JPH07502508A

JPH07502508A - 非対合システイン残基を有するサイトカイン及びその結合体

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Publication number: JPH07502508A
Application number: JP5511163A
Authority: JP
Inventors: チャン　ツェ　ウェン
Original assignee: タノックス　バイオシステムズ　インコーポレイテッド
Priority date: 1991-12-10
Filing date: 1992-12-10
Publication date: 1995-03-16
Anticipated expiration: 2013-01-26
Also published as: JP2704214B2; EP0618927A1; AU666914B2; CA2124672A1; AU3323593A; WO1993012142A1; EP0618927A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】非対合システィン残基を有するサイトカイン及びその結合体発明の分野本発明は、レセプター結合部位より離れた位置に１つの非対合システィン残基を有するように部位特異的に修飾されたサイトカインおよびその結合体、特に非対合システィン残基に親油基が結合している結合体と、ネイティブの状態でレセプター結合部位から離れた位置に非対合システィン残基を有するサイトカインの結合体に関する。

発明の背景サイトカインは、機能的に関連する隣接細胞の増殖、成熟、あるいは活性を促進あるいは抑制することにより細胞に作用し、細胞の増殖、成熟、活性を調節している。サイトカインはリンパ球、マクロファージ、線維芽細胞、神経細胞、あるいは他の種類の細胞により生成、分泌される。

サイトカインの１ｎｖｉｖｏ（生体内）研究により、サイトカインは一般的に非常に低濃度で作用する潜在的因子であることが示されている。各サイトカインには多くの異なる作用があり（多面作用）、機能的関連のある複数の種類の細胞に局所的に作用する。例えば組織の修復や炎症、あるいは免疫応答の部位では、一般的に調節過程のループに関与している。サイトカインは標的細胞の成熟および活性を調節しているだけではなく、サイトカインそのものの産生もある特定の局所的因子によって調節されている。例えば免疫原が投与された部位の微小環境では、マクロファージが活性化しインターロイキン１　（ＩＬ−１）の分泌を誘発する。　ＩＬ−１は隣接する抗原特異的Ｔ細胞を活性化させる。次に活性化Ｔ細胞がインターロイキン２　（ＩＬ−２）を分泌し、ＩＬ−２がこの活性化Ｔ細胞に自己分泌として作用し、活性化Ｔ細胞はまたγ−インターフェロン（ＩＦＮ− γ）を分泌し、ＩＦＮ−γがさらにマクロファージおよびＢ細胞増殖因子を活性化し、Ｂ細胞増殖因子が隣接する抗原特異的Ｂ細胞を活性化する。

サイトカインの局所的機能を、内分泌系のホルモンと対比してみよう。ホルモンは局所的な組織や臓器によって生成され、血液循環により搬送され、全身の組織あるいは臓器に作用するか、あるいは体の異なる部分にある組織や臓器に作用する。

サイトカインは一般的に小さなタンパク質であり、産生は少量である。感度の良い免疫化学的手法を用いても循環内のサイトカインは検出されない。サイトカインは標的細胞のレセプターに対する親和性が非常に高く、標的細胞表面の少数のレセプターに結合するだけで次の生物学的事象を誘発する。

多数のサイトカインが同定されてお、す、また遺伝子のクローニングが行われ、各種の系で発現されている。組換体サイトカインの生成および精製が行われ、治療を目的として、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　（生体外）および１ｎｖｉｖｏ（生体内）で様々に応用されている。特定の組み替えサイトカインは、治療を目的として、米国食品医薬品局や他国の管轄機関によって認可されている。例えば、エリスロボエチン（ＥＰ□）は腎透析を受けている患者の赤血球数を増加させるために、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣ３Ｆ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣ８Ｆ）は化学療法および放射線治療を受けている癌患者の顆粒球数を増加させるために、ＩＬ−２は特定の癌患者の免疫を促進するために、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）は特定のウィルス感染（例、Ｃ型肝炎）あるいは特定の癌の患者のために認可されている。

ＥＰＯおよび上記のコロニー刺激因子（造血増殖因子としてまとめられる）のような血液循環あるいは骨髄内の細胞を標的とするサイトカインは、リンパ節あるいは他の組織を標的とするサイトカインよりも、安全であり効力も高い（あるいは、少なくとも開発が容易である）。ＩＬ−２、ＩＬ−１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＦＮ−α、およびＩＦＮ−γのような多くのサイトカインが全身投与された場合に非常に有毒であることが、ヒトを対象とした多くのｉｎ　ｖｉｖｏ臨床試験により示されている。さらに、大きさが小さいことが部分的な原因となって、サイトカインは薬理学的半減期が非常に短く、ご（早期に循環系から除去されてしまう。

血液循環内の細胞を標的としないサイトカインは全身投与された場合、生体内におけるように、短距離でのあるいは局所的な作用、あるいは組織の微小環境での作用を標的細胞に与えることができないために、有毒であると思われる。サイトカインは全身投与により、標的部位に留まるよりは、循環系およびあらゆる部位に拡散してしまう。

数種類のサイトカインは、局所的な疾患の治療を目的として研究されており、現在も研究が継続しているものがある。上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）　、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）が、事故や手術による損傷の治癒を促進するために研究され、臨床試験が行われた。このようなサイトカインには、胃潰瘍の治療に研究されているものもある。

サイトカインおよび治療用酵素が局部に搬送され、適切な期間標的部位に十分な濃度で保持されるならば、治療効果はさらに上がると思われる。また、サイトカインの全身投与に併発する有毒作用が回避されるため、疾患組織部位に高用量のサイトカインを投与することが可能になる。サイトカインの局所的投与の適用例として、ＴＮＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、あるいはＩＩ、−２による固形癌の治療が考えられる。を椎の損傷部位は、神経増殖因子（ＮＧＦ）あるいは繊毛神経栄養因子ｃｃＮＴＦ）による治療か可能となるであろう。口、鼻、眼の外部器か、あるいは外部生殖器、足指、皮膚の一部のみなど、微生物感染が局所的な組織に留まっている場合は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、あるいはＩＩ、−２をこのような組織に投与すると効果的であると思われる。手術後は損傷組織部分にＰＤＧＦＳＥＧＦＳＦＧＦ、あるいはＩＧＦを局所的に投与すると治癒が促進されると考えられる。アレルギー反応あるいは感染による鼻腔内面の炎症も、アレルギー治療剤あるいは抗生物質にＥＧＦ、ＦＧＦ、あるいはＩＧＦを併用することで治癒されると思われる。歯列矯正手術による歯肉の損傷は、ＥＧＦあるいはＩＧＦにより治療できると思われる。ＥＧＦあるいはＩＧＦはまた眼科手術や損傷により生じた眼の外傷を治療するのに用いられると考えられる。禿も、ＥＧＦあるいはＩＧＦを脱毛部位に皮下投与することで発毛を促進できると思われる。

