JPH07503458A - 蛋白の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 蛋白の製造 発明の分野 本発明は、蛋白の、そして特に組換え蛋白の製造及び回収方法に関する。本方法 は、上記蛋白の微生物生産及びその後の回収に特に有用である。

発明の背景 蛋白の製造、及び特にその微生物製造においては、その製造工程、特に発酵工程 の間のこれらの蛋白の不安定性は、その工程の収益率を確保するための主要な関 心の内にある。

異種蛋白の生産のために組換え技術を使用するとき、その蛋白生成物は、しばし ば、“封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｉｅｓ）“とじて細胞内に見られる 凝集体を形成することが見つかっている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ｅｔ　ａｔＳｃｉ ｅｎｃｅ　２１５　（１９８２）　６８７−６８９）。

封入体としてか又は他に凝集若しくは複合体を形成した状態のいずれかにおける 細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）又は細胞周辺腔（ｐｅｒｉｐｌａｓｍａｔｉｃｓ ｐａｃｅ）内の蛋白の蓄積により、多くの蛋白示その生産生物内の蛋白分解又は 他の修飾に対して保護されていることが見つかっている。

液体生産培地中では、ウシ・アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）のようなプロ テアーゼ阻害剤ヒビターが、哺乳類培養物における蛋白分解消化に対しインシュ リンのような異種生成物を保護するために添加されており（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅ ｔ　ａｌ、　ｉｎ　Ｋｉｎｉｎｏｇｅｎａｓｅｓ−Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ　４　 ｅｄｓ、　Ｈａｂｅｒｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ　（１９７７）　１１３−１１８． 　Ｓｃｈａｔｔａｕｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）　、そして同様の結果がＮｏｖｉｋｏ ｖ　ｅｔ　ａｌ、（Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｌｅｔｔ、　１２　（１９９０）　５４ ７−５５０）により、プロインシュリンを発現するバチルス・サブチリス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）株の発酵における培養培地への合成セリン・ プロテイナーゼ阻害剤の添加を使用して、得られている。

自己蛋白分解（ａｕｔｏｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）は、生物学的な系においてま さに一般的な事象であることが示されている。システィン・プロテイナーゼの阻 害剤の使用により、より高いレベルのプロテイナーゼ・カテプシン（ｃａｔｈｅ ｐｓｉｎ）　Ｂ、　Ｈ及びＣが、ラットにおいて見つかっている（Ｋｏｍｉｎａ ｉ　ｅｔ　ａｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ 、ユ４４　（１９８７）　７４９−７５６）。Ｃｏｎｎｏｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　Ｊ、　２６３　（１９８９）　６０１−６０４）は、プロテアーゼＤが、低濃 度（＜　Ｉｇ／ｍｌ）においてさえ成熟カテプシンＤを生産するために自己蛋白 分解的変更を経験することが示されている。ウシ心臓においては、Ｃａ−依存性 プロテアーゼＩ［が、サブユニットの自己蛋白分解解裂により活性化され、そし てさらなるその後の解裂により、そのプロテアーゼのＣａ−依存性が低下するよ うである（Ｄｅｍａｒｔｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６１ 　（１９８６）　１２０４７−１２０５２）。

微生物においては、自己蛋白分解は、その前形態の分泌の間のバチルス・サブチ リスにおけるサブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）型プロテアーゼの成熟を最 もよく引き起こすことが示された（Ｐｏｗｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　ＰＮの研究は、 その前形態が、自己蛋白分解性成熟を達成するために、その正しいコンホメーシ ョンにそのサブチリシンを案内するために働くことを、示した。

精製されたプロテアーゼによれば、自己消化は、その酵素の不活性化に対する一 般的な原因である。Ｄｒｕｅｃｋｅｒ　ａｎｄ　Ｂｏｒｃｈｅｒｓ　（Ａｒｃｈ 。

ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　１ｕｓ）からのサーモリジン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉ ｎ）の制限された自己消化について記載している。Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｕｒｇ　 ｅｔ　ａｌ　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ。

２７２　（１９９０）９３−９７）は、バチルス・サブチリスからの中性プロテ アーゼの自己触媒性分解について調査しており、そしてＫｉｍ　ｅｔ　ａｌ　（ Ｈａｎ’ｇｕｋ　Ｓａｅｎｇｈｗａ　Ｈａｋｈｏｅｃｈｉ　２３　（１９９０） ５８−６１）は、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇの主要解裂部位を同定した。

自己蛋白分解は、プロテアーゼの高発酵収率を得ることにおける制限因子である ことができる。

発酵の間、その生成物の蛋白分角￥性の分解に関する問題が、そのアーゼ阻害剤 の添加を調整することにおいて伝統的に最小化されているが（国際特許出願第Ｐ ＣＴ／ＤＫ８９１００１９４号）、その生成物の蛋白分解性の分解は、非常に頻 繁に、その収率についての制限を設定するであろう。

他方において、Ｃｏｘｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｌｅｔｔｅｒ　ｉｎ　Ａｐｐｌ、 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１２−（１９９１）　９ｌ−９４）は、細胞外プロテ アーゼにおいて欠損のあるバチルス・サブチリス株の使用が、その細胞が定常増 殖期に達する時に細胞溶解への増加した傾向を示すことを、見つけている。

