JPH07502113A - 生理活性型の腫瘍壊死因子（ｔｎｆ）の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生理活性型の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の検出方法本発明は生理活性型の腫瘍壊死 因子（ＴＮＦ）の測定方法に関する。

さらに詳しくは本発明は、モノマー型のＴＮＦまたはりセブターと複合体を形成 しているＴＮＦ（これらは生埋活性かない）の存在下での、オリゴマー型の生理 活性のあるＴＮＦの検出方法に関する。

アルファ−ＴＮＦ（「カケクチン」　（”ｃａｃｈｅｃｔｉｎ”）とも呼ばれる ）は、主に活性化マクロファージにより分泌されるサイトカインである。

ＴＮＦは、実験動物モデルにおいてある種の腫瘍の出血性壊死を誘導する能力に より、まず「カルメッテグエリン」（”Ｃａｌｍａｔｔｅ　Ｇｕｅｒｉｎ”）バ シルス（ＢＣＧ）で感染したマウスの血清中で同定された。

後にＴＮＦは主要な炎症メディエーターの１つであることが発見された。急性お よび／または慢性産生のような特殊な場合には、ＴＮＦは感染性の慢性疾患およ び悪性腫瘍に罹患した患者に典型的な、敗血症ショックや脂質代謝異常（悪液質 ）のような病状を引き起こすことかある。

さらにＴＮＦは他のサイトカインやリンホカインとともに、免疫制御、血管形成 、細胞分化および増殖過程である役割を果たすことが証明された（ポイトラーと セラミ（Ｂｅｕｔｏｌｅｒ　Ｂ．ａｎｄ　Ｃｅｒａｍｉ　Ａ．）、ｌ９８９、Ａ ｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７、６２５−６５５）。

ＴＮＦがある種の細胞株に対して顕著な細胞毒性を有することやインビボで腫瘍 の壊死を誘導することができることは、抗悪性腫瘍の治療における薬剤としての 利用の可能性を示唆している。さらに過産生条件下（例えば敗血症ショック）で 内因性ＴＮＦにより誘導される毒性を中和することができる化合物を開発すれば 、同様に治療に利用できる可能性かある。

ＴＮＦは、標的細胞の膜の上にあるリセブターを介して、その多面発現性を示す と考えられている。実際２つの異なるリセブター型か精製され性状解析されてい る（スミス（Ｓｍｉｔｈ　Ｃ．Ａ．）ら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８、 １０１９−１０２３：ンヤル（Ｓｃｈａｌｌ　Ｔ、Ｊ、　）ら、１９９０、Ｃｅ 比６Ｉ、３６１−３７０）。

さらに細胞外部分に対応し、強力なＴＮＦ阻害活性を示すそのような分子の可溶 性型は、健常法からそして大量には慢性腎不全の発熱性患者の尿から、または悪 性腫瘍患者の血清から精製された（）７７−　（Ｎｏｐｈａｒ　Ｙ、　）ら、１ ９９０、ＥｌｉｌＢＯＪ２．９．３２６９−３２７８）。

多数の実験的証拠は、細胞レベルまたは組織レベルでのＴＮＦによる種々の生理 活性の発現は、膜リセブターの発現や可溶性型の放出の調節により制御されてい ることを示唆している。

リセブターの種々の異なる分子型か存在する以外に、ＴＮＦの異なる分子型が存 在することか記載されている。３次元構造解析によれば、ＴＮＦは、互いに強く 会合した１７．５キロダルトンの３つの同じサブユニットにより構成される分子 である。超遠心分離、ゲル電気泳動、架橋、Ｘ線散乱およびゲルろ過の研究によ れば、ＴＮＦは溶液中でオリゴマー型でも存在する（ウィングフィールド、ペイ ンとフレイブ（Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ　Ｐ　、　Ｐａ１ｎ　Ｒ，Ｈ，ａｎｄ　Ｃｒ ａｉｇ　Ｓ、）、ｌ９８７、ＦＥＢＳＬｅｔｔ、　、２１１、＋７９−１８４； アラカワとイフ了チス（Ａｒａｋａｗａ　Ｔ、　ａｎｄＹｐｈａｔｉｓ　Ｄ、Ａ 、）、１９８７、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６２．７４８４−７４８５ 　；ラム、スフブリとサロモン（１，ａｍ　Ｋ、　Ｓ、、５ｃｕｄｅｒｉ　Ｐ　 、　ａｎｄ　Ｓａｌｏｍｏｎ　Ｓ、Ｅ、）、１９８８、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅ ５ｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄ、、７．２６７−２７５＋レイットーベンテレ−（Ｌｅｗ ｉｔ−Ｂｅｎｔｅｌｅｙ　Ａ、　）　ら、１９８８、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　 、１９９．３８９−３９２）。しかしオリゴマー型（すなわち生理活性型）は、 生理活性のある（ピコモル）ａ度では部分的にモノマーＴＮＦが形成されるため 不安定なよってある。これはりセブターを結合する能力かほとんとまたはまった （ないこと、そして生理活性（細胞毒性）を示さないことか特徴である。従って 、濃度変化の結果としてのＴＮＦの４次構造は、そのような分子により誘導され る生理的−病的過程の制御で重要な役割を果たしているかも知れないという仮説 が作られた（スミスとバグリオニ（Ｓｍｉｔｈ　Ｒ，Ａ、　ａｎｄ　Ｂａｇｌｉ ｏｎｉ　Ｃ，）、１９８７、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６２．６９５１ −６９５４）。