サイトカインの脂肪アシル化によりサイトカインが局部に保持され、全身投与に併発する毒性を回避することができると考えられる。またサイトカインを十分な期間局所に保持することで、治療効果を上げることもできる。脂肪酸により人工的にアシル化されたタンパク質は、細胞形質膜に対する親和性が増大することがわかっている。例えばリシンＡ鎖（有毒物質である）は、脂肪酸により修飾され複合体となると、各種の細胞に対する非特異的細胞毒性が顕著に増大した。Ｋａｂａｎｏｖ、＾Ｊ、ｅｔ　ｅｌ、Ｂｉｏｍｅｄ、Ｓｃｉ、１：３３（１９９０）。サイトヵインの中で、ＴＮＦは脂肪アシル化されることによりリポソームへの組み込み能が促進された。Ｕｔｓｕｍｉ、ｅｔ、　ａｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　５１：３３６２（１９９１）　、このリポソームが患者に静脈投与されることにより、ＴＮＦが細網内皮系細胞に搬送される。脂肪族アシル基の結合は、ＴＮＦポリペプチド鎖のリジン残基のεアミノ基と、あるいは第１アミノ酸残基の α−アミノ基と、脂肪酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとをカップリングすることにより行われる。ＴＮＦポリペプチド鎖は１つあたり６つのりジン残基を有するため、最終的に、１分子あたりの脂肪基の数と脂肪酸がどの特定のりジン残基と結合するかにより、各種のものが生成される。

生タンパク質の中には、翻訳後ｉｎ　ｖｉｖｏで脂肪族アシル基の共有結合により修飾されるものかあることが知られている。脂肪酸とタンパク質との結合様式は２つに分けることができる。Ｗｉｌｃｏｘ、　Ｃ，＾、および０１ｓｏｎ、　Ｅ、　Ｎ、ｈ匹崩畦牡■　２６：　１０２９（１９８７）。第１のアシル化タンパク質は、脂肪酸が〇−エステルあるいは千オール（ＳＨ）エステル結合によりポリペプチドに結合しているものである。このようなアシル化タンパク質は細胞膜に局在し、おもに１６個の炭素残基を有する飽和脂肪酸であるパルミチン酸によりアシル化されている。

第２のアシル化タンパク質は、脂肪酸とポリペプチドがアミド結合により結合しているものである。このようなタンパク質は、１４個の炭素残基を有する飽和脂肪酸であるミリスチン酸がアミノ末端のグリシン残基に結合することにより、アシル化されている。パルミチン酸アシル化タンパク質と対照的に、このミリスチン酸含有タンパク質は溶解性でしかも膜結合性である。

サイトカインの中には、ネイティブのアシル化パルミチル−ＩＬ−１が発見されている。このｌ−１アイソフオームは単球およびマクロファージの表面の膜に結合する。Ｂａｃｏｕｃｈｅ、Ｏ，ｅｔ　ａｌ、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７：２１６４（１９９１）　ｏ　ｃｉｓ−ゴルジ体および小胞体の変性要素内で、アシル化されるタンパク質の特徴的な構造を酵素が認識し、０−エステルおよびＳ −エステルの脂肪族アシル基への結合が酵素的に行われる。アシル化されるのはＩＬ−１全体のご（一部だけであり、多数のセリン残基のＯＨ基の内のただ１つ、あるいは多数のンスティン残基のＳＨ基の内のただ１つがパルミチン酸と結合する。

従って、従来の化学合成法によるリシンＡ鎖およびＴＮＦの脂肪アシル化は、サイトカインを実際にアシル化し同性複合集合体の形成を促進することが困難である。もう１つの困難な点は、サイトヵインの結合部位が脂肪族アシル化されないことを確保することである。なぜなら、このようなアシル化が起きれば結合及び／又は生物学的活性か阻害又は抑制される虞があるからである。

発明の概要本発明は、レセプター結合部位から離れた位置に１つの非対合システィン残基を有するように部位特異的に変異されたサイトカインを包含する。さらに詳細には、サイトカイン分子が、レセプター結合部位から離れた部位に対合しないシスティン残基を生じるように、ＤＮＡ組換え技術によって部位特異的に変異されている。これは、例えば、レセプター結合部位から離れた部位にある他のアミノ酸残基、例えばセリンを非対合システィンで置換することによって達成することができる。性質修飾基と結合することができる、レセプター結合部位から離れた位置にある非対合システィン残基を含むサイトカインを、その非対合残基が本来存在するものか又は部位特異的変異によって導入されたものかを問わず、ＡＵＣサイトカイン（ＡＵＣは［アロステリック非対合システィン（ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ　ｕｎｐａｉｒｅｄ　ｃｙｓｔｅｉｎ）Ｊ　ト呼フ。

本発明は、さらにこのようなＡＵＧサイトカインの部位特異的親油化をも包含する。親油化は親油性（脂質に対する親和性）を増大させ、得られる物質が細胞膜に結合し又は標的部位に局在化することを助け、それによって排除速度を減少させる。親油化サイトカインは、投与部位にある細胞に結合することができ、それによって血管内スペース又は粘膜液中に拡散する速度が減少し、そのため親油化サイトカインは、標的部位により長期間維持される。しかしながら、親油化サイトカインの生物学的活性及び結合性は、ネイティブの形態のものと実質的に同一である。

本発明の１つの好ましい態様は、１つの脂肪族アシル基に共有結合により結合されることによって親油化されたサイトカインを含む。好ましい脂肪族アシル基の炭素長は６〜１８である。

本発明はさらに、抗体又は他の型の結合性分子、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、蛍光物質又はビオチンに結合されたＡＵＧサイトカインを包含する。このような複合物は細胞性のサイトカインレセプター分析のために試薬として有用である。ＩＬ−２、ＩＬ−２及びＥＧＦのようなＡＵＧサイトカインは、また、それぞれのレセプターを高密度に発現する腫瘍細胞を標的にするために、リシンＡ鎖又はシュードモナス外毒素のような細胞毒と結合することができる。

