WO2019189064A1 - インラインミキサーとハイドロサイクロンを統合したモジュールを複数用いて抗体を細胞培養液から連続的に製造する装置および当該装置を用いた抗体の製造方法 - Google Patents

インラインミキサーとハイドロサイクロンを統合したモジュールを複数用いて抗体を細胞培養液から連続的に製造する装置および当該装置を用いた抗体の製造方法 Download PDF

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WO2019189064A1
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resin
protein
slurry
hydrocyclone
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忠好 河▲崎▼
潔憲 広田
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次世代バイオ医薬品製造技術研究組合
国立研究開発法人産業技術総合研究所
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/02—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor with moving adsorbents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B04—CENTRIFUGAL APPARATUS OR MACHINES FOR CARRYING-OUT PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES
    • B04C—APPARATUS USING FREE VORTEX FLOW, e.g. CYCLONES
    • B04C9/00—Combinations with other devices, e.g. fans, expansion chambers, diffusors, water locks
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus comprising a module combining an in-line mixer and a hydrocyclone for separating and purifying a protein such as an antibody produced by cell culture technology, and a method for producing a protein such as an antibody using the apparatus.
  • Proteins, glycoproteins, peptides, nucleic acids, and the like that have been recently used as biopharmaceuticals are separated and purified from blood, other body fluids, or homogenates of living tissues by precipitation, filtration, centrifugation, or chromatographic separation.
  • proteins and peptides are expressed by genetic recombination of microorganisms such as Escherichia coli (abbreviation: E. coli) and produced as inclusion body granules (inclusion bodies) in the cells, followed by denaturation and solubilization.
  • E. coli Escherichia coli
  • inclusion bodies inclusion bodies
  • the target product regenerated by refolding has been purified by centrifugation, filtration, chromatography, and the like.
  • CHO Chinese Hamster Ovary
  • various separation agents such as affinity chromatography, ion exchange chromatography, and hydrophobic interaction chromatography were finely packed into a cylindrical casing (column) for chromatography and clarified. It has been purified by a combination of chromatographic separation operation and membrane separation operation by flowing glycoprotein or a solution containing protein.
  • Non-Patent Document 2 As a protein purification apparatus that avoids using a column packed with resin, “a system for purifying a target substance from a liquid source, a container for contacting the liquid source with a chromatography resin, and chromatography.
  • a cross-flow filter also referred to as CFF or tangential filter: TFF
  • the container and the cross-flow filter are connected to each other, and the flow A flow circuit for flowing a liquid containing the chromatography resin through the circuit; a chromatography resin in the flow circuit, the container, and the cross-flow filter; and the liquid supply connected to be sent out to the container Source and the flow circuit And means for circulating liquid and chromatography resin I, the system (Patent Document 1).
  • CFF tangential filter
  • Patent Document 2 a reverse flow cross-flow chromatography module
  • a chromatography resin slurry and an unpurified sample are continuously mixed by a mixer, and the mixture is concentrated and separated by a filter.
  • clogging of the filter and complicated maintenance cannot be avoided.
  • Cyclone separators that separate large-mass substances from two-phase liquids using centrifugal force of the flow have been used for a long time, but they are used in systems that separate slurry containing chemical substances and washing methanol. Although it is known (Patent Document 3), it is not used for the purpose of collecting a target substance in a slurry using a hydrocyclone, nor is it used for purifying proteins such as antibodies. Furthermore, although a method of mixing a slurry separated by a hydrocyclone with an in-line mixer is known, an apparatus that combines an in-line mixer with a hydrocyclone, and mixes and reacts with the in-line mixer with a hydrocyclone is known. Absent.
  • the affinity chromatographic separation agent or the like is used after removing the culture solution containing cells or fragments thereof directly or by removing the solid components in the suspension using a hydrocyclone (however, it is not necessary to completely remove them).
  • a separation agent in which an unadsorbed component and a target protein component are combined is separated by a hydrocyclone.
  • the separated and discharged protein-binding separation agent is guided to the next device (module) that combines the in-line mixer and hydrocyclone, washed, and then a solution that inhibits the binding of the target protein and the resin, or a solution that can be dissociated.
  • the target protein and the adsorbing / separating agent are separated by being guided to a third in-line mixer and hydrocyclone apparatus, and the target protein overflows from the top of the hydrocyclone and is recovered.
  • the separating agent dissociated from the protein is introduced into the next in-line mixer and hydrocyclone device, regenerated with the washing and regenerating solution, then introduced into the first in-line mixer and continuously introduced to the target protein such as cell culture solution. It is subjected to reaction with the containing suspension.
  • the present invention is based on a solution containing proteins, glycoproteins, peptides, nucleic acids, etc. without causing clogging (Fouling) even in a suspension containing cells, cell debris, or some aggregates or precipitates. It is a method that can continuously separate components containing the target protein, and is an apparatus that can be used in such a continuous separation and purification method.
  • the target protein expressed by animal cell culture or microbial culture is made into a clear solution from which solid matter has been removed by centrifugation or multistage filter filtration. It has been purified using multiple stages such as a chromatography packed column and a filter packed in a container called a cartridge or a housing. However, a column or filter that is closely packed in a hermetic container is clogged, so that continuous operation is difficult.
  • FIG. 1 and FIG. [1] An apparatus for continuously purifying protein from a cell culture solution using a module in which an in-line mixer and a cyclone are combined, (a) a pipe (3) connecting the culture tank (1) or the cell separator (D) and the first module to the inlet of the in-line mixer (6) of the first module (A: reaction module); A pipe (4) connecting the first storage tank (2) and the first module is connected via a branch valve (5), and the discharge port of the in-line mixer (6) is the introduction of a hydrocyclone (7). A pipe (8) connecting the first reaction module and the second module is connected to the lower outlet of the hydrocyclone (7), and a pipe (8) is connected to the upper outlet of the hydrocyclone (7).
  • the present invention as shown in FIG. [2]
  • the other module is a third module (C: regeneration module), and a pipe (15) connecting the second module (B) and the third module to the inlet of the in-line mixer (20),
  • a pipe (18) connecting the third storage tank (17) and the third module is connected via a branch valve (19), and the discharge port of the in-line mixer (20) and the introduction port of the hydrocyclone (21).
  • Is connected to the lower discharge port of the hydrocyclone (21) and the pipe (23) connecting the third module and the first storage tank (2) is coupled to the upper discharge port of the hydrocyclone (21).
  • the pipe (24) connecting the culture vessel (1) and the cell separator is coupled to the inlet of the hydrocyclone (25), and the lower outlet of the hydrocyclone (25) Is connected to a pipe (26) connecting the cell separation device and the culture tank (1), and the upper outlet is a cell separation unit comprising a pipe (3) connecting the cell culture device and the first module.
  • the present invention relates to the apparatus according to [1] or [2].
  • the present invention also includes one aspect shown in FIG. [4]
  • the apparatus according to any one of [1] to [3], and [5] the fourth module is an inlet of the in-line mixer (30) of the fourth module (E)
  • the pipe (8) connecting the first module and the fourth module and the pipe (28) connecting the fourth storage tank (27) and the fourth module are connected via the branch valve (29).
  • the discharge port of the in-line mixer (30) and the introduction port of the hydrocyclone (31) are connected, and a pipe (8) connected to the second module or a new cleaning module is connected to the discharge port below the hydrocyclone.
  • Hydrocyclone (3 1) The apparatus according to claim 4, wherein a pipe (32) for transferring the cleaning liquid to the discharge port is coupled to the upper discharge port.
  • the present invention provides [6] A method for continuously producing a protein from a cell culture solution using a plurality of modules in which an inline mixer and a cyclone are combined, (a) The cell culture solution containing the protein transferred from the culture tank and the slurry containing the resin transferred from the first storage tank are mixed into the in-line mixer of the first module, and the protein in the cell culture solution is mixed.
  • Process and (e) a method comprising a step of transferring the slurry for elution obtained in the mixing step by the in-line mixer of the second module to a cyclone and separating the slurry into a slurry containing protein and a resin not bound to the protein; [7]
  • a method characterized by including a cleaning step using a third module between step b and step c according to [6], [8]
  • the cleaning method according to [7] in the in-line mixer of the third module, the slurry containing the resin bound to the protein and the cleaning liquid transferred from the fourth storage tank are mixed, and after the cleaning
  • the method is characterized in that the mixed liquid is transferred to a cyclone and separated.
  • the cells and the cell culture solution containing the protein are separated via a cyclone, and the separated cells are cultured.
  • the present invention also provides [11] An apparatus for continuously purifying protein from a cell culture solution using a plurality of modules in which an inline mixer and a cyclone are combined, [12] The apparatus according to [1], wherein the slurry containing the cell culture solution and the resin is mixed by an in-line mixer, the protein in the cell culture solution is combined with the resin in the slurry, and the slurry containing the resin combined with the protein
  • the reaction module with the function of separating the resin-containing slurry and the resin-free cell culture solution with a cyclone, the slurry containing the resin bound to the protein and the eluate are mixed in an in-line mixer, and the hydrocyclone
  • [15] In the apparatus according to any one of [12] to [14], in which the reaction module and the elution module are combined, the resin slurry discharged from the elution module of the apparatus is transferred to the reaction module or the resin slurry storage tank.
  • the present invention relates to a device that enables cycle utilization of a resin slurry, and a protein production method using the device according to any one of [16], [11] to [15].
  • the present invention further includes [17] An apparatus for continuously purifying a protein from a cell culture medium using a module in which an in-line mixer and a cyclone are combined, wherein the protein is obtained by mixing a cell culture liquid containing protein and a slurry containing a resin.
  • a first module for producing a slurry bonded to the resin, a slurry purified by the first module and an eluate, and a second eluting the protein from the slurry
  • a protein purification apparatus comprising a module (elution module), [18]
  • a third module for producing a regenerated resin slurry containing a resin by mixing the slurry from which the protein has been separated in the second module and a regenerated liquid.
  • the protein purification apparatus according to 17, [19]
  • Protein purification equipment [20] A slurry containing a resin bound to a protein produced by the first module and a washing solution are mixed between the first module and the second module to bind to the protein.
  • the cell culture solution and the slurry containing the resin are mixed, the protein in the cell culture solution is combined with the resin in the slurry, and a slurry containing the resin combined with the protein is generated.
  • the protein purification apparatus according to claim 17, comprising: one in-line mixer; a slurry containing resin; and a first hydrocyclone that separates into a cell culture solution not containing resin.
  • the second module includes a second in-line mixer for mixing the slurry containing the resin bound to the protein and the eluate, and a second hydrocyclone for separating the protein and the resin slurry.
  • the apparatus according to claim 19, further comprising a hydrocyclone for transferring a culture solution to the first module, and [25] the slurry containing the resin bound to the protein and the washing solution 21.
  • the apparatus according to claim 20, further comprising: a fourth in-line mixer for mixing, a slurry containing a resin combined with protein, and a fourth hydrocyclone for separating into a waste liquid.
  • the present invention provides a method and apparatus for recovering and purifying a target protein continuously in a short time even from a suspended sample containing a small amount of cells, cell debris, or host microorganisms. To do.
  • the ability to continuously collect and purify the target protein directly from the sample, including a small amount of solids, makes it possible to obtain a large amount of product relatively easily even with a small-scale culture facility depending on the equipment operation time.
  • the productivity is high, and the continuous production enables efficient production with reduced production costs.
  • a target protein such as an antibody molecule can be continuously separated from a culture solution of animal cells without highly separating and removing cells, cell debris or precipitates.
  • Proteins can be separated continuously without using a chromatography column packed with a separation material conventionally used according to the present invention.
  • the present invention enables perfusion culture of animal cells without using a hollow fiber or a continuous centrifuge, and continuously separates the target protein from the extracted culture solution without using a filtration filter or a chromatography column. I can do it.
  • proteins can be separated continuously without using facilities such as a large membrane separation apparatus, a chromatography apparatus, and a large chromatography column.
  • the adsorbing / separating agent can be regenerated and circulated in the flow path of the apparatus, so that continuous separation of proteins and the like can be repeated with a small amount of the adsorbing / separating agent.
  • the present invention allows the target protein to be dissociated within a short time after reacting with the slurry-like adsorbing / separating agent in the flow path of the apparatus without separating the adsorbing / separating agent in the column and separating it from impurities. Structural denaturation due to adsorption of the target protein can be suppressed.
  • the present invention allows impurities such as host proteins, host DNA or RNA to be reacted in a slurry state and washed in a slurry state without filling an adsorption / separation agent in a column or other container.
  • the target protein with high purity can be obtained by avoiding unnecessary adsorption.
  • FIG. 1 shows a reaction module A that performs adsorption and separation of an antibody on a resin.
  • FIG. 2 shows an elution module B that separates the antibody from the resin.
  • FIG. 3 shows a regeneration module C for resin regeneration.
  • FIG. 4 shows a cell separation apparatus D for separating cells during reflux culture.
  • FIG. 5 shows a cleaning module E for cleaning the resin to which an antibody or the like is bound.
  • FIG. 6 shows an apparatus for continuously purifying antibodies from a culture solution.
  • FIG. 7 shows the reaction module of the present invention.
  • FIG. 8 shows a reaction module equipped with a cell sorting device.