ある病的状態（例えば敗血症ショック（ワージ（Ｗａａｇｅ　）ら、１９８７、 Ｌａｎｃｅｔ、　ｉ　、３５５）　、腎移植の拒絶（モーリー（Ｍａｕｒｙ　） ら、１９８７、Ｊ。

εｘｐ、　Ｍｅｄ、、１６６、＋１３２）、寄生体感染（スフブリ（Ｓｃｕｄｅ ｒｉ　）ら、１９８６、Ｌａｎｃｅｔ　ｉｉ　、ｌ　３６４）および種々の悪性 腫瘍（バルクウィル（Ｂａｌｋｗｉｌｌ）ら、１９８７、Ｌａｎｃｅｔ　ｉｉ　 、１２２９）　）では、ＴＮＦの血漿中　濃度はかなり増加する。従って生体液 中のＴＮＦレベルを迅速で簡便に測定する方法の開発は、臨床的および診断的観 点から重要である。

正常および病的条件下での生体液中のＴＮＦレベルは、一般に伝統的な免疫学的 または生物学的測定法によりめられる。この両方の測定により得られた患者血清 での結果の相関性が低いことは、おそらくモノマーＴＮＦまたは可溶性でリセブ ターと複合体を形成しているＴＮＦにより構成される生理活性がなくて免疫原性 のある型の存在を示唆している（バルクウィル（ｆ３ａｌｋｗｉ　１＋）ら、１ ９８７、Ｌａｎｃｅｔ　ｉｉ　、ｌ　２２９）。

生理活性型のＴＮＦのレベルは通常、感受性細胞（例えば、Ｌ９２９細胞（クレ ー？　（Ｋｒａｍｅｒ）ら１．１９８６、Ｊ、ｌｎｗｎｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、　 、　９５．２１Ｏ）およびＷＥＩ−１１１６４細胞（エスペヴイック（Ｅｓｐｅ ｖｉｋ　）ら、１９８６、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈ、　、　９５．９９）に対するＴＮＦの示す細胞毒性に基づくバイオア ッセイを用いて生体液で測定される。

現在使用されている免疫測定法では抗原性のある総ＴＮＦが測定される（これは おそらく生理活性のある遊離のオリゴマーＴＮＦ、およびモノマーＴＮＦまたは 可溶性の複合体を形成しているＴＮＦ　（いずれも生理活性はない）により構成 されている）。病的状態ではＴＮＦ抗原はナノモルレベルになることが証明され た（バルクウィル（Ｂａｌｋｗｉｌｌ）ら、ｌ９８７、Ｌａｎｃｅｔ百、１２２ ９）。

感受性のある細胞でのＴＮＦの生物学的測定には、実施に伴う一連の問題がある ：そのような試験は正確な特異性の確認が必要であり、細胞株を長時間培養する ための細胞培養のための特殊な装置、および細胞培養の専門的な経験が必要であ り、これらのすへてか必ずしもいつもあるわけではない。さらに測定の実施には 通常３から４日必要であるが、これは明らかに長すぎて手間がかかり、多数の試 料を測定することは不可能である。その結果そのような方法はルーチンの臨床検 査では明らかに不可能である。

さらに生物学的測定法では、細胞増殖のために試料は適当な媒体（通常血清、ま たは同し細胞により産生される他の因子を含む、従って調節できない）で希釈す る必要があり、このため測定試料中の生理活性型のＴＮＦの実際の濃度が変化す ることかある。