本発明は、さらに、親油サイトカイン又は上述した他のサイトカイン結合体の医薬組成物を包含する。医薬組成物は、適当なアジュバント、希釈剤及び溶剤を包含する。

発明の詳細な説明Ａ、　に　なサイ　カイン　びそのための　゛　る　・上述のように、多数のネイティブの（修飾されていない）サイトカインが、局所的な疾病部位を治療するために研究され、開発されている。これらと同じサイトカイン（ＥＧＦＳＦＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦＳ　Ｉ　ＦＮ−α、Ｉ　ＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ −１、ＮＧＦ及びＣＮＴＦ）を本発明の方法により親油化し、それらを上記治療にふされしくすることができる。吸入により接種することができ、ｃｙｓｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ患者のａｌｖｅｏｌａｒ　ｍｕｃｕｓ中のＤＮＡを溶解するために有用かもしれないＤＮＡａｓｅのようなある種の酵素、および、骨関節炎患者の炎症関節に投与することができるスーパーオキサイドディスムターゼもまた、本発明の方法により親油化し、このような治療にふされしくすることができる。これらのサイトカインの全ては比較的小さなタンパク質であり、これらを発現するヒト遺伝子もクローン化され、特徴づけられ、宿主細胞中で発現されている。従って、組換えサイトカインは部位特異的変異に適当な量、容易に生産することができ、親油化は容易である。

親油性物質は、脂肪酸基及び親油性の非帯電ペプチドを包含する多くのものであり得る。親油性基は、非免疫原性、非抗原性で、生物学的活性又はレセプター結合に影響するほど大きくないものであるべきである。さらに、上述のように、サイトカインは、親油性物質ではなく、抗体又は他の型の結合性分子、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、蛍光物質、ビオチン及びサイトカイン分子を包含する他の化学修飾基と結合することもできる。

好ましい親油性生成物は脂肪族アシル基に結合されたものである。脂肪　基の長さは最終生成物の親油性を決定し、サイトカイン自体の親油性は、細胞性原形質膜及び細胞該空間の間の平衡／分布を決定する。目的とする用途のための最終生成物の最適の薬理動態的性質を与える脂肪族アシル基を、広範囲な炭素長（６，８，１０，１２，１４，１６及び１８）の脂肪族アシル基から選択することができる。

一般的に、脂肪族アシル基が長くなるほど親油性は大きくなる。親油性が太き（なるほど、最終生成物をより限定された領域に分配することができ、拡散がより少なく、そして投与の部位により長く留まる。１６又は１８炭素長のアンル基と結合したサイトカインは細胞の原形質膜によく結合し、拡散性が低い。もっとも、親油性は必ずしも大きいほど好ましいということではない。なぜなら、最大のレセプター結合及び生物学的効果を達成するためにはある程度の溶解性及び拡散性が要求されるからである。典型的なサイトカインに対して最適の薬理動態を与える脂肪族アシル基は、飽和、直鎖状の炭素数８〜１４のものである。

Ｂ　に　したサイトカイノ　びそのための　−サイトカインは、次の性質の１つまたはそれ以上を有するならば、ヒト臨床試験の結果に基づき、全身投与よりも局所投与の方が適している。

（１）その物質が静脈注射又は一般的な全身経路で投与した場合に非常に有毒である。

（２）その物質の排除速度が大きい、すなわち、血清中半減期が３〜４時間未満である。

（３）その物質を全身投与した場合、標的疾病に対する治療効果が小さい。

（４）その物質によって標的とされる、疾病部位が、局所的な非全身的投与によって物質の分配が容易になるように適切に局在化している。例えば、非転移固形腫瘍又は眼感染症は適切に局在化している例であるが、骨髄中の赤血球産生は、解剖学的及び組織学的に局在化しているが、適切に局在化している例ではない。

サイトカインの親油化は、ネイティブのサイトヵインよりも細胞の原形質膜に対する親和性が高い生成物を与え、それによって、ネイティブの物質よりも標的部位に長く留まる親油化生成物を与える。親油化された物質は、細胞に結合されたまま長く留まり、迅速に毛管内に拡散して血流によって運び去られるということがない。同様に、親油化生成物を粘膜表面に投与した場合には、それは細胞に結合することができ、粘膜液によって迅速に洗い流されることを避けることができる。

Ｃ親油化ヱイ上皇イン茸よる′　に　しこ　びその多くの疾病及び症状を親油化サイトカインの局所的投与により治療することができる。疾病状況が適切に局在化し、分配された薬剤が疾病組織と接触し得るならば、親油化サイトカインの局所的投与が望ましい。なぜなら、全身投与に関連する毒性をもたらすことなく比較的大量に投与できるからである。投与方法は、薬剤を病的組織の全てに分配できるものであるべきである。少Ｉの治療溶液を、組織の単位体積当たり多数の箇所に注射する、「高密度」注射が投与の好ましい聾様である。例えば、１ｍｌの固形組織中の１０箇所に１０μｍの治療溶液を注射することが、典型的な投与のプロトコールである。

固形腫瘍は親油化サイトカインによる治療に適した症状の例である。親油化１ＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−１又は［、−２を固形腫瘍部位に直接注射することができる。この治療は、腫瘍が転移していない場合又はわずかに転移しているだけの場合に特に魅力的である。この直接注射は、腫瘍部位により直接的に接触できるようにするために、外科手術と組合せて行うこともできる。切開部位の付近へのこのような注射はまた、残存する腫瘍細胞の破壊を助けるための最適な免疫応答を確保する。感染した角膜、鼻粘膜、表層外傷及び禿皮膚のように、影響を受けた組織が表層的か非常に薄いか又は露出している場合には、親油化サイトカインの局所投与が有効であり得る。

病巣及び性器イボは親油化ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β又はＩＦＮ−γの直接注射により治療することができる。ここでもまた、直接注射により疾病部位との直接的な接触がもたらされる。を髄損傷は親油化ＮＧＦ又はＣＮＴＦの直接注射で治療することができる。親油化スーパーオキサイドディスムターゼは骨関節炎患者の炎症関節に投与することができる。