  • FIG. 9 is a schematic diagram of a hydrocyclone evaluation module.
  • FIG. 10 is a schematic diagram of an evaluation module in the case where the first hydrocyclone and the second hydrocyclone are connected in a second manner.
  • FIG. 11 is a schematic view of a module used in a test for confirming that an antibody can be recovered by mixing an antibody sample solution and a purification chromatographic resin with an in-line mixer and then separating and recovering the resin with a hydrocyclone.
  • the in-line mixer may be any static mixing device without a drive unit, but preferably a static mixer or a fluidized bed type mixer without moving parts in consideration of damage to cells and resin. Is preferably used.
  • the in-line mixer has a simple structure that mixes and discharges two fluids that are usually introduced by the flow of the liquid, so it has an inlet in one of the cylindrical shapes and an outlet in the liquid outflow direction.
  • the in-line mixer has a shape in which a mixture of two fluids is introduced into one inlet.
  • the discharge port may have one discharge port in the liquid discharge direction.
  • the hydrocyclone refers to a hydrocyclone, and may be any device that does not have a drive unit that has the ability to separate, classify, and concentrate by injecting a treatment liquid into a hydrocyclone stationary device.
  • various types of hydrocyclone such as Mozley type, Dorr-Oliver type, Bradley type, Rietema type, Krebs type, CBV / DEMCO type are used, but considering damage to cells and resin, Bradley
  • a type or Rietema type hydrocyclone is used.
  • hydrocyclones usually have a funnel-like shape, the inlet of the mixture separating on the funnel-type upper wall, the upper outlet of the purified material separated on the funnel-type upper ceiling, the funnel-type There is a lower outlet for the mixture excluding the purified material at the lower end.
  • a feature of the present invention is that a plurality of modules in which an in-line mixer and a cyclone are combined are used, and each module has individual functions of adsorption and separation of antibodies to the resin, separation of the antibodies from the resin, and regeneration of the resin.
  • a simple and trouble-free antibody purification apparatus can be provided.
  • the feature of the present invention is that the cell culture solution and the slurry containing the resin are mixed by an in-line mixer, the protein in the cell culture solution is combined with the resin in the slurry, and the slurry containing the resin combined with the protein is obtained.
  • the present invention relates to a reaction module having a function of generating and separating a resin-containing slurry and a cell culture solution containing no resin by a cyclone.
  • the reaction module may be used alone, but a device in which a plurality of reaction modules are arranged in parallel to increase capacity, a device in which reaction modules are arranged in series to increase efficiency, or a plurality of reaction modules in parallel and It can also be used as a device arranged in series.
  • Proteins in the present invention are antibodies, hematopoietic proteins such as erythropoietin, enzymes such as t-PA, cytokines such as G-CSF and interferon ⁇ , hormones such as insulin and human growth hormone, vaccines such as hepatitis B vaccine, blood coagulation Any substance may be used as long as it is used for pharmaceuticals such as factors, but antibodies are particularly preferred.
  • a monoclonal antibody is preferably used, and a mouse antibody, a humanized antibody, a human antibody, or a chimeric antibody is particularly preferable.
  • the cell culture solution any culture solution may be used as long as the protein-producing cell is cultured and the protein is produced.
  • Examples of the cells that produce the protein include microbial cells such as E. coli, yeast, and insect cells such as Sf9 and Sf21 ⁇ , but also animal cells such as CHO cells, BHK cells, NSO cells, and SP2 / 0 cells. It is preferable to use animal cells.
  • the resin in the present invention includes a resin used for affinity chromatography or ion exchange chromatography, and a resin bound with a ligand for binding to and separating from the protein is preferable.
  • a resin used for affinity chromatography or ion exchange chromatography when the protein to be bound is an antibody, it is preferable to use protein A, protein G, protein L and derivatives thereof, and particularly preferably protein A and derivatives thereof.
  • synthetic ligands such as HIS tags and GST tags, antibodies corresponding to various proteins, receptors for various proteins, various proteins and their low or high molecular weight inhibitors can be used as ligands.
  • metal chelate affinity resins carrying metal ions such as Cu2 + and Zn2 + can also be used.
  • any resin can be used as long as these ligands are bonded and have excellent fluidity, but in order to improve separation by hydrocyclone, a resin or synthetic polymer based on an inorganic material with a certain density is used.
  • a resin based on an organic polymer such as a natural polymer and a resin obtained by combining an organic material with an inorganic material.
  • the inorganic material include glass, silica, zirconium, or an alloy using stainless steel or tungsten.
  • examples of the synthetic polymer include polystyrene resin and methacrylate resin
  • examples of the natural polymer include resins composed of agarose, dextran, cellulose, chitin, chitosan, mannan and the like.
  • it is composed of a base material in which inert metals such as stainless steel and tungsten alloys are mixed with natural polymers such as agarose and synthetic polymers such as vinyl polymers. Resin to be used.
  • the resin used in the ion exchange chromatography used in the present invention may be any of an anion exchange resin or a cation exchange resin, but it is particularly preferable to use a strong anion exchange resin or a strong cation exchange resin.
  • an anion exchange resin as a ligand, diethylaminoethyl (DEAE) group, trimethylaminoethyl (TAME) group, quaternary aminoethyl (QAE) group, primary amino (—NH 2 ) or secondary (—NHR), Examples thereof include resins having substituents such as tertiary amino group (—NR1R2) and quaternary amino (Q) group.
  • cation exchange resins include carboxymethyl (CM), sulfomethyl (SM), sulfoethyl (SE), Resins having substituents such as sulfopropyl (SP), phosphate (P), and sulfonate (S) groups.
  • the resin used for ion exchange may be any resin as long as these ligands are bonded and has excellent fluidity. However, in order to improve separation by hydrocyclone, a certain density of inorganic material is used as a base material.
  • resins based on organic polymers such as resins, synthetic polymers or natural polymers
  • natural polymers and synthetic polymers are mixed with inert metals such as stainless steel and tungsten alloys to increase the specific gravity.
  • a resin composed of a base material It is preferable to use a resin composed of a base material.
  • the inorganic material include glass, silica, zirconium, or an alloy using stainless steel or tungsten.
  • synthetic polymers include polystyrene resins and methacrylate resins, and examples of natural polymers include resins composed of agarose, dextran, and cellulose.
  • the reaction module is connected to the culture tank by piping through a cell separator as necessary.
  • the culture tank can be any device that can cultivate cells producing the protein and can produce the protein, and even a stainless steel culture tank is made of plastic or resin for single use. It may be a culture tank.
  • Any culture method may be used, but it is preferable to use a culture method by a fed-batch method, a continuous culture method, or the like, particularly preferably a continuous culture method.
  • Proteins are produced by culturing cells that produce the protein in a culture vessel under the culture conditions and culture medium normally used by those skilled in the art, and a cell culture solution containing the protein produced by the culture is used in the present invention. .
  • the concentration of cells in the cell culture medium is preferably about 20% (v / v) or less in a packed cell volume (Packed cell volume).
  • the pipe for transferring the culture medium may be any pipe that can be used as a flow path through which the cell culture medium flows smoothly. However, natural or synthetic pipes such as stainless steel pipes, single-use plastics, rubber, or silica may be used.
  • a tube made of resin may be used.
  • the reaction module is also connected to a storage tank storing a resin slurry by a pipe, and can mix the resin slurry and the cell culture solution.
  • the resin slurry is adjusted to a concentration close to physiological conditions by a pH buffer solution near the neutrality in order to suppress the denaturation of the protein, preferably the pH at which the resin and the target substance are efficiently bound. Is preferably used.
  • Piping has the same meaning as described above, and it is preferable to incorporate a pump as necessary to keep the transfer concentration constant.
  • the pipe for transferring the cell culture solution and the pipe for transferring the resin slurry are connected to the in-line mixer of the reaction module through a branch valve as necessary.
  • the branch valve may be any one as long as it is normally used in protein production apparatuses, but a three-way valve is preferably used.
  • the feature of the present invention is that the cells present in the cell culture medium containing the protein flowing out from the culture tank are separated by a hydrocyclone, the collected cells are transferred to the culture tank, and the protein is removed from the cells. It is related with the cell separation unit which transfers the cell culture solution containing this to the following refinement
  • the next purification means may be any means as long as it is a means for purifying ordinary proteins such as an ion exchange chromatography apparatus and an affinity chromatography apparatus, but it is particularly preferable to use the reaction module.
  • a feature of the present invention relates to an elution module in which a slurry containing a resin bonded to a protein and an eluate are mixed by an in-line mixer and separated into a protein and a resin slurry by a hydrocyclone. Although the separated protein is stored, the separated slurry is transferred again to the slurry storage tank, and the apparatus for supplying the antibody bound to the protein to the elution module includes a tank having a stirring device, etc. Any device can be used as long as it mixes the cell culture solution and the resin slurry and can bind to the protein in the cell culture solution and the resin ligand in the resin slurry, but it is preferable to use the reaction module of the present invention. .
  • Elution modules may be used alone, but devices with multiple elution modules arranged in parallel to increase capacity, devices with elution modules arranged in series to increase efficiency, or multiple elution modules in parallel and It can also be used as a device arranged in series.
  • any eluate may be used as long as it is usually used for protein affinity chromatography or ion exchange chromatography.
  • the pH of the eluate is preferably 5 or less, preferably pH 4 to pH 2, particularly preferably pH 2.5 to pH 2.
  • acetic acid buffer, citrate buffer, phosphate buffer, or dilute solutions such as phosphoric acid and hydrochloric acid are used.
  • it is preferable to increase the salt concentration of the eluate and use sodium chloride, potassium chloride or the like to reduce the salt concentration to 1 M or less, preferably 0.1 M to 0. .5M, particularly preferably 0.1M to 0.3M.
  • Tris-HCl buffer, acetate buffer, citrate buffer, phosphate buffer, or the like is used.
  • the feature of the present invention relates to a cleaning module that mixes a slurry containing a resin bonded to a protein and a cleaning liquid using an in-line mixer, and separates the slurry containing a resin bonded to a protein and a waste liquid using a cyclone.
  • the washing module is preferably installed between the reaction module and a device for separating proteins bound to the resin, preferably between the reaction modules.
  • an aqueous medium having a pH of 5 to 8, preferably 6.5 to 8.0 is preferably used.
  • Tris-HCl buffer, acetate buffer, citrate buffer, phosphate buffer, or the like is used. .
  • a salt of 0.1 to 1M sodium chloride, potassium chloride or the like can be added to the medium.
  • the present invention relates to a device for producing protein from a cell culture solution by combining a reaction module and an elution module, and transferring resin slurry discharged from the elution module of the device to a reaction module or a resin slurry reservoir.
  • the present invention also relates to an apparatus for producing a protein from a cell culture solution that enables cycle utilization of a resin slurry.
  • a feature of the present invention relates to an apparatus for producing a protein from a cell culture medium having a cell circulation system by combining a cell separation apparatus with these production apparatuses.
  • a slurry containing a cell culture solution and a resin is mixed by an in-line mixer, the protein in the cell culture solution is combined with the resin in the slurry, and a slurry containing the resin combined with the protein is generated.
  • the present invention also relates to a method of separating a slurry containing a resin and a cell culture solution not containing a resin by a cyclone.
  • the definitions of the in-line mixer, cell culture solution, slurry containing resin, and hydrocyclone in the present invention are the same as described above.
  • the present invention includes a protein obtained by separating cells present in a cell culture solution containing a protein flowing out of a culture tank using a hydrocyclone, transferring the collected cells to the culture tank, and removing the cells.
  • the present invention relates to a method for transferring a cell culture solution to the next purification means.
  • the next purification means may be any means as long as it is a means for purifying ordinary proteins such as an ion exchange chromatography apparatus and an affinity chromatography apparatus, but it is particularly preferable to use the reaction module.
  • the present invention relates to a method of mixing a slurry containing a resin bonded to a protein and an eluate with an in-line mixer and separating the protein and the resin slurry by a cyclone.
  • the definition of the eluate is as defined above.
  • the present invention relates to a washing method in which a slurry containing a resin bonded to a protein and a washing liquid are mixed by an in-line mixer and separated into a slurry containing a resin bonded to a protein and a waste liquid by a cyclone.
  • the definition of the cleaning liquid is the same as described above, and the cleaning temperature is 4 ° C. to 40 ° C.
  • FIG. Cell Separation Step In the protein production apparatus of FIG. 6, the culture tank (101) provided with a storage tank (102) for supplying a culture medium is used to purify the cell culture medium produced in the culture tank. Is connected to a cell separator (103) for circulating use. In the cell separator, only the cells are separated from the cell culture solution and sent to the culture tank (101), and the cell culture solution containing the proteins separated from the cells is transferred to the in-line mixer (105) of module A used in the capturing process.
  • the Capture process refers to an initial purification process when a protein is produced using a plurality of purification means.
  • the cell separator (103) is connected to the inline mixer (105) of the module A, and the inline mixer (105) of the module A is also connected to the storage tank (104) for the adsorption resin (A) such as protein A
  • the cell culture solution from which the cells have been separated in the cell separation step is mixed with the resin (A) in an in-line mixer, and the protein and the resin (A) in the cell culture solution bind to each other.