それ故、その生成物とその培養培地の残り、特にプロテアーゼとの間の接触を、 発酵の間に最小化する方法は、方法の最適化における貴重な道具であろう。これ は、より多くのプロテアーゼが生産される場合にそれが全く影響をもたないとこ ろの蛋白の生産性を増加させる発酵条件を使用することを可能にするであろう。

最小培地の使用は、主な利点としてより良好な生成物の品質を与える。なぜなら 、それが、改良された回収工程をもたらすからである。しかしながら、プロテア ーゼの収率は、むしろしばしば低く、それは、そのプロテアーゼの自己蛋白分解 性の解裂のについての増加した傾向にある程度、起因している。

本明細書及び請求項中では、本発明中において使用されるべき蛋白変異体又は使 用されることを考慮されているものは、参照の便のために以下の命名：元のアミ ノ酸　位置　置換アミノ酸を使用して記載されている。

これに従えば、１９５位でのグリシンについてのグルタミン酸の置換は：　Ｇｌ ｙ　１９５　Ｇｌｕ　又は　Ｇ１９５Ｅのように名付けられ、同意位でのグリシ ンの欠失は：ＧＩ７　１９５　本　又は　Ｇ１９５本であり、追加のアミノ酸残 基、例えば、リジンの挿入は：Ｇｌｙ　１９５　ＧｌｙＬｙｓ又は　Ｇ１９５Ｇ Ｋである。欠失が示される場合には、３６位でのアスパラギン酸の挿入について は、このような位置での挿入は：ネ　３６　Ａｓｐ　又は　ネ３６Ｄ のように示される。

多変異体は、プラスにより分けられ、すなわち：Ａｒｇ　１７０　Ｔｙｒ　＋Ｇ ｌｙ　１９５　Ｇｌｕ　又は　Ｒ１７０Ｙ十Ｇ１９５Ｅは、アルギニン及びグリ シンについての、それぞれ、チロシン及びグルタミン酸の、１７０及び１９５位 で″突然変異された”多変異体を表している。

発明の要約 結果として、本発明の目的は、組換え法を通して特に製造される蛋白の新規の製 造方法を提供する？とである。本発明の方法を通して、その培養培地中での増加 した安定性により、公知方法と比較して問題の蛋白の非常に増強された収率を得 ることが可能になる。

上記目的は、その製造段階の間の上記不活性化に対して上記蛋白を連続的に且つ 可逆的に保護し、その製造培地からその蛋白を分離し、その蛋白を脱保護し、そ してその蛋白生成物を回収することにより、液体生産培地中で不活性化を受け易 い蛋白の微生物生産のための方法を通して、達成される。

図面の簡単な説明 以下、本発明を、図面を参照しながら詳細に説明する。ここで、図１ａ及び図１ ｂは、複合体培養培地中での従来技術に比較した本発明に係る方法についての収 率を示しており、そして図２ａ及び２ｂは、最小培養培地中での同一タイプの結 果を示している。

発明の詳細な説明 本発明に従って、その製造段階の間の上記不活性化又は分解に対して上記蛋白を 連続的に且つ可逆的に保護し、その製造培地からその蛋白を分離し、その蛋白を 脱保護し、そしてその蛋白生成物を回収することにより、液体生産培地中で不活 性化又は分解を受け易い蛋白の製造方法を提供する。

本発明に従って、問題の蛋白を、発酵の間に保護する。この保護は、沈降剤の添 加による沈降を通してのその培地からの蛋白の除去が１であり、そしてその蛋白 の分解の原因であるプロテアーゼが追従しない場合に他の相への抽出による除去 が他のものであるような、多くの可能性のある方法を広くカバーしていると解釈 されることを意図されている。

さらなる解法は、その発酵培地中の蛋白の可溶性を変更されるであろう。これを 行うための方法は、その可溶性を減少させるための遺伝子操作によりその蛋白内 で突然変異を行うことである。

さらなる解法は、可逆的に除去されることができる他の蛋白、例えば、阻害剤又 は抗体の助けによる凝集を使用することである。

本発明の好ましい態様においては、上記の保護は、その生成物からのその蛋白の 除去により、そして特に沈降により、行われる。

この沈降は、その生産培地への沈降剤の添加を通して得られることができ、その 添加は、バッチ毎の添加により、好ましくは、その生産培地へのその沈降剤の連 続添加により、行われることができる。

この沈降剤は、塩、例えば、第１族金属塩、第［１族金属塩、第１族又は第［［ 族金属塩の対応するアンモニウム塩、又はそれらの混合物から選ばれたもの、好 ましくは、その塩のアニオンの価が２価以上である塩であることができ、好まし い塩は、そのリン酸塩、硫酸塩、及びクエン酸塩であり、特に好ましい塩は、リ ン酸ナトリウム、リン酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム及 び硫酸アンモニウム又はその対応するカリウム及びセシウム塩であり、硫酸塩が 、最も望ましい。しかしながら、特定のハロゲニド塩及び酢酸塩も、特にその塩 化物塩が、利用される。

他の態様においては、この沈降剤は、低分子量の有機溶媒、例えば、メチル・エ チル・ケトン、アセトン、メタノール、エタノール、■−プロパツール、イソプ ロパツール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｎ−ブタノール、ジメチル・ホルムアミド 、ジメチル・スルホキシド、エチレン・グリコールのモノエチル・エーテル、エ チル・グリコールのモノメチル・エーテル、等である。

