ｈ，。

ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、　ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　７：　３７１　（１ ９８９）中に記載されている方法を使用して製造することができる。

本発明の実施方法は、以下の例を参照することにより当業者によりさらに十分に 理解されることかできるが、例は、本発明の又はそれに向けた請求項の範囲を限 定することをいかなるやり方においても意図されていない。

甲状腺ｃＤＮＡライブラリーを、そのコード方向において、完全−長ｃＤＮＡの 含有物を最大化するために構築した。増殖性の甲状腺組織を、（、ｒａｖｅｓ’ 　疾患のために甲状腺摘出を経験した患者から得た。ｍＲＮＡを、Ｒａｎ他の方 法（ｔ（ａｎ、　Ｊ、Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２６：１６１ ７−１６２５　（１９８７））に従って単離した。２水路ｃＤＮＡを、Ｇｕｂｌ ｅｒ及びＨｏｆｆｍａｎ（Ｇｕｂｌｅｒ。

Ｕ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　２：２６３−２６９　（１９８３））によ り記載されたように、１５Ｈｇ　ｍＲＮＡから合成した。Ｎｏｔ　ｌ及びＸｂａ 　ｉ　リンカー−プライマー／アダプターをそのｃＤＮＡに取り込み、そのｃＤ ＮＡのそれぞれ５゛及び３°末端においてそれらの制限部位を作った（Ｒａｎ、 　Ｊ、Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２６：１６１７−１６２５　 （１９８７））　、このｃＤＮＡを、アガロース・ゲル（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ、 　ＦＭＣ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　ＭＥ）電気泳動によりサイズ−選択（＞１ｋｂ ）　Ｌ、、Ｎｏｔ　ｌ及びＸｂａｌ　Ｉにより消化し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを 使用してＮｏｔ　［−及びＸｂａ　ｉ−切断したバクテリオファージ・ラムダ− Ｚａｐに結合し、そしてパッケージングした（Ｇｉｇａ−Ｐａｋ　Ｇｏｌｄ、　 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ。

ＣＡ）。得られたファージ・ライブラリーは、増幅前、全体として２Ｘ　１０’ 組換えクローンを含んでいた。

例１１ 完全−長ヒ）４ＰＯｃＤＮＡのためのスクリーニング増幅したｃＤＮＡライブラ リーを、１５０ｎ＋ｎ＋直径皿当たり４　ｘ　１０’　ｐｆｕの密度においてブ レーティングし、そして部分的ヒトＴＰＯｃＤＮＡクローン（クローン１９）か らの挿入物を使用してブロービングした。２つの陽性なバクテリオファージのク ローンを、単離した。このヒトＴＰＯｃＤＮＡ挿入物を含むＢｌｕｅｓｃｒｉｐ ｔファージミドを、Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ手順に従って、ヘルパー・ファージ Ｒ４０８を使用してこれらのクローンの中の１つから作った。得られた組換えＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（ｐＨＴＰＯ−ＢＳ）は、翻訳開始部及びポリー Ａ尾を含む、ヒト甲状腺ペルオキシダーゼｃＤＮＡの塩基５−３０６０を含んで いた。ＤＮＡ配列を、ｔｈｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｋｉｔ及び手順（Ｕｎｉｔｅｄ 　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ）を 使用して、この２本鎖プラスミドから決定した。。このｃＤＮＡ内の配列は、そ の５′及び３゛末端において、そしてそのｃＤＮＡの全体にわたり分散した１０ ヌクレオチド・プライマーに隣接する領域において、ヒトＴＰＯ１、Ｅｎｄｏｃ ｒｉｎｏｌ、　ｌ：８５６−８６１　（＋９８７））。

７３２　（１９８６））を、叶、　Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｒｕｔｔｅｒ　（Ｕ、Ｃ， Ｓ、Ｆ、）から得た。ヒトＴＰＯｃＤＮＡを、図１中に記載するように、このベ クターの多クローニング部位にクローン化した。酵素反応及びＤＮＡ操作を、Ｍ ａｎｉａｔｉｓ他（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ　（１９８２乃中に記載されたように、行った。

ｐＨＴＰｏ−ＥＣＨによる、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞のトランスフェ クション チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞系ＣＨＯ−Ｋｌを、ｌＯ％ウシ胎児血清、ペ ニシリン（１２５単位／ｍ１）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及び アンフオテリシン（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）−Ｂ（２，５ｔｔ　ｇ／ｍｌ） を補われたＨａｍｓ’　Ｆ−１２培地中で維持した。Ｇ−４１８（ＧＩＢＣＯ， Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）によるトランスフェクション及び選択を。

Ｃｈｅｎ及びＯｋａｙａｍａの方法（Ｃｈｅｎ、　Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ １．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　７：２７４５−２７５２　（１９８７））によ り行った。２０ＨｇのｐＨＴＰＯ−ＥＣＥプラス２μｇのｐＳＶ２−ｎｅｏ（２ ８）（Ｄｒ、　ＪｏｈｎＢａｘｔｅｒ、　［Ｊ、Ｃ，Ｓ、Ｆからの）を、トラン スフェクションのために使用した。２０ＨｇのｐＥＣεプラス２μｇのｐＳＶ２ −ｎｅｏ、及び２０ＨのｐＳＶ２−ｎｅｏ単独による対照トランスフェクション を同時に行った。

全ての細胞ＲＮＡを、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋ　ｉ及び５ａｃｃ旧の方法（Ｃｈｏ ｍｃｚｙｎｓｋｉ。

Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６２：１５６−１ ５９　（１９８７））により抽出した。１５ＨｇのＲＮＡを、Ｍａｎｉａｔｉｓ 他（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８２））中に 記載されたように、ホルムアルデヒド・ゲル上で電気泳動にかけた。ＲＮＡを、 Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ膜（ＢｊｏＲａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）上にプ ロットし、そして０．５６ｋｂのヒトＴＰＯｃＤＮＡプローブ（クローン３１挿 入物）によりブロービングし、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉ ｇｈｔｓ、　ＩＬ）からのｔｈｅ　ｌＪｕｌｔｉ−Ｐｒｉｍｅラベリング・キッ トを使用して、４　Ｘ　１０’　ｃｐｍ／μｇＤＮＡの比活性にラベリングした 。

匹Ｎ トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を抽出し、可溶性蛋白を得た。

５つのｌｏＯ＋ｎｍ直径皿を、カルシウム−マグネシウムを含まないリン酸バッ ファー生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。吸引後、１０μｇ／ｍｌのロイペ プチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）　、０．５ｍｇ／ｍｌのバシトラシン（ｂａｃｉ 　ｔｒａｃｉｎ）及び２ｍＭのフェニルメチルスルホニル・フルオリド（すへて は、Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯからのもの）を補われた。上記 と同じバッファー中の０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００の５ｍｌを第一の皿に 添加した。この開始細胞溶液を、こそげ取り、そして他の４つの細胞の皿に順次 後した。

この細胞溶液を、次に、４°Ｃで１時間混合した。１０，０００　ｘ　ｇで３分 間遠心分離した後、その上澄を、蓄え、そして使用まで−２０’Ｃで保存した。

蛋白含有量を、測定しくＢｒａｄｆｏｒｄ、　Ｍ、Ｍ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ。

７２：２４８−２５４　（１９７６））そして５０μｇ蛋白／レーンを、７．５ ％ポリアクリルアミドＳＤＳゲル（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に、、　Ｎａｔｕｒ ｅ　２２７：６８０−６８９　（１９７０））上で電気泳動にかけた。蛋白質を 、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、９２ｍＭグリシン、２０％メタノールを含むエレクト ロブロッティング装置（Ｈｏｅｆｆｅｒ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｊｓｃｏ、　Ｃ Ａ）内で、ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌ ｌ。

Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨ）に電気的に転移させた（３０Ｖ　ｘ　５時間、又は２５０ ｍＡ　−夜）。その後の実験においては、転移を、製造者の指示に従って、０、 　＋５Ｍ　ＮａＣ１）中で１回、次に、０．５％Ｔｗｅｅｎ　２０（Ｓｉｇｍａ 、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ。

ＭＯ）を含むＴＢＳ中で室温において３０−６０分間、濯いだ。ＴＢＳ−Ｔｗｅ ｅｎにより３回のさらなる濯ぎの後、Ｙｏｕｎｇ及びＤａｖｉｓ（Ｙｏｕｎｇ、 　Ｒ，Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐａｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌ ｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、、　７：２９−４１　（１９８５））により記載され たように、甲状腺ミクロソーム抗原に対するマウスｍＡｂの１：２５０希釈物（ ｐｏｒｔｍａｎｎ、　Ｌ、、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓ ｔ、　８１：１２１７−１２２４　（１９８８））、その後のホースラディシュ ・ペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗−マウス［ｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　 Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）の１：２５０希釈物を使用して、そのプロットをブロービ ングした。

他の実験においては、ＣＨＯ−ＨＴＰＯ１２ｂ細胞抽出物を、叶、　Ｓ、　Ｍ、 　ＭｅＬａｃｈｌａｎ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗａｉｅｓ、　Ｃａｒ ｄｉｆｆにより提供された、ポリクロナールの橋本甲状腺炎のパネルを使用して 、プロービングした。

抗ミクロソーム抗体の力価は、過剰のサイログロブリンの存在中の酵素−結合イ ムノソルベント検定（ＥＬ［ＳＡ）　（Ｊａｎｓｓｏｎ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、 。

Ｃｌ１ｎ、　Ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６３：８０−８６　（１９８６）） により先行して測定されていた。多数の橋本甲状腺炎の血清を、Ｍｉｎｉｂｌｏ ｔｔｅｒ　４５　ｍａｎｉｆｏｌｄ（１ｍｍｕｎｅｔｉｃｓ、　Ｃａｍｂｒｉｄ ｇｅ、　Ｍａｓｓ、）を使用して、４℃で一夜、単一のフィルターに塗布した。

次に、膜を先に記載したように処理した。但し、Ｆｃ断片持異的な、アルカリ性 ホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ　（Ｃａｐｐｅｌ、　Ｏｒｇａｎｏｎ　 Ｔｅｋｎｉｋａ　Ｃａｒｐ、、　Ｗｅｓｔ　Ｃｈｅｓｔｅｒ、　ＰＡ）を、１０ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ９，５，１００ｍＭ　ＮａＣｌ、　５ｍＭ　ＭｇＣ１ ｚ中に、ニトロブルー・テトラゾリウム（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ　ｔｅｔｒａｚｏ ｌｉｕｍ）　（０，３ｍｇ／ｍｌ）及び５−プロモー４−クロロ−３−インドー ルイル−ホスフェート（０，１５ｍｇ／ｍｌ）を含む第二抗体として使用した。

３２　（１９８６乃により記載されているように、処理した。簡単に言えば、１ ００ｍｍ直径皿からの細胞を、温和なトリプシン処理により解離させ、そしてそ の細胞を、Ｈａｍ’　ｓ　Ｆ１２培地、１０％０％ウシ胎清（上記を参照のこと ）中で濯ぎ、そしてペレット化（４°Ｃ，１００ｘ　ｇで５分間）した。この細 胞を、０．２ｍｌの、リン酸塩バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）　、１０ｍＭ　 Ｈｅｐｅｓ、　ｐＨ７，４，０，０５％Ｎａアジド（バッフｙ　Ａ）中に再懸濁 させた。テストされるべき血清（２μｌ）を、４°Ｃで３０分間添加し、２％ウ シ胎児血清を含むバッファーＡ中で２回濯ぎ、そして０．２ｍｌの上記と同じ溶 液中に再懸濁させた。２５μｌのＦｃ特異的な、アフィニティー精製した、Ｒ− フィコエリトリンーラベルされた、ヤギ抗−ヒト１ｇＧ（Ｃａｌｔａｇ、　５ｏ ｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　ＣＡ）を、４°Ｃでその後の３０分間 添加した。バッファーＡ中で３回洗浄した後、その細胞を、蛍光−活性化セル・ ソーター上で分析した。

ヒトＴＰＯ活性を、先に記載したように（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、　Ｒ，Ｐ、、　 ｅｔ　ａｌ、。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　１１６：１４９３−１５００　（１９８５））　）リ ブシン及びデオキシコレートにより細胞ミクロソームからの抽出後に測定した。

その後の実験においては、より速い方法を使用した。細胞を、ゴム・スクレーバ ーを用いて１．５ｍｌのカルシウム−マグネシウムを含まないＤｕｌｂｅｃｃｏ ’　ｓリン酸バッファー生理食塩水中に懸濁し、そして蛋白を５μｍ部分に対し て測定した。次にこの細胞を、２分間マイクロ遠心分離によりペレット化した。

冷０．１％デオキシコレート（０，２ｍｌ／ｍｇ細胞蛋白）を、１０分間添加し た。この抽出物を、５分間遠心分離し、そしてその上澄を測定のために取り出し た。１グアヤコ一ル単位は、１針当たりの１．０の　Ａ４７０として定義され、 これは１針当たりに酸化される１５０ｎｍｏｌのグアヤコールと等価である（Ｃ ｈａｎｃｅ、　Ｂ、、　ｅｔ　ａｔ、。

ゼ（ｉｏｄｉｄｅ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の１単位は、１針当たりの１．０の 　Ａ３５３として定義され、これは１針当たりに形成される４３ｎｍｏｌの１３ −と同じ９０　（１９８４））。

ヒトＧｒａｖｅｓ’　疾患甲状腺組織を分散し、そしてその細胞を先に記を含む 新たな培地をさらなる３日間に添加し、その後、その細胞を収穫し、そしてウェ スタン・プロットについて先に記載したように抽出した。

５１の患者からの血清が、叶、　Ｓ、　Ｍ、　ＭｃＬａｃｈｌａｎ　（Ｕｎｉｖ ｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗａｌｅｓ　ＣｏＣｏ１１ｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、 　Ｃａｒｄｉｆｆ、　Ｕ、に、）により提供された。これらの血清の４７は、自 己免疫性甲状腺疾患をもつ患者からのものであり、低から非常に高いところまで のバランスのとれた抗−ＭＳＡ力価のスペクトルを表すように選ばれた。４つの 血清は、正常患者からのものであった。抗−ＭＳＡ及び抗−ＴＧＡ抗体を、５ｃ ｈａｒｄｔ他の方法（Ｓｃｈより測定した。抗−ＭＳＡ検定のために、ヒト甲状 腺ミクロソームを、この疾患の治療のだめの手術において得られた凍結Ｇｒａｖ ｅｓ’　甲状腺組織から調製した（Ｓｃｈａｒｄｔ、　Ｃ，Ｗ、、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ５５：ｌ５５−１６８　（１９ ８２））。そのミクロソーム調製物中に残存しているいずれかのサイログロブリ ンと患者血清との交差反応を回避するために、血清を、１００　、ｌ／ｍ１（１ ，５ｘ　１０−＠Ｍ）のサイログロブリン（同じ組織から得られた）を含むバッ ファー中で、４　”Ｃにおいて一夜、そしてその後、分析前、室温において２時 間、前吸収さた（Ｓｃｈａｒｄｔ。

Ｃ，Ｗ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　５５ ：１５５−１６８　（１９８２））。

酵素活性のあるヒトＴＰＯを発現するチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ） 細胞（クローンＣＨＯ−ＨＴＰＯ＋２ｂ）の生産は、先に記載されていた。これ らの細胞を、完全−長のヒトＴＰＯｃＤＮＡを発現ベクターｐＥＣＥへ挿入する ことにより構築された組換えプラスミドｐＨＴＰＯ−ＥＣＨによりトランスフェ クトさせてあった。ＣＨＯ−ＨＴＰＯ１２ｂ及びＣＨＯ−Ｋｌ（対照、非トラン スフェクト）細胞を、１００ｇルウシ胎児血清（ＦＢＳ）　、ペニシリン（１２ ５単位／ｍｌ）、ゲンタマイシン（４８μｇ／ｍｌ）及びアンフオテリシンー８ （２，５μｇ／ｍｌ）を補われたＨａｍ’ｓ　Ｆ−１２培地中で増殖させた。

細胞を、１００＋ｎｎ＋皿内で集密（ｃｏｎｆ　１ｕｅｎｃｅ）まで増殖させ、 その細胞を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓカルシウム−マグネシウムを含まないリン 酸バッファー生理食塩水ＣＰＢＳ）で３回濯ぎ、そして次に、１０ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ　、　ｐＨ７，４，０、２５Ｍシュクロース、２ｍＭフェニルメチル・スルホ ニル・フルオリト、ＩＯμｇ／ｍ１ロイペプチン、０．５ｍｇ／ｍ！バシトラシ ンを含む溶液（バッファーＡ）中にこそげ取った。細胞を、Ｐｏ１ｙｔｒｏｎに より２０秒間均質化し、４°Ｃで１０，０００　Ｘ　ｇにおいて１５分間遠心分 離し、そして次に、上澄液を、４°Ｃで１００．０００　ｘ　ｇにおいて１時間 遠心分離した。このミクロソーム・ペレットを、０．５ｍｌのバッファーＡ中に 再懸濁し、Ｄｏｕｎｃｅホモゲナイザー内で均質化し、そして次に、使用まで一 ８０°Ｃにて凍結した。蛋白含有量を、Ｂｒａｄｆ　ｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆ ｏｒｄ、　Ｍ、Ｍ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２：２４８−２５４ 　（１９７６））により測定した。ミクロソーム蛋白の収率は、集密細胞の１０ ０ｍｍ皿当たり約１００−２００μｇ／ｍｌであった。

テストされるべき血清を、使用前−８０°Ｃにおいて一部保存した。

この検定手順は、僅かな変更を伴う、５ｃｈｒｄｔ他のもの（Ｓｃｈａｒｄｔ、 　Ｃ。

Ｗ、、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　５５：１ ５５−１６８　（１９８２））であった。

マルチＷｅ１１マイクローＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｓ、 　Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、　ＶＡ）を、被覆バッファー（０，０５Ｍ２炭酸ナトリ ウム、ｐＨ９，３，０，０２％アジ化ナトリウム）中で、ｗｅｌｌ当たり４μｇ のＣＨＯ−ＨＴＰＯ１２ｂ又はＣＨＯ−Ｋｌミクロソーム蛋白により（−夜、４ ℃において）被覆した。次にこのｗｅｌｌを、０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ　、　ｐＨ７ ，４，０，１５Ｍ　ＮａＣ１（Ｔｒｉｓバッファー）中で２回、０．２Ｍ　Ｔｒ ｉｓ　、　ｐＨ７，４，０，１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０５％Ｔｗｅｅｎ　２０（ Ｔｒｉｓ−Ｔｗｅｅｎバッファー）中で１回、モしてＴｒｉｓバッファー中で１ 回、濯いだ。１００μｇのＰＢＳ　、５０ｇルウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ Ｓｉｇｔｎａ。

Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を、それぞれのｗｅｌｌに添加し、そして室温で ２０分間インキュベートした。吸引後、このｗｅｌｌを、Ｔｒｉｓバッファー中 で２回、Ｔｒｉｓ−Ｔｗｅｅｎバッファー中て１回、そしてＴｒｉｓ／＜”ｔフ ァー中で１回洗浄した。

血清サンプルを、ＰＢＳ　、　５ｇ／ｌ　ＢＳＡ中で１／１００．１／１０００ 又は１／１０．０００に希釈した。この希釈血清サンプルの１００μｍを、２連 において、ｗｅｌｌ毎に添加し、そして３７°Ｃで１時間インキュベートした。