  • the cell culture solution is discharged from the upper outlet, and the resin (A) bonded to the protein is discharged from the lower outlet.
  • the lower outlet of the cyclone (106) of the module A is connected to the inline mixer (108) of the module B, and the inline mixer is also connected to the resin (A) eluate storage tank (104).
  • the resin (A) bound to the protein and the eluate are mixed, and the protein is released from the resin (A). Since the discharge port of the in-line mixer is connected to the introduction port of the cyclone (109) of the module B, the protein and the resin (A) are separated in the cyclone (109) of the module B, and the protein is discharged from the cyclone upper discharge port.
  • the resin (A) is discharged from the lower discharge port.
  • the protein is sent to the in-line mixer (111) of the module D used for the next polishing step through the pipe (110).
  • the lower discharge port of the cyclone (109) of the module B is connected to the inline mixer (116) of the module C, and the inline mixer is also connected to the resin regenerated liquid storage tank (117). 109)
  • the resin (A) discharged from the lower discharge port is mixed with the regenerated liquid in the inline mixer (116) of the module C, and the regenerated liquid is mixed with the regenerated liquid in the cyclone (118) of the module C connected to the inline mixer.
  • the separated resin A is sent from the cyclone lower outlet of the module C to the resin (A) storage tank (104) via the pipe (119).
  • polishing Step 1 refers to a purification step after the medium-term step when protein is produced using a plurality of purification means. Polishing process 1 Since the in-line mixer (111) of the module D is connected to the cyclone and the resin (B) storage tank (123) such as the ion exchange resin of the module B in the capturing process by the pipe (110), it is obtained in the capturing process. The obtained protein and the resin (B) are mixed in the in-line mixer to form a slurry of the resin (B) bonded to the protein.
  • the discharge port of the in-line mixer (111) of the module D is connected to the introduction port of the cyclone (112) of the module D, the slurry of the resin (B) bound to the protein in the cyclone (112) of the module D and the remaining The solution is separated, and the waste liquid is discharged from the upper discharge port, and the slurry of the resin (B) bonded to the protein is discharged from the lower discharge port.
  • the cyclone (112) lower discharge port of module D is connected to the inline mixer (121) of module E, and the inline mixer is also connected to the eluate storage tank (124) for resin (B).
  • the resin (B) slurry bound to the protein in (1) is mixed with the eluate, and the protein is released from the resin (B).
  • the discharge port of the in-line mixer (121) of the module E is connected to the introduction port of the cyclone (122) of the module E, the protein and the resin (B) are separated in the cyclone.
  • Protein is discharged from the upper outlet of the cyclone (122) of module E, and resin (B) is discharged from the lower outlet.
  • the protein is transferred via a pipe (115) to the in-line mixer of module E performing the polishing step 2.
  • the resin (B) slurry discharged from the cyclone lower discharge port is transferred to the resin (B) storage tank through the pipe (125) and reused.
  • Polishing process 2 The in-line mixer (113) of the module F is connected to the cyclone and the resin (C) storage tank (133) such as a hydrophobic resin of the module E of the polishing process 1 by the pipe (115).
  • the obtained crude protein and resin (C) are mixed in the in-line mixer to form a slurry of resin (C) bonded to protein.
  • the discharge port of the in-line mixer (113) of the module F is connected to the introduction port of the cyclone (114) of the module F, the slurry of the resin (C) bonded to the protein in the cyclone (114) of the module F and the remaining The solution is separated, the waste liquid is discharged from the upper outlet, and the slurry of the resin (C) bonded to the protein is discharged from the lower outlet.
  • the lower outlet of the cyclone (114) of the module F is connected to the in-line mixer (131) of the module G, and the in-line mixer is also connected to the eluate storage tank (134) for the resin (C).
  • the resin (C) slurry bound to the protein in the mixer is mixed with the eluate, and the protein is released from the resin (C). Since the in-line mixer (131) outlet of the module G and the inlet of the cyclone (132) of the module G are connected, the protein and the resin (B) are separated in the cyclone.
  • the obtained purified protein is converted into a purified protein from the upper discharge port of the cyclone (132) of the module G through a pipe (120) and advanced purification processes such as virus filtration and UF / DF membrane.
  • the resin (C) slurry discharged from the cyclone (132) lower discharge port of the module G is transferred to the resin (C) storage tank through the pipe (135) and reused.
  • the above aspect is a positional aspect of the present invention, and the present invention is not limited to this. It is also possible to add a resin conventionally used for protein purification and its elution and regeneration methods. is there.
  • FIG. 7 shows the module of the present invention.
  • a three-way joint (202) is connected to the inlet of an in-line mixer (201, outer diameter 8 mm, inner diameter 5 mm, total length 145 mm, product name Static Mixer N40-172-0, manufactured by Noritake Co., Ltd.), and mixed with the in-line mixer. Two types of fluid are introduced through the other two joints.
  • the outlet of the in-line mixer is connected to an inlet of a hydrocyclone (204, outer diameter 8 mm, inner diameter 5 mm, total length 190 mm, self-made) through a connecting tube (203).
  • a three-way cock (205) that can be connected to two flow paths for discharging the separated slurry and cleaning liquid is connected to the lower part of the cyclone, and a flow rate adjusting device that adjusts the flow rate of the liquid at the upper discharge port of the cyclone (206, air control bass, single type, manufactured by Azu Japan) is installed.
  • FIG. 8 shows a reaction module equipped with a cell separation unit.
  • the hydrocyclone (301, outer diameter: 16 mm, inner diameter: 13 mm, total length: 150 mm, made of polyacrylic, self-made) of the cell separation unit is provided with an inlet (302) for injecting a cell culture solution from the culture tank. Is connected to a three-way joint (303) which can be switched between a lead-out port for circulating the cells again into the culture tank and a waste-solution lead-out port.
  • the outlet of the upper part of the hydrocyclone is connected to a pipe (305) for transferring the culture supernatant to the reaction module via a joint (304).
  • the reaction module inline mixer (307, outer diameter 8 mm, inner diameter 5 mm, total length 145 mm, product name Static mixer N40-172-0, manufactured by Noritake Co., Ltd.) has a three-way joint (306) connected to its inlet, inline Two types of fluids, a cell supernatant mixed with a mixer and a gel slurry, are introduced through the three-way joint (306).
  • the outlet of the in-line mixer is connected to an inlet of a hydrocyclone (309, outer diameter 8 mm, inner diameter 5 mm, total length 190 mm, self-made) through a connection tube (308).
  • a three-way joint (310) that can be connected to two flow paths for discharging the separated slurry and cleaning liquid is connected to the lower part of the hydrocyclone, and the flow rate adjustment for adjusting the flow rate of the liquid is made to the outlet of the upper part of the cyclone.
  • the device (311, air control bass, single type, manufactured by Azure Japan Co., Ltd.) is installed.
  • Example 3 it was confirmed that the resin could be concentrated and separated from the resin slurry liquid by a hydrocyclone.
  • FIG. 9 is a schematic diagram of the module used at that time.
  • silica gel (Osaka Soda) having an average particle diameter of 50 ⁇ m was used.
  • a 25% slurry solution was prepared by mixing 250 mL of the resin and 750 mL of solvent (pure water). This slurry liquid is injected into the hydrocyclone inlet using a pump (Model RD-05, manufactured by Iwaki Co., Ltd.), and the slurry liquid flowing out from the upper outlet and lower outlet of the hydrocyclone is discharged for a certain period of time.
  • the degree of separation of the resin was confirmed by measuring the volume of the resin and the solvent (pure water) that were collected and contained therein. The situation of the experiment was filmed and analyzed after the experiment to determine the time taken for each task. Hydrocyclone with a total length of 75 mm and 100 mm was used, the flow rate was adjusted by changing the strength of the pump, and the difference in the degree of separation depending on the size of the cyclone and the flow rate was confirmed. The degree of separation was based on the resin and solvent flow rates at the lower and upper hydrocyclone outlets and the resin ratio. Table 1A shows the results for a hydrocyclone with a total length of 75 mm, and Table 1B shows the results for a hydrocyclone with a total length of 100 mm.
  • Example 4 In this example, two hydrocyclones are connected, and the slurry liquid flowing out from the lower outlet of the first upstream cyclone and the solvent (pure water) are ejected (model made by Asahi Organic Materials Co., Ltd .: DAEJH18012). ) And sent to the downstream second cyclone where it was confirmed that the resin could be separated.
  • FIG. 10 is a schematic diagram of the module used at that time.
  • a 25% slurry of silica gel (Osaka Soda Co.) was used.
  • the resin was supplied to the second cyclone, and the resin was separated there. That is, 0.55 L of resin and 0.6 L of solvent (pure water) flow out from the lower outlet in one minute (resin ratio: 47.9%), and 0.02 L of resin and 2 from the upper outlet. 49 L of solvent (pure water) was flowing out (resin ratio: 1.0%).
  • the resin may not be supplied to the downstream second cyclone, so it is desirable to use an ejector.
  • Example 5 it was confirmed that the antibody could be recovered by mixing the antibody sample solution and the chromatographic resin for purification with an in-line mixer and then separating and recovering the resin with a hydrocyclone.
  • FIG. 11 is a schematic diagram of the module used at that time.
  • an antibody solution (1 mg / mL) diluted with a phosphate buffer was used as an antibody sample solution, and silica gel (average particle size 50 ⁇ m, Osaka Soda Co., Ltd.) with immobilized protein A was used as a chromatographic resin for antibody purification. .
  • the antibody sample solution (1 mg / mL: 1 L) and the resin slurry solution (25% resin: 1 L) are merged at a three-way joint, introduced into an in-line mixer, mixed thoroughly, and then introduced into a hydrocyclone for separation. I tried to flow into my mouth. After each solution started to flow steadily, each of the slurry liquids flowing out from the upper outlet and lower outlet of the hydrocyclone was collected for about 16 seconds. Regarding the slurry liquid flowing out from the lower outlet, the resin and the solvent (antibody sample liquid) were quickly separated by filter filtration immediately after the outflow, and only the resin was recovered.
  • the recovered resin was washed twice with 100 mL of phosphate buffer, and then 100 mL of elution buffer (0.1 M glycine hydrochloric acid, pH 2.5) was added to elute the adsorbed antibody. This operation was repeated 7 times, the eluted antibody was collected, and the antibody was quantified by measuring the absorbance at 280 nm.
  • the situation of the experiment was filmed and analyzed after the experiment to determine the time taken for each task.
  • an inline mixer in which a hydrocyclone with a closed upper outlet was installed upside down was used. Moreover, the outflow of the solution from an upper outlet was suppressed by setting a pinch cock in the upper outlet of the separation hydrocyclone.
  • Table 3 shows the slurry solution flow rate, the cyclone lower discharge port, the resin flow rate at the upper discharge port, the solution flow rate, and the resin ratio before the hydrocyclone introduction.
  • Table 4 shows the antibody recovery rate, the adsorption amount, the antibody feeding amount, and the treatment time.
  • the resin was separated by the separation hydrocyclone, and about 66% of the input amount of the antibody was recovered from the resin.
  • Example 6 it was confirmed that the antibody could be purified from the culture supernatant (the supernatant obtained by removing cells from the antibody-expressing cell culture medium) using the module shown in FIG.
  • the culture supernatant was an antibody concentration of 1.16 mg / mL as the culture supernatant, and the same protein A-immobilized silica gel as in Example 5 was used as the chromatographic resin for purification.
  • the experiment was performed in the same manner as in Example 5, but the recovered resin was washed 5 times with 200 mL of phosphate buffer, and elution after the washing was performed 5 times with 200 mL of elution buffer.
  • Table 5 shows the slurry solution flow rate, the cyclone lower discharge port, the resin flow rate at the upper discharge port, the solution flow rate, and the resin ratio by the pump before the introduction of the hydrocyclone.
  • Table 6 shows the antibody recovery rate, the adsorption amount, the antibody feeding amount, and the treatment time.
  • Example 5 the resin was separated by the separation hydrocyclone, and about 69.4% of the input amount of antibody was recovered from the resin (Tables 5 and 6).
  • Example 7 it was confirmed that the antibody could be purified from the culture solution (including antibody-expressing cells) using the module shown in FIG.
  • a culture solution the same protein A-immobilized silica gel as in Example 5 was used as a chromatographic resin for purification with a culture solution having an antibody concentration of 3.15 g / L and a cell number of 34 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • the experiment was performed in the same manner as in Example 5. However, the recovered resin was washed 12 times with 300 mL of phosphate buffer, and elution after the washing was performed 7 times with 100 mL of elution buffer, and the amount was collected and quantified.
  • Table 7 shows the slurry solution flow rate, the cyclone lower discharge port, the resin flow rate at the upper discharge port, the solution flow rate, and the resin ratio before the introduction of the hydrocyclone.
  • Table 8 shows the antibody recovery rate, the amount of adsorption, the amount of antibody delivered, and the treatment time.
  • Example 5 the resin was separated by the separation hydrocyclone, and about 78.4% of the input antibody was recovered from the resin (Tables 7 and 8).
  • a module used for a protein particularly a biopharmaceutical production apparatus, which is suitable for continuous production of protein, is maintenance-free, and has improved resin regeneration efficiency.