上記の態様においては、沈降剤、例えば、塩又は低分子量有機溶媒が、発酵の間 の蛋白生産培地に添加される。この沈降剤の添加は、その蛋白及び／又は蛋白複 合体が沈降することを引き起こし、そして”スラリー′又は“ケーキ”が作られ る。本説明及び請求の範囲の全体を通して、用語”ケーキ″は、用語“スラリー ”と交換可能に使用されることができ、そしてそれは、それが”スラリー“と思 われる程に”ケーキ゛が湿っているような場合を含むことを意図されている。蛋 白又は蛋白複合体を含むケーキは、連続的にか又はその発酵が終了した時のいず れかにその残存溶液から分離される。普通には、この分離は、濾過により達成さ れ、そして不純物を含む濾液は、廃棄される考えられる。そのケーキ中に未だ過 剰の母液が在る場合には、それは、幾つかの方法のいずれかを使用することによ りそのスラリー又はケーキから実質的に除去されることができる。

例えば、過剰の母液は、追加の濾過により、例えば、圧力差（例えば、吸引濾過 ）；重力沈降；又は遠心分離により、除去されることができる。この除去は、そ の後、水洗浄及びエアー・ブローが行われることができ、比較的乾燥したケーキ を提供する。

本発明において使用される沈降剤は、無害である。用語“無害（ｌｎｎｏｃｕｏ ｕｓ）“は、本発明によりもくろまれた沈降剤が、（１）問題の蛋白を破壊せず 、（２）その蛋白に最終用途に負の影響を及ぼさず、そして（３）除去のための 広い追加の処理を必要としない、ということを意味する。ある場合には、その蛋 白生成物は、上記沈降剤を含むことが不必要でさえある。本発明によりもくろま れた沈降剤は、多くの蛋白に広く有用である。

本発明において沈降剤として塩を使用することが好ましいが、低分子量の有機溶 媒も、それらがその蛋白の可溶化のためにその後に使用される特定のポリオール に匹敵するほど長く、より良好に作用するであろう。好ましい有機溶媒沈降剤は 、メチル・エチル・ケトン、アセトン、メタノール、エタノール、ｌ−プロパツ ール、イソプロパツール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｎ−ブタノール、ジメチル・ ホルムアミド、ジメチル・スルホキシド、エチレン・グリコールのモノエチル・ エーテル、エチル・グリコールのモノメチル・エーテル、等である。

有機溶媒沈降剤は、その蛋白含有溶液の容量の２〜３倍の容量において、その蛋 白を含む培地に、問題の蛋白を生産する細胞に毒とならないように注意されなが ら、添加されることができる。

塩が沈降剤として使用される場合には、それらは、第１族金属塩、第［［族金属 塩、第１族又は第［［族金属塩の対応するアンモニウム塩、又はそれらの混合物 から選ばれなければならない。その塩のアニオンの価が２価以上であることが好 ましい。好ましいのは、そのリン酸塩、硫酸塩、及びクエン酸塩である。特に好 ましい塩は、リン酸ナトリウム、リン酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、硫 酸ナトリウム及び硫酸アンモニウムである。カリウム及びセシウム塩も使用され ることができるが、もちろん、これらは、より高価である。

硫酸塩が最も望ましい。塩沈降剤は、蛋白含有溶液に、５−５０％重量／塩剤基 剤量、の量において、その蛋白を含む溶液に単に添加されることができる。より 好ましくは、その基剤は、１２−２５％重量／容量の量で添加される。また、そ の基剤は、添加された水及び水性溶媒中に溶解されることができる。上記のよう に、この沈降剤の添加は、その蛋白生産細胞又は微生物に毒とならないように注 意しながら行われなければならない。

さらなる態様においては、その沈降は、その蛋白がその生産培地から沈降すると ころの生産培地のｐＨ及び／又はイオン強度の条件下でその生産段階を実施する ことにより、行われる。

本発明の特に好ましい態様においては、この沈降は、その蛋白をコードしている 遺伝子の遺伝子操作を通してその蛋白を修飾し、それによりその蛋白それ自体が その生産培地に入ったときに沈降することにより、行われる。

本発明の上記の態様のために、この蛋白の上記の沈降及び脱保護は、普通には、 濾過及び不純物の除去のための水によるその沈殿物のその後の洗浄、その沈降物 からその蛋白の抽出／再可溶化、及びその残りの固形物からの蛋白含有抽出物／ 溶液の分離により、行われる。

本発明の１つの有利な態様においては、この抽出／再可溶化は、ポリオール、例 えば、低分子量のポリエチレン・グリコール及び少なくとも２のＯＨ基をもつ、 好ましくは２のみのＯＨ基をもつその０２−〇、アルコールの使用により、行わ れ、特に好ましいのは、２のＯＨ基がその鎖内の隣接炭素原子上に存在し、そし てそのＣ、−Ｃ，アルコールが脂肪族であり、そして線状の炭素鎖をもつような ポリオールである。

上記の態様においては、エチレン・グリコール、プロピレン・グリコール、グリ セロール、低分子量（約９００未満）のポリエチレン・グリコール、及びそれら の混合物を含んで成る群から上記のボリールを選ぶことが特にを用である。