このｗｅｌｌを次に、ＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳ　、２５０ｇ／Ｌ　ＦＢＳ 中で１１５００に希釈された、１００μｌのペルオキシダーゼ−結合、アフィニ ティー精製、ヤギ抗−ヒト［ｇＧ　、　Ｐｃ断片持異的抗体（Ｃａｐｐｅｌ、　 Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ　Ｃａｒｐ、、　Ｗｅｓｔ　Ｃｈｅｓｔｅｒ、 　ＰＡ）を、それぞれのｗｅｌｌに添加し、モして３７°Ｃで１時間インキュベ ートした。このｗｅｌｌを次に、Ｔｒｉｓ−Ｔ＊ｅｅｎバッファーで４回洗浄し た。１００μｌの基質溶液（１２ｍｌの０．２３１ｔ１クエン酸塩、０．２６Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ５，０溶液＋１２μｍ　３０％Ｈ２０ｔ　＋　４．２ｍ ｇオルト−フェニレンジアミン）を、それぞれのｗｅｌｌに添加し、そして室温 で３０分間インキュベートした。この反応を、それぞれのｗｅｌｌに１００μｍ の２０％硫酸を添加することにより停止させた。ＥＬ　Ｉ　ＳＡ値（ＯＤ　４９ ０ｎｍ）を、マイクロＥＬＩＳＡリーダー内で測定し、そして抗原□を欠いたｗ ｅｌｌを標準（ブランク）とした。

上記のファージミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｓａｎ　 Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）内の、ヒトＴＰＱ　ｃＤＮＡの非コード・ストランドを、 オリゴヌクレオチド−指定突然変異誘発の鋳型として使用した。　ｔｈｅ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｒｅ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｓａｎ　Ｆ ｒａｎｃｉｓｃｏ　Ｖｅｔｅｒａｎｓ’　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　Ｍｅ ｄｉｘａｌ　Ｃｅｎｔｅｒにより合成された、５２塩基対の突然変異原プライマ ー（５−ＡＧＧＣＴＣＣＣＴＣＧＧＧＴＧＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＣＡＴＧＴＡ ＧＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧ−３’　）を、上記蛋白の推定膜− スパニング領域の直接上流に２つの終止コドンを作り出すために設計した。それ 故、ＴＧＡ及びＴＡＧコドンは、ヒトＴＰＯｃＤＮＡ（Ｍａｄｎｕｓｓｏｎ、Ｒ ，Ｐ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１：８５６−８６１ 　（１９８７乃内のそれぞれ、２６２９−２６３１塩基対及び２６４１−２６４ ３塩基対において創出された。突然変異体の便利なスクリーニングのために、Ｅ ｃｏＲ［制限部位（ＧＡＡＴＴＣ，２６３０−２６３５塩基対における）を、第 一　（ＴＧＡ）終止コドンと一緒に創出した。この突然変異誘発の手順を、製造 者（Ｍｕｔａ−ｇｅｎｅ　ｐｈａｇｅｍｉｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅ ｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ、　Ｂｉｏｒａｄ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）の手順に従って行い、上記のプラスミドｐＨＴＰＯ （Ｍｌ）−ＢＳを作り出した。

ヌクレオチド配列決定（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ　７４：５４６３−５４６７　（１９７７））により上記の 突然変異を確認した後（図１３）、そのｃＤＮＡを、Ｎｏｔ　Ｉによるｐ）ＩＴ ＰＯ（Ｍｌ）−ＢＳの消化により切除し、その末端を、ＤＮＡポリメラーゼ１の Ｋｌｅｎｏｗ断片により平滑にし、そしてそのｃＤＮＡを、Ｘｂａ　ｌによる消 化により遊離させた。この突然変異されたｃＤＮＡ（３，０５ｋｂ）を、上記の プラスミドｐＳＶ２−ＤＨＦＲ−ＥＣＥ−ＨＴＰＯ内の野性型ヒトＴＰＯｃＤＮ Ａと置換し、ｐＨＴＰＯ（Ｍｌ　）　−ＥＣＥ−ＳＶ２−ＤＨＰＲを作り出した 。このプラスミドは、発現ベクターｐＥＣＥ（Ｅｌｌｉｓ、　Ｌ、。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　４５ニア２１−７３２　（１９８６））及びｐＳＶ ２−ｄｈｆｒ（Ｌｅｅ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｔ。

、　Ｎａｔｕｒｅ　２９４＋２２８−２３２　（１９８１））であって、それぞ れ、叶、　ＷｉｌｌｉａｍＲｕｔｔｅｒ　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ １ｉｆｏｒｎｉａ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）及び叶、　Ｇｏｒｄｏｎ　 Ｒｉｎｇｏｌｄ（Ｓｙｎｔｅｘ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ）により提供されたもの の成分を含んでいる。簡単に言えば、ｐＳＶ２−ＤＨＰＲ−ＥＣＥ−ＨＴＰＯを Ｓａｌ　Ｉにより消化し、その末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断 片により平滑にし、そしてそのｈＴＰＯｃＤＮＡを、Ｘｂａ　［による消化によ り遊離させた。残ったベクター（ｐＳＶ２−ＤＨＰＲ−ＥＣＥ）を、バクテリア のアルカリ性ホスファターゼにより処理し、ゲル精製し、そして５ｅａＰＩａｑ ｕｅアガロース（ＦＭＣＢｉｏｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ　ＭＥ ）中に回収した。また５ｅａＰｌａｑｕｅアガロース中の回収されたｈＴＰｏ　 ｃＤＮＡを、このベクターに結合した。

懸 制限酵素、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡポリメラーゼｌ　、　Ｋｌｅｎｏｗ 断片を、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　 （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ ｓ　（Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）又はＢｏｅｆｈｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ 　（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）のどちらかから得た。

Ｂ、結果及び討議 先に構築されたヒト甲状腺ｃＤＮＡライブラリーのラムダｇｔｌｌ内での多スク リーニング（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、　Ｒ，Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　 Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１：８５６−８６１　（１９８７））が、ＴＰＯｃＤＮ Ａの断片のみを産出したため、ラムダＺａｐ内で新たな甲状腺ｃＤＮＡライブラ リーを、本明細書中に記載したように構築した。完全−長のヒトＴＰＯｃＤＮＡ を含むプラスミドｐＨＴＰＯ−ＢＳを、このライブラリーから得た。ｐＨＴＰＯ −ＥＣ［Ｅを、図１中に示した戦略に従って、ｐＨＴＰＯ−ＢＳ及び哺乳類の発 現ベクターｐＥＣＥ（Ｅｌｌｉｓ、　Ｌ、。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　４５ニア２１−７３２　（１９８６））から構築し 、そしてその後の細胞トランスフェクションのために使用した。

チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞を、ｐＨＴＰｏ−ＥＣＥ及びｐｓＶ２−ｎｅ 。

により共同トランスフェクションし、そして１２クローンを、ノーザン・プロッ ト検定により、ＴＰＯｍＲＮＡの存在についてテストした。４つのｐＨＴＰＯ− ＥＣＥ　トランスフェクト細胞系（Ｃ）１０−ＨＴＰｏ４、ＣＨＯ−ＨＴＰＯ１ ２、Ｃ）（０−ＨＴＰ０１４及びＣＨＯ−ＨＴＰｏ１７）及び１つの対照ｐＳＶ ２−ｎｅｏ−トランスフェクト細胞系（ＣＨＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ）からの、細 胞ＲＮＡの全部（１５ｔｔｇ／レーン）を、本明細書中に記載するように、ヒト ＴＰＯｃＤＮＡプローブを使用してノーザン・プロット検定に供した。比較のた めに、Ｇｒａｖｅｓ’疾患を患った患者からのヒト甲状腺線（ｔｈｙｒｏｉｄ　 ｇｌａｎｄ）から調製したポリＡ＋　ｍＲＮＡのｌμｇを使用した。２８Ｓ及び １８Ｓ　リポソームＲＮＡマーカー、並びに、ＲＮＡ分子量方法（ｌａｄｄｅｒ ）（Ｂ、Ｒ，Ｌ、、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）を、分子量測定のた めに使用した。

これらのクローンの中の４つ並びに４つの対照（ｐＳＶ２−ｎｅｏ単独）クロー ンの中の１つは、そのｐ）ＩＴＰＯ−ＥＣＥ−トランスフェクト・クローン内に ３．３ｋｂ　ｍＲＮＡを現した。このトランスフェクトされたＣＩ−ｔｏ細胞内 のヒトＴＰＯｍＲＮＡのサイズは、Ｇｒａｖｅｓ’　甲状腺細胞内のもの（３， １ｋｂ）僅かに大きく、これは推定するとこによれば、そのｐＨＴＰＯ−ＥＣＥ プラスミドの３゛末端における追加のＳＶ４０ポリ−Ａコード領域（図１参照の こと）による。

マウス・モノクロナール抗−ヒト甲状腺ミクロソーム抗体（Ｐｏｒｔｍａｎｎ、 　Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　［ｎｖｅｓｔ、　８１：１２１ ７−１２２４　（１９８８））を使用した、ＴＰＯＩ−ランスフエクトＣＨＯ細 胞から抽出された蛋白の（還元条件下の）ウェスタン・プロット検定は、ヒト甲 状腺ペルオキシダーゼ（Ｃｚａｒｎｏｃｋａ、　Ｂ、、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅ ｒｓ　１０９：１４７−１５２　（１９８５）；　０ｈｔａｋｉ。

Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔ ａｂ、　６３：５７０−５７６　（１９８６））について予測されていたような 、１０５−１１０ｋＤの免疫反応上蛋白を現した。簡単に言えば、ｐＨＴＰｏ− ＥＣＥ　トランスフェクト細胞系（ＣＨＯ−ＨＴＰｏ４、ＣＨＯ−ＨＴＰｏ　１ ２、ＣＨＯ−ＨＴＰｏ１４及びＣＨＯ−ＨＴＰＯ１７）から、ｐＥｃＥ及びＰＳ Ｖ２−ｎｅｏにより共同トランスフェクトされた対照細胞系から、そしてｐＳＶ ２−ｎｅｏ単独によりトランスフェクトされた他の対照細胞系から、のデオキシ コレート（ＤＤＣ）−抽出蛋白の３０μｇを、還元条件下、ＳＯＳポリアクリル アミド・ゲル電気泳動に供した。この蛋白を、ニトロセルロース膜に電気転移さ せ、そして次に、本明細書中に記載するように、甲状腺ミクロソーム抗原に対す るマウスｍＡｂ（Ｐｏｒｔｍａｎｎ、　Ｌ、。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　８１：１２１７−１２２４ 　（１９８８））によりブローブングした。

強いＴＰＯ酵素活性は、限界希釈（表１）により得られた、クローンＣＨＯ−Ｈ ＴＰＯ１２内で、そしテサブクロ−：ｚＣＨＯ−ＴＰＯ１２ｂ及びＣＨＯ−ＴＰ Ｏ１２ｇ内で明らかであった。より低い酵素活性がその他のクローン内で検出さ れた。このＣＨＯ−ＴＰＯ１２クローンにおけるＴＰＯ活性は、単層培養（表１ ）におけるＴＳＨ−刺激Ｇｒａｖｅｓ’　甲状腺細胞内のＴＰＯ活性とほとんと 同じであった。

甲状腺細胞内の生来のＴＰＯがそうであるように、上記の組換えヒトＴＰＯがこ の遺伝子によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の表面上に発現されたか否か を決定するために、ＣＨＯ−ＨＴＰＯ１２ｂ細胞を、ＦＡＣ３分析（図２）に供 した。高い力価の橋本患者血清（εしｌ５Ａ（ｉｆｔｌ、７７２；正常値＜０． ２）とのこれらの細胞のインキュベーション（Ｊａｎｓｓｏｎ、　Ｒ，。

ｅｔ　ａｌ、、Ｃｌ１ｎ、　Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６３：８０−８６　（ １９８６））は、これらの細胞が対照血清とのインキュベートされたときよりも 約１００倍大きい蛍光を産生した。同様な結果を、３つの異なる橋本血清により 得た。

上記の対照及び橋本患者血清−インキュベート細胞の両方の大きさは、同じであ った（図３６及び３Ｆ）、但し、細胞における違いが、シグナルにおける違いに 一部責任を負っていた可能性があった。

一連のウェスタン・プロット試験を、次に、ＥＬ［ＳＡにより測定されたような 既知の抗ミクロソーム抗体レベル（Ｊａｎｓｓｏｎ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｌ１ｎ、　ＥＸＩ）、　［ｍｍｕｎｏｌ、　６３：８０−８６　（１９８６） ）をもつ橋本患者血清のパネルを使用して、ＣＨＯ−ＴＰＯ１２ｂ細胞からの蛋 白により行った。非還元条件下、テストされた２９の橋本患者血清のすべてが、 ３つの正常血清とは異なり、約２００ｋＤの主要な、幅の広い蛋白バンドと、並 びに、約１１０ｋＤのかすかな二重線と反応した。総計で、非還元条件下で行わ れた試験においては、上記の６つの対照血清以外の、テストされた３６の橋本患 者血清のすへてか、これらのバンドと反応した。しかしながら、これらのバンド の強度における実験間のばらつき、並びに、多くのサンプルを同時に分析するこ とにおける方法論的限界により、テストされだすへてのサンプルの結果を比較す ることができなかった。

にもかかわらず、単一の大きな実験において、最も強いシグナルか、最も高い抗 ミクロソーム抗体ＥＬＩＳＡ値を含む血清により現れたことは、明らかであった 。いくつかの血清は、ＴＰＯについて予想されたもの以外の蛋白バンドをも、認 識した。これらのバンドは、野性型ＣＨＯ抗原（以下に示す）であった。１つの 明らかな１１０ｋＤのＴＰＯ−特異的シグナルも、非特異的野性型ＣＨＯシグナ ルであった。このことを、以降に、より詳細に討議する。

還元及び非還元条件下で行われたウェスタン・プロット上の組換えＴＰＯシグナ ルの比較（β−メルカプトメタノールを使用した）は、還元により以下の＝（ａ ）上記の２００ｋＤの幅の広いバンドの消失；（ｂ）それがもはや明瞭に二重線 となるような、上記の１１０ｋＤのシグナルの変更、及び（Ｃ）上記の弱い血清 のいくつかが陰性になるような、上記の特異的シグナルの弱まり、を現した。約 １１０ｋＤのバンドと反応した先に記載した非免疫血清は、野性型のＣＨＯ蛋白 であり、かつ、ＴＰＯではない。

先に討議した２００ｋＤ及び１１０ｋＤのバンドの特異性は、野性型の、非−Ｔ ＰＯ−トランスフェクトＣＨＯ細胞を使用した２つの別個の実験において証明さ れた。第一の実験においては、最も都合の良い（すなわち、非還元）条件下でテ ストされた、選択され、分化した橋本患者血清は、２００ｋＤ又は１１０ｋＤの 蛋白バンドと反応できなかった。第二の実験は、１１０ｋＤのバンドと反応する ことが先に示された非免疫血清が偽陽性であることを示した。野性型Ｃ１１０細 胞におけるこのシグナルは、都合の悪い（すなわち、還元）条件の使用にもかか わらず強いものである。

上記の特異的シグナルの検出の感度を評価するために、ウェスタン・プロット検 定を、２つの橋本患者血清の連続希釈により行った。

ＣＨＯ−ＴＰＯ１２ｂ細胞内て作られたＴＰＯの量は、それらの橋本患者血清が ３０００倍よりも大きく希釈されたときでさえ十分に検出されることができた。

ヒトＴＰＯは、５つのグリコジル化可能な部位を含んでいる。それ故、炭水化物 の部分が、橋本患者血清により認識されるヒトＴＰＯ抗原内のエピトープのコン フォメーションにおいて重要であるかどう二カマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉ ｎ）　、すなわち、蛋白質のグリコジル化の阻害剤中で２０時間、前培養された ＣＨＯ−ＴＰＯ１２ｂ細胞から抽出された蛋白質上で行った。この時間の長さは 、有意な毒性（すなわち、細胞損失）の証拠を伴わずに最も長く耐えた長さにか ら選んだ。ツニカマインン処理は、抗原認識に対して明らかな効果をもっておら ず、このことは、炭水化物部分が上記のミクロソーム抗原エピトープの重要な成 分でないことを示唆している。対照実験においては、同様の条件下でのツニカマ インン処理は、放射ラベルされたＤ−グルコサミンの蛋白質への取り込みを、５ ６．３±４．８％（平均上標準誤差；ｎ・３）はど減少させた。

上記のミクロソーム抗原（ＭＳＡ）に対して向けられた抗体を使用して行われた ＥＬＩＳＡを、本発明の組換えヒトＴＰＯに対して向けられた抗体により行われ たＥＬＩＳＡと比較した（図３）。良好な相関（０，８３８５２４９）を観察し た。実際、抗−ＭＳＡの基づくＥＬＩＳＡは、偽陽性（図３中に“範囲外“とし て示す）をもたらしたが、これは、上記の抗−組換えヒトＴＰＯ抗体に基づ＜　 ＥＬＩＳＡにおいては観察されなかった。

これらの偽陽性は、抗サイログロブリン抗体とミクロソームとの非特異的反応か ら生じたようであり、そして図３のための線型回帰計算に含まれなかった。この 結論のための支持は、図４中に在り、こらは、図３中にしましたものと類似の線 量回帰分析を示すが、より大きな（１／１０００）希釈においてのものである。

図４から、増加された希釈倍率が、より低い希釈において見られた範囲外のデー タの点を取り去り、そしてその相関（０，９０６０７７３）が有意に高くなった ことが見られた。この結果は、抗−λＩｓＡに基づ＜　ＥＬＩＳＡのより低い特 異性が、事実として、抗原汚染の作用であるということを強く示唆している。検 定の特異性を低くするこのような問題は、非組換えの、アフィニティー精製され たＴＰＯの使用により届けられるがもじれない。

しかしながら、真に純粋な、アフィニティー精製された天然のＴＰＯを達成する ことは、不可能ではないが非常に困難であることが証明されている。これらの問 題は、本発明の組換えヒ１−ＴＰＯ抗原の使用により回避される。

その特異性をさらに調査するために、組換えヒトＴＰＯを、ＥＬ［ＳＡ手順にお ける抗原の源として、Ｇｒａｖｅｓ’　甲状腺ミクロソームと比較した。この組 換えｈＴＰＯは、非甲状腺の非ヒト真核細胞系であってそれ故にｈＴＰＯ以外の 甲状腺特異的抗原を含むことができないものから調製されたミクロソーム内に存 在する。にもかかわらず、自己免疫甲状腺炎をもつ患者からの血清が多数の抗原 に対する抗体を含むので、それらのいくつかは、チャイニーズ・ハムスター卵巣 （ＣＨＯ）細胞（Ｋａｕｆｍａｎ、　Ｋ、Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ １ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８４：３９４−４０３　（１９８９））中に存在する ことができ、それぞれの血清サンプルも、対照の、非トランスフェクトＣＨＯ細 胞から調製されたミクロソームに対して検定された。

上記の組換えｈＴＰｏ及び上記の甲状腺ミクロソームの両検定における標準（１ ／１００）希釈での上記の５１血清を比較においては、比較的良好な相関か観察 された（「・０．６６８；　ｐ＜０．００１）（図１０Ａ）。しかしながら、明 らかに、いくつかの広く食い違う値か在った。