  • Three-way cock, 206. Flow rate adjusting device, 301. Hydrocyclone, 302. Introduction port, 303. Three-way joint, 304. Bonding member, 305. Pipe, 306. Three-way joint, 307. In-line mixer, 309. Hydrocyclone, 310. Three-way joint, 311. Flow regulators All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

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Abstract

動物細胞からのタンパク質の製造方法において、密閉容器に細密充填したカラムやフィルターは目詰まりを生ずるため連続した操作が困難である。このような問題を解決するため、インラインミキサーにより細胞培養液と樹脂を含むスラリーを混合し、タンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーを生成させ、サイクロンにより樹脂を含んだスラリーと樹脂を含まない細胞培養液に分離し、更に樹脂スラリーからタンパク質を溶出させるモジュールを提供する。

Description

インラインミキサーとハイドロサイクロンを統合したモジュールを複数用いて抗体を細胞培養液から連続的に製造する装置および当該装置を用いた抗体の製造方法
　本発明は、細胞培養技術により生産された抗体等タンパク質を分離精製するための、インラインミキサーとハイドロサイクロンを組み合わせたモジュールから構成される装置および当該装置を用いた抗体等タンパク質の製造方法に関する。
　バイオ医薬品として最近用いられているタンパク質や糖タンパク質或いはペプチドや核酸などは従来血液やその他の体液或いは生体組織のホモジネートなどから沈殿操作やろ過、遠心分離或いはクロマトグラフィー分離操作などにより分離精製して用いられてきた。また最近では大腸菌（Escherichia coli、略号：E. coli）などの微生物の遺伝子組み換え操作によりタンパク質やペプチドなどが発現されて菌体内に封入体顆粒（インクルージョンボディー）として生産され、変性可溶化とそれに続くリフォールディングにより再生された目的物を遠心分離やろ過、クロマトグラフィー操作などにより精製されてきた。特に最近ではモノクローナル抗体を初めとした糖タンパク質医薬品に在っては遺伝子組み換えを行ったChinese Hamster Ovary (CHO)細胞の培養による製造が行われた後、連続遠心分離やデプスフィルター及びメンブレンフィルターを加えた細胞除去及び澄明化を行った後アフィニティークロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなど各種分離剤をクロマトグラフィー用筒状筐体(カラム)に細密充填し、それらに清澄化した糖タンパク質やタンパク質を含む溶液を流してクロマトグラフィー分離操作や膜分離操作を組み合わせて精製されてきた。
　しかしこれまで行われてきたクロマトグラフィー分離操作は時間が掛かることに加え分離剤を筒状筐体に充填した、限られた大きさのカラムを用いるために精製することが出来る目的物の量は限られる。そのため複数のカラムを順番に操作する装置を用いて最初のカラムに試料を添加した後分離操作を行っている間に次のカラムに試料を添加し、さらに2番目のカラムで分離操作をしている間に1番目のカラムは再生洗浄を行うと同時に3番目のカラムに試料を添加するという操作を繰り返すことで連続的に試料を処理するいわゆる疑似移動床（SMB：Simulated Moving Bed）型分離精製法或いは複数のカラムに処理すべき試料と再生洗浄液を順次切り替えて流すことで効率的に連続な精製処理を可能にしている例が見られる（非特許文献１）。
　但し、これら従来の分離精製操作では何れもカラム筐体に分離剤を細密充填したクロマトグラフィーカラムやハウジング或いはカートリッジ容器に充填したフィルターを用いることから細胞や細胞破片、或いは何らかの凝集体、沈殿などが有る場合には目詰まり（Fouling）を生じるためタンパク質や糖タンパク質、ペプチド、核酸などを含む溶液或いは懸濁液を流すことが出来なくなり作業を中断せざるを得なくなり連続した操作は困難になる。
　このため近年ではカラムを用いないタンパク質の精製方法が着目されている（非特許文献２）。樹脂を充填したカラムを用いることを避けるタンパク質の精製装置として、「標的物質を液体供給源から精製するためのシステムであって、　液体供給源をクロマトグラフィー樹脂と接触させるための容器と、　クロマトグラフィー樹脂を濾過して、前記標的物質を前記クロマトグラフィー樹脂から回収するためのクロスフローフィルター（CFF或いはタンジェンシャルフィルター：TFFとも言う。）と、　前記容器と前記クロスフローフィルターを相互に接続し、フロー回路を通って前記クロマトグラフィー樹脂を含有する液体を流すためのフロー回路と、　前記フロー回路、前記容器、および前記クロスフローフィルターにおけるクロマトグラフィー樹脂と、　前記容器に送り出すようにつながれた、前記液体供給源と、　前記フロー回路を通って液体とクロマトグラフィー樹脂を循環させるための手段とを備える、システム（特許文献１）。」が知られているが、クロスフローフィルターの目詰まりのためメンテナンスが煩雑である。また、連続的にミキサーによりクロマトグラフィー樹脂スラリーと未精製標品を混合し、フィルターにより混合液の濃縮、分離する逆流クロスフロークロマトグラフィーのモジュール（特許文献２）が知られているが、このモジュールもフィルターの目詰まりやメンテナンスの煩雑さを回避することができない。
　流れの遠心力を利用して二相流液から質量の大きい物質を分離するサイクロン式分離機は古くから用いられているが、化学物質を含むスラリーと洗浄用のメタノールを分離するシステムに用いられることは知られているが（特許文献３）、ハイドロサイクロンを用いてスラリー中の標的物質を捕集する目的には使用されておらず、また抗体等タンパク質の精製には使用されていない。更にハイドロサイクロンで分離したスラリーをインラインミキサーで混合する方法は知られているが、インラインミキサーをハイドロサイクロンと結合し、インラインミキサーで混合、反応させたスラリーをハイドロサイクロンで分離する装置は知られていない。
　本発明は細胞やその破片などを含む培養液を直接、或いは懸濁液中の固形成分をハイドロサイクロンを用いて沈殿除去（ただし完全に除去する必要はない。）した後アフィニティークロマトグラフィー分離剤やイオン交換クロマトグラフィー分離剤などのスラリーとインラインミキサー内で吸着反応を行った後に未吸着成分と目的タンパク質成分を結合した分離剤をハイドロサイクロンにより分離する。さらに分離排出されたタンパク質結合分離剤は次のインラインミキサーとハイドロサイクロンを結合した装置（モジュール）に導かれ洗浄された後、目的タンパク質と樹脂の結合を阻害する溶液、或いは解離させることが出来る溶液と共に3番目のインラインミキサーとハイドロサイクロンからなる装置に導かれて目的タンパク質と吸着分離剤とが分離され目的タンパク質はハイドロサイクロンの上部からオーバーフローして回収される。一方タンパク質と解離した分離剤は次のインラインミキサーとハイドロサイクロンからなる装置に導かれ洗浄再生溶液で再生された後最初のインラインミキサーに導入され連続的に導入される細胞培養液などの目的タンパク質を含む懸濁液との反応に供される。
　このように本発明は細胞や細胞破片、或いは何らかの凝集体や沈殿などが存在する懸濁液であっても目詰まり（Fouling）を生じることなくタンパク質や糖タンパク質、ペプチド、核酸などを含む溶液から目的タンパク質を含む成分を連続的に分離することが出来る方法であり、またそのような連続した分離精製法に用いることが可能な装置である。
特表２００３－５１２５９４号公報 ＵＳ２０１０/０１９３４３４Ａ 特開平５－１４００４４号公報
杉山征輝、吉本則子、山本修一、「カラムスイッチングによる連続クロマトグラフィー分離操作」、食品工学誌、2017年、第18巻、2号、A9頁～A12頁 Petra Gronemeyer, Reinhard Ditz and Jochen Strub, "Trends in Upstream and Downstream Process Development for Antibody Manufacturing", Bioengineering,(2014), Vol1, 188-212
　動物細胞の培養や微生物の培養などにより発現された目的タンパク質などはこれまで遠心分離や多段階のフィルターろ過操作により固形物を除去した清澄溶液とした後クロマトグラフィー分離剤をカラム筐体に細密充填したクロマトグラフィー充填カラムやカートリッジ又はハウジングと呼ばれる容器に充填されたフィルターなどを多段階用いて精製されてきた。しかし、密閉容器に細密充填したカラムやフィルターは目詰まりを生ずるため連続した操作が困難である。
更に、本発明は、図１および図２にその一態様が示されたように、
〔１〕インラインミキサーとサイクロンを結合したモジュールを用いて、タンパク質を細胞培養液から連続的に精製する装置であって、
　(a) 第一のモジュール（A：反応モジュール）のインラインミキサー（６）の導入口に、培養槽（１）または細胞分離装置（D）と第一のモジュールとを結ぶ配管（３）と、第第一の貯留槽（２）と第一のモジュールとを結ぶ配管（４）が分岐バルブ（５）を介して接続され、前記インラインミキサー（６）の排出口はハイドロサイクロン（７）の導入口に接続され、ハイドロサイクロン（７）の下部排出口には、第一の反応モジュールと第二のモジュールを結ぶ配管（８）が結合し、ハイドロサイクロン（７）の上部排出口には配管（９）が結合している第一のモジュールと、
　(b) 第二のモジュール（B：溶出モジュール）のインラインミキサー（１３）の導入口には、第一のモジュールと第二のモジュールを結ぶ配管（８）と、第二の貯留槽（１０）と第二のモジュールを結ぶ配管（１１）が分岐バルプ（１２）を介して接続され、前記インラインミキサー（１３）の排出口とハイドロサイクロン（１４）の導入口は接続され、ハイドロサイクロン下部の排出口には第二のモジュールと他のモジュールとを結ぶ配管（１５）が結合し、ハイドロサイクロン（１４）上部排出口には、配管（１６）が結合している第二のモジュールから構成される装置に関する。
　本発明は、また図３にその一態様が示されたように、
〔２〕他のモジュールが、第三のモジュール（C：再生モジュール）として、インラインミキサー（２０）の導入口に、第二のモジュール（B）と第三のモジュールを結ぶ配管（１５）と、第三の貯留槽（１７）と第三のモジュールを結ぶ配管（１８）とが分岐バルプ（１９）を介して接続され、前記インラインミキサー（２０）の排出口とハイドロサイクロン（２１）の導入口は接続され、ハイドロサイクロン（２１）の下部排出口には第三のモジュールと第一の貯留槽（２）とを結ぶ配管（２３）が結合し、ハイドロサイクロン（２１）の上部排出口には配管（２２）が結合している第三のモジュールである〔１〕に記載の装置に関する。
　更に、本発明は図４にその一態様が示されているように、
〔３〕　細胞分離装置（D）が、培養槽（１）と細胞分離装置とを結ぶ配管（２４）がハイドロサイクロン（２５）の導入口と結合し、当該ハイドロサイクロン（２５）の下部排出口は細胞分離装置と培養槽（１）とを結ぶ配管（２６）と結合し、上部排出口は細胞培養装置と第一のモジュールとを結ぶ配管（３）から構成される細胞分離ユニットであることを特徴とする〔１〕または〔２〕記載の装置に関する。
　本発明はまた、図５に一態様が示されているように、
〔４〕〔１〕記載の第一のモジュール（A）と第二のモジュール（B）を結ぶ配管（８）の間に洗浄用の第四のモジュール（E：洗浄モジュール）を１または２個挿入することを特徴とする〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載の装置、および
〔５〕第四のモジュールが、第四のモジュール（E）のインラインミキサー（３０）の導入口には、第一のモジュールと第四のモジュールを結ぶ配管（８）と、第四の貯留槽（２７）と第四のモジュールを結ぶ配管（２８）が分岐バルプ（２９）を介して接続され、前記インラインミキサー（３０）の排出口とハイドロサイクロン（３１）の導入口は接続され、ハイドロサイクロン下部の排出口には第二のモジュールまたは新たな洗浄用モジュールへ接続する配管（８）が結合し、ハイドロサイクロン（３１）上部排出口には、洗浄液を排出口へ移送する配管（３２）が結合している請求項４に記載の装置に関する。
　更に本発明は、
〔６〕インラインミキサーとサイクロンを結合したモジュールを複数用いて、タンパク質を細胞培養液から連続的に製造する方法であって、
(a)第一のモジュールのインラインミキサーへ、培養槽から移送されたタンパク質を含有する細胞培養液と第一の貯留槽から移送された樹脂を含むスラリーを混合し、細胞培養液中のタンパク質をスラリー中の樹脂と結合させ、タンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーを生成する工程、
(b)前記第一のモジュールのインラインミキサーによる混合工程で得たタンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーを、サイクロンへ移送し、タンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーと細胞培養液に分離する工程、