従って生理活性のない型（モノマーＴＮＦおよび／または可溶性のりセブターと 複合体を形成しているＴＮＦ）から生理活性のあるＴＮＦ　（すなわちオリゴマ ー型であって、インヒビターと複合体を形成していないＴＮＦ）を区別してイン ビトロで検出することができ、専門家でなくても容易に測定可能であり、細胞培 養の不要な方法に対するニーズかある。

従って本発明の目的は、以下の工程よりなる生理活性型のＴＮＦの検出方法であ るニ ー　オリゴマー型のＴＮＦ分子とのみ反応することかでき、リセプターと複合体 を形成しているＴＮＦやモノマー型のＴＮＦとは反応しない捕捉性反応物（ｃａ ｐｔｕｒｉｎｇ　ｒｅａｃｔａｎｔ）を、基体（ｓｕｂＳけａｔｅ　）上に固定 し、−上記捕捉性反応物を試料とインキュベートし、−上記試料を検出性反応物 （ｄｅｔｅｃｔｏｒ　ｒｅａｃｔａｎｔ　）とインキュベートし、−洗浄し、 −上記検出性反応物の反応により測定を実施する。

好ましくは、上記検出性反応物は、オリゴマー型のＴＮＦ分子とのみ反応するこ とかでき、リセブターと複合体を形成しているＴＮＦや検出システムと結合して いるモノマー型のＴＮＦとは反応せず、上記捕捉性反応物のオリゴマー型ＴＮＦ に対する親和性定数は＋ｏ”Ｍ−’より太き（、リセブターと複合体を形成して いるＴＮＦに対する親和性定数は１０５Ｍ−’より小さい。

好適な実施態様において、捕捉性反応物と検出性反応物は同し反応物分子よりな り、オリゴマー型ＴＮＦは反応物分子に対して少なくとも２つの結合部位を有す る。

さらに本発明において、捕捉性反応物と検出性反応物はポリクローナル抗ＴＮＦ 抗体またはモノクローナル抗ＴＮＦ抗体（これらは好ましくはＴＮＦ／リセブタ ー結合を中和する物質（ｎｅｕｔｒａｌ　１ｚｅｒｓ）である）よりなる、さら に好ましくはモノクローナルＭａｂ−７８抗体（英国特許出願第９０２８１２３ ．１；）くルバンチ（Ｂａｒｂａｎｔｉ　Ｐ、　）ら、［外傷、ショックおよび 敗血症に対する第２回国際会議９機構と治療方法」　（”２ｎｄ　Ｉｎｔ、　Ｃ ｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｎ　Ｔｒａｕｍａ、　５ｈｏｃｋ　ａｎｄＳｅｐｓｉｓ：Ｍ ｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ”　）、１９９１　ミュンヘン）よりなる。別の実施態様において、捕捉性反応 物と検出性反応物は、ＴＮＦリセブターまたは合成分子または組換え分子よりな る。

好適な実施態様において、基体はマイクロタイタープレートまたはポリスチレン 管またはポリビニルクロリド管よりなり、検出システムは蛍光性化合物または化 学発光性化合物または放射性化合物またはコロイド性金属、または着色ラテック ス粒子の酵素性分子よりなる。上記酵素性分子は好ましくは、ペルオキシダーゼ 、アルカリ性ホスファターゼ、ウレアー七、ベータガラクトシダーゼよりなる群 からなり、コロイド性金属は金、銀、銅、白金、水酸化鋼、水酸化アルミニウム 、酸化バナジウム、水酸化マグネシウムよりなる群からなる。

さらに本発明において、検出性反応物を発色性または蛍光性基質と反応させ、シ グナルを読むことにより測定が実施される。

本発明の別の目的は、以下のものよりなる試料中の生理活性型のＴＮＦを検出す るキットである。

−オリゴマー型のＴＮＦ分子とのみ反応することができ、リセブターと複合体を 形成しているＴＮＦやモノマー型のＴＮＦとは反応しない、基体上に固定された 捕捉性反応物、 −上記試料をインキュベートするための溶液、−オリゴマー型のＴＮＦとのみ反 応することができ、リセブターと複合体を形成しているＴＮＦや検出システムと 結合したモノマー型のＴＮＦとは反応しない検出性反応物、 −洗浄液、 −基準試料。