特に、抗−ＭＳＡ検定において非常に強力であった２つの血清（血清＃ｌｌ及び ＃２７、図１０Ａ　、それぞれ、大きな丸及び四角）は、上記の抗−ｈＴＰＯ抗 体検定において、上記の４つの正常血清（図１ＯＡ、起点近くの長方形内の４つ の点）と同様の値を与えた。初期において高い範囲の活性における、多数の他の 血清は、また、組換え１１ＴＰ　Ｏによるよりも甲状腺ミクロソーム調製物によ り存意に高い値を与えた（図１ＯＡ）。これと同じ血清希釈においては、より低 い相関が、抗原としてのサイログロブリン及び組換えｈＴＰＯにより得られた値 の間で、観察された（ｒ□０．３１５；　ｐ＜０．０５）。

多重抗原（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ａｎｔｉｇｅｎ）に対する抗体を含む自己免疫性 血清においは、別個の抗体が、それらのそれぞれの抗原への変化したアフィニテ ィーをもつよってある。血清の連続希釈は、それぞれの抗体−抗原の相互作用の アフィニティーに基づ＜　ＥＬＩＳＡ値の異なる輪郭を産生ずるであろう。ｈＴ ＰＯが甲状腺ミクロソーム調製物内の主要な自己抗原である場合には、それ故、 上記と同じ血清希釈曲線か、甲状腺ミクロソーム及び組換えｈＴＰＯを使用した 検定において観察されるはずである。この仮定の支持として、１／１０００又は ｌ／ｉ０．０００の血清希釈においては、甲状腺ミクロソームとヒトＴＰＯとの 間のＥＬＩＳＡ値における相関は、非常に大きい（ｒ＝０．９０６及び０．９０ ２、それぞれ：ｐ＜０．００１）（図１０８及び１０Ｃ）。劇的に、甲状腺ミク ロソームにより強く陽性であるが組換えｈＴＰｏ抗原によってはそうでない２つ の血清（（ｆｆｌ　１０Ａ）は、２つの検定（１０Ｂ及び１０Ｃ）の間ではもは や有意な食い違いはなかった。これらの２つの血清の希釈曲線は、抗−ＭＳＡ及 び抗−ｈＴＰ０抗体の検定（図１ＩＡ及びＩＩＢ）においては全く異なっており 、これらの血清かｈＴＰＯ以外の抗原に対して低いアフィニティーをもって反応 していたことを確信させる。これらの２つの血清は、それらの非常に高いレベル の抗−サイログロブリン抗体により区別されることもできる。反対に、同様の抗 −ＭＳＡレベル（１／１００血清希釈における）をもつ他の血清は、両検定（血 清＃１２及び２８、図１１Ａ及びＩＩＢ）における正常希釈曲線を作りだす。

上記の抗−ｈＴＰｏ抗体ＥＬＩＳＡデータは、抗原としてＣＨＯ−ＨＴＰＯミク ロソーム及びＣＨＯ−Ｋｌ　ミクロソームを使用して得られた値の間の差異とし ても表現され、抗コＣＨＯ細胞抗体による可能性のある妨害を補正した（Ｋａｕ ｆｍａｎ、　Ｋ、Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　 ８４：３９４−４０３　（１９８９乃。有意な変化は、上記の３つの血清希釈の それぞれにおいてのこれらの修正データを使用して、甲状腺ミクロソーム及び組 換えｈＴＰＯ検定の間の相関においては、見られなかった。標準（１／１ｏｏ） 希釈においてテストされた自己免疫甲状腺疾患をもつ患者の４７の血清について の抗−ＣＨｏ−Ｋｌ抗体ＥＬＩＳＡ値は、０．１６４±０．０６６標準誤差（平 均±標準誤差）であった。

抗−ｈＴＰｏ抗体ＥＬＩＳＡの精度を、自己抗体能のスペクトルを表すために選 ばれた３つの血清を使用して評価した。平均上標準誤差として表された標準（１ ／１００）血清希釈における検定間の変動（それぞれの血清につき１０回）（図 １２）は、０．３４６±０．１８（低−能力血清）、０゜５９９±０．４４（中 間−能力血清）、及び０．９２３±０．９４（高−能力血清）であった。これら の血清についての検定間の変動係数（Ｃ■）は、それぞれ、５．１２％、７．３ ９％、及び１０．２％であった。上記の検定間ＣＶ’　（それぞれの血清につい て７回）は、それぞれ、５．３６％、７．６３％、及び７．２９％であった。

本発明の他の態様においては、ＣＨＯ細胞のヒトＴＰＯ発現が異なるプラスミド の使用により育意に増加されることができるということ驚くべきことに発見した 。ジヒドロ葉酸・レダクターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆ。

１ａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅＸＤＨＰＲ）−ＴＰＯ構築物は、その中で、両遺 伝子（ＤＨＰＲ及びＴＰＯ）がＳＶ４０プロモーターにより駆動されるものとし て作られた（図４）。これらの構築物によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞 のスクリーニングは、ｐＨＴＰｏ−ＤＨＰＲ−２Ｂ及びｐＨＴＰＯ−ＤＨＰＲ− ４Ｃと命名された２つのプラスミドを作り出し、これらは、ｐＥｃＥ−ＨＴＰＯ プラスミドを使用して達成されたものより３倍多くの抗原を目下、発現している 。

ｐＥｃＥ−ＨＴＰＯ、ｐＨＴＰＯ−ＤＨＰＲ−２Ｂ及びｐＨＴＰＯ−ＤＨＰＲ− ４ＣによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞において観察された相対ＴＰＯ活 性を、図５中にメトトレキサート濃度に対してプロットされたものとして示す。

さらに、ｐＤＨＦＲ−ＴＰＯ−４Ｃ−ＭＴＸと命名された１つの特定のサブクロ ーンが、今まで単離された他のいずれの構築物よりも相対的に多量のＴＰＯを発 現することが見つかり、そしてこれに関しては、ＣＨＯ細胞内でヒトＴＰＯを発 現することを目下もくろまれている最良の態様を含んで成る。このプラスミドｐ ＤＨＦＲ−ＴＰＯ−４Ｃ−ＭＴＸは、ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒ ｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８６２において、１９８ ９年ｌＯ月３日、寄託番号ＣＲＬ　１０２５０として、寄託された。

図５は、メトトレキサート濃度の増加に伴い、ｐＨＴＰｏ−ＤＨＰＲ−２Ｂ及び ｐＨＴＰＯ−ＤＨＰＲ−４Ｃプラスミドにより、プラトーがＣＨＯのＴＰＯ発現 に到達する。いかなる特定の理論により結び付けられることを意図していないけ れども、この観察についての１つの可能な説明は、その発現された完全長のＴＰ Ｏ遺伝子がその宿主ＣＨＯ細胞に毒性をもち、より高いメトキサレート濃度にお いて、ＴＰＯに対するものを除き、ＤＨＰＲについての選択をもたらすというこ とである。このような選択の結果は、ＴＰＯが除去されながらＤＨＰＲが増幅さ れるということかもしれない。

上記の完全長のＴＰＯ遺伝子が膜関連のものなので、本発明者は、発現された蛋 白がその膜から何とかして解離されることができる場合には、ＣＨＯ細胞内でＴ ＰＯ生産を増加させることが可能であるかもしれないとういことを仮定した。し たがって、その遺伝子から野性型のトランスメンブラン配列を同定しそして除去 することによりヒ）　ＴＰＯの分泌可能な形態を作りだすための実験を行った。

ｈＴＰｏの合成における未成熟な終了は、９３３から８４８アミノ酸までのｈＴ Ｐｏ−Ｍｌ蛋白のサイズを減少させると仮定された。Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐ ＨＴＰｏ−ＢＳ）内の元も完全長ヒトＴＰＯｃＤＮＡクローンを、プラスミドｐ ＨＴＰＯ（Ｍｌ）−ＢＳを作るために部位特異的突然変異誘発に供した。１本鎖 ＤＮＡ鋳型を作り、そして先に示した５２−ｍａｒのオリゴヌクレオチド・プロ ーブを突然変異誘発のために使用した。この突然変異は、ヒトＴＰＯ遺伝子のト ランスメンブラン領域から直上流の領域内に、２つの終止コドン、並びに、確認 のためのＥｃｏ　ＲＩ部位を取り込んだ（図６）。完全長ヒトＴＰＯ遺伝子配列 の全体を、比較のために図７中に示す。

突然変異の結果として、その膜に結合されるよりもむしろその宿主細胞により分 泌される、“切り詰められた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）“ヒトＴＰＯＢＳから切除 し、そしてｐＥｃＥ−ＳＶ２−ＤＨＰＲのその対応する部位に挿入し、発現’　 ラスミＦ　ｐＨＴＰｏ（Ｍｌ）−ＥＣＥ−ＳＶ２−ＤＨＰＲ（図８）を作ツタ。

コノプラスミドによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、切り詰められたヒ トＴＰＯ蛋白を生産するようであり、これは、完全長の蛋白の抗原としての性質 を保持していると信じられ、そして従って、このことは、本発明の他の態様を含 んで成る。プラスミドｐＨＴＰｏ（Ｍｌ）−ＥＣＥ−ＳＶ２−ＤＨＰＲの構築を 、図９中に要約する。

突然変異すｔｕ、：ｈＴＰＯｃＤＮＡ　’ｆｉ：含ムフラスミドｐｌ（ＴＰＯ（ Ｍｌ）−ＥＣＥ−ＳＶ２−ＤＨＰＲ４二よりＣＨＯ細胞を好適にトランスフェク トした後、細胞（ＣＨＯ−ＴＰＯ−Ｍｌ）の個々のコロニーをＴＰＯの発現につ いて試験した（図１４）。

潜在的に分泌されるｈＴＰＯ−Ｍｌ蛋白の動態は知られていないので、っこおの 蛋白の発現を、ＣＨＯ細胞溶菌物中で最初にスクリーニングした。なぜなら、そ の蛋白が大量に分泌された場合でさえも、粒状ＴＰＯが検出されることが期待さ れるであろうからである。ランダムに選択されたＣＨＯ−ＴＰＯ−Ｍｌクローン は、変動する細胞ＴＰＯ発現の証拠を示した（図１４）。約１０５−１０１ｋＤ の二重線は、橋本甲状腺炎を患った患者からの血清により、これらのクローンの 溶菌物から特異的に免疫沈降された。野性型ｈＴＰＯｃＤＮＡによりトランスフ ェクトされたＣＩ（０細胞においては、橋本患者血清は、より大きなサイズ、１ １２−１０５ｋＤの二重線を免疫沈降させ、そして、非トランスフェクトＣＨＯ 細胞においては、先に観察されたように（ｋａｕｆｍａｎ、　Ｋ、Ｄ、、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８４：３９４−４０３　（１９８９））　、二重 線は検出されなかった（図１４Ａ）。野性型ｈＴＰｏによりトランスフェクトさ れたＣＨＯ細胞とは異なり、これらの細胞が、橋本甲状腺血清及び蛍光−札付け されたヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体と共に前インキュベートされたとき、免疫反応性 ＴＰＯは、免疫蛍光の消失により証明される如く、ＣＨＯ−ＴＰＯ−Ｍｌ細胞の 細胞表面から存在していなかった（Ｋａｕｆｍａｎ、に、Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、　１ｎｖｅｓｔ、　８４：３９４−４０３　（１９８９））。

突然変異されたｈＴＰｏ−Ｍｌが分泌蛋白であるかどうかを決定するために、ｈ ＴＰＯ−Ｍｌ　と野性型ｈＴＰＯの両方の生合成及びプロセッシングを、パルス −チェース実験において調査した。最初に、切り詰められたＴＰＯ（７）最も高 い発現をもっクロー　：／ＣＨＯ−ＴＰＯ−Ｍｌ−Ｋ（図１４Ａ）を、限界希釈 によりサブクローニングし、そして１つの細胞系（ＣＨＯ−ＴＰＯ−Ｍｌ−Ｋｌ ）を、さらなる研究のために選択した（図１４Ｂ）。２４時間のチェース期間に わたり、放射ラベルされたｈＴＰＯ−Ｍｌ蛋白が、細胞により、その培養培地中 に分泌され、そして橋本患者血清による免疫沈降により検出された（図１５）。

この分泌蛋白は、４時間のチェース後、培養培地中に存在し、そのレベルは、２ ４時間の期間にわたりだんだんと蓄積した。面白いことに、その分泌された、免 疫沈殿可能なｈＴＰＯ−＋１１１蛋白は、その細胞−結合形態と比較して、ポリ アクリルアミド・ゲル上に、より低い電気泳動の移動性を有する単一バンドとし て現れた。反対に、野性型ｈＴＰＯを発現するＣＨＯ細胞は、その培養培地中に 検出可能な免疫沈降性物質を全く分泌しなかった。この細胞−結合ｈＴＰＯ及び ｈＴＰＯ−Ｍｌ蛋白は、同じように安定であり、それらの放射ラベルされた免疫 沈降物は、チェースの０と４時間の間、増加した。２４時間のチェースにおける 放射ラベルされた野性型のｈＴＰＯ蛋白の量は、基準線（０時間）と同じであっ た。４から２４時間までのＣＨＯ−ＴＰＯ−Ｍｌ−Ｋｌ細胞溶菌物中のシグナル において観察された減少は、それらの細胞の培地中のシグナルにおける増加によ り平行とされ、分泌蛋白の概念を支持し、これは、それ故本発明の他の態様を含 んで成る。

ＣＨＯ−ＴＰＯ−Ｍｌ−Ｋｌにより培養内地中に放出された免疫沈降物質が実際 にＴＰＯであることを証明するために、条件培地を、ＴＰＯ酵素活性についてテ ストした。ＴＰＯ活性（１，０グアヤコ一ル単位／１．Ｏｍｌ培地）は、ｈＴＰ Ｏの突然変異形態を発現するＣＨＯ細胞からの培養培地中に明らかに存在した（ 図１６）。反対に、先に記載したように、それらの細胞の溶菌物中に存在する強 いＴＰＯ活性にもかかわらず（Ｋａｕｆｍａｎ。

Ｋ、Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８４：３９ ４−４０３　（１９８９））　、野性型ｈＴＰＯを発現するＣＨＯ細胞からの条 件培地中には酵素活性は全く存在しなかった（図１６）。

表１ ＣＨＯ−ＴＰＯ＋２細胞中の及びＴＳＨ−刺激Ｇｒａｖｅｓ’　疾患ヒト甲状腺 細胞初期培養中の、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）活性細胞型　グアヤコー ル　・　ペルオキシダーゼ　ヨーノド　・　ペルオキシダーゼ（Ｇｕａｉａｃｏ ｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）　（Ｉｏｄｉｄｅ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（単位 ／ｍｇ蛋白）　（単位／ｍｇ蛋白）ＣＨＯ−ｐＥＣＥ　０　０ （対照） ＣＨＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ　０　０ （対照） ヒト甲状腺細胞　４．７　３．０ ４、６　３．４ ＣＨＯ−ＨＴＰＯ１２３，６ｎｄ ＣＨＯ−ＨＴＰＯ１２ｂ　４．０　３、ｌＣＨＯ−ＨＴＰＯ１２ｇ　３．１　１ ．９上記の細胞の１００ｍｍ直径の皿から調製されたデオキシコレート抽出物内 で測定されたグアヤコール及びヨーシトＴＰＯ活性の多重測定からのデータの要 約。Ｇｒａｖｅｓ’　疾患を患ったヒト甲状腺細胞を、１２゜５ｍＵ／ｍｌヒト ＴＳＨにおいて３日間培養した。ｎｄ−実施せず。

興旦Ｌ Ｇｒａｖｅｓ’疾患におけるＴＰＯ特異的Ｔ細胞浸潤甲状腺組換えＴＰＯの利用 可能性を利用して、甲状腺内の母集団におけるこの自己抗原に特異的なＴ細胞に ついてのインビボにおける選択の発生を調査した。

し互族 浸潤単核細胞を、しっこく再発したＧｒａｖｅｓ’　疾患を患った２６歳の女性 の甲状腺摘出標本（ＣＸ８１：ＨＬＡ−ＡＩ、２；　Ｂ８．３７＋　ＤＲ３：　 ＤＲｗ５２；　ＤＱｗ２）から抽出し、そして高い力価の抗甲状腺ミクロソーム 抗体（１：６４０）を、酵素消化、その後の一夜のインキュベーション、そして 先２２凱８５−８９　（１９８５））により得た。この活性化細胞を、１週間、 組換えＩＬ−２（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ　−２０ｎｇ／ｍｌ）及びＲＰＭＩ−１６ ４０（Ｇｉｂｃｏ）中の１０％ヒト血清中での増殖により選択的に増殖させた。

細胞を、０ＫＴ３／ＩＬ−２及びＤＲ−ｍａｔｃｈｅｄ抗原存在細胞（ＡＰＣ） による限界希釈（０，５細胞／ｗｅｌｌ）におけるクローニングに先立つ２週間 の間、支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ　ｃｅｌｌｓ）としての照射自己上皮血液リンパ 球、０ＫＴ３モノクロナ一ル抗体（３０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ２の添加により非 特異的に増殖させた。すべてのクローンのさらなる増殖及び維持を、０ＫＴ３／ ＩＬ−２及びＨＬＡ　ｕｎｍａｔｃｈｅｄ照射支持細胞による１−２週間毎の再 刺激によった。細胞を、培養サイクルの終了時において、そしてそれらのＩＬ− ２への最後の暴露後の最小限５日において分析した。

増殖検定を、３連マイクロタイタ−ｗｅｌｌ内で３日間にわたり行った。照射自 己ＰＢＬ（２Ｘ　１０’　）を、２００μｌの１０％ヒト血清中（７）１０’ク ローンのＴ細胞に添加した。１μｍの生のミクロソーム（蛋白濃度５ｍｇ／ｍｌ ）を、ｗｅｌｌ毎に添加した。ｌμＣｉの［２旧チミジンを、ガラス・ファイバ ー・フィルター及びシンチレーション・カウンティング上への収穫に先立ち、検 定の最後の６時間の間に添加した。

シュクロース・グラジェント遠心分離（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ　−Ｎｙｃｏｍｅ ｄ）により精製された上皮血液単核細胞を、２００μｌの１０％ヒト血清を含む マイクロタイターｗｅｌｌ内で、ｗｅｌｌ当たり１０’細胞においてインキュベ ートした。対照及び１−２μｌ内のＴＰＯミクロソームを、先に記載したように ｗｅｌｌ毎に添加する。培養液を、５−６日間インキニンベートし、そして収穫 及びシンチレーション・カウンティングに先立つ最後の６−１８時間の間に１３ 旧チミジンによりパルスした。

発現ベクターｐＥＣＥへクローニングされたヒトＴＰＯのための完全ｃＤＮＡに よるＣＨＯ細胞のトランスフェクション並びにトランスフェクトさらた又はトラ ンスフェクトされていないＣＨＯ細胞からの細胞ミクロソームの調製は、先に記 載したものと同じであった。

Ｂ、結果 インビボにおいて活性化された甲状腺浸潤Ｔ細胞を、組換えＩＬ−２内で増殖に より選択した。得られた集団を次に、ＩＬ−２と組み合わせた抗−ＣＩＢ３抗体 （ＯＫＴ３）による刺激により非特異的にさらに増殖させた。そのように誘導さ れた系は、添加された抗原存在細胞（ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　 ｃｅｌｌｓ）（ＡＰｃ）が存在しない、自己甲状腺上皮細胞への顕著な反応を示 した。例えば、放射ラベルされたチミジンの取り込みとして測定された、以下の レベルのＴ細胞刺激が観察された：Ｔ細胞：５１±３　ｃｐｍ： 甲状腺上皮細胞（ＴＥＣ）：　６２±８　ｃｐｍ：Ｔ細胞＋ＴＥＣ：　６１０８ ±１０４０　ｃｐｍ０Ｔ細胞クローンを、限界希釈（０，５細胞／ｗｅｌｌ）に おけるその系のブレーティング、その後のＩＬ−２及び０ＫＴ３によるさらなる 増殖により、得た。この方法において、抗原特異的選択を、そのクローンのスク リーニングに先立ち回避した。