(c)前記第一のモジュールのサイクロンによる分離工程で得たタンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーを第二のモジュールに移送し、細胞培養液を第一の貯留槽へ移送する工程、
(d)第二のモジュールのインラインミキサー中で、前記工程で得たタンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーと、第二の貯留槽から移送された溶出液を混合し、溶出用スラリーを生成する工程、および
(e)前記第二のモジュールのインラインミキサーによる混合工程で得た溶出用スラリーをサイクロンへ移送し、タンパク質と、タンパク質と結合していない樹脂を含むスラリーに分離する工程を含む方法、
〔７〕〔６〕に記載の工程bと工程cの間に、第三のモジュールを用いた洗浄工程を入れることを特徴とする方法、
〔８〕〔７〕に記載の洗浄方法が、第三のモジュールのインラインミキサー中で、タンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーと、第四の貯留槽から移送された洗浄液を混合し、洗浄後の混合液をサイクロンに移送し分離する工程であることを特徴とする方法。
〔９〕第一のモジュールのインラインミキサーへ培養槽からタンパク質を含有する細胞培養液を移送する工程において、サイクロンを介して細胞とタンパク質を含有する細胞培養液とを分離し、分離した細胞は培養槽へ移送し、純化したタンパク質を含有する細胞培養液を、第一のモジュールのインラインミキサーに移送することを特徴とする〔６〕～〔８〕のいずれかひとつに記載の方法および
〔１０〕樹脂がアフィニティ樹脂であることを特徴とする〔６〕～〔９〕のいずれかひとつに記載の方法に関する。
本発明はまた、
〔１１〕インラインミキサーとサイクロンを結合したモジュールを複数用いて、タンパク質を細胞培養液から連続的に精製する装置、
〔１２〕〔１〕記載の装置が、インラインミキサーにより細胞培養液と樹脂を含むスラリーを混合し、細胞培養液中のタンパク質をスラリー中の樹脂と結合させ、タンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーを生成させ、サイクロンにより樹脂を含んだスラリーと樹脂を含まない細胞培養液に分離する機能を持つ反応モジュールと、タンパク質と結合した樹脂を含むスラリーと溶出液をインラインミキサーにて混合し、ハイドロサイクロンによりタンパク質と樹脂スラリーに分離する溶出モジュールから構成される装置、
〔１３〕培養槽から流出するタンパク質を含む細胞培養液中に存在する細胞をハイドロサイクロンにより分離し、採取された細胞を培養槽へ移送し、当該細胞を除いたタンパク質を含む細胞培養液を、次の精製手段に移送する細胞分離装置を装着した〔１１〕または〔１２〕に記載の装置、
〔１４〕　タンパク質と結合した樹脂を含むスラリーと洗浄液をインラインミキサーにて混合し、サイクロンによりタンパク質と結合した樹脂を含むスラリーと廃液に分離する洗浄モジュールを装着した〔１１〕～〔１３〕のいずれかひとつに記載の装置。
〔１５〕　反応モジュールと溶出モジュールを組み合わせた〔１２〕～〔１４〕のいずれかひとつに記載の装置において、当該装置の溶出モジュールで排出する樹脂スラリーを反応モジュールまたは樹脂スラリーの貯留槽に移送して、樹脂スラリーのサイクル利用を可能にした装置、および
〔１６〕〔１１〕～〔１５〕のいずれか１項に記載の装置を用いたタンパク質の製造方法に関する。
本発明は更に、
〔１７〕　インラインミキサーとサイクロンを結合したモジュールを用いて、タンパク質を細胞培養液から連続的に精製する装置であって、　タンパク質を含有する細胞培養液と樹脂を含むスラリーを混合して前記タンパク質が前記樹脂に結合されたスラリーを生成する第一のモジュール（反応モジュール）と、　該第一のモジュールにより精製されたスラリーと溶出液とを混合して、前記スラリーから前記タンパク質を溶出する第二のモジュール（溶出モジュール）とを有することを特徴とするタンパク質精製装置、
〔１８〕　前記第二のモジュールで前記タンパク質が分離したスラリーと再生液とを混合して樹脂を含む再生樹脂スラリーを生成する第三のモジュール（再生モジュール）とを有することを特徴とする請求項１７に記載のタンパク質精製装置、
〔１９〕　培養槽から供給される細胞培養液から細胞を分離して前記第一のモジュールに前記タンパク質を含有する細胞培養液を供給する細胞分離モジュールを有することを特徴とする請求項１７に記載のタンパク質精製装置、
〔２０〕　前記第一のモジュールと前記第二のモジュールとの間に介在されて、前記第一のモジュールにより生成されたタンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーと洗浄液を混合して、タンパク質と結合した樹脂スラリーを洗浄する第四のモジュール（洗浄モジュール）を有することを特徴とする請求項１７記載のタンパク質精製装置、
〔２１〕　前記第一のモジュールは、細胞培養液と樹脂を含むスラリーを混合し、細胞培養液中のタンパク質をスラリー中の樹脂と結合させ、タンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーを生成させる第一のインラインミキサーと、樹脂を含んだスラリーと樹脂を含まない細胞培養液に分離する第一のハイドロサイクロンとを有することを特徴とする請求項１７記載のタンパク質精製装置、
〔２２〕　前記第二のモジュールは、タンパク質と結合した樹脂を含むスラリーと溶出液を混合する第二のインラインミキサーと、タンパク質と樹脂スラリーに分離する第二のハイドロサイクロンとを有することを特徴とする請求項１７に記載のタンパク質精製装置、
〔２３〕　前記樹脂を含むスラリーを貯留する貯留槽を備え、
前記第三のモジュールは、前記再生樹脂スラリーを前記貯留槽に移送することを特徴とする請求項１８記載のタンパク質精製装置、
〔２４〕　前記細胞分離モジュールは、培養槽から流出するタンパク質を含む細胞培養液中に存在する細胞を分離して、採取された細胞を培養槽へ移送し、当該細胞を除いたタンパク質を含む細胞培養液を前記第一のモジュールに移送するハイドロサイクロンを有することを特徴とする請求項１９記載の装置、および
〔２５〕　前記第四のモジュールは、前記タンパク質と結合した樹脂を含むスラリーと前記洗浄液を混合する第四のインラインミキサーと、タンパク質と結合した樹脂を含むスラリーと廃液に分離する第四のハイドロサイクロンとを有することを特徴とする請求項２０に記載の装置。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-058853号の開示内容を包含する。
　本発明は少量の細胞や細胞破片或いは宿主微生物などが含まれる懸濁状態の試料であってもその中から目的タンパク質を連続的に短時間で回収、精製することが出来る方法とその装置を提供する。少量の固形物を含み試料から直接目的タンパク質などを連続的に回収、精製することが出来ることにより小規模培養設備でも設備稼働時間によって比較的容易に大量の生産物を得られることが可能になり、生産性が高く、連続的生産により製造コストを抑制した効率的な製造が可能になる。
(１)本発明により動物細胞の培養液から細胞や細胞破片或いは沈殿物などを高度に分離除去すること無く抗体分子など目的タンパク質を連続的に分離することが出来る。
(２)本発明により従来用いられてきた分離材を充填したクロマトグラフィーカラムを用いること無く連続的にタンパク質の分離を行うことが出来る。
(３)本発明によりホローファイバーや連続遠心機などを用いること無く動物細胞の灌流培養が可能になり、抜き出した培養液からろ過フィルターやクロマトグラフィーカラムを用いず目的タンパク質を連続的に分離することが出来る。
(４)本発明の装置を用いることで大型の膜分離装置やクロマトグラフィー装置、大型クロマトグラフィーカラムなどの設備を用いること無く連続でタンパク質の分離が出来る。
(５)本発明の装置を用いることで装置の流路内で吸着分離剤の再生洗浄を行い循環させることが出来ることから少量の吸着分離剤で連続したタンパク質などの分離を繰り返すことが出来る。
(６)本発明は吸着分離剤をカラムに充填することが無く装置の流路内でスラリー状の吸着分離剤と反応させて不純物と分離したのち短時間の内に目的タンパク質を解離させることで目的タンパク質などの吸着による構造的変性を抑制することが出来る。
(７)本発明は吸着分離剤をカラムなどの容器に充填すること無く、スラリー状態で目的タンパク質などと反応させ、スラリー状態で洗浄を行うことが出来ることから宿主タンパク質や宿主DNA或いはRNAなど不純物との不必要な吸着を避けることで純度の高い目的タンパク質などを得ることが出来る。
図１は樹脂への抗体の吸着と分離を行う反応モジュールAである。 図２は樹脂からの抗体の分離を行う溶出モジュールBである。 図３は樹脂の再生を行うための再生モジュールCである。 図４は還流培養時の細胞の分離のための細胞分離装置Dである。 図５は抗体等が結合した樹脂の洗浄を行う洗浄モジュールEである。 図６は培養液からの抗体の連続精製装置である。 図７は本発明の反応モジュールである。 図８は細胞分取装置を装着した反応モジュールである。 図９はハイドロサイクロン評価用モジュールの模式図である。 図１０は第一ハイドロサイクロンおよび第二ハイドロサイクロンを２第連結した場合の評価用モジュールの模式図である。 図１１は、抗体サンプル溶液と精製用クロマト樹脂をインラインミキサーで混ぜた後、ハイドロサイクロンで樹脂を分離回収することにより抗体を回収できることを確認した試験に用いたモジュールの模式図である。
　本発明においてインラインミキサーとは、駆動部の無い静的混合装置であればどのようなものでもよいが、好ましくは細胞や樹脂へのダメージを考慮すると可動部の無いスタティックミキサー或いは流動床型のミキサーを用いることが好ましい。
　インラインミキサーは通常導入される２つの流体を液体の流れにより混合し排出するシンプルな構造のため、円筒状の形状の一方に導入口、液体の流出方向に排出口を持つが、本発明に用いるインラインミキサーは２つの流体を混合したものを一つの導入口に導入される形状を持つ。また排出口は液体の排出方向に一つの排出口を持てばよい。
　本発明においてハイドロサイクロンとは液体サイクロンを示し、液体サイクロン静止状態の機器へ処理液を注入することにより分離・分級・濃縮を行う能力を持つ駆動部の無い機器であればどのようなものでもよいが、代表的にはMozley型やDorr-Oliver型、Bradley 型、Rietema型、Krebs型、CBV/DEMCO型など様々なタイプのハイドロサイクロンが利用されているが細胞や樹脂へのダメージを考慮するとBradley型又はRietema型ハイドロサイクロンを用いることが好ましい。
これらのハイドロサイクロンは通常ロート状の形状をしており、ロート型の上部壁面に分離を行う混合物の導入口、ロート型の上部天井部に分離され純化された物質の上部排出口、ロート型の下端部に純化された物質を除いた混合物の下部排出口がある。
　本発明の特徴は、インラインミキサーとサイクロンを結合させた複数のモジュールを用い、各モジュールが樹脂への抗体の吸着と・分離、樹脂からの抗体の分離、樹脂の再生という個別の機能を有するために、シンプルかつトラブルの少ない抗体の精製装置が提供できる点にある。
　第一に、本発明の特徴は、インラインミキサーにより細胞培養液と樹脂を含むスラリーを混合し、細胞培養液中のタンパク質をスラリー中の樹脂と結合させ、タンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーを生成させ、サイクロンにより樹脂を含んだスラリーと樹脂を含まない細胞培養液に分離する機能を持つ反応モジュールに関する。
　反応モジュールは単独で用いても良いが、容量を増やすために複数の反応モジュールを並列に配置した装置、効率を増加するために反応モジュールを直列に配置した装置、または複数の反応モジュールを並列および直列に配置した装置として用いることもできる。
　本発明におけるタンパク質とは抗体、エリスロポエチン等の造血タンパク質、ｔ－PA等の酵素、G-CSF,インターフェロンβ等のサイトカイン、インシュリン、ヒト成長ホルモン等のホルモン、B型肝炎ワクチン等のワクチン、血液凝固因子等医薬品に用いられるものであればどのようなものでも良いが、とりわけ抗体を対象とすることが好ましい。抗体としてはモノクローナル抗体を用いることが好ましく、マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体を対象とすることがとりわけ好ましい。細胞培養液としては前記タンパク質を生産する細胞を培養し、タンパク質を生産した状態の培養液であればどのような培養液でも良い。前記タンパク質を生産する細胞としては大腸菌等の微生物細胞、酵母、或いはSf9やSf21 等の昆虫細胞に加え、CHO細胞、BHK細胞、NSO細胞、SP2/0細胞等の動物細胞が挙げられるが、とりわけ動物細胞を用いることが好ましい。