好ましくは捕捉性反応物と検出性反応物は、Ｍａｂ−７８抗体よりなり、キット はまた総ＴＮＦの検出システムも合作する。

以下に本発明を実施例を用いて、図１　（測定検量線を示す）を参照して記載す る。

実施例１ オリゴマー型ＴＮＦの測定を実施するための固相の調製ＴＮＦ中和活性を有する モノクローナル抗体を、以下のようにしてポリビニルクロリドプレート上に固定 した＝９６ウエルプレートの各ウェルに、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含有す る５０μｍの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７゜３　（ＰＢＳ）とｌｏμ ｇ／ｍｌのモノクローナルＭａｂ−７８抗体（英国特許出願第９０２８１２３． Ｉ；パルバンチ（Ｂａｒｂａｎｔｉ　Ｐ、　）ら、「外傷、ショックおよび敗血 症に対する第２回国際会議：機（荷と治療方法」　（”２ｎｄ　Ｉｎｔ、　Ｃｏ ｎｇｒｅｓｓｏｎ　Ｔｒａｕｍａ　Ｓ　５ｈｏｃｋ　ａｎｄ　５ｅｐｓｉｓ：Ｍ ｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｐｐｒｏａｃ■■刀 h　）　、 ＋９９１、ミュンヘン）を加えた。次に室温でプレートを２時間インキュベート し、３％子ウシ血清アルブミン溶液で室温で２時間ブロッキングした。こうして 調製したプレートは４°Ｃて数週間保存できる。

実施例２ オリゴマーＷＴＮＦの測定を実施するための検出性反応物の調製モノクローナル Ｍａｂ−ｔ８抗体を以下のようにしてビオチン化した：１ｍｇ／ｍｌのＭａｂ− ７８抗体を含有する溶液（６００μｌ）を、ジメチルスルホキシド中の６μｍの Ｄ−ビオチニル−６−アミノカプロン酸のＮ−ヒドロキシサクシニミドエステル （１０ｍｇ／ｍｌ）と混合し、室温で４時間インキュベートした。次に６０μｍ のＩＭのリジン溶液を加えた。この混合物を室温でさらに１時間インキュベート し、次にＰＢＳに対して一晩透析した。生成物をＰＢＳで３ｍＩに希釈し、−２ ０°Ｃて保存した。

実施例３ オリゴマー型ＴＮＦの測定 実施例１に開示したようにＭａｂ−８抗体で感作したプレートを、ウェルにＰＢ Ｓを満たし次にこれを空にすることにより洗浄した（３回）。次にウェルを、１ ％ＢＳＡを含有するＰＢＳ　（ＰＢＳ−Ｂ）で適宜希釈した分析すべき試料で満 たした。プレートを再び４°Ｃで一晩インキユベートし、０．０５％ツイーン２ ゜を含有するＰＢＳ　（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄した。最後に各ウェルに、０．０５ ％のツイーン２０を含有するＰＢＳ−Ｂ　（ＰＢＳ−ＢＴ）で１：２００の比率 て希釈した、５０μｍのビオチン化Ｎａｂ−Ｎｅｕを加えた。３７°Ｃて２時間 インキュベートした後プレートをＰＢＳ−Ｔて洗浄し、ＰＢＳ−ＢＴてＩ　：　 １０００の比率て希釈した、ウェル当たり５０μｍのストレブトアビジンーペル オキシダーゼ（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）よ り市販されている）の溶液で満たし、次に再び３７°Ｃで１時間インキュベート シた。ＰＢＳ−Ｔて洗浄（８回）した後、プレートをＡＢＴＳ　［２，２’　− アジノージ−（３−エチル−ベンジルチアゾリンスルホネート）］（カーケが一 ドアントベリーラボラトリーズ社（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、）より市販されている）を含有する発色 性溶液で染色した。

図１に、エスカイアケミー社（ε５ｑｕｉｒｅ　Ｃｈｅｍｉｅ　ＡＧ　）　（ス イス、チューリッヒ）から購入した組換えヒトＴＮＦで得られた検量線が報告さ れている。

実施例４ オリゴマー壓ＴＮＦ測定法の特異性の測定文献（（スミスとバグリオ−（Ｓｍｉ ｔｈ　Ｒ，Ａ、　ａｎｄ　Ｂａｇｌｉｏｎｉ　Ｃ，）、１９８７、Ｊ。

Ｂｉ　ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６２．６９５１−６９５４）に記載されたように 、組換えＤＮＦを０．　１％のトリトンＸ−１００で解離させて、オリゴマー型 ＴＮＦおよびモノマー型のＴＮＦを調製し、ＴＳＫ３０００ＳＷクロマトグラフ ィーカラム（エルケービーーファルマシア（ＬＫＢ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　 ）のＨＰＬＣゲルろ過（流速＝０．５ｍｌ／分）により分離した。モノマー型の ＴＮＦに対応するクロマトグラフィー画分は、オリゴマー型ＴＮＦの測定法でま ったく活性がなかった。このような画分中のモノマー型のＴＮＦの存在は、実施 例６に記載するポリクローナル抗ＴＮＦ抗体を用いる従来の測定法を用いてチェ ックした。