インフルエンザ、細菌性、ウィルス性又は寄生虫性肺炎のような、肺に影響を与える感染症は、親油化ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β又はＩＦＮ−γの吸入により治療することができる。嚢胞性線維症においては、親油化ＤＮａｓｅは吸入により接種することができる。ＤＮａｓｅは肺胞粘膜中のＤＮＡを溶解する二とができ、従って該粘膜液の粘度を下げることができる。好ましい吸入装置は、鳳った量を投与することを確保できる、目盛り付き計量吸入器である。

膣、直腸、口、のど、鼻の中、目及び／又は耳の局所的なウィルス性、細菌性又は酵母性感染症は、好ましくは滴下器具又は噴霧器具を用いて粘膜表面に親油化ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β又はＩＦＮ−γを投与することにより治療することができる。親油化ＥＦＧ、ＦＧＦ又はＩＧＦをこのように局所投与することは、傷又は外科的切開又は病巣の治癒をはやめることに効果的であり得る。

禿を治療し又は髪の生長を促進するために、親油化ＥＧＦＳＦＧＦ又はＩＧＦを皮膚内注射、皮下注射又は局所的塗布により投与することができる。

Ｄ、ＡＵＧサイトカインの量　り結合上述のように、サイトカインに脂肪族アンル基に結合する方法として数種類の方法を採用することができる。活性な結合基を有するように修飾された脂肪族アンル基として脂肪酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを挙げることができ、これはＬａｐｉｄｏｔ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ、　８：１４２　（１９７６）に記載の方法により構成することができる。これらの活性なエステルのいくつかは、例えば、シグマ・ケミカル社（ミズリー州セントルイス）やマトレヤ社（ペンシルへニア州プレザントギャノプ）から市販もされており、これらの市販品を用いることもできる。

脂肪酸のＮ−ヒトロキシスクシンイミドエステルのサイトカインへの結合は、Ｕｔｓｕｍｉ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　５１：３３６２　（１９９１）に記載された方法により行うことができる。この論文はまた、修飾タンパク質１分子当たりの脂肪族アシル基の数を滴定する方法も記載している。上述のように、サイトカイ２１分子当たり１つだけ脂肪族アシル基が結合していることが好ましい。この好ましい化学量論量は、結合反応における反応物質の比率を制御することにより達成することができる。１分子当たり１つの脂肪族アシル基を有する親油化サイトカインは、ルーチンな操作により精製することができる。

脂肪族アシル基がサイトカイン上のリンン残基のε−アミノ基を介して結合している場合には、サイトカイン上の特定のりジン残基のε−アミノ基に１つの脂肪族アシル基を結合することを確保することができない。従って、最終的な親油化サイトカインは、サイトカイン分子当たりの脂肪族アンル基の数及び位置が異なる異種混合物となるであろう。このような結合体では、修飾サイトカイン分子のあるものはレセプター結合活性を喪失しているであろう。なぜなら、脂肪族アンル基はサイトカインのレセプター結合部位の近傍のアミノ酸基と結合するかもしれないからである。さらに、このような異種混合物の結合体は、脂肪族アシル基によって修飾された部位の免疫原性を高める可能性がある。従って、結合の好ましい方法は、親油基がサイトカイン分子上の他の位置ではなく、特定の位置に部位特異的に結合できるように、先ずサイトカインを部位特異的に修飾することである。

本発明の親油化サイトカインを構築するために、組換えＤＮＡ法により、サイトカイン遺伝子を部位特異的に変異化する。この際、サイトカインのレセプター結合又は生物学的活性が阻害されないように、変異化されたサイトカインが、レセプター結合部位から十分に離れた位置に対合していないシスティン残基を有するように変異化する。

一般的に、ネイティブサイトカイン分子は単鎖ポリペプチドであり、偶数のシスティン残基を含む。これらのシスティン残基は、一対のシスティン残基の間でジスルフィド結合を形成する。システィン残基の特定の対合はポリペプチド鎖の３次元的な折りたたみによって決定され、これはポリペプチドの配列によって決定される。ジスルフィド結合は通常タンパク質分子の表面に露出しておらず、その機能は、細胞質の外側に存在する比較的厳しい種々の条件に耐え得る堅固な構造にタンパク質を維持することにある。サイトカインのように分泌されるタンパク質はジスルフィド結合を有するが、細胞質内又は原形質膜の内表面上に維持されるタンパク質はジスルフィド結合を持たない。

システィン残基はサイトカインの特定の部位に導入することができ、それによって脂肪族アシル基と結合する部位を与えることができる。この残基をどの位置に入れるかを選択する基準は以下の通りである。

（１）この置換によりサイトカイン分子の三次元的な折りたたみに影響がないこと（２）この残基は、レセプター結合部位から離れているべきである。

（３）この残基はタンパク質分子の表面に存在し７、脂肪族アシル基と接触できるべきである。

一般に、高度に親水性のペプチド領域中又はその近傍のセリン残基をシスティン残基で置換することが最も好ましい。システィン及びセリン残基は構造的に高度に相同的である。親水性ペプチド領域の近傍又はその中にあるというごとにより、この残基がタンパク質分子の表面上に存在し、従って置換後に化学的結合に付すことができることか確保される。置換することができる他の残基は、親水性のペプチド領域の中又は近傍に位置することを条件として、アスパラギン、グルタミン、ヂロンン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸のような極性のある又は帯電したものである。

はとんどのサイトカイン分子についてＸ線結晶学的な三次元構造が決定されていないので、あるアミノ酸残基が特定のサイトカインのレセプター結合部位の中又はその近傍にあるのか否かを予測することはできない。この決定を行い置換すべき適当な残基を特定する方法は、特定の残基をシスティンで置換し、親油化後、置換生成物のレセプター結合又は生物活性が影響を受けるか否かを系統的に決定することを含む。

ＡＵＣサイトカインを得る段階的な方法は次のとおりである。

（１）配列決定第１段階はアミノ酸配列を決定することである。はとんどのサイトカインの配列は文献に記載されており、配列を決定することは不要である。歪の他のものについては、配列決定は、サイトカインのｍ　Ｒ，Ｎ　ＡのｃＤＮＡクローンのヌクレオヂト配列を決定することにより行うことができる。推定アミノ酸配列は、Ｎ −末端アミノ酸配列分析及びサイトカインタンパク質の分子量決定から確認することができる。