　本発明における樹脂とはアフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーに使用される樹脂が挙げられ、前記タンパク質と結合、分離するためのリガンドが結合した樹脂が好ましい。アフィニティークロマトグラフィーのためのリガンドとしては結合するタンパク質が抗体の場合は、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインL及びそれらの誘導体等を用いることが好ましくとりわけプロテインＡ及びその誘導体を用いることが好ましい。抗体以外のタンパク質の場合、ＨＩＳタグ、ＧＳＴタグ等の合成リガンド、各種タンパク質に対応した抗体、各種タンパク質の受容体、各種タンパク質とその低分子または高分子の阻害剤等をリガンドとして用いることができる。またCu2+やZn2+などの金属イオンを担持させた金属キレートアフィニティー樹脂なども用いることが出来る。樹脂としてはこれらのリガンドが結合され、流動性に優れたものならどのようなもので良いが、ハイドロサイクロンによる分離を改善するためにある程度密度の高い無機材質を基材とした樹脂または合成高分子または天然高分子など有機系高分子を基材とした樹脂および高分子有機材料に無機材質を組み合わせた樹脂を用いることが好ましい。無機材質としてはガラス、シリカ、ジルコニウム、或いはステンレスやタングステンを用いた合金などが挙げられる。一方、合成高分子としてはポリスチレン樹脂、メタクリレート樹脂等が挙げられ、天然高分子としてはアガロース、デキストラン、セルロース、キチン、キトサン、マンナンなどから構成される樹脂が挙げられる。とりわけハイドロサイクロンによる分離を考慮して比重を上げるためにステンレスなどの不活性金属やタングステン合金などを天然高分子であるアガロースや合成高分子であるビニル系高分子などと混ぜ合わせた基材で構成される樹脂が挙げられる。
　本発明に用いられるイオン交換クロマトグラフィーに用いられる樹脂は、陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂のどのようなものでも良いが、とりわけ強陰イオン交換樹脂あるいは強陽イオン交換樹脂を用いることが好ましい。陰イオン交換樹脂としてはリガンドとして、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、トリメチルアミノエチル（ＴＡＭＥ）基、４級アミノエチル（ＱＡＥ）基、および１級アミノ（－ＮＨ２）や２級（－ＮＨＲ）、３級アミノ基（－ＮＲ１Ｒ２）４級アミノ（Q）基などの置換基を有する樹脂が挙げられ、陽イオン交換樹脂としてはリガンドとしてカルボキシメチル（ＣＭ）、スルホメチル（ＳＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ），およびスルホネート（Ｓ）基などの置換基を有する樹脂が挙げられる。イオン交換に用いられる樹脂としてはこれらのリガンドが結合され、流動性に優れたものならどのようなもので良いが、ハイドロサイクロンによる分離を改善するためにある程度密度の高い無機材質を基材とした樹脂または合成高分子または天然高分子など有機系高分子を基材とした樹脂に加え、比重を上げるためにステンレスなどの不活性金属やタングステン合金などと天然高分子や合成高分子を混ぜ合わせた基材で構成される樹脂を用いることが好ましい。無機材質としてはガラス、シリカ、ジルコニウム、或いはステンレスやタングステンを用いた合金などが挙げられる。また合成高分子としてはポリスチレン樹脂、メタクリレート樹脂等が挙げられ、天然高分子としてはアガロース、デキストラン、セルロースから構成される樹脂が挙げられる。
　前記反応モジュールは、培養槽と、必要に応じて細胞分離装置を介して、配管により結合されることが好ましい。培養槽は前記タンパク質を生産する細胞を培養し、タンパク質を生産できる装置であればどのようなものでも良く、ステンレス製の培養槽であっても、シングルユース用のプラスチックまたは樹脂等により製作された培養槽であってもよい。
　培養方法はどのようなものでも良いが、フェドバッチ法による培養法、連続培養法等を用いることが好ましく、とりわけ連続培養法に用いることが好ましい。培養槽で前記タンパク質を生産する細胞を当業者が通常用いる培養条件および培地等にて培養することによりタンパク質を生産し、当該培養により生産されたタンパク質を含んだ細胞培養液が本発明に用いられる。細胞培養液中の細胞の濃度はパックドセルボリューム（Ｐａｃｋｅｄ　ｃｅｌｌ　ｖｏｌｕｍｅ）が～約２０％（ｖ／ｖ）以下であることが好ましい。培養液を移送する配管は、細胞培養液が円滑に流れる流路として用いられるものであればどのようなものでも良いが、ステンレス管、シングルユース用のプラスチック、ゴムまたはシリカ等の天然または合成の樹脂により製作されたチューブであってもよい。
　前記反応モジュールはまた、樹脂スラリーを貯留した貯留槽と配管により連結され、樹脂スラリーと前記細胞培養液を混合することができる。樹脂スラリーは前記樹脂が目的物質である抗体やタンパク質が効率的に結合するｐＨ、好ましくはタンパク質の変性を抑制するために中性付近のｐＨ緩衝液により生理的条件に近い濃度に調整されたものを用いることが好ましい。
　配管は前記と同義であり、必要に応じてポンプを組み込み、移送濃度を一定にすることが好ましい。細胞培養液を移送する配管と樹脂スラリーを移送する配管は、必要により分岐バルブを介して反応モジュールのインラインミキサーと結合される。分岐バルブは、通常タンパク質の製造装置に用いられるものであればどのようなものでも良いが、三方バルブを用いることが好ましい。
　第二に、本発明の特徴は、培養槽から流出するタンパク質を含む細胞培養液中に存在する細胞をハイドロサイクロンにより分離し、採取された細胞を培養槽へ移送し、当該細胞を除いたタンパク質を含む細胞培養液を、次の精製手段に移送する細胞分離ユニットに関する。次の精製手段はイオン交換クロマトグラフィー装置、アフィニティークロマトグラフィー装置等通常のタンパク質の精製に用いる手段であればどのようなものでも良いが、前記反応モジュールを用いることがとりわけ好ましい。
　第三に本発明の特徴は、タンパク質と結合した樹脂を含むスラリーと溶出液をインラインミキサーにて混合し、ハイドロサイクロンによりタンパク質と樹脂スラリーに分離する溶出モジュールに関する。なお、分離されたタンパク質は貯蔵されるが、分離されたスラリーは再び前記スラリー貯蔵タンクに移送され、溶出モジュールにタンパク質と結合した抗体を供給するための装置としては、攪拌装置を有するタンク等、細胞培養液と樹脂スラリーを混合させ、細胞培養液中のタンパク質と樹脂スラリー中の樹脂リガンドに結合させ得る装置であればどのようなものでも良いが、本発明の前記反応モジュールを用いることが好ましい。
　溶出モジュールは単独で用いても良いが、容量を増やすために複数の溶出モジュールを並列に配置した装置、効率を増加するために溶出モジュールを直列に配置した装置、または複数の溶出モジュールを並列および直列に配置した装置として用いることもできる。
　溶出液としては、通常タンパク質のアフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーに用いる溶出液であればどのようなものでも良いが、
プロテインＡ等アフィニティークロマトグラフィーに用いるリガンドと結合した樹脂の場合は、溶出液のｐＨを５以下、好ましくはｐＨ４～ｐＨ２、とりわけ好ましくはｐＨ２．５～ｐＨ２にすることが好ましい。媒体としては、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、或いはリン酸や塩酸等の希薄溶液を用いる。イオン交換クロマトグラフィーに用いるリガンドと結合した樹脂の場合は、溶出液の塩濃度を増加することが好ましく、塩化ナトリウム、塩化カリウム等を用いて、塩濃度を１Ｍ以下、好ましくは０．１Ｍ～０．５Ｍ、とりわけ好ましくは０．１Ｍ～０．３Ｍにして用いる。媒体としては、トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液等を用いる。
　第四に本件発明の特徴は、タンパク質と結合した樹脂を含むスラリーと洗浄液をインラインミキサーにて混合し、サイクロンによりタンパク質と結合した樹脂を含むスラリーと廃液に分離する洗浄モジュールに関する。洗浄モジュールは前記反応モジュールと樹脂に結合したタンパク質を分離する装置、好ましくは前記反応モジュールの間に設置することが好ましい。洗浄液としては、ｐH５～８、好ましくはｐH６．５～８．０の水性媒体を用いることが好ましく、媒体としてはトリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液等を用いる。前記媒体には必要により０．１～１Mの塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩を加えることができる。
　第五に本件発明は、反応モジュールと溶出モジュールを組み合わせることにより細胞培養液からのタンパク質の製造装置が、当該装置の溶出モジュールで排出する樹脂スラリーを反応モジュールまたは樹脂スラリーの貯留槽に移送して、樹脂スラリーのサイクル利用を可能にした細胞培養液からのタンパク質の製造装置に関する。本発明の特徴はこれらの製造装置に細胞分離装置を組み合わせることにより細胞循環システムを持つ細胞培養液からのタンパク質の製造装置に関する。
　更に、これらの装置の反応モジュールと溶出モジュールの間に洗浄モジュールを組み込むことにより、洗浄工程が必要なタンパク質のための製造装置が提供される。
　第六に、本発明は、インラインミキサーにより細胞培養液と樹脂を含むスラリーを混合し、細胞培養液中のタンパク質をスラリー中の樹脂と結合させ、タンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーを生成させ、サイクロンにより樹脂を含んだスラリーと樹脂を含まない細胞培養液に分離する方法に関する。本発明におけるインラインミキサー、細胞培養液、樹脂を含むスラリー、ハイドロサイクロンの定義は前記と同義である。
　第七に、本発明は、培養槽から流出するタンパク質を含む細胞培養液中に存在する細胞をハイドロサイクロンにより分離し、採取された細胞を培養槽へ移送し、当該細胞を除いたタンパク質を含む細胞培養液を、次の精製手段に移送する方法に関する。次の精製手段はイオン交換クロマトグラフィー装置、アフィニティークロマトグラフィー装置等通常のタンパク質の精製に用いる手段であればどのようなものでも良いが、前記反応モジュールを用いることがとりわけ好ましい。
　第八に本発明は、タンパク質と結合した樹脂を含むスラリーと溶出液をインラインミキサーにて混合し、サイクロンによりタンパク質と樹脂スラリーに分離する方法に関する。溶出液の定義は前記と同義である。本発明を第六の発明および必要により第七の発明と組み合わせることにより、細胞培養液からのタンパク質の精製方法が構築される。
　第九に本発明は、タンパク質と結合した樹脂を含むスラリーと洗浄液をインラインミキサーにて混合し、サイクロンによりタンパク質と結合した樹脂を含むスラリーと廃液に分離する洗浄方法に関する。洗浄液の定義は前記と同義であり、洗浄温度は４℃～４０℃である。本発明は第六の発明、第八の発明、必要により第七の発明と組み合わせて使用することにより、細胞培養液からのタンパク質の精製方法が構築される。
　以下に本発明のタンパク質の製造装置による精製の一態様を図６に示す。
細胞分離工程
　図６のタンパク質の製造装置において、培地を供給するための貯留槽（１０２）を備えた培養槽（１０１）は、当該培養槽で生産した細胞培養液を精製するため、細胞培養液を循環使用するための細胞分離機（１０３）と接続されている。細胞分離機においては細胞培養液から細胞のみが分離され培養槽（１０１）へ送られ、細胞が分離したタンパク質を含む細胞培養液はキャプチャリング工程に用いるモジュールＡの インラインミキサー（１０５）ヘ移送される。
キャプチャリング工程
キャプチャリング工程とは複数の精製手段を用いてタンパク質の製造を行う場合に、初期の精製工程を言う。
　細胞分離機（１０３）がモジュールＡのインラインミキサー（１０５）と接続され、かつモジュールＡのインラインミキサー（１０５）はプロテインＡ等吸着樹脂（Ａ）用貯留槽（１０４）とも接続されているため、前記細胞分離工程で細胞が分離した細胞培養液はインラインミキサー中で樹脂（Ａ）と混合され、細胞培養液中のタンパク質と樹脂（Ａ）が結合するため、細胞培養液とタンパク質と結合した樹脂（Ａ）とのスラリーを形成する。モジュールＡのインラインミキサー（１０５）の排出口はモジュールＡのサイクロン（１０６）の導入口と結合しているため、当該サイクロン中で細胞培養液とタンパク質と結合した樹脂（Ａ）のスラリーは分離され、細胞培養液は上部排出口から、タンパク質と結合した樹脂（Ａ）は下部排出口から排出される。モジュールＡのサイクロン（１０６）の下部排出口は、モジュールＢのインラインミキサー（１０８）と接続し、当該インラインミキサーは樹脂（Ａ）溶出液用貯留槽（１０４）とも接続しているため、モジュールＢのインラインミキサー（１０８）中で、タンパク質と結合した樹脂（Ａ）と溶出液は混合されタンパク質は樹脂（Ａ）から離脱する。当該インラインミキサーの排出口はモジュールＢのサイクロン（１０９）の導入口と接続されているため、モジュールＢのサイクロン（１０９）中でタンパク質と樹脂（Ａ）は分離され、タンパク質は当該サイクロン上部排出口から樹脂（Ａ）は下部排出口から排出される。タンパク質は配管（１１０）を介して次のポリッシング工程に用いるモジュールＤのインラインミキサー（１１１）に送られる。
一方、モジュールＢのサイクロン（１０９）の下部排出口はモジュールＣのインラインミキサー（１１６）と接続され、当該インラインミキサーは樹脂再生液貯留槽（１１７）とも接続されているため、モジュールＢのサイクロン（１０９）下部排出口から排出された樹脂（Ａ）はモジュールＣのインラインミキサー（１１６）中で再生液と混合され、当該インラインミキサーと接続しているモジュールＣのサイクロン（１１８）中で再生液と分離する。分離した樹脂ＡはモジュールＣのサイクロン下部排出口から配管（１１９）を介して樹脂（Ａ）用貯留槽（１０４）へ送られる。