次に、ポリオール溶媒であってその好ましい態様においてモノ−プロピレン・グ リコール（ＭＰＧ）であるものが、蛋白及び／又は蛋白複合体を可溶化し、そし てそのケーキからそれを回収するために、そのケーキを通して循環される。用語 ”可溶化すること”は、用語”溶解すること“又は”抽出すること”と同じこと を意味することを本明細書中で意図しており、これらの用語は、交換可能に使用 されることができる。また、用語゛ポリオール溶媒”は、本明細書中で使用する とき、１０％＃ポリオール、本質的に１００％のポリオール、又はポリオール含 有溶液てあってそのポリオールが相溶共溶剤との組み合わせにおいて在るものを 意味することを意図されている。

本発明中にもくろまれたポリオールは、低分子量のポリエチレン・グリコール及 び少なくとも２のＯＨ基をもつそのＣ２からＣ８までのアルコールを含んで成る 。２以上のＯＨ基をもつＣ２−Ｃ＠アルコール、例えば、グリセロールを使用す ることができるが、２のＯＨ基のみが存在することが好ましい。特に望ましいの は、これらの２のＯＨ基がその鎖内の隣接炭素原子上に存在し、そしてそのＣ、 −Ｃ，アルコールが脂肪族であり、そして線状の炭素鎖をもつものである。好適 なポリオールは、例えば、エチレン・グリコール、プロピレン・グリコール、モ ノ−プロピレン・グリコール、グリセロール、低分子量（約９００未満）のポリ エチレン・グリコール、及びそれらの混合物を含む。

このポリオールは、その蛋白のための共溶媒を含む溶液中に、その共溶媒がその ポリオールと相溶性でありながら、存在することができる。この共溶媒は、もち ろん、水であることができるが、有機溶媒、例えば、アセトン、メチル・エチル ・ケトン、メタノール、エタノール、１−プロパツール、イソプロパツール、ｔ ｅｒｔ−ブタノール、ジメチル・ホルムアミド、ジメチル・スルホキシド、エチ レン・グリコールのモノメチル・エーテル、エチル・グリコールのモノエチル・ エーテル、等から選ばれることもできる。このポリオールが共溶媒を含む溶液中 で使用される場合には、そのポリオールが少なくとも２０容量％、より好ましく は５０％の量で存在することが好ましい。より高い濃度のポリオール、共溶媒を 含まない１００％までのポリオールを、有利に使用することもできる。また、共 溶媒の量は、使用する共溶媒に依存する。例えば、エタノールを、沈降剤として 、すなわち、前記の発明の要約の段階（ａ）において、使用することもできる。

それ故、そのポリオールとの共溶媒としての非常に多量のエタノールは、その蛋 白の可溶化よりもむしろ沈降を引き起こすことができる。

このポリオール溶媒は、その蛋白含有ケーキを通して１回通過されることができ るが、好ましくは、それは、その蛋白の抽出を強化するために少なくとも２回そ のケーキを通して再循環される。少なくとも５回の再循環を使用することが特に 望ましく、モして１００と同程度までの、又はそれ以上の再循環を有利に使用す ることができる。この結果物は、液体蛋白生成物であってその蛋白又は蛋白複合 体のポリオール溶液であるものである。塩沈降剤を使用した場合には、得られた 蛋白又は蛋白複合体のポリオール溶液を、室温と過剰の塩の沈殿を生じさせるこ の溶液の凝固点との間の範囲内の温度まで冷却することができる。アルカリ性プ ロテアーゼによる好ましい態様においては、この冷却は、約１６°Ｃまでである 。

所望の最終用途に依存して、この蛋白又は蛋白複合体のポリオール溶液は、それ 自体として、液体蛋白生成物として使用されるとかでき、又はその溶媒は、蛋白 それ自体が使用されることができるように実質的に除去されることができる。こ の溶媒の除去は、１以上の公知技術又はそれらの組み合わせにより行われること ができ、それにより、実質的に溶媒を含まない蛋白生成物を提供することができ る。このような技術の１つは、限外濾過であり、そして他のものは、液体除去の ための蛋白の再沈降その後の濾過及び／又は遠心分離である。

その蛋白に依存して、再循環の間の上記の酸レンジへのｐＨ調整又は再スラリー 化が、抽出を強化することができる。少量の酸、例えば、酢酸、硫酸又は塩酸を 、ｐＨ調整のために有利に使用することができる。

いずれかのポリオール抽出物を、所望により、配合することができる。好ましい 方法は、そのポリオール溶媒としてのポリエチレンン・グリコールによる抽出、 及び次の、共溶媒によるそれの希釈による、例えば、水によりそれを３０容量％ ＰＧ抽出物及び７０容量％Ｈ２０まて希釈することによる、そのＰＣ抽出物の配 合を含む。また、先に述へた他の共溶媒のいずれかを、上記抽出物の配合におい て使用することかできる。配合のための理由は、その液体蛋白生成物の最終用途 に依存して望ましいものにその蛋白活性を下げることである。

その配合の間に非常に多量の共溶媒を使用しないように注意しなければならず、 又はその蛋白は、溶液に残る代わりに沈殿することができる。

他の態様においては、その生産培地からのその蛋白の除去は、その蛋白を他の液 体培地に移すことにより行われる。

本発明のさらなる態様においては、上記の保護は、問題の蛋白と少なくともｌの 片割れ（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）との間の複合体を形成することにより行われ 、る。この態様においては、この片割れは、上記蛋白と共同発現されることがさ らに好ましく、このことは、その片割れが問題の蛋白を発現する宿主により天然 に発現されることか、又はその宿主を通しての蛋白操作がその複合体形成片割れ の１方又は両方を作るように修飾されていることかのいずれかを、意味している 。