（ｉｉ）親水性分析次の段階はサイトカインボリペプチドの親水性を分析することである。−次アミノ酸配列に関して定量的な数字で親水性をプロットする数種類のソフトウェアプログラムが入手可能であり、用いることができる。このようなコンピュータープログラムの１つはＨｏｐｐ、ｒ、ｐ及びＷｃｘｘｌ、　Ｋ、Ｒ，によって開発され、ＭＯＬ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２０：４８３　（１，９８３）に記載されている。カリフォルニア州パロアルトのベックマン・インストルーメンツ社より販売されているＭｉｃｒｏＧｅｎｉｅ配列分析パッケージは親水性プロットを行うためのソフトウェアプログラムを与える。

（ｉｉｉ）伝補戊基二回定次の段階はポリペプチド鎖中の親水性領域を同定し、システィン残基で置換するのに最も適当な、親水性領域の中又は近傍中の残基を同定することである。置換に適した残基はセリン残基である。もっとも、セリン残基が利用できない場合又は適当でない場合には、ヒスチジン、チロシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、ヒスチジン、アスパラギン又はグルタミン残基をセリン残基に代えて選択することができる。１分子当たり１つだけ置換した変異体でも、多数の変異体（１０種類もの）が得られる。最終的には、下記に記載する方法により、変異体をスクリーニングし、どの置換が結合部位から離れているかを決定する。

（ｉｖ）遣正王金成次の段階はネイティブ及び変異遺伝子を合成することである。ネイティブのサイトカイン遺伝子を構築するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることができる。サイトカインのｍＲＮＡの５°及び３′末端に対応し、適切なりローニング配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いることができる。先ず、活性化リンパ球、白血球、繊維が細胞又は特定のサイトカインを生産する他のセルラインからＲＮＡを調製し、これからｃＤＮＡをクローニングする。クローニングされたｃＤＮＡは、配列を確認した後、ｐＵｃ１９のようなプラスミドに挿入し、次の操作に付す。部位特異的変異のためのルーチンな実験室的方法は、置換すべきセリン（又は他の）残基のトリブレットコドンに代えてシスティン残基のトリプレットコドンを含む約２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーを合成することから始める。変異が組み込まれたこれらのプライマーは、部位特異的変異を有する完全長ＤＮＡ遺伝子の合成を可能にする。１つの便利な方法がＫｕｎｋｅｌ、　Ｔ、Ａ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８２：４８８（１９８５）によ■ 開発された。試薬を用いる段階的プロトコールは、Ｋｕｎｋｅｌ、　Ｔ、Ａ、によりＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｌｏｇｙ、　５ｕｐｐ、　６　＠　８．２．　Ｉ、　Ｆ、ｄｓ、　Ａｕ５ｕｂｃｌ、 @Ｆ、Ｍ、　ｅｔａｌ、　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ９（＋９９０）に記載されている。クローン化ＤＮＡ中に点突然変異を導入するためのＰＣＲ法もまた多くの分子生物学の研究室でルーチンに用いられティる。段階的な操作方法がＣｏｒｍａｃｋ、Ｂ、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｎｇｙ、　５ｕｐｐ、　＋５　’ａ　８．５．ｌ　Ｅｄｓ、＾ｕｓｕｂｅ１．　Ｆ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｗｉｌｅｙ　hｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ　（１９９１）に記載されている。

ネイティブ遺伝子及び変異体の全ファミリーを構築する好ましい方法はＤＮＡ合成機を用いて完全な遺伝子を合成することである。ポンチイブ及びネガティブ鎖から、３′末端が隣接するオリゴヌクレオチドと相補的な、重複する６０〜８０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを例えばアプライド・バイオシステム社から市販されている市販のＤＮＡ合成機の１つで合成することができる。オリゴヌクレオチドは、鋳型とプライマーの両方を与え（相互プライムド合成）、単一の工程で所望の配列が生じる。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼで伸長を行った後、セグメントをリガーゼで結合する。遺伝子の両端にあるオリゴヌクレオチドは、合成した遺伝子を適当な発現ベクター中に挿入できるように、制限酵素部位を含むように適切に設計されている。調製すべき試薬及び段階毎の操作方法は、Ｍｏｏｒｅ、　Ｄ、ＤＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　１Ｊｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　５ｕｐｐ、Ｎ　１１．２．８．　Ｅｄｓ、　ＡｕTｕｂｅｌ。

Ｆ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｙｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ　（１９９０）に記載されている。この方法によれば、種々の変異体を構築するのに必要な、多数の部位特異的変異体の構築が容易であり、また、一般的にサイトカインの遺伝子は６００ヌクレオチド未満と比較的小さいので、この方法は魅力的である。特定の変異を有する１つのオリゴヌクレオチド以外の全てのオリゴヌクレオチドは、個々の構築物を構築する際に共用することができる。完全な合成インターフェロン遺伝子が作られている。Ｅｄｇｅ、　Ｍ。

Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　７．　Ｅｄ、　Ｇｒｅｓｓｅｒ、Ｉ　ｐｐ、　２−４６　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　kｏｎｄｏｎ。

＋９８６）。

（ｖ）発現次の段階は、真核発現系又は原核発現系において、野生型及び変異したｃＤＮＡの組を発現させ、ネイティブのりイトカイン及び変異サイトカインを生産し、これらを生成して十分な置土産することである。ジスルフィド結合を有するが又はグリコリル化されているほとんどのサイトカインにとっては真核発現系が好ましい。なぜなら、ジスルフィド結合の形成及びポリペプチド鎖の適正な折りたたみが確保されるからである。種々の真核発現系の中で、外来サイトヵイン遺伝子の発現に好ましい系は、昆虫ウィルスであるバキュロウィルス（裁幾肛即崩Ｃａｌ ■凹旦９）の核多面体タ′／バク遺伝子から誘導された発現ベクターを用いる系である。このウィルスは昆虫細胞（消息ゆ狙徨徂紅皿か虹釦細胞、（ｓｆ９細胞））中で増殖することができる。Ｌｕｃｋｏｗ、　Ｖ＾、及びＳｕｍｍｅｒｓ、　ｉｌ、Ｄ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６７：３１（１９８９）　、　、：、の発現系は便利なキット（商品名ｎ１ａｘ　Ｂａｃ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ＥｘｐｒｅｓｓＳｙＳｔｅｍＪにパッケージされており、インビトロンエン社（カリフォルニア州すンジエゴ）によって販売されている。