ヒトｈＴＰＯｃＤＮＡの完全配列を、先に記載したように、哺乳類発現ベクター ｐＥＣＥにクローニングし、そしてチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細 胞にトランスフェクトした。これらのトランスフェクト細胞は、高いレベルの免 疫反応性及び酵素活性のあるＴＰＯを発現している。トランスフェクトされたＣ ＨＯ細胞から調製されたミクロソームは、甲状線内母集団から得られた２４クロ ーンの中の５について有意な増殖を生じさせることが見つかった（図１７Ａ）。

これらの細胞は、非トランスフェクトＣＨＯミクロソームに対する反応を全く示 さなかった（図１７Ａ）。

反対に、同じ患者から、他のＧｒａｖｅｓ’患者から、又は正常対照からの、上 皮血液Ｔ細胞（ＰＢＬ）は、トランスフェクトされた又はトランスフェクトされ ていない調製物の両方と反応した（図１７Ｂ）。ＣＨＯ細胞誘導蛋白に対するＰ ＢＬ反応は、予測できないものではない、なぜなら、同様の反応が他の異種移植 細胞抽出物により記載されていたのからである（Ｖａｎ　Ｖｌｉｅｔ、　Ｅ、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒｏｐ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１９：２１３−２１ ６　（１９８９））。しかしながら、それは、甲状腺浸潤及び上皮血液Ｔ細胞の 間の抗原レパートリ−における差異を証明している。なぜなら、直ちに、非トラ ンスフェクトＣＨＯミクロソームに対する反応が甲状腺誘導Ｔ細胞により見られ るからである（図１７Ａ及び表ＩＶ）表Ｉｔ ＮＰ−Ｉ　ＩＩＩ−−−−１３１ ＮＰ−２１１６−−−−１３１ ＮＰ−３１８７−−−−２０４ ＮＰ−４２３４−−−−２５Ｏ ＮＰ−６４２６−−−−４４Ｏ ＮＰ−７５３５−−−−５５１ ＮＰ−８６６９−−−−６８６ ＮＰ−９６９３−−−−７１６ ＮＰ−１０７２４−−−−７３９ ＮＰ−１３４８７−−−−５０４ ヒトＴＰＯ配列における、Ｔ細胞をスクリーニングすために使用される合成ペプ チドの位置。残基は、そのアミノ末端からの数である。

Ｔ細胞クローンｃ４３のＮＰペプチドへの反応ＮＰ−１４８７２５２ ＮＰ−１８５５４６３ ＮＰ−３５９６２６２ ＮＰ−４５０６７１００ ＮＰ−６６５６０１０２ ＮＰ−７２７１６１９０１６２３５ ＮＰ−８６８８５２２１ ＮＰ−９６９５２８Ｏ ＮＰ−１０６３１０１５５ ＮＰ−１３３８６９１２１ 表］］の合成ペプチドのパネルに対する甲状腺誘導Ｔ細胞クローンｃ４３の反応 （１分間当たりのカウント数）。ペプチドを示した濃度において使用した。ｃ４ ３＋自己支持（ｆｅｅｄｅｒ）単独の反応は、１０１±１６ｃｐｍであった。反 応のＳ、　Ｅ、　Ｍ、は、終始一貫してその平均値の１５％未満てあった。ｃ４ ３〜ＮＰ−７の反応は、同様の結果を与える５回の反復実験により確認された。

対照　ＴＰＯＡＰＣ＋ＮＰ−７ ミクロソーム　ミクロソーム　ＰＣ（１０μｇ／μ１）Ｃ２５７９±１３　８０ ２４±１１４４　１２３　±３２　７８±８ｃ３９　１７５±２２　１３８２４ ±１１５６　２３６　±１９　２７６±６５ｃ６５　５４＋１１　１２０３＋ｌ １１　７０　＋４　６４±６ｃ６９　７８±１０　３７５７±５１７　１６７　 ±４　２３２±８９ｃ１０３　７５±１２　’　４５７５±４７９　７６　±１ ２　５４±５ｃ４３　６５４±３９６　２１２１±５５４’　８２　±１２　１ ７１７３±１９８４ｃ７５　８４±１５　１５１±３０　３４６　±１０７　２ ５４４±１３５ｃ１０４　４４±６　２６０±２６　６８　±１４　５０１５± ７４７ｃ１０５　１７２±３０　１０２８±１４１　５９９　±５９　４４５５ ±３３８ｃ３　７１＋ＩＩ　７８±２０　７５　±ＩＩ　６０±５Ｃ９７２±４ 　４５２±３２　７１　±４　２５８±４６ｃ１８　６３±３　６２±１０　４ ９　±６　５１＋１ｃ２０　１２６±２１　７０４±８９　１０２　±９　１０ ６±１７ｃ２９　１２１±２７　１５６±１７　１０７　±７　８６±５ｃ６０ 　１９７±１１０　３４５±８４　３１０　±５３　５３６±５０ｃ６４　５０ ±３　１６０±１３　８６　±２０　２２８±５２ｃ７０　７６±１７　１３８ ±２３　９３　±２０　１５４±２０ｃ７７　６１±８　６４５±２８４　９４ 　±１１　２４２±４３ｃ８２　１８４４±１４３　４２４６±１７６　８３１ ８　±１９１　６６３２±２９２ｃ８３　１９２±４４　１３９±２６　１３０ 　±１３　７７±７ｃ９４　９５±８　１１４±１７　７０　±６　９２±８ｃ ９５　４４±６　８９±９　６２　±２５　２７４±４８ｃ９８　８７±９　９ ６±１４　８８　±８　７０±５ｃ１００　９９±１５　８１±１０　２５２　 ±１０　１６６±８ＴＰＯミクロソーム及びペプチドＮＰ−７に対する甲状腺誘 導Ｔ細胞クローンの反応。ＮＰ−７（１０μｇ／ｍｌ）又は対照又はＴＰＯミク ロソーム（０，５〜１μｌ）を、示したようにｗｅｌｌ毎に添加する。自己照射 されたＰＢＬ又はＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞を、２と５との間のＡＰＣ：Ｔ細胞比 において抗原存在細胞（ＡＰＣ）として使用゛した。結果は、３連ｗｅｌｌの平 均Ｃｐｍ（主標準誤差）である。陽性結果を、２〜７の別個の実験において確認 した。

クローンを、表ＩＩに示すような、ＴＰＯ配列に基づく１０の合成ペプチドのパ ネルを使用してさらにスクリーニングし、２つのＴ細胞のして小さな反応のみを 示す２つのクローン（Ｃ４３及びｃ１０５Ｘ表Ｉ■）は、ＴＰＯの残基５３５− ５５１に対応するペプチド（ＮＰ−７）に対し特異的反応を示した（表１１１及 びＩｖ）。すへてのＴＰＯミクロソーム調製物に対し反応しなかった２つの追加 のクローン（Ｃ７５及びＣ１０４）は、ＮＰ−７に対し有意な反応を示した。反 対に、ＴＰＯミクロソームに対して高（反応する５つのクローン（Ｃ２５、Ｃ３ ９、Ｃ６５、Ｃ６９、Ｃ１０３）は、ＮＰ−７と反応しなかった（表Ｉ■）。Ｎ Ｐ−７に対する非反応は、患者の上皮血液Ｔ細胞と共にみられた（ＰＢＬ単独＝ ６０９±１９０ｃｐｍ；　ＰＢＬ　＋　ＮＰ−７（１０μｇ／ｍ１）＝　３０２ ±３８ｃｐｍ）。

Ｃ９討議 ＴＰＯ反応性クローンによるＮＰ−７の認識の欠失は、ＮＰ−７から区別される ＴＰＯ上の追加のＴ細胞エピトープの存在を示唆している。このＴＰＯ配列（Ｎ Ｐ−７）から得られたエピトープに特異的なりローンが甲状腺浸潤物の中に高い 頻度で存在し、そして、さらに、上皮血液起源のＡＰＣにより表さられるすへて のＴＰＯとほとんど又は全く反応しないという観察は、注目に値する。

これらの結果は、標的組織を浸潤する有意な割合の活性化Ｔ細胞がその組織に特 異的な抗原蛋白を認識するという、ヒトの器官特異的な自己免疫性における第一 の明確な証拠を提供している。このことは、リウマチ様の関節炎における関節内 のコラーゲン型１１特異的Ｔ細胞の発見（Ｌｏｎｄｅｉ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８虹６３６− ６４０　（１９８９））と矛盾しない。これらの結果は、ＴＰＯ内（７）Ｔ細胞 エピトープの部位（残基５３５−５５１）をも決定し、そして、同一の患者にお ける単一標的分子上の少なくとも２つの区別されるエピトープの存在についての 証拠を提供している。このような情報は、先に討議したように、適切なペプチド に基づく免疫治療の設計のために非常に重要である。

アミノ酸レベルで、ヒトＴＰＯ内のエピトープであって自己免疫性甲状腺疾患を もつ患者の血清中の抗体により認識されるのちを正確に決定するために、天然Ｔ ＰＯに対して作られたｍＡｂのパネルについて研究した。ＴＰＯに対するこれら のｍＡｂのいくつかの結合は、患者の血清によって阻害され、そしてこれらのｍ Ａｂにより認識されるＴＰＯエピトープの決定は、間接的に、この疾患関連エピ トープを定めることになる。

上記パネル（７）１３ｍＡｂを、もっばら、ＴＰＯｃＤＮＡ（７）２００−５０ ０塩基対のランダム断片を含むように構築されたラムダ−Ｚａｐミルライブラリ ークリーニングするために使用した。バクテリアの融合蛋白として発現されたと き、３．８　ｘ　１０’　ｃＤＮＡ断片の１／６がＴＰＯのランダム６６−１６ ６アミノ酸断片を発現するであろう。

スクリーニングのために、ネズミの抗−ＴＰＯｍＡｂ（１：４０）の結合を、ペ ルオキシダーゼ−結合ヤギ抗−マウス免疫グロブリン抗体を使用して検出した。

陽性プラークは、テストされた１３のｍＡｂの中のたった１つにより現された（ ｍＡｂ〜４７）。ＭＡｂ−４７は、高いアフィニティーを伴ってＴＰＯと結合し たが、ＴＰＯの酵素活性を妨害しなかった。ヒト抗−ＴＰＯ自己抗体は、ｌ：２ ０の希釈において、ｍＡｂ−４７の結合を強（阻害する。

ｍＡｂ−４７により認識される７つのランダムに選ばれたクローンのヌクレオチ ド配列を決定した。これらのクローンのすべてが、２１８０−２１７１塩基対の 領域内で重複しているＴＰＯｃＤＮＡの同一領域に渡っている。この領域は、こ のＴＰＯ蛋白内の３０アミノ酸（位置６９８−７２８における）をコードしてい る。

抗−ＴＰＯｍＡｂ−４７は、ＴＰＯ上の連続エピトープを認識するということに おいて、テストされた１３のｍＡｂの中でユニークである。他のｍＡｂは、推定 によるが、不連続なエピトープを認識する。ｍＡｂ−４７及び天然の抗−ＴＰＯ 自己抗体の、ＴＰＯへの競合的結合は、ｍＡｂ−４７が天然の疾患関連ＴＰＯエ ピトープを定めていることを示唆している。

自己免疫性甲状腺疾患の病因についての分子及び細胞の基礎をさらに明確にする ためには、橋本甲状腺炎患者における抗−ＴＰＯ抗体により認識されるＴＰＯ上 の部位（エピトープ）を同定することが非常に重要であろう。この問題の調査に 対する従来のアプローチは、免疫学的プローブ（ポリクロナール又はモノクロナ ール抗−ＴＰＯ抗血区別される抗体結合領域がＴＰＯ内に存在するようである。

しかしながら、ＴＰＯは、非常に大きな抗原（約１０７ｋＤ）であり、そしてこ れらの技術は、関係する正確なエピトープの決定をすることができなかった。そ れ故、本発明者は、橋本甲状腺炎をもつ患者がらの血清により、多数のｈＴＰＯ ｃＤＮＡ断片を含むバクテリオファージ（ラムダ−Ｚａｐ）のヒト甲状腺ｃＤＮ Ａ発現ライブラリーを、スクリーニングすることを行った。

これらの断片のそれぞれは、６６−１６６アミノ酸のＴＰＯポリペプチドをコー ドしている長さ２００−５００塩基対である。ｈＴＰＯ蛋白の全体は、９３３ア ミノ酸を含んで成る。これらのＴＰＯポリペプチド断片は、いわゆる、バクテリ アの融合蛋白として発現される、なぜなら、その蛋白が甲状腺蛋白成分に結合さ れたβ−ラクタマーゼのｌ０ｋＤ断片のハイブリッドであるからである。

ｏ　Ｒ［（ＢＲＬ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、 　ＭＤ）及びＮｏｔ　Ｉ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｗｅｓ ｔ　Ｇｅｒｍａｎｙ）による消化により、そのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）から開放した。ベクタ ー及び挿入物の両方が同じ長さを有しているので、このＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを さらに、Ｓｃａ　Ｉ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒ ｌｙ、　ＭＡ）により消化した。このＴＰＯｃＤＮＡを、アガロース・ゲル電気 泳動及び電気溶出により精製した。このｃＤＮＡを次に、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ− ＨＣＩ　、　ｐＨ７，５，１，５ｍＭ　ＭｎＣ１□中の及びウシ血清アルブミン 中のＤＮＡａｓｅ　！（０，ｌｎｇ　ＤＮａｓｅ／　、ｌ　ｃＤＮＡＸＢＲい、 １００μｇ／ｍｌにより、小さなランダム・サイズの断片に、（室温で６分間） 消化した。２％５ｅａＰＩａｑｕｅアガロース（ＦＭＣＢｉｏ　Ｐｒｏｄｕｃｔ ｓ。

Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　ＭＥ）中の電気泳動の後、長さ２００−５００塩基対のＴ ＰＯｃＤＮＡ断片を、電気溶出により回収した。この断片の末端を、ＤＮＡポリ メ着末端末端リン酸化平滑末端（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ 、　ＮＪ）を含む凪四−ＲＩリンカ−（ＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧ）に結合 させた。ポリヌクレオチド・キナーゼによるリン酸化の後、過剰のリンカ−を、 ２％５ｅａＰｌａｑｕｅアガロース内での電気泳動により除去した。このリンカ −結合ｃＤＮＡを、再びサイズ選択（２００−５００塩基対）し、電気溶出し、 エタノール沈殿させ、そして陀虹Ｒ１切断ラムダーＺａｐベクター（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ）に結語した。パッケージングの（Ｇｉｇａ−Ｐａｋ　Ｇｏｌｄ、　 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）後、このライブラリーを、ＸＬＩ−ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ）内で増幅した。ｃＤＮＡ挿入物のサイズを、Ｂｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔ・リバース及び−２０プライマーを使用−２１１２塩基対にわたる２つの オリゴヌクレオチド２２−ｍｅｒプライマー（５−ＧＧＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＴ ＧＧＡＧＧＧＡＧＴ　及び５−ＧＴＧＧＣＴＧＴＴＣＴＣＣＣＡＣＣＡＡＡＡＣ ）を使用して行った。ＰＣＲ（３０サイクル）は、９４°Ｃ１分間、５５°Ｃ２ 分間、そして７２°Ｃ１分間であった。上記のライブラリーのスクリーニングの ために、このＰＣＲにより作られたＤＮＡを、ランダム・プライマー法（Ｍｕｌ ｔｉｐｒｉｍｅ：　Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ 、［Ｌ）を使用して、３”Ｐ−ａ　ＣＴＰにより、０．８　ｘ　１０”　ｃｐｍ ／μｇ　ＤＮＡの比放射活性までラベルした。このスクリーニング手順は、標準 的な技術（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、。

ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８２））を使 用し、最後に、０．Ｉ　Ｘ　ＳＳＣ、１％ＳＤＳバッフｙ−（１５０ＮａＣ１、 １５ｍＭクエン酸Ｎａ、　ｐＨ７，５中の１　ｘ　５ＳＣ）中で、５５°Ｃで３ ０分間（ｘ２）洗浄を含む。

上記のニトロセルロース・フィルターのオートラジオグラフィーを、Ｋｏｄａｋ 　ＸＡＲ−５フイルムにより行った。

て、ブレーティングされた、ＴＰＯｃＤＮＡ断片含存ラムダ−Ｚａｐミルライブ ラリー先に記載したように（Ｓｅｔｏ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ １ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ。

旦１２０５−１２０８　（１９８７））スクリーニングした。簡単に言えば、４ ２°Ｃで３．５時間後、ｌ０ｍＭイソプロピル−チオ−β−ローガラクトピラノ シド（ＩＰＴＧ）中に浸漬されたニトロセルロース・フィルターを、３７℃で３ ．５時間、重層した。フィルターを取り出し、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＴＢ Ｓバッファー（ＩＯｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、　ｐＨ７，５，１５０ｍＭＮａＣ １）中で洗浄し、２％Ｃａｒｎａｔｉｏｎ　ミルクを含むＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中 で室温で１５分間インキュベートし、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎで濯ぎ、そして次に、 抗体と共に４°Ｃで一夜インキユベートした。免疫スクリーニングのために、甲 状腺ミクロソーム抗原（Ｐｏｒｔｍａｎｎ、　Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　 Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８１：ｌ２１７−１２２４（１９８８））Ｉ：対 するマウス・モノクロナール抗体（＃２０．１０）を、１：２００希釈において 使用した。モノクロナール抗体により達成された非常に低い背景及び強いシグナ ルにより、バクテリア蛋白の前−吸着は、先に記載したようなスクリーニング（ Ｓｅｔｏ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　８０：ｌ２０５−１２０８　（１９８７いに先立って必要では ない。高い力価の抗ミクロソーム抗体をもっ１３の橋本甲状腺炎患者からの血清 を、１・２００の希釈において、様々に異なる条件下で使用した。橋本患者血清 によるラムダｇｔｌｌライブラリーのスクリーニング（Ｈｉｒａｙｕ、　Ｈ，。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　 ６４：５７８−５８４　（１９８７））　、このような血清による非常に少ない 背景を提供されたラムダ−ＺＡＰのスクリーニングにおける先の経験に反して、 そして、一般的に、前−吸着は、この非特異的背景を減少させることを必要とじ なかった。

前−吸着が行われたとき、Ｙ１０９０蛋白を、ニトロセルロース・フィルター上 に固定した。さらに、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の表面上で 発現された組換えｈＴＰＯを使用して作った、アフィニティー精製抗−ＴＰＯ抗 体を、固定化抗原として使用した（Ｋａｕｆｍａｎ。