上記の態様に従えば、上記の片割れは、好ましくは、その蛋白のための阻害剤又 はその蛋白に対する抗体である。

以下に述へるサブチリシン・プロテアーゼとの関連においては、上記の態様にお いて、プロテアーゼ・インヒビター、例えば、Ｃｌ−１、Ｃｌ−２、ＰＳ［、Ｅ ｇｌｉｎ　Ｃ、Ｅｇｌｉｎ　Ｂ　、　ＴＳ［−１、ＳＳ［、又はｖｓｒ阻害剤、 それらの変異体、又はそのサブチリシン・プロテアーゼを保護するだめのこれら のいずれかの混合物を、使用することが好ましい。

上記の態様においては、問題の蛋′白、例えば、プロテアーゼの脱保護は、普通 には、例えば、その洗浄液を調製するときに溶解される洗剤組成物中でそのプロ テアーゼを使用するときその複合体の溶解を通して、行われる。

一般的には、本発明は、蛋白を分泌する真核生物又は原核生物の細胞、例えば、 植物又は動物細胞又は微生物、例えば、バクテリア、酵母、又は菌の栄養培養培 地中で発酵させることにより提供されたいずれかの細胞外で作られた蛋白により 、作用する。本発明は、プロテアーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、リ パーゼ、オキシド・レダクターゼ、及びオキシダーゼから選ばれた酵素により、 特によく作用する。好ましい態様においては、その発酵生成物、アルカリ性プロ テアーゼであって幾つかの工業、特に洗剤工業において有用であるものが使用さ れる。

特に好ましいアルカリ性プロテアーゼとして、サブチリシン・プロテアーゼを、 掲げることができる。これは、特に以下に列記したものであって：サブチリシン ３０９、少な（とも３６又は１３６位で修飾されたサブチリシン３０９、及び以 下に示すように修飾されたサブチリシン３０９である： ＊３６Ｄ、＊３６Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２５１Ｅ、＊：１６Ｄ＋Ｈ１ ２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２：１５Ｌ。

＊］６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２］５Ｌ＋に２５１Ｅ、＊ ３６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ’：Ｌ９５Ｅ＋に２３５Ｌ。

＊３６Ｄ＋Ｎ７６Ｄ、＊１６Ｄ＋Ｎ７６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２コ５ Ｌ、＊３６Ｑ、＊］６Ｄ＋Ｑ５９Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９ＥＩＲ＋５９９Ｄ＋Ｈ１２ ０Ｄ＋Ｎ１４０Ｄ＋５１４１Ｒ＋Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２３５Ｌ＋Ｎ２４ ８Ｄ＋Ｔ２５５Ｅ＋５２５６に＋５２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ，＊：１６Ｄ＋Ｑ５９ Ｅ＋Ｎ７６Ｄ＋Ａ９８Ｒ＋５９９Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ｎ１４０Ｄ＋５１４１Ｒ＋５ １５６Ｅ＋Ａ１５８Ｒ＋Ａ１７２Ｄ＋Ｎ１７］Ｋ＋に２コ５Ｌ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｔ ２５５Ｅ。

＋５２５６に＋５２５９Ｄ＋Ａ２７２Ｒ。

以下の実施例は、本発明の幾つかの好ましい態様を説明しており、そして本実施 例中に開示される懸様に本請求の範囲が限定されることを意図するのもではない 。

実施例 本発明の方法により、伝統的な方法により典型的に得られる収率の、１００％か ら２００％までの、そして４００％以上までの酵素の収率が得られることができ ることが、見つかった。

沈降を通して保護される蛋白の、水中への低い溶解性及びモノ・プロピレン・グ リコール（ＭＰＧ）のような有機溶媒中への高い溶解性を使用することにより、 典型的な酵素回収装置をまさに使用することによって、９０％を超える酵素純度 をもつ２％がら１０％超えまでの蛋白を含む高品質液体配合品を生産することが 可能である。

本回収工程は、３つの期に分けられる：１）−酵素含有スラッジ相の洗浄 １１）−その酵素の抽出／再可溶化 １ｉｉ）−濃縮及び標準化 ｌ）全酵素量の約９０％を含むスラッジ相を、回収し、そして水により十分に洗 浄する。すべての可溶性不純物、例えば、色素、多糖類蛋白を、酵素のいかなる 育意な損失を伴わないように除去する。

自）　ＡＩＰＧによる上記スラッジ相からの酵素のその後の抽出は、はとんとた だ１つのポリマー成分−酵素を含む軽い抽出物をもたらす。

水−ＭＰＧ系中のこのような蛋白の安定性はその＋ＩＩＰＧ濃度に正比例し、モ してＩＩＩＰＧの最小消費が不可欠なものであるので、その沈降酵素がその飽和 点のほんの少し下において系中に再溶解されるような方法でそのＭＰＧに与える ことが重要である。