ＩＦＮ−γのようにジスルフィド結合を含まないサイトカイン及び炭水化物部分が存在しない又はサイトカインレセプターとの結合に関与しないサイトカインについては、原核細胞中で発現させることができる。大腸菌発現系を用いる場合には、発現したサイトカインタンパクを可溶化し、還元してポリペプチドをほどき、次いで最も好ましい三次元構造を形成するように正常の状態に戻す。好ましい系は、インターナショナル・バイオチクノロシーズ・オブ・コダック社（コネチカット州ニューバーペン）により市販されているＦＬＡＧ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　ｋｉｔである。

この系はまた、非融合タンパク質の検出及び精製のための試薬も含んでいる。はとんどのサイトカインに対するモノクローナル抗体は開発されており、市販されている。これらのモノクローナル抗体はそれぞれのサイトカインを親和精製するために用いることができる。

（ｖｉ）結合次の段階は、精製したネイティブ及び変異サイトカインを脂肪族アシル基、好ましくは炭素要約８〜１４の脂肪族基と結合することである。炭素数１０の脂肪族アシル基を用いてこの結合を達成するために好ましい、Ｃａｒｌｓｓｏｎらの方法、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１７３ニア２３（１９７８）を改変した化学反応の例は、次のとおりである。

反応１において、ｌ−ブロモデカン（アルドリッチ・ケミカル社、ライスコンシン州ミルウォーキーから市販）を２，２°　−ジピリジルジスルフィド（アルドリッチ）と反応させてピリジルデカンジスルフィドを形成する。反応２において、この生成物をＡＵＣサイトカインと反応させてデカノイルタンパク質を形成する。

もっとも、結合反応を行う前の第１段階はサイトカモン上に遊離のＳＨ基を創製することである。生合成の間に他のスルフヒドリル基含有代謝物としばしば結合している、サイトカインの非対合システィンの遊離のＳＨ基を先ず緩やかに還元して、上記代謝物からこれを遊離する。もっとも、この緩やかな還元条件は、サイトカインの分子背骨の内側に埋もれているジスルフィド結合を還元しない。

還元後、ゲルろ過又はイオン交換クロマトグラフィーによって還元剤を除去する。処理したサイトカインを次いで、予め活性な基で修飾しである脂肪族アシル基と反応させる。

ネイティブのサイトカインは脂肪族アシル基と結合しそうにない。なぜなら、ネイティブのサイトカインは、接触可能な、非対合システィン残基を有さないからである。しかしながら、接触可能な非対合システィン残基を有するネイティブのサイトカインは、上述の方法により脂肪族アシル基と結合することもできるであろう。次いで、それらのレセプター結合／生物学的活性をすぐ下に記載するようにして分析し、それらがＡＵＧサイトカインか否かを決定することができる。

もしこの分析により、それらがＡＵＧサイトカインでないことが判明したならば、そのシスティン残基をセリン残基で置換しくこのシスティン残基が脂肪族アシル基と結合しないことを確保するため）、他の部位にある他の残基をシスティン残基で置換することができる。システィンをセリンに置換することはレセプター結合又は生物学的活性に影響を与えないであろう。結合反応により、１つの非対合システィン残基においてのみ脂肪族アシル化が行われ、他のいずれの部位においても脂肪族アシル化は行われない。

（ｖｉｉ）レセブター−ム　Ｉ　加・最後の段階はネイティブサイトカインと脂肪族アシル結合変異サイトカインとのレセプター結合及び生物学的活性を分析し比較することである。特定の置換システィン残基を有し、ネイティブのサイトカインと実質的に同一のレセプター結合及び生物活性を有する変異サイトカイン分子をＡＵＣサイトカインと呼ぶ。

２、　＋ＡＵＧ−ＩＦＮ−α２Ｑ諷製セクションＤ、　（ｉ）−（ｖｉｉ）に記載した工程は、例えば、ＡＵＧサイトカインＩＦＮ−Ｃ２の生産に用いることかできる。ＩＦＮ−Ｃ２は、インターフェロンサイト力インファミリーの一員であり、下記表１には、このファミリーの関連する重要な性質、特に、そのシスティン残基に関する情報が含まれている。

１９種類のＩＦＮ−α、１種類のＩＦＮ−β及び１種類のＩＦＮ−γが存在する。２種類の■ＦＮ−αを除く他の全てのＩＦＮ−αは４つのシスティン残基を有し、残基番号１と９９（又は９８又は１００）の間と２９と３９の間に２つのジスルフィド結合を形成する。ＩＦＮ−Ｃ１とＩＦＮ−αＤのみが非対合システィン残基（Ｎｏ、　８６）を有する。ＩＦＮ−βは１つのジスルフィド結合を有しくシス残基番号３１と１４１の間）、１つの非対合システィン残基を有する（Ｎｏ、　１７）。ＩＦＮ−γはシスティン残基を有さない。