Ｋ、Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８４：３９ ４−４０３　（１９８９））。この手順のために、１ｍｌの血清を、０．０５％ アジ化ナトリウム及び１ｍＭフェニルメチル・スルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ ）を含むリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）中で１：１０１：希釈した。Ｔ ＰＯ−ＣＩ（０細胞（約１０”　）を、軽いトリプシン化により再懸濁して、１ ０％ウシ血清を含むＰＢＳ中で希釈し、ペレット化（１，０００ｘ　ｇて５分間 ）し、モして４°Ｃで１時間上記の希釈抗体中に再懸濁した。未結合の抗体を、 その細胞のペレット化、その後の水冷ＰＢＳ中での濯ぎにより除去した、遠心分 離（１゜０００　ｘ　ｇで５分間）による回収後、その細胞を、再懸濁し、そし て１５０ｍ１の、０．０５％アジ化ナトリウム及びＩｍＭ　ＰＭＳＦを含むＰＢ Ｓ中の酢酸中で４°Ｃて１５分間インキュベートした。ＮａＯＨ及びＩ　Ｍ　Ｔ ｒｉｓ、　ｐＨ７゜５を、添加し、上記の酢酸を中和し、そしてその細胞及び粒 状物質を、遠心分離（４℃で、１．０００　Ｘ　ｇて５分間、そして次に、１０ ０．０００Ｘｇて３０分間）により、取り除き、その上澄液中にアフィニティー 精製された抗体を残した。このアフィニティー精製の収率は、ＥＬＩＳＭｅｔｈ ｏｄＳ　５５：１５５−１６８　（＋９８２））　、約５０％であった。

融合蛋白への抗体結合のための検出系は、先に記載されており（Ｓｅｔｏ、　Ｐ 、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８０：１２０５− １２０８　（１９８７））、以下の抗血清：マウス抗ミクロソーム・モノクロナ ール抗体のためには、１：３００の希釈における、ペルオキシダーゼ結合したア フィニティー精製されたヤギ抗マウスＩｇＧ（重及び軽鎖特異的なものＸＣａｐ ｐｅｌ、叶ｇａｎｏｎ、　Ｗｅｓ！　Ｃｈｅｓｔｅｒ、　ＰＡ、）：　ポリクロ ナール・ヒト抗血清のためには、Ｉ：３００の希釈における、抗−ヒト［ｇＧ（ Ｆｃ断片、ガンマ鎖特異的なもの）（Ｃａｐｐｅｌ）を使用するものである。色 を、２．８ｍＮ１Φ４−クロロ−１−ナツタノール（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌ ｏｕｉｓ、　ｈｉｄ）により発色させた。上記のポリクロナール抗体スクリーニ ング手順において使用された免疫学的試薬の品質を、ウェスタン・プロット分析 上の真核組換えｈＴＰＯによる強いシグナルを作るそれらの能力により確認した （Ｋａｕｆｍａｎ、　Ｋ、Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓ ｔ、　８４：３９４−４０３　（１９８９乃。陽性クローンを、同種までプラー ク精製した、潜在的に陽性なプラークの対照スクリーニングを、そのスクリーニ ング手順において第一（抗−ＴＰＯ）抗体を省くことにより行った。

選択されたクローンのヌクレオチド配列分析：プラーク精製されたラムダ−Ｚａ ｐミルファージＴＰＯｃＤＮＡの断片であってそのそれぞれの融合蛋白か上記の 抗血清により検出されているものを含むＢｌｕｅｓｃｒｉｐｉプラスミドを作る ために使用した。この手順は、製造者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の手順書に従っ てヘルパー・ファージＲ４０８を使用した。救出されたファージミド（Ｒｅｓｃ ｕｅｄ　ｐｈａｇｅｍｉｄｓ）を、ＸＬＩ−ブルー・バクテリア（Ｓ　ｔｒａ　 ｔａｇｅｎｅ）を感染させるために使用した。プラスミドを、個々のコロニーか ら調製しくＭａｎｉａｔｉＳ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏｌｏｇシ′：、へ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８２））、そしてそのｃＤＮＡ挿入物のサイズを 、Ｅｃｏ　Ｒ１による消化により評価した。選択されたプラスミドｃＤＮＡ挿入 物のヌクレオチド配列を、ジデオキシヌクレオチド終止法（Ｓａｎｇｅｒ。

Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡ　７４：５４６３−５４６７　（１９７７））により行った。ヌクレオチド 配列分析を、Ｂｉｏｎｅｔにより提供されたソフトウェア−を使用して行った。

エピトープの位置決め。自己免疫性甲状腺疾患をもつ患者内の抗−ＴＰＯ抗体に ついてのエピトープを決定するために、ｈＴＰＯｃＤＮＡ断片サブ−ライブラリ ーの免疫スクリーニングの有効性を決定することが最初に必要であった（Ｍｅｈ ｒａ、　Ｖ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ。

ＵＳＡ　８３ニア０１３−７０１７　（１９８６））。この目的のために、甲状 腺ミクロソーム抗原に対して作られたモノクロナール抗体（Ｐｏｒｔｍａｎｎ、 　Ｌ、、　ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　８１：１２１７− １２２４　（１９８８乃であってＧｒａｖｅｓ’　甲状腺ｃＤＮＡライブラリー からこの抗原をクローン化するために（ＨｉｒａＹｕ、　Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、 　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　６４：５７８− ５８４　（１９８７））過去において具合よく使用されていたものを使用した。

新たなＴＰＯｃＤＮＡ断片サブ・ライブラリーは、３．８　ｘ　１０’組換えク ローンであって、この数の６分の１の有効な（正しい方向及び読み取り枠）をも つものを含むように構築された。この挿入サイズは、２００−５００塩基対の範 囲内にあることが確かめられた。

上記の抗−ミクロソーム抗原モノクロナール抗体による上記ライブラリーのスク リーニングは、スクリーニングされた１、　０００プラーク当たり６−１２の陽 性プラークを作った。１４の陽性クローンを、ＴＰＯ遺伝子の全体と比へたそれ らのＴＰＯｃＤＮＡ挿入物の位置を描写するために、部分的なヌクレオチド配列 についてランダムに選んだ。１４りローンの中の１２は、１６０−３５０塩基対 のｃＤＮＡ挿入物をもっていた。推定された最大５００塩基対よりも僅かに大き いｃＤＮＡ挿入物をもつ２つのクローン（Ｕ及びＹ）は、ヌクレオチド配列上に 、２重のｃＤＮＡ挿入物をもっていることが見つかった。上記手順の成功が示す ように、上記モノクロナール抗体により認識された１４クローンのすべてが、ｈ ＴＰＯ遺伝子の同一領域（７４６−１，１５０塩基対）に広がっていた（Ｍａｇ ｎｕｓｓｏｎ。

Ｒ，Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、ｌ：８５６− ８６１　（１９８７）Ｘ図１８）　。すべてのクローンに共通な最大領域、そし てそれ故に共通エピトープを示すものは、塩基８８１及び９２７の間（ＡＡ　Ａ ＡＣＣＣＡ　ＴＧＴ　ＴＴＴ　ＣＣＣＡＴＡ　ＣＡＡ　ＣＴＣＣＣＧ　ＧＡＧ　 ＧＡＧ　ＧＣＣＣＧＧ　ＣＣＧ　ＧＣＣ）にあり、これは、たった１５残基の誘 導アミノ酸配列（Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　ｌｉｅ　Ｇｉｎ　 Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｌａ）に対応している。それ故、 上記のモノクロナール抗体により認識されるエピトープは、この１５アミノ酸ス パン内に横たわっている。

自己甲状腺疾患における抗ミクロソーム／ＴＰＯ抗体についてのエピトープ。橋 本甲状腺炎をもつ患者からの血清による、先に記載したようなものと同じＴＰＯ ｃＤＮＡ断片サブ−ライブラリーの約４０のスクリーニングは、いかなる陽性な りローンをも作らなかった。ｌ）その中でＴＰＯ融合蛋白を発現する異なる宿主 バクテリア（ＢＢ４、ＸＬｌブルー及びＹ１０９０）の使用：２）異なる売手か らの抗−ヒトＩｇＧ抗体又は蛋白Ａの使用を含む、抗体結合検出系における変動 ：及び３）有力な抗−ＴＰＯ活性をもつ１３の異なる患者血清の使用、を含む変 更を試した。この血清を、多くの方法：バクテリアの前−吸着なしものの：バク テリア溶菌物による後吸着のもの：又は組換えｈＴＰｏによるアフィニティー精 製後のもの、においてテストした。上記のスクリーニング手順における内部対照 として、上記のモノクロナール抗体は、予測された数の陽性クローン数をいつも 作った。

全く驚くべきことに、先に報告されたような（Ｌｉｂｅｒｔ、　Ｆ、、　ｅｔ　 ａｌ。

、　ＥＭＢＯＪ、　６：４１９３−４１９６　（１９８７）：　Ｌｕｄｇａｔｅ 、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、６８：１０９１−１０９６　（１９８９ ））　、８６アミノ酸Ｃ２ｈＴＰ。

ポリペプチド断片内で発現されたエピトープを検出することができなかった。使 用された断片ライブラリーが０２領域を欠いていたかもしれないという可能性の ために、Ｃ２領域の存在を、その０２領域のそれぞれの末端に相補的なオリゴヌ クレオチド・プライマーを使用して、ＰＣＲによりテストした。予想されたサイ ズの断片（２６１塩基対）をはっきりと検出した。さらに、ライブラリーをスク リーニングするためのプローブとしてこのＰＣＲ−生成断片を使用することによ り、ライブラリー中の約１０％のプラークが０２配列を含むことを決定した。

このｈＴＰＯｃＤＮＡ断片ライブラリー中の橋本甲状腺炎血清によるこれらの陰 性結果のため、これらの血清を、先に記載されたように構築された（Ｋａｕｆｍ ａｎ、　Ｋ、Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８ ４：３９４−４０３（１９８９））　、ラムダ−Ｚａｐ　Ｇｒａｖｅｓ’甲状腺 ライブラリー（オリゴ−ｄＴ及びランダムープライムド（ｒａ口ｄｏｍ−ｐｒ　 ｉｍｅｄ）の両方）をスクリーニングするためにも使用した。上記のオリゴ−ｄ Ｔ−プライムド・ライブラリーは、多数のＴＰＯｃＤＮＡ完全長コピー（３，１ ｋｂ）を含んでいる、これは、このようなｃＤＮＡがそのファージ・ベクターか ら真核発現プラスミドにサブクローン化され、モして真核のチャイニーズ・／Ｘ ムスター卵巣細胞中に安定してトランスフェクトされたとき（Ｋａｕｆｍａｎ、 　Ｋ。

Ｄ、、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８４：３９４− ４０３　（１９８９））　、酵素活性をもち、抗原として無傷であるＴＰＯを発 現する能力により、証明された。これにも係わらず、真核細胞内で発現されたＴ ＰＱと免疫学的に強く反応するＩ３の有力な橋本患者血清による、このラムダ− Ｚａｐミルライブラリークリーニングにおいて、特異的なシグナルは全く検出さ れなかった（ｋａｕｆｍａｎ、　Ｋ、Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ 、　１ｎｖｅｓｔ、　８４：３９４−４０３　（＋９８９））。多くの強く反応 するプラークがこれらのスクリーニングにおいて観察され、その中では、プラー クは、患者の血清の非存在中でさえその第二抗体（抗−ヒト［ｇＧ）と反応して いた。同様の発見が、過去において、ラムダｇｔｌＩ　（Ｈｉｒａｙｕ、　Ｈ， 、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、 　６４：５７８−５８４　（１９８７））内のＧｒａｖｅｓ’　甲状腺ｃＤＮＡ ライブラリーにより観察された。これらのクローンは、そこからそのライブラリ ーが作られているところのＧｒａｖｅｓ’　甲状腺線内のＢ−リンパ球内に存在 するＩｇＧを表しているのかもしれない。

完全長ｃＤＮＡファージ・ライブラリー内での蛋白発現に伴う潜在的な困難は、 そのｃＤＮＡ挿入物の５°−非翻訳領域内の終止コドンが、その融合蛋白のβ− ガラクトシダーゼ部分の下流に挿入されている外来蛋白の翻訳を妨害するかもし れないということである。この可能性を取り除くために、２つの追加のアプロー チを試みた。第一は、オリゴ−ｄＴプライムド・ライブラリーと同じようなやり 方で構築されたう〉・ダムープライムド・ヒト甲状腺ｃＤＮＡラムダーＺＡＰラ イブラリーのスクリーニングであった。但し、オリゴ−ｄＴよりもむしろランダ ム・プライマーか第一ストランドｃＤＮＡ合成のために使用された。

第二のアプローチは、このラムダ−Ｚａｐミルクローン作られたＢｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔプラスミド内の完全長ｈＴＰＯｃＤＮＡクローンからの５−未翻訳領によ る消化、それに２より、ｈＴＰｏ　ｃＤＮＡの５−末端の１５４塩基対を脱離さ せ、そのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドのβ−ガラクトシダーゼ成分を読み取 り枠内に残しているＴＰＯ蛋白（そのシグナル・ペプチドを差し引いたもの）の 全体を残すことにより、達成した。この新たなプラスミド構築物を、融合蛋白の 生産（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　ＣＡ）及びウェスタン・ プロット分析にためにＸＬＩ〜ブルー宿主バクテリアにトランスフェクトした。

ランダムープライムド・ライブラリー及びＸｈｏ　［欠失突然変異体のいずも、 橋本患者血清により、又は組換えｈＴＰＯを使用したこれらの血清からアフィニ ティー精製された抗−ＴＰＯ抗体により、認識されることができるｈＴＰＯ蛋白 を全く作らなかった。

討議 本データは、甲状腺自己抗原に対する抗体により認識されるエピトープの、正確 な分子レベルにおける、最初の定義を提供する。ヒＴＰＯ（Ｌｉｂｅｒｔ、　Ｆ 、、　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　６：４１９３−４１９６　（１９８７） ：　Ｌｕｄｇａｔｅ。

Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔ ａｂ、　６８：１０９１−１０９６　（１９８９）：　Ｄｏｂｌｅ、　Ｎ、Ｄ、 、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６４：２３−２９　（１９８８）：　 Ｌａｉｎｇ、　Ｐ、。

Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｌａｂ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１９：１９−２３　（１９８ ６）；にｏｈｎｏ、　Ｙ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｃ１１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、６８ニア６ロー７７３　（１９ ８９）：　Ｙｏｋｏｙａｍａ、Ｎ、、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎ ｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　６８ニア６ロー７７３　（１９８９））に 対するポリクロナール又はモノクロナール抗体を使用した先の研究は、これらの 抗体がこの抗原の異なる領域を認識することを示唆しているが、いずれの研究も 、大きさ１５アミノ酸残基と同じように小さいその分子の領域にエピトープを位 置決めすることができなかった。

Ｂ−細胞（抗体−認識）エピトープの最小サイズは、討議の下にあるが、５−１ ０アミノ酸残基のオーダーであると信じられている（Ｖａｎ　Ｒｅｇｅｎｍｏｒ ｔｅｌ、　Ｍ、Ｈ，Ｖ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｌｅｔｔ、　 １７：９５−１０８　（１９８８））。

それ故、本発明の１５アミノ残基のスパンは、そのエピトープそれ自体のサイズ と非常に近い。

本例における顕著な発見は、抗−ミクロソーム／ＴＰＯモノクロナール抗体によ る陽性結果と、天然の疾患関連抗−ＴＰＯ抗体がその使用されたライブラリー内 で発現された６６−１６６アミノ酸ＴＰＯ断片を認識することができないという こととの間の著しい対比である。より線状のＴ−細胞エピトープと異なり、天然 のＢ−細胞エピトープは、より立体的な配置（ｃｏｎｆｏｒｍａｔ　１ｏｎａｌ ）であることができ、そしてその分子の２次又はさらに３次構造により影響され ることができる。折り畳まれた蛋白質のループのジスルフィド結合及び近接であ ってその線状構造においては遠い距離にあることができるものが、Ｂ−細胞エピ トープの形成に貢献しているかもしれない。本データは、上記疾患関連抗−ＴＰ Ｏ抗体についてのエピトープが高く立体的な配置であることを示唆している。

例Ｘｎ ＴＰＯ上のβ細胞のさらなる決定 本例は、抗甲状腺ペルオキシダーゼ（抗−ＴＰＯ）抗体により認識されるエピト ープの決定による橋本甲状腺炎の病因の理解における重要な段階を提供する。例 Ｘｌｌ＋においては、その蛋白のランダム断片（長さはそれぞれの６６−１６６ アミノ酸）を発現する、ヒトＴＰＯｃＤＮＡザブサイプラリ−を構築した（Ｍｅ ｈｒａ、　Ｖ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌｌ鉢」 と７０１３−１０１７　（１９８６））。しかしながら、高い力価の抗−ＴＰＯ 抗体をもつ橋本疾患を患った患者からの血清は、これらのＴＰＯ蛋白断片のいづ れをも認識できなかった。反対に、このライブラリー内のＴＰＯ断片は、変性ヒ トＴＰＯに対するマウス・モノクロナール抗体（ＭＡｂ）により認識された。こ れらのデータは、上記疾患関連ＴＰＯエピトープが高く立体的な配置であり、そ してその線状アミノ酸配列の非隣接（非連続）領域により形成されているようで あるという先の証拠（Ｈａｍａｄａ、　Ｎ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、λ１ｅｔａｂ、　６４：２３０−１５−２３　（ １９８７））を支持している。

本実験は、非変性ヒトＴＰＯに対して作られた１３のＭＡｂのパネルを使用して 、ＴＰＣＩ上の疾患関連Ｂ−細胞エピトーブを決定することである（Ｒｕｆ、　 Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１２５：１２１１−８ 　（１９８９））。これらのＭＡｂのいくつかの生来のＴＰＯへの結合は、自己 免疫疾患をもつ患者の血清中の抗−ＴＰＯ抗体により阻害され（Ｒｕｆ、　Ｊ、 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１２５：１２１１−８　（ １９８９））、このことは、これらの特定のＭＡｂエピトープが、上記の疾患関 連エピトープと同じであるか又は近くに在ることを示している。それ故、上記パ ネル内のＴＰＯＭＡｂのいくつかについてのエピトープの決定は、上記の自己免 疫性甲状腺疾患関連Ｂ−細胞エピトーブの分子ドメインを描くことができた。

材料及び方法 ＴＰＯ断片ライブラリー：　ＴＰＯランダム断片ｃＤＮＡライブラリー（３，８ ｘ　１０　’ブラークー形成単位）の構築は先に記載されている。このライブラ リーの免疫スクリーニングを、生米のヒトＴＰＯに対して作られた１３のマウス ＭＡｂを使用して、先に記載したような、標準的な技術（Ｒｕｆ、　Ｊ、、　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１２５：１２１１−８　（１９８ ９））により、行った。陽性クローンを、プラーク精製し、そしてそのｃＤＮＡ 挿入物の７クレオチド配列のためのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを作るため に使用した（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４：５４６３−５４６７　（１９７７） ）。独立したクローンのＤＮＡ配列を、そのエピトープを包含する重複の最小領 域を位置決めするために、そのＴＰＯｃＤＮＡ配ウェスタン・プロット：　チャ イニーズ・ハムスター卵巣細胞により安定して発現された組換えヒトＴＰＯを抗 原として使用した。細胞を、すへて先に記載したように、培養し、］ＯｍＭ　Ｔ ｒｉｓ　（ｐＨ７，４）、０゜２５　Ｍシュクロース、　２ｍｇ／ｍＬバチドラ ジン、ＩｍＭフェニルメチルスルホニルーフルオリド、０．１ｍＭ　Ｎ〜α−ｐ −トシル−し−リジン−クロロメチルケトン、及び０．１ｍＭロイペプチン（す べて、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｔｎｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍ Ｏから）を含むバッファー中にこそげ落とし、そしてミクロソーム分画を調製し た。この蛋白濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、　Ｍ、Ｍ、 、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２：２３８−２５４　（１９７６））に より測定した。サンプル（−１００μｇ蛋白）を、２％ドデシル硫酸ナトリウム 及び５％β−メルカプトエタノール（最終濃度）により処理し、そして７．５％ ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に、、　Ｎａｔｕ ｒｅ２２７：６８０−６８５　（１９７０乃に供した。蛋白を、製造者の推奨に 従って、Ｍｉ！ｌ１Ｂｌｏｔ転移システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏ、、　Ｂ ｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）を使用してＰｒｏＢｌｏｔ膜（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）に転移した。