ポリッシング工程
ポリッシング工程とは複数の精製手段を用いてタンパク質の製造を行う場合に、中期工程以降の精製工程を言う。
ポリッシング工程１
　モジュールＤのインラインミキサー（１１１）は配管（１１０）により前記キャプチャリング工程のモジュールＢのサイクロンおよびイオン交換樹脂等の樹脂（Ｂ）貯留槽（１２３）と接続しているため、キャプチャリング工程で得られたタンパク質と樹脂（Ｂ）は当該インラインミキサー中で混合され、タンパク質と結合した樹脂（Ｂ）のスラリーが形成される。モジュールＤのインラインミキサー（１１１）排出口はモジュールＤのサイクロン（１１２）の導入口と接続しているため、モジュールＤのサイクロン（１１２）中でタンパク質と結合した樹脂（Ｂ）のスラリーと残余の溶液は分離され、廃液は上部排出口からタンパク質と結合した樹脂（Ｂ）のスラリーは下部排出口から排出される。モジュールＤのサイクロン（１１２）下部排出口はモジュールＥのインラインミキサー（１２１）に接続し、当該インラインミキサーは樹脂（Ｂ）用溶出液貯留槽（１２４）とも接続しているため、当該インラインミキサー中でタンパク質と結合した樹脂（Ｂ）スラリーは溶出液と混合され、タンパク質は樹脂（Ｂ）と遊離する。モジュールＥのインラインミキサー（１２１）排出口とモジュールＥのサイクロン（１２２）の導入口とは接続しているため、当該サイクロン中でタンパク質と樹脂（Ｂ）は分離される。タンパク質はモジュールＥのサイクロン（１２２）の上部排出口から、樹脂（Ｂ）は下部排出口から排出される。タンパク質は配管（１１５）を介してポリッシング工程２を遂行するモジュールＥのインラインミキサーに移送される。当該サイクロン下部排出口から排出された樹脂（Ｂ）スラリーは配管（１２５）を介して樹脂（Ｂ）用貯留槽に移送され再利用される。
ポリッシング工程２
　モジュールＦのインラインミキサー（１１３）は配管（１１５）により前記ポリッシング工程１のモジュールＥのサイクロンおよび疎水性樹脂等の樹脂（Ｃ）貯留槽（１３３）と接続しているため、ポリッシング工程１で得られた粗精製タンパク質と樹脂（Ｃ）は当該インラインミキサー中で混合され、タンパク質と結合した樹脂（Ｃ）のスラリーが形成される。モジュールＦのインラインミキサー（１１３）の排出口はモジュールＦのサイクロン（１１４）の導入口と接続しているため、モジュールＦのサイクロン（１１４）中でタンパク質と結合した樹脂（Ｃ）のスラリーと残余の溶液は分離され、廃液は上部排出口から、タンパク質と結合した樹脂（Ｃ）のスラリーは下部排出口から排出される。モジュールＦのサイクロン（１１４）下部排出口はモジュールＧのインラインミキサー（１３１）に接続し、当該インラインミキサーは樹脂（Ｃ）用溶出液貯留槽（１３４）とも接続しているため、モジュールＧのインラインミキサー中でタンパク質と結合した樹脂（Ｃ）スラリーは溶出液と混合され、タンパク質は樹脂（Ｃ）と遊離する。モジュールＧのインラインミキサー（１３１）排出口とモジュールＧのサイクロン（１３２）の導入口とは接続しているため、当該サイクロン中でタンパク質と樹脂（Ｂ）は分離される。得られた精製タンパク質はモジュールＧのサイクロン（１３２）の上部排出口から配管（１２０）を介してウイルス濾過、ＵＦ／ＤＦ膜等の高度精製工程を経て精製タンパク質となる。モジュールＧのサイクロン（１３２）下部排出口から排出された樹脂（Ｃ）スラリーは配管（１３５）を介して樹脂（Ｃ）用貯留槽に移送され再利用される。
　なお、上記態様は本発明の位置態様であり、本発明はこれに限定されるものではなく、慣用的にタンパク質の精製に用いられている樹脂とその溶出、再生方法等を加えることも可能施ある。
　本発明では、このような装置の構成を採用することにより、高価な樹脂を繰り返し、再利用することも可能である。
実施例１
　図７は本発明のモジュールである。インラインミキサー（２０１、外径８ｍｍ、内径５ｍｍ、全長１４５ｍｍ、製品名　スタティックミキサーN４０－１７２－０、株式会社ノリタケカンパニーリミテッド製）の導入口に三方継手（２０２）を接続し、インラインミキサーで混合する2種類の流体が他の2つの継手を介して導入される。インラインミキサーの導出口は接続チューブ（２０３）を介してハイドロサイクロン（２０４、外径８ｍｍ、内径５ｍｍ、全長１９０ｍｍ、自作）の導入口に接続されている。サイクロン下部には分離したスラリーの排出用と洗浄液の排出用の2つの流路に接続可能な三方コック（２０５）が接続され、サイクロン上部の排出口には、液体の流量を調整する流量調整装置（２０６、エアーコントロールバスブ、シングルタイプ、アズージャパン社製）が装着されている。
実施例２
　図８は細胞分離ユニットを装着した反応モジュールである。細胞分離ユニットのハイドロサイクロン（３０１、外径１６ｍｍ、内径１３ｍｍ、全長１５０ｍｍ、ポリアクリル製、自作）は培養槽からの細胞培養液を注入するための導入口（３０２）が設けられており、下端には、細胞を再び培養槽に循環させるための導出口と廃液の導出口に切り替えられる三方継手（３０３）が接続されている。ハイドロサイクロン上部の導出口は接合部（３０４）を介して、反応モジュールへ培養上清液を移送するパイプ（３０５）と接続されている。反応モジュールのインラインミキサー（３０７、外径８ｍｍ、内径５ｍｍ、全長１４５ｍｍ、製品名　スタティックミキサーN４０－１７２－０、株式会社ノリタケカンパニーリミテッド製）はその導入口に三方継手（３０６）を接続し、インラインミキサーで混合する細胞上清液とゲルスラリーの2種類の流体が前記三方継手（３０６）を介して導入される。インラインミキサーの導出口は接続チューブ（３０８）を介してハイドロサイクロン（３０９、外径８ｍｍ、内径５ｍｍ、全長１９０ｍｍ、自作）の導入口に接続されている。ハイドロサイクロン下部には分離したスラリーの排出用と洗浄液の排出用の2つの流路に接続可能な三方継手（３１０）が接続され、サイクロン上部の排出口には、液体の流量を調整する流量調整装置（３１１、エアーコントロールバスブ、シングルタイプ、アズージャパン社製）が装着されている。
実施例３
　本実施例では、樹脂スラリー液からハイドロサイクロンにより樹脂を濃縮分離できることを確認した。図９はその時に用いたモジュールの模式図である。樹脂としては、平均粒径が５０μｍのシリカゲル（大阪ソーダ社）を用いた。その樹脂２５０ｍＬと溶媒（純水）７５０ｍＬとを混合することで２５％スラリー液を調整した。このスラリー液をポンプ（株式会社イワキ製モデルＲＤ－０５）を用いてハイドロサイクロンの導入口に注入し、一定時間の間にハイドロサイクロンの上部導出口、下部導出口から流出してくるスラリー液を回収し、それに含まれる、樹脂、および、溶媒（純水）の体積を測定することにより、樹脂の分離の度合いを確認した。実験の状況はビデオ撮影し、実験後にそれを解析して各作業にかかった時間を求めた。ハイドロサイクロンとしては、全長７５ｍｍ、および、１００ｍｍのものを用い、ポンプの強度を変えることにより流速を調整し、サイクロンのサイズや流速による分離の度合いの違いを確認した。分離の度合いはハイドロサイクロン下部排出口および上部排出口における樹脂および溶媒の流速と、樹脂の割合を指標とした。表１Ａに全長７５ｍｍのハイドロサイクロンの結果を、表１Ｂに全長１００ｍｍのハイドロサイクロンの結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　例えば、１００ｍｍのサイクロンに強度４で流した場合、1分間に下部導出口から０．７Ｌの樹脂と０．３Ｌの溶媒（純水）が流出し（樹脂の割合：７０%）、上部導出口からは０．０４Ｌの樹脂と３．３２Ｌの溶媒（純水）が流出していた（樹脂の割合：１．２%）。このように、樹脂を分離することが可能であり、流速が早く、大きいサイクロン（１００ｍｍ）の方が分離の度合いは良かった。
実施例４
　本実施例では、ハイドロサイクロンを２台連結し、上流の第１サイクロンの下部導出口から流出してくるスラリー液と、溶媒（純水）とを、エジェクター（旭有機材工業社製モデル：ＤＡＥＪＨ１８０１２）を介して混合し、それを下流の第２サイクロンに送り込んで、そこで樹脂の分離ができることを確認した。図１０はその時に用いたモジュールの模式図である。樹脂スラリー液としては、実施例３と同じく、シリカゲル（大阪ソーダ社）の２５％スラリー液を用いた。第1サイクロンに樹脂スラリーを供給するためのポンプの強度を最大に設定し、第2サイクロンに溶媒（純水）を供給するためのポンプの強度も最大に設定して送液を行い、一定時間の間に第2サイクロンの上部導出口、下部導出口から流出してくるスラリー液を回収し、それに含まれる、樹脂、および、溶媒（純水）の体積を測定することにより、樹脂の分離の度合いを確認した。実験の状況はビデオ撮影し、実験後にそれを解析して各作業にかかった時間を求めた。第１サイクロン上部排出液、第２サイクロン下部排出液、第２サイクロン上部排出液における樹脂の流速、溶媒の流速および樹脂の割合を算出しその結果を、表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
表２に示すように、第２サイクロンに樹脂が供給されていて、そこで樹脂が分離されていた。すなわち、１分間に下部導出口から０．５５Ｌの樹脂と０．６Ｌの溶媒（純水）が流出し（樹脂の割合：４７．９％）、上部導出口からは０．０２Ｌの樹脂と２．４９Ｌの溶媒（純水）が流出していた（樹脂の割合：１．０%）。なお、第１サイクロンからの流出液と溶媒との連結において、通常の三方継手を用いると、樹脂が下流の第２サイクロンに供給されない場合があるので、エジェクターを介することが望ましい。
実施例５
　本実施例では、抗体サンプル溶液と精製用クロマト樹脂をインラインミキサーで混ぜた後ハイドロサイクロンで樹脂を分離回収することにより抗体を回収できることを確認した。図１１はその時に用いたモジュールの模式図である。本実施例では、抗体サンプル液としてリン酸バッファーで希釈した抗体溶液（１ｍｇ／ｍＬ）、抗体精製用のクロマト樹脂としてプロテインＡを固定化したシリカゲル（平均粒径５０μｍ、大阪ソーダ社）を用いた。抗体サンプル液（１ｍｇ／ｍＬ：１Ｌ）と樹脂スラリー液（２５％樹脂：１Ｌ）は、三方継手で合流させた後、インラインミキサーに導入して十分にミキシングしてから分離用のハイドロサイクロンの導入口に流入するようにした。各溶液が定常的に流れるようになった後、ハイドロサイクロンの上部導出口、下部導出口から流出してくるスラリー液それぞれを、約１６秒間回収した。下部導出口から流出してくるスラリー液に関しては、流出後直ちにフィルター濾過により迅速に樹脂と溶媒（抗体サンプル液）とを分離し、樹脂のみを回収した。回収した樹脂をリン酸バッファー１００ｍＬにより2回洗浄した後、溶出バッファー（０．１Ｍグリシン塩酸、ｐＨ２．５）１００ｍＬを投入して吸着していた抗体を溶出した。この操作を７回繰り返し、溶出されてくる抗体を回収し、２８０ｎｍの吸光度を測定することにより抗体を定量した。実験の状況はビデオ撮影し、実験後にそれを解析して各作業にかかった時間を求めた。ただし、本実施例では、インラインミキサーとして、上部導出口を塞いだハイドロサイクロンを上下逆向きに設置したものを用いた。また、分離用ハイドロサイクロンの上部導出口にピンチコックをセットすることにより、上部導出口からの溶液の流出を抑制した。
　ハイドロサイクロン導入前のポンプによるスラリー溶液の流速、サイクロン下部排出口、上部排出口の樹脂の流速、溶液の流速、樹脂の割合を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　また、抗体の回収率、吸着量、抗体送液量および処理時間を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　結果は、表３および表４に示すように、分離用のハイドロサイクロンにより樹脂は分離されており、その樹脂から投入量の約６６％の抗体が回収されていた。
実施例６．
　本実施例では、図１１に示したモジュールを用いて、培養上清（抗体発現細胞培養液から細胞除去した上清）から抗体を精製できることを確認した。培養上清としては抗体濃度が１．１６ｍｇ／ｍＬの培養上清を、精製用のクロマト樹脂としては実施例５と同じプロテインＡ固定化シリカゲルを用いた。実験は実施例５と同様に行ったが、回収した樹脂の洗浄は、リン酸バッファー２００ｍＬにより５回行い、洗浄後の溶出は溶出バッファー２００ｍＬで５回行った。ハイドロサイクロン導入前のポンプによるスラリー溶液の流速、サイクロン下部排出口、上部排出口の樹脂の流速、溶液の流速、樹脂の割合を表５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　また、抗体の回収率、吸着量、抗体送液量および処理時間を表６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　結果は、実施例５と同様に分離用のハイドロサイクロンにより樹脂は分離されており、その樹脂から投入量の約６９．４％の抗体が回収されていた（表５、表６）。
実施例７．
　本実施例では、図１３に示したモジュールを用いて、培養液（抗体発現細胞を含む）から抗体を精製できることを確認した。培養液としては、抗体濃度が３．１５ｇ/Ｌ、細胞数が３４Ｘ１０６細胞/ｍＬの培養液を精製用のクロマト樹脂としては実施例５と同じプロテインＡ固定化シリカゲルを用いた。実験は実施例５と同様に行ったが、回収した樹脂の洗浄は、リン酸バッファー３００ｍＬにより１２回行い、洗浄後の溶出は溶出バッファー１００ｍＬで７回行い、回収定量した。ハイドロサイクロン導入前のポンプによるスラリー溶液の流速、サイクロン下部排出口、上部排出口の樹脂の流速、溶液の流速、樹脂の割合を表７に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　また、抗体の回収率、吸着量、抗体送液量および処理時間を表８に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　結果は、実施例５と同様に分離用のハイドロサイクロンにより樹脂は分離されており、その樹脂から投入量の約７８．４％の抗体が回収されていた（表７，８）。