その全体的な抽出収率は、典型的に９０％以上であり、そしてその抽出のために 使用されたＭＰＧの容量は、その培養ブロス容量の約４０％である。

１ｉｉ）　上記の最後の濃縮は、典型的には、２段階：（ａ）付随的な限外濾過 （以下を参照のこと）、及び（ｂ）蒸発、において行われる。

（ａ）この限外濾過工程は、再結晶化／再沈降することなく比較的高いレベルま でその酵素の濃度（固定されたＭＰＧ−水組成物を含む）を増加させることを可 能にする。この濃度レベルは、主に、その最終生成物中の＆ＩＰＧ／酵素レベル により制御される。

透過物中のＡＩＰＧの濃度は、非常に低いレベルの不純物を含み、そしてそれ故 、蒸発（７０％−７５％ＭＰＣまでの）後に問題なく、その抽出段階において再 使用される。

（ｂ）上記の最後の標準化は、単純な蒸発により行われ、そしてその生成物の純 度は、典型的に９０％を超える。

段階（ｉｉ）の抽出手順は、そのＭＰＧと一緒にカオトロピズム成分、例えば、 尿素を添加することにより、変更されることができる。これは、ＡＩＰＧ−水系 の抽出能力（沈降酵素の溶解性）を増加させ、そしてこれにより、そのＭＰＧ／ 酵素比のレベルを減少させるであろう。

より低い＆ＩＰＧ／酵素比は、限外濾過を伴わない所望の最終濃度を行うことが できるようにするであろう。

ＷＯ８９１０６２７９及びＷＯ９１１００３４５中に記載されテイルように構築 され、そして以下の修飾：本３６Ｄ＋Ｎ７６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ十Ｇ１９５Ｅ＋に２ ３５Ｌ　（ＳＯ３５）を含んて成るサブチリシン３０９プロテアーゼ変異体は、 その野性型サブチリシン３０９ブロテアーセを作るバチルスと並行して発酵され た上記変異体を作るように形質転換されたバチルス株により、作られた。

この３０３５変異体は、発酵の間その生産培地から連続的に沈降し、そしてその 沈降したプロテアーゼの改良された安定性は、その蛋白合成がその培養液へのク ロラムフェニコール（ＣＡＭ）の添加により中止された後の、その発酵培地のイ ンキュベーションにより示される。

この生産は、以下の組成（１リツター当たり）の１００ｍ１のプロテアーゼ生産 培地を含む５００ｍ１バッフル付きＥｒ　ｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ内で回転振 どう台（３００ｒ、ｐ、ｍ）上で３０°Ｃにおいて、行った・ポテト澱粉　１０ ０１？ 粉砕大麦　５０ｇ 大豆粉　２０ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４Ｘ　１２Ｈ２０９ｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｏ，Ｉｇ カセイン酸ナトリウム　ｌＯｇ 培地中の澱粉を、α−アミラーゼで液化し、そしてその培地を、１２０°Ｃにお いて４５分間、加熱することにより滅菌する。滅菌後、培地のｐＨを、０．１Ｍ までのＮａＨＣｏ　２の添加により、９に調整する。

サブチリシン３０９のための野性型“生産株を、５Ｏ３５突然変異株と並行して 発酵させた。その装備は、それぞれの株について２ｘ３振どうフラスコであった 。培養の７４時間後、２００μｇ／ｍｌ　ＣＡＭを、その３振とうフラスコの第 一（Ａ）に添加した。９４時間目における他の２０時間後、２００μｇ／ｍｌ　 ＣＡＭを、その第二ボトル（Ｂ）に添加した。その第三ボトル（Ｃ）は、ＣＡＭ 添加なしで並行して処理された。その培養を続け、そして１６８時間後に終了さ せた。図１ａ及び１ｂは、異なる時間のインキュベーション後のプロテアーゼ・ レベルを示している。最も高いレベルの正常のサブチリシン３０９対照株（Ｃ） が、１００パーセントに設定されている。

コノプロテアーゼ・レベルヲ、ＡＰ　２２０／１−ＧＢ　（ＮＯＶＯＮ０ＲＤ［ ＳＫ　Ａ／Ｓ。

Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、　ＤＥＮＭＡＲＫから入手可能な刊行物）中に記載されて いるように検出した。

して５Ｏ３５変異体について対応して図２ｂ中に示し、図中、時間の関数として のプロテアーゼの収率が示されている。

ＣＡＮＩの添加後のプロテアーゼの増加レベルは、たぶん、振どうフラスコから の蒸発により引き起こされる。

５Ｏ３５変異体のプロテアーゼ・レベルを、その沈降酵素が７５パーセントのモ ノ−プロピレン・グリコール（１，ＩＰＧ）中に再溶解された後に、検定した。

その再懸濁の前の上澄液中のプロテアーゼ・レベルは、１５から２０パーセント までであった。

粉砕大麦、犬豆扮、綿実粉及びコーン又は小麦からの澱粉のような蛋白及び炭水 化物の普通には安い複合源を、酵素の発酵において使用する（Ａｔｋｉｎｓｏｎ 　ａｎｄ　ｌ＋Ｉａｖｉｔｕｎａ、　１９８３．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅ ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｈａｎｄｂｏｏ ｋ、Ｔｈｅ　Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｒｅｓｓ、ｐ、９９８−１０１５）。非分解性蛋 白及び炭水化物とフィチン酸塩との複合体のような不溶物の含量は、これらの基 質中でもしろ高い。これは、特にそお沈降蛋白の可溶化に関してのその回収工程 において幾つかの制限を与える。これは、最小基壇地中の発酵により回避される ことができるかもしれない。