表１　ヒトインターフェロンのシスティン残基ＩＦＮ　全残基数　システィン残基数　Ｓ−８結合　遊離システィンＩＦＮ−α６　１６６　４　Ｃ１−Ｃ９９，Ｃ２９−Ｃ３９０ＩＦＮ−Ｃ５１６６４Ｃ１−Ｃ９９，Ｃ２９−Ｃ３９０ＩＦＮ −Ｃ２１６５４Ｃ１−Ｃ９８，Ｃ２９−Ｃ３９０ＩＦＮ−Ｃ１１６６５Ｃ１−Ｃ９９，Ｃ２９−Ｃ３９Ｃ８６ＩＦＮ−αＤ　１６６　５　Ｃｌ−Ｃ９９，Ｃ２９ −Ｃ３９Ｃ８６ＩＦＮ−αＨ１１６６４Ｃ１−Ｃ９９，Ｃ２９−Ｃ３９０ＩＦＮ −Ｃ８１６６４Ｃ１−Ｃ９９，Ｃ２９−Ｃ３９０ＩＦＮ−αＨ１６６４Ｃ１−Ｃ１００，Ｃ２９−Ｃ３９０ＩＦＮ−α４ｂ　１６６　４　Ｃ１−Ｃ９９，Ｃ２９ −Ｃ３９０ＩＦＮ−αＣ１６６４Ｃ１−Ｃ９９，Ｃ２９−Ｃ３９０ＴＦＮ−αＬ　１６６　４　Ｃ１−Ｃ９９，Ｃ２９−Ｃ３９０ＩＦＮ−αＪｌ　１６６　４　Ｃ１−Ｃ９９，Ｃ２９−Ｃ３９０ＩＦＮ−αＨ２１６６４Ｃ１−Ｃ９９，Ｃ２９ −Ｃ３９０ＩＦＮ−αＨ１６６４Ｃ１−Ｃ９９，Ｃ２９−Ｃ３９０ＩＦＮ−αＦ　１６６　４　Ｃｌ−Ｃ９９，Ｃ２９’−Ｃ３９０ＩＦＮ−αＷＡ　１６６　４　Ｃ１−Ｃ９９，Ｃ２９−Ｃ３９０ＩＦＮ−αＧｘ−１１６６４Ｃ１−Ｃ９９，Ｃ２９−Ｃ３９０ＩＦＮ−α７６　１６６　４　Ｃ１−Ｃ９９，Ｃ２９−Ｃ３９０ＩＦＮ−α８８　１６６　４　Ｃ１−Ｃ９９，Ｃ２９−Ｃ３９０ＩＦＮ−β　１６６　３　Ｃ３ｌ−Ｃ１４１Ｃ１？ＩＦＮ−γ　１４３　０　０　０サイトカイン中に非対合システィン残基を導入する、上記セクションＤ、　（ｉ）ないしくｖｉｉ）に記載した方法をほとんどのＩＦＮに対して用いるべきであるが、■ＦＮ−αＩＳ　ＩＦＮ−αＤ及びＩＦＮ−βについては用いるべきではない。なぜなら、ＩＦＮ−Ｃ１、ＩＦＮ−αＤ及びＩＦＮ−βは全て、非対合システィン残基を有しているので、セクションＤ、（ｖｉ）に記載した方法（非対合システィン残基をセリンで置換し、次いで池の位置をシスティンで置換する）を用（するべきだ力１らである。

ＩＦＮ−Ｃ１及びＩＦＮ−αＤ基以外全てのＩＦＮ−αにおいて、アミノ酸残基Ｎｏ、　８６がセＩル又はチロシン残基であるという事実は、ＩＦＮ−Ｃ１及びＩＦＮ−ａＤ中のシスティン残基Ｎｏ、　８６が重要ではないことを示唆して０る。従って、■ＦＮ−αｌ及びＴＦＮ−αＤについては、先ず、Ｃｙｓ　８６をセクションＤ、　（ｖｉ）の方法によって脂肪族アシル基に結合し、次いでセクションＤ、　（ｖｉｉ）の方法を用いて該結合体がレセプター結合及び生物学的活性を有するか否かを決定する。

もしこの置換が容易ではなく、あるいはもし上記分析により該サイトカインカ（ＡＵＣサイトカインでないことが判明したならば、Ｃｙｓ　８Ｂをセリン残基で置換し、セクションＤ、　（ｖｉ）の方法に従ってＡＵＧ−ＩＦＮ−Ｃ１及びＩＦＮ−αＤを調製する。

同様な方法は、ＩＦＮ−βのＡＵＣ型を調製するために用いることができる。

もしネイティブの非対合システィン残基がセリン残基又は他の残基によって置換され、非対合システィン残基が異なる位置にある他の残基を置換して導入されたならば、変異サイトカインは２つの部位特異的変異を有するが、１つの部位のみが親油性物質との結合に適している。

表１に示すように、ＩＦＮ−Ｃ２は、４つのシスティン残基を有し、２つのジスルフィド結合を形成している。ｃＤＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列が知られており、発表されている。Ｈｏｐｐ、　Ｔ、Ｐ、及びｆｏｏｄ、　Ｋ、Ｒ，Ｍｏｌ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２０：４８３　（１９８３）の原理を利用したＭｉｃｒｏＧｅｎｉｅによって提供される親水性分析プログラムを用いることにより、親水性プロットを作ることができる（図示せず）。このプロットは比較的親水性が高いペプチド領域を示す。セクションＤにおいて上述した基準を用いると、部位特異的変異のために選択されるアミノ酸残基（すなわち、システィン残基で置換するための残基）は、セリンＮｏ、　１１、アルギニンＮｏ、　２２、リジンＮｏ、　３Ｌグルタミン酸Ｎｏ、　４２、グルタミン酸Ｎｏ−５ＬセリンＮｏ、　７２、グルタミン酸Ｎｏ、　１１３　、セリンＮｏ、　１１５、リジンＮｏ、　１３３　、セリンＮｏ、　１６０及びセリンＮｏ、　１６３である（全部で１１の変異体を創製）。

ネイティブのＩＦＮ−２遺伝子及び１１種類の変異体遺伝子を調製するための好ましい方法は、セクションＤ、　（ｉｖ）で上述したオリゴヌクレオチド合成法である。好ましい結合方法はセクションＤ、　（ｖｉ）に記載されている。

先に一般的に記載し、ＩＦＮ−Ｃ２については詳細に説明した段階的な方法は、他のＡＵＣサイトカインを調製するためにも用いることができる。上述のように、はとんどのネイティブサイトカインは偶数のシスティン残基を有し、非対合システィン残基を有さない。例えば、ヒトＥＧＦポリペプチドの長さは、６個のシスティン残基（３個のジスルフィド結合）を有する５３アミノ酸残基であり、ヒト塩基性ＦＧＦポリペプチドは４個のシスティン残基（２個のジスルフィド結合）を有する１５５アミノ酸残基の長さを有し、ヒトＩＧＦポリペプチドは６個のシスティン残基（３個のジスルフィド結合）を有する７０アミノ酸残基の長さを有し、ヒトＴＮＦ−αポリペプチドは２個のシスティン残基（１個のジスルフィド結合）を有する１５７アミノ酸残基の長さを有し、ヒトβ−ＮＧＦポリペプチドは６個のシスティン残基（３個のジスルフィド結合）を有する１８８アミノ酸残基の長さを有する。比較的少数のサイトカインだけが奇数のシスティン残基を有し、従って非対合システィン残基を有する。そのうちの１つがヒトＩＬ−２ポリペプチドであり、これは３個のシスティン残基（１個のジスルフィド結合）を有する１５３アミノ酸残基の長さを有する。非対合システィン残基Ｎｏ、　１２５は、［、−２のレセプター結合及び生物学的活性を喪失することなくシスティン以外の残基に置換することができる。ＥＰ−＾−１３６４８９゜従って、このシスティン残基（Ｎｏ、　１２５）は結合のための部位を与えることはおそらく間違いない。