　本発明によりタンパク質の連続製造に適し、メインテナンスフリーで、樹脂の再生効率を高めた、タンパク質とりわけバイオ医薬品製造装置に用いるモジュールが提供される。
１．培養槽、２．貯留槽、３．配管、４．配管、５．分岐バルブ、６．インラインミキサー、７．ハイドロサイクロン、８.配管、９．配管、１０.貯留槽、１１．配管、１２．分岐バルブ、１３．インラインミキサー、１４．ハイドロサイクロン、１５．配管、１６．配管、１７．貯留槽、１８．配管、１９．分岐バルブ、２０．インラインミキサー、２１．ハイドロサイクロン、２２．配管、２３．配管、２４．配管、２５．ハイドロサイクロン、２６．配管、２７．貯留槽、２８．配管、２９．分岐バルブ、３０．インラインミキサー、３１．ハイドロサイクロン、３２．配管、１０１．培養槽、１０２．貯留槽、１０３細胞分離機、１０４．貯留槽、１０５．インラインミキサー、１０６．ハイドロサイクロン、１０７．貯留槽、１０８．インラインミキサー、１０９．ハイドロサイクロン、１１０．配管、１１１．インラインミキサー、１１２．ハイドロサイクロン、１１３．インラインミキサー、１１４．ハイドロサイクロン、１１５．配管、１１６．インラインミキサー、１１７．貯留槽、１１８．ハイドロサイクロン、１１９．配管、１２０．配管、１２１．インラインミキサー、１２２．ハイドロサイクロン、１２３．貯留槽、１２４．貯留槽、１２５．配管、１３１．インラインミキサー、１３２．ハイドロサイクロン、１３３．貯留槽、１３４．貯留槽、１３５．配管、２０１．インラインミキサー、２０２．三方継手、２０３．接続チューブ、２０４．ハイドロサイクロン、２０５．三方コック、２０６．流量調整装置、３０１．ハイドロサイクロン、３０２．導入口、３０３．三方継手、３０４．接合部材、３０５．パイプ、３０６．三方継手、３０７．インラインミキサー、３０９．ハイドロサイクロン、３１０．三方継手、３１１．流量調整装置
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (25)

  1. 　インラインミキサーとサイクロンを結合したモジュールを用いて、タンパク質を細胞培養液から連続的に精製する装置であって、
    　(a) 第一のモジュール（A：反応モジュール）のインラインミキサー（６）の導入口に、培養槽（１）または細胞分離装置（D）と第一のモジュールとを結ぶ配管（３）と、第第一の貯留槽（２）と第一のモジュールとを結ぶ配管（４）が分岐バルブ（５）を介して接続され、前記インラインミキサー（６）の排出口はハイドロサイクロン（７）の導入口に接続され、ハイドロサイクロン（７）の下部排出口には、第一の反応モジュールと第二のモジュールを結ぶ配管（８）が結合し、ハイドロサイクロン（７）の上部排出口には配管（９）が結合している第一のモジュールと、
    　(b) 第二のモジュール（B：溶出モジュール）のインラインミキサー（１３）の導入口には、第一のモジュールと第二のモジュールを結ぶ配管（８）と、第二の貯留槽（１０）と第二のモジュールを結ぶ配管（１１）が分岐バルプ（１２）を介して接続され、前記インラインミキサー（１３）の排出口とハイドロサイクロン（１４）の導入口は接続され、ハイドロサイクロン下部の排出口には第二のモジュールと他のモジュールとを結ぶ配管（１５）が結合し、ハイドロサイクロン（１４）上部排出口には、配管（１６）が結合している第二のモジュールから構成される装置。
  2. 　他のモジュールが、第三のモジュール（C：再生モジュール）として、インラインミキサー（２０）の導入口に、第二のモジュール（B）と第三のモジュールを結ぶ配管（１５）と、第三の貯留槽（１７）と第三のモジュールを結ぶ配管（１８）とが分岐バルプ（１９）を介して接続され、前記インラインミキサー（２０）の排出口とハイドロサイクロン（２１）の導入口は接続され、ハイドロサイクロン（２１）の下部排出口には第三のモジュールと第一の貯留槽（２）とを結ぶ配管（２３）が結合し、ハイドロサイクロン（２１）の上部排出口には配管（２２）が結合している第三のモジュールである請求項１に記載の装置。
  3. 　細胞分離装置（D）が、培養槽（１）と細胞分離装置とを結ぶ配管（２４）がハイドロサイクロン（２５）の導入口と結合し、当該ハイドロサイクロン（２５）の下部排出口は細胞分離装置と培養槽（１）とを結ぶ配管（２６）と結合し、上部排出口は細胞培養装置と第一のモジュールとを結ぶ配管（３）から構成される細胞分離ユニットであることを特徴とする請求項１または２記載の装置。
  4. 　請求項１記載の第一のモジュール（A）と第二のモジュール（B）を結ぶ配管（８）の間に洗浄用の第四のモジュール（E：洗浄モジュール）を１または２個挿入することを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の装置。
  5. 　第四のモジュールが、第四のモジュール（E）のインラインミキサー（３０）の導入口には、第一のモジュールと第四のモジュールを結ぶ配管（８）と、第四の貯留槽（２７）と第四のモジュールを結ぶ配管（２８）が分岐バルプ（２９）を介して接続され、前記インラインミキサー（３０）の排出口とハイドロサイクロン（３１）の導入口は接続され、ハイドロサイクロン下部の排出口には第二のモジュールまたは新たな洗浄用モジュールへ接続する配管（８）が結合し、ハイドロサイクロン（３１）上部排出口には、洗浄液を排出口へ移送する配管（３２）が結合している請求項４に記載の装置。
  6. 　インラインミキサーとサイクロンを結合したモジュールを複数用いて、タンパク質を細胞培養液から連続的に製造する方法であって、
    (a)第一のモジュールのインラインミキサーへ、培養槽から移送されたタンパク質を含有する細胞培養液と第一の貯留槽から移送された樹脂を含むスラリーを混合し、細胞培養液中のタンパク質をスラリー中の樹脂と結合させ、タンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーを生成する工程、
    (b)前記第一のモジュールのインラインミキサーによる混合工程で得たタンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーを、サイクロンへ移送し、タンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーと細胞培養液に分離する工程、
    (c)前記第一のモジュールのサイクロンによる分離工程で得たタンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーを第二のモジュールに移送し、細胞培養液を第一の貯留槽へ移送する工程、
    (d)第二のモジュールのインラインミキサー中で、前記工程で得たタンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーと、第二の貯留槽から移送された溶出液を混合し、溶出用スラリーを生成する工程、および
    (e)前記第二のモジュールのインラインミキサーによる混合工程で得た溶出用スラリーをサイクロンへ移送し、タンパク質と、タンパク質と結合していない樹脂を含むスラリーに分離する工程を含む方法。
  7. 　請求項６に記載の工程bと工程cの間に、第三のモジュールを用いた洗浄工程を入れることを特徴とする方法。
  8. 　請求項７に記載の洗浄方法が、第三のモジュールのインラインミキサー中で、タンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーと、第四の貯留槽から移送された洗浄液を混合し、洗浄後の混合液をサイクロンに移送し分離する工程であることを特徴とする方法。
  9. 　第一のモジュールのインラインミキサーへ培養槽からタンパク質を含有する細胞培養液を移送する工程において、サイクロンを介して細胞とタンパク質を含有する細胞培養液とを分離し、分離した細胞は培養槽へ移送し、純化したタンパク質を含有する細胞培養液を、第一のモジュールのインラインミキサーに移送することを特徴とする請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　樹脂がアフィニティ樹脂であることを特徴とする請求項６～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　インラインミキサーとサイクロンを結合したモジュールを複数用いて、タンパク質を細胞培養液から連続的に精製する装置。
  12. 　請求項１記載の装置が、インラインミキサーにより細胞培養液と樹脂を含むスラリーを混合し、細胞培養液中のタンパク質をスラリー中の樹脂と結合させ、タンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーを生成させ、サイクロンにより樹脂を含んだスラリーと樹脂を含まない細胞培養液に分離する機能を持つ反応モジュールと、タンパク質と結合した樹脂を含むスラリーと溶出液をインラインミキサーにて混合し、ハイドロサイクロンによりタンパク質と樹脂スラリーに分離する溶出モジュールから構成される装置。
  13. 　培養槽から流出するタンパク質を含む細胞培養液中に存在する細胞をハイドロサイクロンにより分離し、採取された細胞を培養槽へ移送し、当該細胞を除いたタンパク質を含む細胞培養液を、次の精製手段に移送する細胞分離装置を装着した請求項１１または１２に記載の装置。
  14. 　タンパク質と結合した樹脂を含むスラリーと洗浄液をインラインミキサーにて混合し、サイクロンによりタンパク質と結合した樹脂を含むスラリーと廃液に分離する洗浄モジュールを装着した請求項１１～１３のいずれか１項に記載の装置。
  15. 　反応モジュールと溶出モジュールを組み合わせた請求項１２～１４のいずれか１項に記載の装置において、当該装置の溶出モジュールで排出する樹脂スラリーを反応モジュールまたは樹脂スラリーの貯留槽に移送して、樹脂スラリーのサイクル利用を可能にした装置。
  16. 　請求項１１～１５のいずれか１項に記載の装置を用いたタンパク質の製造方法。
  17. 　インラインミキサーとサイクロンを結合したモジュールを用いて、タンパク質を細胞培養液から連続的に精製する装置であって、
    　タンパク質を含有する細胞培養液と樹脂を含むスラリーを混合して前記タンパク質が前記樹脂に結合されたスラリーを生成する第一のモジュール（反応モジュール）と、
    　該第一のモジュールにより精製されたスラリーと溶出液とを混合して、前記スラリーから前記タンパク質を溶出する第二のモジュール（溶出モジュール）と、
    を有することを特徴とするタンパク質精製装置。
  18. 　前記第二のモジュールで前記タンパク質が分離したスラリーと再生液とを混合して樹脂を含む再生樹脂スラリーを生成する第三のモジュール（再生モジュール）とを有することを特徴とする請求項１７に記載のタンパク質精製装置。
  19. 　培養槽から供給される細胞培養液から細胞を分離して前記第一のモジュールに前記タンパク質を含有する細胞培養液を供給する細胞分離モジュールを有することを特徴とする請求項１７に記載のタンパク質精製装置。
  20. 　前記第一のモジュールと前記第二のモジュールとの間に介在されて、前記第一のモジュールにより生成されたタンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーと洗浄液を混合して、タンパク質と結合した樹脂スラリーを洗浄する第四のモジュール（洗浄モジュール）を有することを特徴とする請求項１７記載のタンパク質精製装置。
  21. 　前記第一のモジュールは、細胞培養液と樹脂を含むスラリーを混合し、細胞培養液中のタンパク質をスラリー中の樹脂と結合させ、タンパク質と結合した樹脂を含んだスラリーを生成させる第一のインラインミキサーと、樹脂を含んだスラリーと樹脂を含まない細胞培養液に分離する第一のハイドロサイクロンとを有することを特徴とする請求項１７記載のタンパク質精製装置。
  22. 　前記第二のモジュールは、タンパク質と結合した樹脂を含むスラリーと溶出液を混合する第二のインラインミキサーと、タンパク質と樹脂スラリーに分離する第二のハイドロサイクロンとを有することを特徴とする請求項１７に記載のタンパク質精製装置。
  23. 　前記樹脂を含むスラリーを貯留する貯留槽を備え、
    前記第三のモジュールは、前記再生樹脂スラリーを前記貯留槽に移送することを特徴とする請求項１８記載のタンパク質精製装置。
  24. 　前記細胞分離モジュールは、培養槽から流出するタンパク質を含む細胞培養液中に存在する細胞を分離して、採取された細胞を培養槽へ移送し、当該細胞を除いたタンパク質を含む細胞培養液を前記第一のモジュールに移送するハイドロサイクロンを有することを特徴とする請求項１９記載の装置。
  25. 　前記第四のモジュールは、前記タンパク質と結合した樹脂を含むスラリーと前記洗浄液を混合する第四のインラインミキサーと、タンパク質と結合した樹脂を含むスラリーと廃液に分離する第四のハイドロサイクロンとを有することを特徴とする請求項２０に記載の装置。
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