本実施例中では、実施例１からの２つの株を、２．５１のジャーファメンター（ ＭＲＲミニ）内で３６“Ｃにおいて５Ｎ　ＮａＯＨの添加により８．０において ｐＨを制御し、激しく攪拌し、そして１．５　ｖｖｍ、のエアレーションを行い ながら、培養した。この培養培地の（ｇルにおける）組成は、以下のようであっ た・ マルトデキストリン（Ｇｌｕｃｉｄｅｘ　６）　４０酵母エキス　ｌ クエン酸Ｈ２０６ ＣａＣ１ｚ　、２Ｈ２００，８ へＩｇＳ０４．７Ｈ２０４ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（消泡剤）０．４ 微量金属溶液本　７ ビタミン溶液本本　４ 本組成（ｇ／Ｌ）：　Ｈ、ＢＯ４０，８２；　ＭｎＣｌ２，４Ｈ２００，５８； 　ＦｅＣ１＊　、６Ｈ。

０１．９５；　ＣｕＳＯ４，５Ｈ２００，２：　ＢａＣ１２０，１：　ＺｎＣ１ ２０，２：　（ＮＨ４）　５Ｍ０ｔ　０２４．４Ｈｘ　００．１：　ＣＯＣｌ２ ．６Ｈ２００，３；クエン酸、ＨｔＯＩＯ＊ネ　組成：チアミン、ＨＣｌ　１５ ０　ｍｇル及びビオチン５ｍｇ／Ｌ２４時間目から、そして発酵の休止中、スク ロースの６０（ｗ／ｖ）％及び（ＮＨ、）　２　ＳＯ，の１２（ｗ／ｖ）％を含 む２つの投与培地を、それぞれ、約４と２−２．５　ｇ／Ｌ／時間の速度におい て供給した。

増殖曲線（ＯＤ　＝ｓ。、。とじて示した）及び（野性型生産株により得られた 最も高い濃度の％における）プロテアーゼ濃度の曲線を、野性型と５Ｏ３５変異 体とについて、それぞれ、図２ａと２ｂ中に示す。

プロテアーゼ含量を、ＡＰ　２２０／ＩＧＤに従って測定した。さらに、５Ｏ３ ５については、溶液中のプロテアーゼの画分が、全プロテアーゼ濃度の％として 示されている。サブチリシン３０９（図２ａ）に比較して５Ｏ３５の顕著に高い 発現（図２ｂ）は、複合培養培地によるよりも最小培最小培地中の可溶性５０３ ５の非常に低い画分は、プロテアーゼ濃度におけるこの違いに対する主要な説明 とならなければならない。この沈降を伴わない、最小培地の使用は、複合培地と 同じである。

この沈降プロテアーゼのその後の精製の利点のため、その不溶物の容量は、同一 細胞マスをもつ複合培養培地による発酵と比較してほんの約半分のサイズである 。

培養ブロスを、塩化カルシウム及び水（培養ブロス１ｋｇ当たり＝２５　ｇ　Ｃ ａＣｌ　２　Ｘ　２　Ｈ２０及び１１水）により前処理し、そしてそのｐＨを苛 性ソーダにより８．０に調整した。次にその懸濁液を、カチオン及びアニオン凝 集剤（培養ブロス１ｋｇ当たり：それぞれ、８ｇ５ｕｐｅｒｆｌｏｃ　Ｃ５２１ 及び２５０ｍｇ　５ｕｐｅｒｆｌｏｃ　Ａ　１３０）の添加により凝集させた。

この酵素を含むスラッジ相を、遠心分離によりそ清澄な上澄液から分離させ、そ して次に、ｐＨ５，５において４ｗ／ｗ％ＣａＣｌ２を含む水により２回洗浄し た。

その沈降酵素を含むスラッジを、次に室温（２０°Ｃ〜２５°Ｃ）において約１ 時間、ｐＨ７，５においてモノ−プロピレン・グリコール（ＭＰＧ）と十分に混 合した。再可溶化のために使用したＭＰＧは、そのスラッジの重量の約１．１倍 に対応する。このＭＰＧ−水抽出物を、遠心分離により、このスラッジから分離 した。

このスラッジ中の残りの可溶化酵素を、水道水により洗浄し、そしてその懸濁液 を遠心分離した。ＭＰＧと水抽出物を、合わせ、濾過し、そして限外濾過した。

この限外濾過は、ｐＨ５，５−６，０において、そして５°Ｃから２５°Ｃまで の増加温度（濃縮係数に比例する）において、行った。約３．５ｇ酵素／１００ ｇ　！１１ＰＧに対応する酵素−ＭＰＧレベルが達成されたとき、この限外濾過 を中止し、そして最後の標準化を蒸発により行った。この最終生成物は、典型的 には、６５％ＭＰＧ及び２．３％の酵素を含んでいた。

時間 ＋　ＣＡＭ７２時間後　→　ＣＡＭ９４時間後　−対照Ｆｉｇ、　ｌａ 時間 ＋　ＣＡＭ７２時間後　−−ＣＡＭ９４時間後　−一対照時間 中味光度　→プロテアーゼ相対％ Ｆｉｇ、　２ａ 時間 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号／／Ｃｌ２Ｐ　２１１０ ０　Ｃ９２８２−４Ｂ（７２）発明者　ペテルセン、ヨルゲンデンマーク国、デ ーコー−３４５０アレロエト、フエムバイ　３ Ｉ （７２）発明者　ニールセン、トルベン　コー。