Ｅ　研光及Ｊ診所ヱｌ土ヱ立な咋の改良車れた　ためのＡＵＣサイ上左ヱ２凶遍朋本発明では、主として、ＡＵＣサイトカインの脂肪族アシル誘導体を局所的な又は粘膜への治療的投与に焦点を当てている。しかしながら、これらはＡＵＣサイトカインの唯一の治療的適用方法ではない。ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＥＧＦのようなサイトカイ／は、シュードモナス属外毒素のような細胞毒のための、それぞれのサイトカインのレセプターを高密度に発現している腫瘍細胞への結合分子及び担体として用いられている。従来法によりネイティブのサイトカインを細胞毒に結合すると、異種混合の結合体が得られる。細胞毒をＡＵＧサイトカインに非対合システィン残基を介して結合すると、細胞に対する細胞毒を標的とする改良された結合体が得られる。

治療のための適用は、ＡＵＧサイトカインの唯一の適用方法ではない。有用な研究用試薬及び診断試薬を与えるＡＵＣサイトカインの数種類の適用方法もまた開発することができる。サイトカインの機能の研究において、培養液又は体液中のサイトカイン濃度、標的細胞上のサイトカインレセプターの発現レベル及び／又は組織におけるレセプター発現細胞の濃度を定量することは重要である。ある種の疾病及び症状において、これらの生物学的パラメーターの濃度は変化することがある。従って、これらの濃度を監視することは、疾病の状態を決定又は監視する手段を与え得る。

免疫化学的及び細胞結合分析を包含する、このような定量分析のためには、指示物質（例えば、抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、蛍光物質、及びアビジン−結合指示物質と共に用いるビオチン）と結合したサイトカインは有用な試薬である。これらの結合体を調製するための従来法では、結合はりジン残基のε−アミノ基を介して行われていた。しかしながら、上述のように、このようにして形成した結合体は結合した基の数及び位置に関して異種混合物である。また、これらの結合サイトカイン分子のいくつかの活性及びレセプター結合性は、結合部位の中又は近傍のりジン残基に結合した修飾基にょ９て影響を受りるかもしれない。上述の方法を用いて、ＡＵＣサイトカインの単一の非対合システィン残基を介してこれらの修飾基を結合することにより、これらの問題を最小化又は排除することができ、従って、研究及び診断のための改良された試薬を与えることができる。レセプターの研究のためには、サイトカインはレセプター特異的抗体よりも優れている。なぜなら、サイトカインは通常抗体よりもそれぞれのレセプターに対する親和性が高いからである。サイトカインは抗体よりもサイズが小さく、従って、試薬の組織侵入及び拡散が重要である場合に組織切片の染色のために特に適している。

ここで用いた用語、表現及び例は例示のためだけのものであって限定的なものではなく、当業者はルーチンな実験を超えるものを必要とすることなくここに記載した本発明の具体例の多（の均等物を認識することができるであろう。このような全ての均等物は、次の請求の範囲に包含されることを意図する。

フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１４１５５５　８３１８−４Ｈ１９１００８３１８−４Ｈ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＤＫ、　ＥＳ。

ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＷ、ＮＯ，ＲＯ，ＳＤＩ

Claims

【特許請求の範囲】

１．レセプター結合部位から離れた位置に１つの非対合システイン残基を含むように部位特異的に修飾されたサイトカインであって、前記非対合システイン残基は、これに結合する親油性物質によって結合生成物のレセプター結合活性又は生物学的活性が有意に影響を受けないように、レセプター結合部位から離れた位置に導入されているサイトカイン。
２．インターフェロン−α１及びインターフェロン−αＤ以外のインターフェロンα、γ−インターフェロン、インターロイキン−１、インターロイキン−２、腫瘍壊死因子、上皮増殖因子、線維芽増殖因子、インシュリン様増殖因子、血小板由来増殖因子、神経成長因子又は繊毛神経栄養因子である請求項１記載のサイトカイン。
３．遊離のＳＨ基が性質修飾基と結合されている請求項１記載のサイトカイン。
４．性質修飾基は、抗体、ビオチン、蛍光色素、西洋ワサビペルオキシダーゼ及び親油性物質から成る群より選ばれる請求項３記載の結合サイトカイン。
５．前記性質修飾基は脂肪族アシル基又は親油性の非帯電ペプチドである請求項３記載の結合サイトカイン。
６．脂肪族アシル基は、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８の炭素長を有する請求項５記載の結合サイトカイン。
７．前記脂肪族アシル基は炭素数８〜１４の、飽和した直鎖状の脂肪族アシル基である請求項６記載の結合サイトカイン。
８．前記結合サイトカインは、セリンＮｏ．１１、アルギニンＮｏ．２２、リジンＮｏ．３１グルタミン酸Ｎｏ．４２、グルタミン酸Ｎｏ．５１、セリンＮｏ．７２、グルタミン酸Ｎｏ．１１３、セリンＮｏ．１１５、リジンＮｏ．１３３、セリンＮｏ．１６０又はセリンＮｏ．１６３を置換するシステイン残基及び該置換システイン残基に結合された脂肪族アシル基を有するＩＦＮ−α２である請求項６記載の結合サイトカイン。
９．局所的疾病又は症状を治療するために患者に投与するのに適した、請求項５記載の誘導サイトカインを含む医薬組成物。
１０．レセプター結合部位から離れた位置に、親油性物質と結合した非対合システイン残基を有し、該結合によって結合生成物のレセプター結合活性又は生物学的活性が有意に影響を受けないサイトカイン。
１１．インターフェロン−α１、インターフェロン−αＤ又はインターフェロンーβである請求項１０記載のサイトカイン。
１２．サイトカインのレセプター結合部位から離れた位置であって、この位置に親油性基を結合しても結合生成物のレセプター結合活性又は生物学的活性が有意に影響を受けない位置を非対合システイン残基で置換し、該非対合システイン残基に親油性物質を結合することを含む、親油化サイトカインの製造方法。
１３．局所的疾病又は症状を治療するために患者に投与するのに適した、請求項１０記載の誘導サイトカインを含む医薬組成物。