膜を、少しの変更を伴って、先に記載したように加工した。ＭＡｂ（１：１００ ０希釈）とのインキュベショーンを４°Ｃで一夜行った。ＭＡｂ結合を、Ｉ　： 　１０００に希釈された、ホースラジッシュ・ペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マ ウス免疫グロブリンＧ　Ｆ（ａｂ’）ｚ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｒｎｔｅｒｎａ ｔｉ。

ｎａｌ、　Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｕｎｉｔｅ ｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ）　により、０゜５ｍｇ／ｍＬ　４−クロロ−１−ナフトー ル、０．５７ｍｇ／ｍＬイミダゾール、１７％メタノール、及び基質としての０ ．４２％過酸化水素を使用して検出した。

結果 非変性のヒトＴＰＯに対して作られた１３のマウスＭＡｂ（Ｒｕｆ、　Ｊ、、　 ｅｔａｔ、、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１２５：１２１１−８　（１９８ ９））の中の、たった１　ツ（４７番）が、ｃＤＮＡライブラリーにより発現さ れたＴＰＯ蛋白断片を認識した。このヌクレオチド配列を、１８のランダムに選 択されたｃＤＮＡクローンについて決定した。すべてのｃＤＮＡ挿入物は、ＴＰ ＯｃＤＮＡ配列の同一領域にわたっていた（図１９）。すべてのｃＤＮＡ断片に 共通な最小領域は、その蛋白内の９アミノ酸（残基７１３−７２１）をコードし ている、ヒトＴＰＯｃＤＮＡヌクレオチド配列の塩基対２２１９と２２４７との 間に在った。

したがって、これらの９アミノ酸は、抗−ＴＰＯモノクロナール抗体４７のため のエピトープの少なくとも一部である。他の１２　ＴＰＯＭＡｂが上記のライブ ラリーにより発現されたＴＰＯペプチド断片を認識できないことは、そのスクリ ーニング手順における技術的な困難に帰することはできない、であろう。なぜな ら、内部対照、ＴＰＯＭＡｂ　４７及びＴＰＯＭＡｂ　２０．１０（Ｐｏｒｔｍ ａｎｎ、　Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８１ ：１２１７−１２２４　（１９８８））のすべてが、強く陽性であったからであ る。

１３ＭＡｂのパネルの、ｃＤＮＡライブラリーにより作られたＴＰＯ断片（上を 参照のこと）に対しての反応性と、ＴＰＯ蛋白全体に対しての反応性とを比較す るために、ウェスタン・プロット分析を、プローブとしてのこれらのＭＡｂ及び 抗原としてのＣＨＯ細胞内で発現された組換えヒトＴＰＯを使用して行った。こ のＴＰＯ断片については、ＭＡｂ　４７だけが、変性及び還元条件下で完全なＴ ＰＯ分子と反応した（図２０）。対照として、ＴＰＯＭＡｂ　２０．１０（Ｐｏ ｒｔｍａｎｎ、　Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、［ｎｖｅｓｔ、　 ８１：１２１７−１２２４　（１９８８））であって上記の変性蛋白に対して作 られそしてＴＰＯアミノ酸２６６−２８１の間の線状エピトープを認識すること が先に示されている（Ｆｉｎｋｅ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、 　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ。

１、　Ｍｅｔａｂ、　７１：５３−５９　（１９９０））ものも、同様のサイズ の蛋白を検出した。先の酵素結合イムノソルベント検定のデータ（Ｒｕｆ、　Ｊ 、、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１２５：１２１１−８　（１９８９））と矛盾せ ず、生来のＴＰＯに対する＋３ＭＡｂのすべてか、非変性組換えヒトＴＰＯを免 疫沈降させた。

討議 本データは、生来のヒトＴＰＯに対して作られた１３ＭＡｌ］のパネルの中のた った１つ（４７番）が、９３３アミノ酸ＴＰＯ分子のランダム６６−Ｉ６６アミ ノ酸断片と反応することを示した。この観察と矛盾することなく、ＭＡｂ　４７ のみが、変性及び還元の後、無傷のＴＰＯを認識した。

但し、このパネル内の１３ＭＡｂのすべてが、生来の非変性ヒトＴＰＯ認識した （Ｒｕｆ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｔ、、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１２５：１ ２１１−８　（１９８９））。

我々の発見と一致して、ＭＡｔｌ　４７は、それがＴＰＯへのその結合がその蛋 白のジチオトレイトール処理により廃止されることができない唯一のＭＡｂであ ることにおいて、ＴＰＯＭＡｂの上記のパネルの中でユニークである。ＴＰＯＭ Ａｂ　４７（アミノ酸７１３−７２１）のためのエピトープは、ＴＰＯＭＡｂ　 ２０．１０（アミノ酸２６６−２８１）のためのものとは異なっている。

さらに、ＴＰＯＭＡｂ　２０．１０は、変性ＴＰＯとのみ反応する（Ｐｏｒｔｍ ａｎｎ、　Ｌ。

、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、８１：１２１７−１２２４　（ １９８８））　。

我々の発見は、多くのＢ−細胞エピトープが立体的な配置であり、そして不連続 であるようであるという新たな概念を補強している。

このことは、球状蛋白上のエピトープが、３次元構造に依存し、そして蛋白の折 り畳みにより並Ｗ　（ａｐｐｏｓ　ｉ　ｔ　１ｏｎ）にもっていかれた線状蛋白 の多数の異なる領域から成るということを意味している。それ故、生来のＴＰＯ により免疫化されたマウスにより作られた１３ＭＡｂの中のたった１つが、ＴＰ Ｏ断片ライうラリー内で、又は変性及び還元によりＴＰＯの非折り畳みの後に、 発現された線状エピトープを、認識する。なぜなら、ＭＡｂ　４７は、生来のＴ ＰＯ蛋白をも認識し、アミノ酸７１３−７２１は、ヒトＴＰＯの表面上に位置し なければならないからである（ＴＰＯλｌＡｂ　２０．１０により認識されるア ミノ酸２６６−２８１　とは異なる）。線状配列の異なる領域から得られた折り 畳み蛋白内の他の隣接ループも、ＭＡｂ　４７のためのエピトープに貢献するこ とができる。

アミノ酸７１３−７２１は、上記抗体による認識に必要である最小限のものかも しれない。

ヒトＴＰＯに対するＴＰＯＭＡｂ　４７の結合は、自己免疫甲状腺疾患をもつ患 者の血清中の抗−ＴＰＯ抗体により阻害される（Ｒｕｆ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ 、。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１２５：１２１１−８　（１９８９））　、それ 故、ＭＡｂ　４７のための線状９アミノ酸（残基７１３−７２１）エピトープは 、自己抗体関連ＴＰＯＢ−細胞エピトープに一致するか又は近いものである。本 データは、甲状腺自己抗体のためのエピトープを含むドメイン内の特異的アミノ 酸を定める。ＭＡｂ　４７についての競合研究（Ｒｕｆ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ 、、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１２５：１２１１−８　（１９８９））は、 ＭＡｂ　４７エピトーブと相互反応する自己免疫性甲状腺疾患活性中のイディオ タイプ抗体が共通でないことを示唆している。

先の例は、生米の、膜関連酵素、及び切り詰められた、分泌蛋白、の両方として の、組換えヒトＴＰＯ（ｉＴＰＯ）の発現について記載している。本例において は、真核細胞における組換えｈＴＰＯの分泌形態の過剰発現について記載する。

ｈＴＰＯ遺伝子増輻を、マウス・ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子 を含むベクターにより行った。安定してトランスフェクトされたチャイニーズ・ ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、戸んだんと増加する濃度のメトトレキサート （ＭＴＸ）の存在中で増殖させた。ＴＰＯ発現を、酵素結合イムノソルベント検 定（ＥＬＩＳＡ）において免疫学的に、抗−ＴＰＯ抗体を使用して測定した。こ の酵素の野性型の、膜関連形態をも過剰発現させるという試みは、はとども、Ｍ ＴＸによる選択圧の開始に先立っていくつかの高生産細胞系において観察された ものよりも有意に高い蛋白発現のレベルを達成することは不可能であった。事実 、１１００ｎ　ＭＴＸを超える、細胞の免疫反応性ｈＴＰＯ含有物が、実際に減 少した。反対に、最終ＭＴＸ濃度１０゜０００　ｎＭまでの１ＴＰＯの切り詰め られた、分泌形態の漸進的過剰発現を観察した。トランスフェクトされた細胞か らのゲノムＤＮＡのスロット−プロット分析は、上記のｄｈｆｒ及び切り詰めら れたｈＴＰＯ遺伝子の並列的な増幅を表した。分泌ｈＴＰＯの高いレベルの発現 は、それにより大量の生物学的及び免疫学的な活性ｈＴＰｏ蛋白を得ることがで きるような手段を提供する。

材料及び方法 発現プラスミドｐＳＶ２−ＤＨＰＲ−ＥＣＥ−ｈＴＰｏ及びｐｓＶ−Ｄ）ＩＦＲ −ＥＣＥ−ｈＴＰＯ−ＭＩノ懸；上記の発現ベクターｐＥＣＥの内の完全長ｈＴ Ｐｏ　ｃＤＮＡを、ハ巽−］により消化し、そしてその末端を、ＤＮＡポリメラ ーゼｌのＫｌｅｎｏｗ断片により平滑化した、発現ベクターｐＳＶ２−ｄｈｆｒ （叶、　Ｇｏｒｄｏｎ　Ｒｉｎｇｏｌｄ。

５ｙｎｔｅｘ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡにより好意的に提供された）を、 Ｅｃｏ　Ｉ’ｌｌにより消化し、その末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎ ｏｗ断片により平滑化し、そして、そのベクターを、バクテリアのアルカリ性ホ スファターゼにより処理した。この平滑末端の、線状にされたベクター及びｃＤ ＮＡを、互いに結合し、組換えプラスミドｐＳＶ２−ＤＨＰＲ−ＥＣε−ＨＴＰ Ｏを作った。部位特異的突然変異誘発によるＢｌｕｓｃｒｉｐｔ内で作られた、 ｈＴＰＯの分泌形態（ｈＴＰｏ−Ｍｌ）をコードしているｃＤＮＡを、プラスミ ドｐＳＶ２−ＤＨＰＲ−ＥＣＥ−ＨＴＰＯ内ノ野性ＷｈＴＰＯｃＤＮＡ　ト交換 し、ｐＳＶ２−Ｄ）（ＦＲ−ＥＣＥ−ＨＴＰＯ−Ｍｌを作り出した。

ｐＳＶ２−ＤＨＰＲ−ＥＣＥ−ＨＴＰＯ及びｐＳＶ２−ＤＨＰＲ−ＥＣＥ−ＨＴ ＰＯ−ＭｌのＣＨＯｄｈｆｒ−細胞へのトランスフェクション及びメトトレキサ ートによる増幅二ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞（ＣＨＯ−ＤＧ４４；　ＤＲ，Ｒｏｂｅ ｒｔ　Ｓｃｈｉｍｋｅ、　５ｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｐａ１ ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡにより好意的に提供された）を、１０％ウシ血清、ペニシ リン（１００Ｕ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（４０μｇ／ｍｌ）及びアンフオテリ シンＢ（２，５μｇ／ｍｌ）を補ったＨａｍ’ｓ　Ｆ−１２培地中で維持した。

プラスミドＤＮＡ（１０μｇ）によるトランスフェクションを、リン酸カルシウ ム沈殿法（Ｃｈｅｎ、　Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏ ｌ、　７：２７４５−２７５２　（１９８７））により行った。

トランスフェクトされた細胞を、上記のような、ｌＯ％透析ウシ胎児血清及び抗 生物質を補った、チミジン−、グアニジン−１及びヒポサンチン（ｈｙｐｏｓａ ｎｔｈｉｎｅ）−フリーのＨａｍ’　ｓ　Ｆ−１２培地中で選択した。

個々のクローンを、クローニング・シリンダーにより選択し、そして高いレベル のＴＰＯ発現をもつ２つのクローン（クローンＣ）１０−ＨＴＰＯ−２Ｂ及びＣ ＨＯ−ＨＴＰＯ−Ｃ４Ｃ）を、次に、増幅のために使用した。メトトレキサート （Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ（ＭＴＸりを、３．３ｎλ（の開始濃度としてこの 選択細胞培養培地に添加し、そして生存細胞を収穫し、そして増殖させた。この メトトレキサート濃度を、次に、最終濃度１０．０００μｍ（１００μＭ）に達 するまで、３．３３倍の増加量により増加させた。

ＣＨＯ−ｈＴＰＯ及びＣＨＯ−ｈＴＰＯ−Ｍｌ細胞のＥＬＩＳＡ：　対照及びＭ ＴＸ−処理ＣＨＯ−ｈＴＰＯ細胞のヒト血清（Ｄｒ、　５ａｎｄｒａ　ＭｃＬａ ｃｈｌａｎ、　Ｃａｒｄｉｆｆ、　Ｗａｉｅｓ、　ＬＩＫにより好意的に提供さ れた）を、細胞ミクロソームを使用した、先に記載したような、５ｃｈａｒｄｔ 他の方法（Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　５５：１５５−１６８　 （１９８２））の方法から、変更した。ｉＴＰｏ−Ｍｌ蛋白は、ＣＨＯ−ｈＴＰ 。

−Ｍｌ細胞の培地中に分泌されるので、３日間ならした培地を、それらの細胞か ら回収した。これらの培地からの蛋白を、先に記載したように、沈殿させ、そし て処理した。ヒト血清のＥＬ［ＳＡのための抗原を、ｗｅｌｌ当たり上記の透析 蛋白沈殿物の１００μｌとして使用し、約３００μｇの蛋白を、２ｘ被覆バツフ アー（０，１Ｍ２炭酸ナトリウム、ｐＨ９，３＋　０．０４％アジ化ナトリウム ）中でｌｌに希釈した。１以上のＥＬＩＳＡを、すべてのＭＴＸ　６度について 使用したので、値を、それぞれの細胞型の検定にわたり使用されたＩｏｏｏｎＭ 　ＭＴＸ値に参照されたＥＬＩＳＡ係数として報告した。これと同じ血清を、そ れぞれの細胞型のＥＬ［ＳＡにおいて使用した。

ＣＨＯ−ｈＴＰｏ−Ｍｌ細胞のゲノムＤＮＡ抽出：それぞれのＭＴＸ濃度におい て生存していたＣＨＯ−ｈＴＰＯ−Ｍｌ細胞の集密１００ｍｍ１直径皿がらの細 胞を、凍結し、そして再ブレーティング（１００ｍｍ）まで−８０″Ｃで保管し 、集密まで増殖させ、モしてゲノムＤＮＡの抽出のために使用した。細胞を、５ ｍｌの氷冷Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　’Ｊン酸バッファー生理食塩水であってカ ルシウムー及びマグネシウム−フリー（ＰＢＳ−ＣＩｔｌＦ）のものの中で３回 濯いだ。この細胞を、次に、その皿からこそけ落とし、４°ＣＣ１２０００ｒｐ ての１０分間の遠心分離により回収した。このペレットを、２容量（１００−２ ００μｌ）の３２０ｍ）Ｊシュクロース、１０ｍλｌ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ、ｌｌＨ ７，５，５ｍＭ　ＭｇＣＩｚ　、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００中に再懸濁し、 そして３０分間氷上で保管した。この懸濁液を、（４°Ｃ）２５０Ｏｒｐｍで１ ５分間遠心分離し、そしてそのペレットを、４．５ｍｌ　ｌ０ｍＭ　ＮａＣｌ　 、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ、ｐＨ７，５，１０ｍＭＥＤＴＡ中に再懸濁した。

ＲＮａｓｅ消化（室温における６０分間の４．５μＩのｌ０ｍｇ／ｍｌ　ＤＮａ ｓｅ−フリーＲＮａｓｅの添加）を行い、その後、プロテイナーゼに消化を、３ ７°Ｃで一夜行った（０．５ｍｌ　１０％ＳＤＳ　＋　０．１ｍｌ　１０ｍｇ／ ｍ　ｌブロテイナーセＫ）。次に、ＤＮＡを、５ｍｌの０．ＩＭ　ＴｒｉＳ−バ ッファー・フェノール、ｐＨ７，４：ＣＨＣｌ　２．４％イソアミル・アルコー ル（ｌ：１）により２又は３回（その水相が清澄になるまで）抽出し、その後、 ＣＨＣｌ　、、４％イソアミル・アルコールにより等容量を抽出した。

このＤＮＡを、０．１容量の３Ｍ酢酸すトリウム、ｐＨ５，２及び２容量のエタ ノールにより、−８０℃で２時間、沈殿させ、そしてそのペレットを０．５ｍｌ 　ＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁し た。ゲノムＤＮＡサンプルの性質及び量を、アガロース・ゲル電気泳動及び２６ ０ｍｍにおける吸光度により評価した。集密細胞の１００ｍｍ皿からのゲノムＤ ＮＡの収量は、４０−１６０μｇであった。

ＣＨＯ−ｈＴＰＯ−Ｍｌ細胞のスロット・プロット検定：　ＣＩＣｌ０−ｈＴＰ ｏ−細胞からのゲノムＤＮＡ（１５Ｍｇ）を、ＥｃｏＲＩにより消化し、エタノ ール沈殿させ、ＴＥバッファー中に再懸濁し、そして２６０ｍｍにおける吸光度 により再定量した。このＤＮＡの部分（１，０，０，５、又は０．２５μｇ）を 、０゜５ｍｌの０．４　Ｎ　ＮａＯＨ，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ中で希釈し、１０分 間煮沸し、そして氷上に置いた。０．４　Ｎ　ＮａＯＨで濯いだ、ナイロン膜フ ィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−ＮＲＰＮ、３０５ＯＮ　、　Ａｍｅｒｓｂａｍ　Ｃｏ ｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を、スロ ット−プロット装置（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ　Ｉｔ、　５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　 ５ｃｈｕｅｌｌ。

Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨ）に使用し、そしてそのｗｅｌｌを、０．５ｍｌの０．４　 Ｎ　ＮａＯＨで濯ぎ、そして真空乾燥させた。個々の０．５ｍｌのゲノムＤＮＡ サンプルを、ｗｅｌｌ毎に添加し、真空を短く使用し、そしてそのｗｅｌｌを、 ０．５ｍｌの０．４　Ｎ　ＮａＯＨで濯ぎ、そして真空乾燥させた。このフィル ターを、取り出し、２　ｘ　５ＳＣ（０，３Ｍ　ＮａＣ１，０，０３Ｍ　クエン 酸ナトリウム、ｐＨ７，０）中で手短に洗浄し、そして風乾した。ゲノムＤＮＡ は、Ｕｖ照射（ＵＶ　５ｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ　２４００．　Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ、　ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）によりそのフィルター架橋し、そしてそ のフィルターを、ラベルされた、ＰＣＲ−生成、マウスｄｈｆｒ　ｃＤＮＡの０ ．３ｋｂ断片によりブロービングし、洗浄し、そしてオートラジオグラムを行っ た。０．１　ｘ　５ＳＣ（０，０１５Ｍ　ＮａＣ１，０゜００１５　Ｍ　クエン 酸ナトリウム）、０．１％ＳＯ８中での１時間の煮沸後の最初のラベルの除去を 確認した後、そのフィルターを、ラベルされたヒトＴＰＯｃＤＮＡの０．５６ｋ ｂ断片により再ブロービングし、洗浄し、そして写真を撮った。