デンマーク国、デーコー−４０００口スキルデ、ティングガールトスバエンゲト 　９０（７２）発明者　ミツケルセン、セン　モーラーデンマーク国、デーニー −２８２０ゲントフテ、ガルデルホエイバイ　８

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．液体生産培地中で不活性化又は分解を受け易い蛋白の製造方法であって、そ の生産段階の間の上記不活性化又は分解に対して上記蛋白を連続的に且つ可逆的 に保護し、その生産培地からその蛋白を分離し、その蛋白を脱保護し、そしてそ の蛋白生成物を回収することを特徴とする方法。
2. ２．保護が、生産培地からの蛋白の除去により行われる、請求項１に記載の方法 。
3. ３．除去が沈降により行われる、請求項２に記載の方法。
4. ４．沈降が、生産培地に沈降剤を連続的に添加することにより行われる、請求項 ３に記載の方法。
5. ５．沈降剤が、塩、例えば、第Ｉ族金属塩、第ＩＩ族金属塩、第Ｉ族又は第ＩＩ 族金属塩の対応するアンモニウム塩、又はそれらの混合物から選ばれたもの、好 ましくは、その塩のアニオンの価が２価以上である塩であり、好ましい塩が、そ のリン酸塩、硫酸塩、及びクエン酸塩であり、特に好ましい塩が、リン酸ナトリ ウム、リン酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム及び硫酸アン モニウム又はその対応するカリウム及びセシウム塩であり、硫酸塩が最も望まし いような、請求項４に記載の方法。
6. ６．沈降剤が、低分子量の有機溶媒、例えば、メチル・エチル・ケトン、アセト ン、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール、ｔｅｒｔ −ブタノール、ｎ−ブタノール、ジメチル・ホルムアミド、ジメチル・スルホキ シド、エチレン・グリコールのモノエチル・エーテル、エチル・グリコールのモ ノメチル・エーテル、等である、請求項４に記載の方法。
7. ７．沈降が、蛋白が生産培地から沈降するところの生産培地のｐＨ及び／又はイ オン強度の条件下でその生産段階を実施することにより、行われる、請求項３に 記載の方法。
8. ８．沈降が、蛋白をコードしている遺伝子の遺伝子操作を通してその蛋白を修飾 し、それによりその蛋白それ自体がその生産培地中で沈降することにより、行わ れる、請求項３に記載の方法。
9. ９．蛋白の分離及び脱保護が、濾過、遠心分離、重力濃縮、水サイクロン分離、 凝集、又は浮揚、好ましくは濾過又は遠心分離により、及び不純物の除去のため の水によるその沈殿物のその後の洗浄、その沈降物からその蛋白の抽出／再可溶 化、並びにその残りの固形物からの蛋白含有抽出物／溶液の分離により、行われ る、請求項３〜８のいずれかに記載の方法。
10. １０．抽出／再可溶化が、ポリオール、例えば、低分子量のポリエチレン・グリ コール及び少なくとも２のＯＨ基をもつ、好ましくは２のみのＯＨ基をもつその Ｃ２からＣ８・までのアルコールの使用により、行われ、特に好ましいのものが 、２のＯＨ基がその鎖内の隣接炭素原子上に存在し、そしてそのＣ２−Ｃ８アル コールが脂肪族であり、そして線状の炭素鎖をもつようなポリオールである、請 求項９に記載の方法。
11. １１．ポリオールが、エチレン・グリコール、プロピレン・グリコール、モノ− プロピレン・グリコール、グリセロール、低分子量（約９００以下）のポリエチ レン・グリコール、及びそれらの混合物から選ばれている、請求項１０に記載の 方法。
12. １２．除去が、蛋白を他の液体培地に移すことにより行われる、請求項２に記載 の方法。
13. １３．保護が、少なくとも１の片割れと複合体を形成することにより行われる、 請求項１に記載の方法。
14. １４．片割れが蛋白と共同発現される、請求項１３に記載の方法。
15. １５．片割れが、蛋白のための阻害剤である、請求項１３又は１４に記載の方法 。
16. １６．蛋白が、酵素、例えば、オキシド・レダクターゼ、トランスフェラーゼ、 ハイドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼ、好ましくはプロテアー ゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ピクチナーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ 、又はリパーゼである、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
17. １７．酵素がサブチリシン・プロテアーゼである、請求項１６に記載の方法。
18. １８．サブチリシン・プロテアーゼがサブチリシン３０９である、請求項１７に 記載の方法。
19. １９．サブチリシン３０９が少なくとも３６位で修飾されている、請求項１８に 記載の方法。
20. ２０．３６位での修飾が＊３６Ｄ又は＊３６Ｑである、請求項１９に記載の方法 。
21. ２１．酵素が、以下の： 【配列があります】 のように修飾されている、請求項２０に記載の方法。
22. ２２．阻害剤が、プロテアーゼ・インヒビター、例えば、【配列があります】又 はＶＳＩ阻害剤、 それらの変異体、又はそれらのいずれかの混合物である、請求項１５に及び請求 項１７〜２１のいずれかに記載の方法。