組換えプラスミドｐＳＶ−ｄｈｆｒ−ｅｃｅ−ｈＴＰＯ及びｐＳＶ−ｄｈｆｒ− ｅｃｅ−ｈＴＰＯ−Ｍｌを、ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクトし、それ ぞれ、ＣＨＯ−ＴＰＯ及びＣＨＯ−ＴＰＯ−Ｍｌ細胞系を作った。これらの細胞 系を、１０００（膜関連ｈＴＰＯ）又は１０．０００（分泌ｈＴＰＯ）までの漸 進的増加（３，３３倍）！！ＩＴＸ濃度中で増殖させた。それぞれのサイクルは 、３週間の最小値をもっていた。増幅のそれぞれの段階における細胞を、低温− 保存しくｃｒｙｏ−ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）、そして免疫反応性ｈＴＰｏ発現のレ ベルの比較のために最終増幅段階の後に再ブレーティングした。

細胞系ＣＨＯ−ＨＴＰＯ−２５及びＣＨＯ−ＨＴＰＯ−Ｃ４Ｃからのミクロソー ム分画中の野性型膜関連ヒトＴＰＯの含有量を、橋本甲状腺炎血清中の抗−ＴＰ Ｏ抗体を使用してＥＬ　Ｉ　ＳＡにより免疫学的に定量した。両方の細胞系にお いては、ある程度のＴＰＯ免疫反応性の増幅が、１００　ｎｍ　ＭＴＸにおける 最大値に達する、ＭＴＸ濃度の増加により明らかであった。この増加の後に、１ ８Ｍまでのより高いＭＴＸ濃度において免疫反応性ＴＰＯ蛋白における段階的な 落ち込みがあった。ＣＨＯ−ＨＴＰＯ−Ｃ４Ｃ１すなわち、より高い基礎の（前 −ＭＴＸ）ｈＴＰｏ含有量をもつ細胞系、においてＴＰＯ発現の最小増加が在っ た。ＣＨＯ−ＨＴＰＯ−２Ｂ細胞においてＴＰＯ発現におけるより大きな増加が 在り、その達成された最大レベルは、上記のＣＨＯ−ＨＴＰＯ−Ｃ４Ｃ細胞にお けるものよりもほんの僅か高いものであった。

ＣＨＯ−ＨＴＰＯ及びＣＨＯ−ＨＴＰＯ−Ｍ＋細胞の両方のλＩＴＸ−誘導遺伝 子の増幅の間、より低い濃度におけるよりも、１００〜３３３ｎＭ　ＭＴＸにお いてより高い細胞の死滅があったようであり、生存細胞の集密まての増殖におけ る遅れかあった。

酵素の膜関連形悪をもつＴＰＯの制限された過剰発現とは反対に、ＣＨＯ−ＨＴ ＰＯ−Ｍｌ細胞によるｈＴＰｏの分泌形態の過剰発現は、非常に大きかった。こ れらの細胞においては、そのＴＰＯの殆どが、その培地中に分泌され、その細胞 内には殆と残っていなかった。ＴＰＯ発現は、３３３　ｎＭ　ＭＴＸに始まり、 ベースラインの上を著しく増加し、最高使用濃度（１０ＭＭ）まで段々と増加し た。ｄｈｆｒ又はｈＴＰＯＤＮＡプローブのどちらかを使用したＣ）１０−ＨＴ ＰＯ−Ｍｌ細胞からのゲノムＤＮＡのスロット−プロット分析は、ＴＰＯ蛋白発 現のパターンのもの平行な、同様の増幅パターンを現した。

比較を、膜関連（ＣＨＯ−ＨＴＰＯ−２Ｂ細胞）及び分泌蛋白（ＣＨＯ−ＨＴＰ Ｏ−Ｍｌ細胞）から入手可能なＴＰＯの量の、ＥＬＩＳＡにおける免疫学的検出 についての比較を行った。集密ＣＨＯ−ＨＴＰＯ−Ｍｌ）細胞（１０ｕＭ　ＭＴ Ｘ）（７）単一１００ｍｍ皿からの３日間ならした培地は、ＣＨＯ−ＨＴＰＯ− ２Ｂ細胞（１００ｎＭ　ＭＴＸ）の１００ｍｍ集密皿から調製されたミクロソー ムから得るよりも有意に多いＴＰＯ蛋白を作り出した。これらの細胞系の両方は 、それらの最も高いレベルのＴＰＯ発現を表した。

例ＸＶ［ 橋本甲状腺炎における抗−ＴＰＯ抗体によるＴＰＯの認識における炭水化物部分 の役割 ｈＴＰｏ上の炭水化物の部分は、橋本甲状腺炎において抗−ｈＴＰＯ抗体により 認識されるエピトープに貢献することができる。なぜなら、真核細胞内で発現さ れる蛋白と異なり、バクテリアの融合蛋白はグリコジル化されているからである 。ｈＴＰｏにおける炭水化物部分についてはほとんと知られていない。ヒトＴＰ Ｏ（Ｒｕｆ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　ＡｃｔａＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　５ ｕｐｐ１．２８１：４９−５６　（１９８７））及びミクロソーム抗原（ＫａＪ ・コンカナバリンＡ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ　Ａ）と結合させた。また、後 者を、物構造が、Ｎ−結合、〇−結合、又は両結合されているかどうは、知られ ていない。本例においては、ｈＴＰｏの炭水化物成分の性質、並びにｈＴＰＯの 炭水化物が橋本甲状腺炎における天然のエピトープの構造において役割をはたし ているかどうかを調査した。

（１９８９））を安定して発現するチャイニーズ・ハムスター卵巣（Ｃ１（０） 細胞を、ｌＯ％ウシ胎児血清、１００　Ｕ／ｍｌペニシリン、４０℃ｇ／ｍｌゲ ンタマイシン及び２．５μｇ／ｍｌアンフオテリシンＢを含むＦ１２培地中で１ ００ｍｍ直径皿内で培養した。放射ラベリングのために、集密に至前の細胞を、 カルシウム及びマグネシウムを含まないリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ− ＣＭＦ）中で２回濯ぎ、そして次に、ｌＯ％透析ウシ胎児血清を含むメチオニン ーフＩＪ−Ｆ１２培地（３ｍｌ／皿）中で１５−２０分間インキュベートした。

３ＳＳ−メチオニン（＞１１００　Ｃｉ／ｍｍｏｌ；　Ａｍｅｒｓｈａｍ。

ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　［Ｌ）を、次に、その培地に添加しく ０．２ｍＣ１／ｍ１）、そしてそのインキュベーションを、３７°Ｃで２−４時 間続けた。

この培地を取り除き、そしてその細胞を、ＰＢＳ−ＣＭＦ中で２回濯ぎ、水冷Ｐ ＢＳ−ＣＭＦ中にこそげ落とし、そして１０００　ｘ　ｇ（４°Ｃ）で１０分間 ペレット化し、ｌ０ｍ１の上記と同じバッファー中で１回洗浄し、そしてソノ細 胞ペレットを、均一化バ７７７−（５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ＳｐＨ７，５，１％ Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，０，１ｍＭフェニルメチルスルホニル・フルオリド 、２ｍｇ／ｍｌバチドラジン、０．２５ｍＭ　ＴＬＣＫ（Ｎ−ｐ−）シル−１− リジン・クロＣ１−メチル・ケトン）及び０．１ｍＭロイペプチン（Ｓｉｇｍａ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、。

Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ））中で再懸濁した（０．３ｍｌ／ｍｌ／細胞室温 において１時間振とうした後、その混合液を、１００，０００　Ｘ　ｇ　（４° Ｃ）で１時間遠心分離し、そしてその上澄液を、免疫沈降バッファ−（１０ｍＭ 　ＩＪン酸Ｎａ、　ｐＨ７，２、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１、ｏ、ｉ％ドデシル硫酸Ｎａ 、　０．５％ＮＰ−４０及び２ｍＭ　ＥＤＴＡ）中で１ｍｌまで希釈した。

１ｍｌの可溶化細胞蛋白を、８０μｌの１０％ＩｇＧ−３ｏｒｒｙ（スタフィロ コッカスＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　Ａ））（Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅ　 Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｍａｉｄｅｎ、　ＭＡ）と、室温で１０分間、２回、前吸着さ せ、その後、ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ内で１０．Ｏｏｏ　ｘ　ｇにおいて３分間の遠 心分離により［ｇＧ−３ｏｒｂを除去した。抗−ｈＴＰＯ抗体の高い力価（ＥＬ ｉＳＡの読み＞１．５０．０．単位）をもつ橋本甲状腺血清を、１・２００の最 終希釈まで添加した。同様の結果を、３つの別個の血清により得た。４℃で一夜 インキユベートした後、１５０μｌの［ｇＧ−Ｓｏｒｂを添加し、そしてそのチ ューブを、室温で２−４時間、端から端まで回転させた。この［ｇＧ−Ｓｏｒｂ を、１０．０００　ｘ　ｇで５分間遠心分離により回収し、１ｍｌの免疫沈降バ ッファーで５回、そして次に、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　ｐＨ７，５，２ｍＭ　 ＥＤＴＡ及び０６５％ドデシル硫酸Ｎａにより１回洗浄した。最後に、このペレ ットを、５０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む、ｌａｅｍｍｌｉサン プル・バッファー（３１）中に、再懸濁し、３分間煮沸し、そして６％アガロー ス・ゲルに使用した。分子量マーカー（Ｓｉｇｍａ：　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　 ＭＯ）は、以下の：　２０５　ｋＤミオシン：ｌ１６　ｋＤβ−ガラクトシダー ゼ；　９７　ｋＤホスホリラーゼｂ　、　６６　ｋＤウシ血清アルチミン：　４ ５　ｋＤ卵白アルブミン、のようなものであった。

オートラジオグラフィーをＫｏｄａｋ　ＸＡＲ−５フイルムにより行った。

免疫沈降ヒトＴＰＯの酵素的脱グリコジル化：先に記載したように、免疫沈降さ れそして（ｇＧ−３ｏｒｂに結合した、組換えの、放射ラベルされたｈＴＰＯを 、ｌａｅｍｍｌ　ｉサンプル′・バ・ソファ−中でよりもむしろ酵素消化バッフ ァー中で回収した。酵素消化（３７℃で１８時間）を以下の：エンドグリカナー ゼＦ（ｅｎｄｏｇｌｙｃａｎａｓｅ　Ｆ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈ ｅｉｍ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａｎｙ、３０　Ｕ／ｍｌ；　１００ｍＭ　リン酸 ）くラフ７−Ｎａ、　ｐｉ（６，０，５０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、Ｏ，１％ＳＤＳ、 　１％β−メルカプトエタノール及び１％ＮＰ４０中のもの）：エンドグリカナ ーゼＨ（ｅｎｄｏｇｌｙｃａｎａｓｅ　Ｈ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　０．２ 　Ｕ／ｍｌ；　エンドＦのためのものと同じ）＜・ソファ−中のもの、但し、Ｅ ＤＴＡを除いたもの）：０−グリカナーゼ（０−ｇｌｙｃａｎａｓｅ）（Ｂｏｅ ｈｒｉｎｇｅｒ、　２．５　［１／ｍｌ：エンドＨのためのものと同じ）＜・ノ ア７　）＋及びノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）（Ｓｉｇｍａ 、１　［Ｊ／ｍｌ：　１００ｍＭクエン酸Ｎａ５ｐＨ５，２，５ｍＭ　ＥＤＴＡ 及び１％β−メルカブトエタノーノい、のように行った。対照として、ｈＴＰｏ の分解を監視するために、それぞれの実験は、添加酵素を伴わずに並行してイン キュベートされたサンプルを含んでいた。

レクチン・アフィニティー・クロマ１〜グラフイー・ＣＩ（Ｏ−ＴＰＱ細ｌ包（ ５−７１００ｍｍ直径皿）の洗剤抽出物を、２５Ｓ−メチオニン（上記を参照の こと）により放射ラベルし、そして、コンカナノくリンＡ（Ｃａｎ　Ａ）、ピー ナツ凝集素（ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＰＮＡ）　、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ） 　、ヒマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）凝集素１（ＲＣＡＩ）及びウナ ギ（Ｕｌｅｘ　Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）（ＵＥＡ−Ｆ）アガロース結合レクチン（ すべて、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｕ山口ｇａｍｅ、　Ｃ Ａから購入した）のカラムの２ｍＩｎのべ・ソド容量に、供給した。このカラム への使用のために、サンプル（０，３ｍ１）を、それぞれの個々のレクチンのた めに以下のもの：　ＷＧＡ及びＲＣＡＩ　−１ｍｋ（ＥＤＴＡ：　Ｃａｎ　Ａ　 −１ｍλｌ　ＣａＣ１２，１ｍＭ　ＭｎＣｌ　、：　ＰＮＡ　−１ｍＭ　Ｃａｌ 　２　、１ｍＭＭｇＣ１ｚ：　ＵＥＡ−Ｆ　−１ｍＭ　ＣａＣ１、を補ったバッ ファ　−Ａ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ、ｐＨ７，４，１５０ｍＭ　ＮａＣ１ ，０，１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１ｏｏ）中で１０＋ｎｌまで希釈した。カラムへ の供給の後、未結合の蛋白を、先のバッファーＡの５０ｍ１で洗浄することによ り除去した。特異的に吸着された蛋白を、以下のニーＷＧＡ　、　Ｎ−アセチル グルコサミン：　ＰＮＡ及びＲＣＡＩ、　Ｄ−ガラクトース：　Ｃｏｎ　Ａ　、 ａ−メチル−〇−７ンノサイド（ｍａｎｎｏｓｉｄｅ）　；及びＵＥＡ−Ｆ、α −フコース（ａ−ｆｕｃｏｓｅ）の（すべて３００ｍＭにおける）ものの２５’ ｍｌにより溶出させた。０．５ｍｌの分画を回収し、そして液体シンチレーショ ン・カウンター内で放射能について計測した。溶出された放射能のピークを含む ２つの分画をプールしく１ｍ１）　、そして橋本甲状腺炎をもつ患者の血清中の 抗−ｈＴＰＯ抗体と免疫沈降させ、その後、ポリアクリルアミド電気泳動及びオ ートラジオグラフィー（上を参照のこと）に供した。

結果 先に記載したように、ヒトｈＴＰＯの誘導アミノ酸配列（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ。

Ｒ，Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏｃｒｊｎｏｌ、　Ｉ：８５６ −８６１　（１９８７）：　Ｋｉｍｕｒａ、　Ｓ、。

ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ　 ８４：５５５５−５５５９　（１９８７）；　Ｌｉｂｅｒｔ、　Ｆ、、　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５：６７３５　（１９８７） ）は、その酵素の細胞外ドメイン内に５潜在的なグリコジル化部位があることを 示唆している。これは、Ａｓｎ−Ｘ−３ｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘは、いずれかのアミノ 酸：第３位は、Ｓｅｔ又はＴｈｒのいずれかであることができる）のグリコジル 化部位のだめのトリーペプチドのアルゴリズムに基づいている。炭水化物の鎖は 、Ａｓｎ残基（Ｎ−結合）、又はＳｅｒ又はＴｈｒ残基（〇−結合）に結合され ることができる。

ｈＴＰＯ炭水化物の部分が、Ｎ−結合、〇−結合、又は両結合されているかどう かを決定するために、そしてまた、その炭水化物成分の特徴についての情報を得 るために、ｈＴＰｏを、様々な特異性を有する多数の脱グリコジル化酵素により 消化した。放射ラベルされたｈＴＰＯを調製するために、組換えｈＴＰＯを発現 するチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内の蛋白を２５Ｓ−メチオニ ンにより放射ラベルし、その後、橋本甲状腺炎をもつ患者の血清中に存在する抗 −ｈＴＰＯ抗体により免疫沈降させた。ウェスタン・プロット分析上で先に観察 したように（Ｋａｕｆｍａｎ、　Ｋ、Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ 、Ｉｎｖｅｓｔ、　８４：３９４−４０３　（１９８９乃、組換えｈＴＰｏは、 約１１５　ｋＤ及び１１０　ｋＤの二重線として存在し、その＋１５　ｋＤ及び １１０　ｋＤのバンドの相対的強度（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｄｏｍｉｎａｎｃｅ） は、実験から実験へ変動する。そのチトビオース（ｃｈｉｔｏｂｉｏｓｅ）コア 内の２つのＮ−アセチル・グルコサミン（ＧｌｕＮａｃ）残基の間のグリコシド 結合を解裂することにより複合及びポリマンノース（Ｔｈｏ　ｔａｋｕｒａ。

Ｎ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１３８：３５０− ３５９　（１９８７））のＮ−結合グリカンの両方を除去するエンドグリコシダ ーゼ（ｅｎｄｏ）　Ｆは、約１１０　ｋＤ及び１０５　ｋＤの二重線までの上記 のｈＴＰｏ二重線の電気泳動の易動性を増加させた。ポリマンノースに対しては エンドＦと同様であるが複合グリカンに対してはエンドＦとは異なる、エンドＨ も、１１０　ｋＤ及び１０５　ｋＤの二重線までのｈＴＰｏ二重線の易動性を変 換する。反対に、０−グリカン成分及びノイラニミダーゼであってされぞれ〇− 結合グリカン及び末端ノイラミン酸（ｎｅｕｒａ制旧ｃ　ａｃｉｄ）を除去する ものが、放射ラベルされたｈＴＰＯの易動性を変更しなかった。これらのデータ は、ヒトＴＰＯがポリマンノースのＮ−結合グリカンのみを含んでいることを示 唆している。

レクチン・アフィニティー・クロマトグラフィー（Ｍｅｒｋｌｅ、　Ｒ，に、。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１３８：２３２−２５９　（ １９８７））は、ｈＴＰＯ炭水化物部分のポリマンノース性についてのさらなる 支持を提供した。それ故、放射ラベルされた、組換えｈＴＰｏを、コンカナバリ ンＡ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ上にのみ保持され、これは、少なくとも２つの外側の マンノース残基が置換されていないか又は他の糖によりＣ−２位において置換さ れているかのとちらかであるところのＮ〜結合オリゴサツカライドに高いアフィ ニティーを伴って結合する。結合したｈＴＰＯは、３００ｍＭのα−メチル−〇 −マンノサイドにより溶出されることができた。ＴＰＯは、小麦胚芽凝集素（末 端及び内部のＧｌｕＮａｃ及び末端ノイラミン酸に特異的である）、ヒマ凝集素 １（ＲＡＣＩ）（末端ガラクトース残基をもつビー及び１−リーａｎｔｅｎｎａ ｒｙ　Ｎ−結合オリゴサツカライドに高いアフィニティーをもツ）、ピーナツ凝 集素（末端Ｇａ１−β−１，３−Ｇａ１Ｎａｃ）又はウナギ（末端α−Ｌ−フコ ース）には結合しなかった。

組換えヒトＴＰＯ内に存在する炭水化物のタイプを決定したので、本発明者は、 それらの残基が、橋本甲状腺炎における抗−ｈＴＰＯ抗体により認識されるｈＴ ＰＯ上の疾患関連エピトープにおいて役割をもつかどうかを調査した。

放射ラベルされた組換えｈＴＰｏを、コンカナバリンＡ−３ｅｐｈａｒｏｓｅア フイニテイー・クロマトグラフィーにより最初に部分精製し、次に３つの異なる グリカナーゼにより消化し、そして最後に、橋本甲状腺炎における抗−ｈＴＰＯ 抗体による免疫沈降に供した。エンドＦ及びエンドＨによるそのチトビオース・ コアから離れたＮ−結合炭水化物績の完全除去は、抗体結合を妨害しなかった。

これらの実験の複雑性の視点において、Ｎ−グリカナーゼ処理の完全性に注目す ることが重要である。それ故、グリコジル化の後、免疫沈降されたｈＴＰｏのす へてか、上記のより小さな（１１０ｋＤ及び１０５　ｋＤ）二重線と同じであっ た。さらなる対照として、０−グリカナーゼによる消化は、非変更ｈＴＰｏ形態 （１１５ｋＤ及び１１０　ｋＤ）の免疫沈降を導いた。

先の研究は、甲状腺ミクロソーム抗原（Ｋａｊｉｔａ、　Ｙ、、　ｅｔ　ａｌ、 、　ＦＥＢ８７乃が、フンカナバリンＡにより結合されることを示した。しかし ながら、本発明者は、ヒトＴＰＯ内のオリゴサツカライド（グリカン）部分の性 質についての他のデータを得ていない。本明細書中先に記載したような非甲状腺 真核細胞内での組換えヒＩ−ＴＰＯの発現を利用することにより、本データは、 この主題に対し新たな情報を提供する。

従って、グリカン酵素消化及び示差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）レクチン・ア フィニティー・クロマトグラフィーの両方により、本例中にあるデータは、ｈＴ ＰＯ上のすへての炭水化物の部分がＡｓｎ残基（Ｎ−結合）に結合しており、か つ、Ｓｅｔ又はＴｈｒ（０−結合）に結合していないという強い証拠を提供して いる。さらに、エンドＨによる選択的膜グリコジル化（Ｔｈｏｔａｋｕｒａ、　 Ｎ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１３８：３５０− ３５９（１９８７い、並びニコンカナバリンＡへの選択的吸着（Ｍｅｒｋｌｅ、 　Ｒ，に、。

ｅｔ　ａｔ、、　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１３８：２３２−２５９　（１ ９８７））は、それらのＮ−結合オリゴサツカライドが各種のポリマンノースを 有していることを示唆している。

橋本甲状腺炎の病因の展望から最も重要であるが、本データは、ｈＴＰＯ内に存 在するオリゴサツカライドが、自己免疫性甲状腺疾患、主に橋本甲状腺炎を患っ た患者の血清中の抗−ｈＴＰｏ抗体により認識されるエピトープに有意に影響を 与えないということを示している。

本例に固有の推測は、組換えｈＴＰＯのグリカン成分か、インビボにおいてヒト 甲状腺細胞内に存在するＴＰＯ内のものと構造的に同じということである。チャ イニーズ・ハムスター卵巣細胞がヒト甲状腺細胞と異なるやり方でそのｈＴＰＯ ポリペプチド鎖をグリコジル化することかできるということを排除することはで きないけれとも、このような差異のいずれも取るに足らないものであろう。それ 故、酵母及びバクテリアにおけるポリペプチドのグリコジル化のパターンとは異 なり、真核のチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞におけるグリコジル化は、ヒト 甲状腺細胞におけるものと同一ではないにしても、非常に少ないものである。本 推定のためのさらなる支持は、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞内の組換えｈ ＴＰＯが、単層培養におけるヒト甲状腺細胞（Ｋａｕｆｍａｎ、　Ｋ、Ｄ、、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８４：３９４−４０３　 （＋９８９））内に存在するのと同じレベルにおいて、機能的に活性である。さ らに、事実、抗−ミクロソーム抗体を含む橋本甲状腺炎をもつ患者からのすべて の血清がウェスタン・プロット分析（Ｋａｕｆｍａｎ、Ｋ、Ｄ、、ｅｔ　ａｌ、 、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、８４：３９４−４０３　（１９８９））　上で 又はＥＬＩＳＡにより、本形態の組換えヒトＴＰＯを認識する。それ故、決定に より、本発明の組換えヒトＴＰＯは、妥当な、疾患関連の、ｈＴＰＯ上のエピト ープを含んでいる。

ヒトＴＰＯ上の炭水化物の除去が橋本甲状腺炎血清中の抗−ｈＴＰＯ抗体による 認識に関してその分子の抗原性に影響を与えないという本発見は、ツニカマイシ ンにより得られたデータと矛盾しない（例Ｘ！を参照のこと）。しかしながら、 本データは、より強いものである。

本データは、ｈＴＰＯ内のオリゴサツカライド成分が自己免疫性甲状腺炎をもつ 患者の血清中の抗−ＴＰＯ抗体により認識される”天然の“エピトープの一部で ないということを示唆している。しかしながら、この分子のグリコジル化部分が そのエピトープと抗体との相互作用に、例えば、その相互作用のアフィニティー を変更することにより、影響を与えることができるかもしれないという可能性が 残る。いずれかの特定の理論により合わされることを意図していないけれとも、 ポリクロナール及びモノクロナール抗体の両方により認識される工ピトーブの大 部分が非連続性であるという認識が増している。すなわち、ポリペプチド鎖の折 り畳みにより、蛋白の３次元構造が、エピトープ、すなわち、広く別れた、”非 連続的な”ポリペプチド鎖の領域、として、並置になることができる。この３次 元の立体配置は、ペプチド断片における欠損があり、又はバクテリア融合蛋白の β−ガラクトシダーゼ成分により変更されることができる。

本データは、抗体によるＴＰＯ上のエピトープ（Ｂ−細胞エピトープ）の認識に 関する。これらのＢ−細胞エピトープは、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）制限法 （ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ　ｍａｎｎｅｒＸＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、　Ａ、Ｍ、 、　ｅｔａｌ、、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｎ＋ｕｎｏ１．５：４７７−５０ １　（１９８７））におけるＴ−細胞に現れたエピトープから区別されると、現 在、認識されている。Ｂ−細胞エピトープは、免疫系による甲状腺線へのダメー ジを仲介することにおいて重要であるようであり、一方、Ｔ−細胞エピトープは 、その自己免疫過程の開始において比較的より重要であるようである。

例ＶＸＵ β−細胞エピトープを甲状腺ペルオキシダーゼに結合することができるβ−細胞 領域の同定及び配列決定とりわけ、例ｘ１１１及びＸ［Ｖにおいて本発明により 開示された配列は、甲状腺ペルオキシダーゼのβ−細胞認識の原因である相互作 用を同定する方法を提供する。

詳細には、好ましい態様の例ＸＩＩ［及びＸＩＶ中に開示された配列を使用して 、これらの配列に結合する蛋白を単離することが可能である。これは、特異的な りＮＡ配列に結合する蛋白を精製する、当業者によく知られた方法を使用して達 成される。好ましくは、特異的なりＮＡ配列に結合する蛋白を、アフィニティー ・クロマトグラフィーを使用して精製する。特に、甲状腺ペルオキシダーゼの残 基７１３−７２１に対応する９のアミノ酸配列を、好適なマトリックス、例えば 、５ｅｐｈａｒｏｓｅ上に固定化し、そしてフィニティー・マトリックスとして 使用し、特定の配列に結合する蛋白を精製する（Ａｒｃａｎｇｉ　ｏｌ　ｉ、　 Ｂ、　。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７９：３５９−３６４ 　（１９８９））。

好ましくは、上記のＤＮＡ結合蛋白は、ヒトβ細胞から抽出される。

このβ細胞から得られた蛋白抽出物を、問題の固定化ＤＮＡ配列を含むカラムに 供給する。そのＤＮＡ配列に結合することができない蛋白を、そのカラムから洗 い出す。そのＤＮＡ配列に結合した蛋白を塩グラジェントを使用してそのカラム から溶出させた。このようなカラムから溶出された蛋白は、上記のマトリックス 上に固定化された特異的ＤＮＡ配列に結合する蛋白について濃縮されている。こ のＤＮＡ結合蛋白を、当業者によく知られた手順、例えば、イオン交換クロマト グラフィー、高速液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等を 使用してさらに精製する。

このＤＮＡ結合蛋白の精製の間、この蛋白を、例えば、よく知られｅｓ、　９： ６５０６　（１９８１））、又は他のよく知られた方法を使用して、検定する。

一旦、上記のＤＮＡ結合蛋白を精製すれば、部分アミノ酸配列を、その蛋白のＮ −末端から得ることができる。あるいは、その蛋白を、推定アミノ酸配列をオリ ゴヌクレオチド・プローブを作るために使用する。コード配列は、その生物によ り、より頻繁に使用されることが知られているコドンに基づくことができる。あ るいは、このプローブは、そのポリペプチドをコードすることができるであろう コドンの可能な組み合わせのすべての混合物から成ることができる。

このような方法は、当業者によく知られている。

上記のアミノ酸配列に相補的なプローブを、そのＤＮＡ結合蛋白をコードしてい るゲノム配列について、ｃＤＮＡ又はゲノム・ライブラリーをスクリーニングす るために使用する。一旦、そのＤＮＡ結合蛋白をコードしている遺伝子が得られ たら、そのＤＮＡの配列を、よく知られた方法に従って決定する。この遺伝子を 、組換え宿主から大量の蛋白を得るために使用し、又はその配列を、そのＤＮＡ と相互作用する蛋白内の機能的領域をさらに決定するための突然変異的分析（二 おいて使用することができる。

あるいは、β−細胞エピトープ（残基７１３−７１２）に結合する蛋白を、よく 知られた技術、例えば、サウスウエスタン・プロット法（Ｓｏｕｔｈ１５９−１ １６６　（１９９０））を使用して、その蛋白を発現するクローンを同定するこ とにより単離する。

サウスウエスタン・プロットにおいては、ラベルされたＤＮＡ配列を、ｃＤＮＡ 発現ライブラリーであってその発現蛋白がコロニー又はプラーク転移を介してフ ィルター上に固定されているものをスクリーニングするために使用した。このラ ベルされたＤＮＡは、特定のＤＮＡ配列に結合する能力のある蛋白を発現するコ ロニー又はプラークに結合する。このラベルされたＤＮＡ配列に結合する蛋白を 発現するコロニーを、精製し、そしてそのＤＮＡ結合蛋白をコードしているｃＤ ＮＡ挿入物を、単離し、そして配列決定する。この単離されたＤＮＡを、さらな る精製及び研究のための、大量の蛋白を発現させるために使用することが、その ｃＤＮＡに対応するゲノム配列の単離において使用することが、又はその結合蛋 白の機能的誘導体を作るため４二使用することが出来る。

それ故、本発明は、β−細胞エピトープに及びそれらの機能的誘導体に結合する ことができるＤＮＡ結合蛋白を指向するものである。

ハシモト０ＮＬＹ ＦＩＧ　２Ｂ ≦ 特表平７−５０３６０４　（３１） ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、　５ ８１　１０Ｂ 八６丁　ＧＣＡ　ＧＴＴ　ＧＧＣＴＧＡ　Ｇ＾Ａ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＡＡ＾　＾ ＧＡ　ＡＴＧ　ＡＧＡ　ＧＣＧ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　bＴＧ　ＴＣＴ ＭＥＴ　Ａｒｇ　ＡＩＱ　Ｌｅｕ　Ａｌｏ　ＶＱＩ　ＬＥＩＬＩ　５ｐｒ１”１ ５　１６２ ＧＴＣＡＣＧ　ＣＴＧ　ＧＴＴ　ＡＴＧ　ＧＣＣＴＧＣＡＣＡ　ＧＭ　ＧＣＣＴ ＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＣＡｒｃ　ＴＣｒＪ　ＡＧＡ　ＧＧＧＶａｔ　Ｔｈｒ　Ｌ ｅｕ　Ｖａｌ　Ｍｐｔ　Ａｌ＋Ｉ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　ＧＬＬＩ　ＡＩＱ　Ｐ）ｖ 　Ｐｈｐ　Ｐｒｏ　Ｐｈｐ　ｌ　ｌｐ　rｐｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＣＴＣＣＴＴ　ＴＧＧ　ＧＧＡ　ＡＡＧ　ＣＣＴ　ＧＡＧ　Ｇ ＡＧ　ＴＣＴ　ＣＧＴ　ＧＴＣＴＣＴ　ＡＧＣＧＴＣＴＴ［戟@ＧＡＧ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　ＬＥＩＬＪ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌ ｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　ＶＱＩ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖモ奄戟@Ｌｅｕ　Ｇ ｌｕ ＧＡＡ　ＡＧＣＡＡＧ　ＣＧＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＡＣＡＣＣ［ＪＣＣＡＴＧ　 ＴＡＣＧＣＣＡＣ［Ｊ　ＡＴ［Ｊ　ＣＡ［Ｊ　ＡＧＡ　ＡＡbＣＴＣ Ｇｌｕ　Ｓｐｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｖａ（Ａｓｐ　Ｔｈｒ＾Ｉｎ　Ｈｐ ｔ　Ｔｙｒ＾ＩＱ　Ｔｈｒ　Ｈｅｔ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ａｓ氏@Ｌｅｕ ２９７　コ２４ ＡＡ［Ｉ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＡＴＣＣＴＴ　ＴＣＴ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　 ＣＡＧ　ＣＴＴ　ＣＴｃ　ＴＣＴ　ＴＴＴ　ＴＣＣＡＡＡ　bＴＴ　ＣＣＴ しｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｉ　ｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ＡＩＱ 　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙ刀@Ｌｐｕ　Ｐｒ。

コ５１　コア８ ＧＡＧＣＣ＾ＡＣＡＡＧＣＧＧＡＧＴＧＡＴＴ［ＩＣＣＣＣｌ＾ＧＣＡＧＣＡＧ ＡＧＡｒＡ＾丁ＧＧＡＡＡＣＡＴＣＡＡＴＡＧｌｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｐｒ　 ＧＩＹ　ＶＱＩ　ｌｌｐ＾ＩＱ　Ａｒｇ　Ａｌａ＾ｌｏ　Ｇｌｕ　ｌｌｅ　Ｍｅ ｔ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓ垂秩@１ｉｅ ４０５　４］２ Ｃ八八　ＧＣ［ｌ　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＧＴＣＡＡＣＣＴＧ　Ｍ Ａ　ＡＣＴ　ＣＡＡ　ＣＡ＾　ＴＣＡ　ＣＡＧ　ＣＡＴ　ＣbＡ　ＡＣ［ｌｌ Ｇｌｎ　Ａｌｏ　Ｈｐｔ　Ｌｙｓ＾ｒｇ　Ｌｙｓ　Ｖａｔ＾ｓｎ　Ｌｐｕ　Ｌｙ ｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　Ｐ窒潤@Ｔｈｒ ４５９　４Ｂ６ ＧＡＴＧＣＴＴＴＡ丁ＣＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＧＣ八丁Ｃ＾ＴＴＧＣＡ ＾＾ＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＴＧＴＣＴＣ八５ｐ　＾ｌｏ　Ｌｃ＋ｕ　Ｓｅｒ　Ｇ ｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｐｕ　Ｌｅｕ　Ｓｐｒ　Ｉｌ［ｌ　ｌｌｐ　＾ＩＱ　Ａｓｎ　 Ｍｅｔ　Ｓｐｒ　Ｇ撃凵@Ｃｙｓ　Ｌｐｕ ５１］　５４０ Ｃ口１丁Ａ（：ＡＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＡＡＡＡＴＧＣＣＣＡＡＡＣＡＣＴＴＧ ＣＣＴＧＧＣＧＡＡＣＡＡＡＴ＾ＣＡＧＧＰｒｏ　Ｔｙｒ　Ｈｅｔｔ　Ｌｅｕ　 Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　丁ｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　 ＾ｔｏ　Ａｓｎ　Ｌｙ刀@Ｔｙｒ　Ａｒｇ ＣＣＣ八ＴＣＡＣＡ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　ＴＧＣＡＡＣＡＡＣＡＧＡ　ＧＡＣＣＡ ＣＣＣＣＡＧＡ　ＴＧＧ　ＧＧＣ、ＧＣＣＴＣＣＡＡＣＰｒｏ　１ｉｅＴｈｒ　 Ｇｌｙ　ＡＩＱ　Ｃｙｓ＾ｓｎ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｈａｓ　Ｐｒｏ　Ａ ｒｇ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ａｌｏ　Ｓ■窒■Tｎ ＾ＣＧ　ＧＣＣＣＴ［ｌｌ　ＧＣＡ　ＣＧＡ　ＴＧＧ　ＣＴＣＣＣＴ　ＣＣＡ　 ＧＴＣＴ＾■６八Ｇ　ＧＡＣＧＧＣＴＴＣＡＧＴ　ＣＡＧ　bＣ［： Ｔｈｒ　ＡＩＱ　Ｌｅｕ　Ａｌｏ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｌｐｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　 Ｖｃｉｌ　ｌｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｐｈｐ　Ｓｅ秩@Ｇｉｎ　Ｐｒ。

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Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．組換えヒト甲状腺ペルオキシダーゼ、又はそれらの機能的若しくは化学的誘 導体の残基７１３−７２１を含んで成る９アミノ酸の領域を含んで成るペプチド 。
2. ２．以下のアミノ酸配列： 【配列があります】 又はそれらの機能的若しくは化学的誘導体を含んで成るペプチド。
3. ３．甲状腺ペルオキシダーゼのＢ−細胞エピトープに結合するペプチド。
4. ４．前記のペプチドがＢ−細胞蛋白から単離される、請求項３のペプチド。
5. ５．前記の蛋白が組換えにより製造される、請求項４のＢ−細胞蛋白。
6. ６．ヒト甲状腺ペルオキシダーゼの疾患関連Ｂ−細胞エピトープを含んで成るペ プチド。
7. ７．請求項１〜６のペプチドをコードしている、ＤＮＡ配列。
8. ８．アミノ酸残基７１３−７２１を含んで成る９アミノ酸領域が欠失又は置換さ れている、組換え甲状腺ペルオキシダーゼ。
9. ９．請求項１〜６のペプチドに対する抗体。
10. １０．前記の抗体が、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、抗−イディオ タイプ抗体及び抗抗−イディオタイプ抗体から成る群がら選ばれている、請求項 ９の抗体。
11. １１．サンプル中のヒト甲状腺ペルオキシダーゼの検出方法であって、このサン プルを、検出可能なものとしてラベルされている請求項９又は１０の抗体と、そ のサンプル中のヒト甲状腺ペルオキシダーゼと検出可能なものとしてラベルされ た抗体との間に複合体を形成させるように接触させること、そして複合体を形成 した又は複合体を形成しなかった検出可能なラベル抗体を検出することを含んで 成る方法。
12. １２．請求項１０の抗−イディオタイプ抗体を含んで成る医薬組成物。
13. １３．免疫疾患を患った患者の治療のための請求項１２の医薬組成物の使用。
14. １４．前記の免疫疾患が橋本甲状腺炎である、請求項１３に記載の使用。