実施例５ 抗原性総ＴＮＦの測定のための固相の調製Ｂａ１ｂ／ｃマウスを免疫してポリク ローナル抗ＴＮＦＭａｂ−７８抗体を調製し、文献（ブリングマン（Ｂｒｉｎｇ ｍａｎ）ら、１９８７、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、　５．４８９）で公知の方法に従 って精製した。）ｈ製した免疫グロブリンを以下のようにポリビニルクロリドプ レート上に固定した：９６ウエルのプレートの各ウェルに、０．１５Ｍの塩化ナ トリウムを含有する５０ｍＭのリン酸すｌ・リウム緩衝液ｐＨ７，３（ＰＢＳ） と１０Ｍｇ／ｒｎｌの免疫グロブリンを加えた。次にプレートを室温で２時間イ ンキュベートし、３％子ウシ血清アルブミン溶液を用いて室温で２時間ブロッキ ングした。こうして調製したプレートは４°Ｃて数週間保存できる。

実施例６ 抗原性総ＴＮＦの測定 実施例５に記載したマウス抗ＴＮＦ免疫グロブリンで感作したプレートを、ウェ ルにＰＢＳを満たし次にこれを空にすることにより洗浄した（３回）。次にウェ ルを、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ　（ＰＢＳ−Ｂ）で適宜希釈した分析すべき 試料で満たした。プレートを再び４°Ｃで一晩インキュベートし、０．０５％ツ イーン２０を含有するＰＢＳ　（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄した。最後に各ウェルに、 ０゜０５９ｆｒＯ）ライ−ン２０を含有するＰＢＳ−Ｂ　（ＰＢＳ−ＢＴ）　で ｌ　：　２０００ｆ：希釈したＩＰ３００ウサギ抗ＴＮＦ抗血清（ジエンザイム 社（ＧｅｎｚｙｍｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　）　５０　μＩを加えた。３７° Ｃで２時間インキュベートした後ブレー１−をＰＢＳ−Ｔて洗浄し、ウェル当た り５０　ｊｔ　ｌのベルオキシダーゼの結合したＰＢＳ−ＢＴてＩ：ｌ０００に 希釈したヤギ抗ウサギ免疫グロブリングロブリン（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍ ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）より市販されている）の溶液で満たし、再び３ ７°Ｃて１時間インキュベートシた。ＰＢＳ−Ｔて洗浄（８回）したｉ＆、プレ ートをＡＢＴＳ　［２，２’　−アジノージ−（３−エチル−ヘンシルチアプリ ンスルホネート）］（カーケガートアンドペリーラホラトリーズ社（Ｋｉｒｋｅ ｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、　）よ り市販されている）を含有する発色性溶液で染色した。

本発明をいくつかの好適な実施態様に関して具体的に開示したか、当業者は本発 明の軸回を逸脱することなく、本測定法に必要な工程を減少させたり感度を上昇 させたりすることを目的とする変更および／または修飾が可能であることは理解 すべきである。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の工程よりなる生理活性型のＴＮＦの検出方法：−オリゴマー型のＴＮ Ｆ分子とのみ反応することができ、リセプターと複合体を形成しているＴＮＦや モノマー型のＴＮＦとは反応しない捕捉性反応物（ｃａｐｔｕｒｉｎｇ　ｒｅａ ｃｔａｎｔ）を、基体上に固定し、−上記捕捉性反応物を試料とインキュベート し、−上記試料を検出性反応物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ　ｒｅａｃｔａｎｔ）とイン キュベートし、−洗浄し、 −上記検出性反応物の反応により測定を実施する。
2. ２．請求の範囲第１項に記載の生理活性型のＴＮＦの検出方法であって、検出性 反応物は、オリゴマー型のＴＮＦ分子とのみ反応することができ、リセプターと 複合体を形成しているＴＮＦや検出システムに結合したモノマー型のＴＮＦとは 反応しない、上記方法。
3. ３．前項までの請求の範囲のいずれか１項に記載に生理活性型のＴＮＦの検出方 法であって、捕捉性反応物のオリゴマー型ＴＮＦに対する親和性定数は１０９Ｍ −１より大きく、リセプターと複合体を形成しているＴＮＦに対する親和性定数 は１０５Ｍ−１より小さい、上記方法。
4. ４．前項までの請求の範囲のいずれか１項に記載に生理活性型のＴＮＦの検出方 法であって、捕捉性反応物と検出性反応物は同じ反応物分子よりなり、オリゴマ ー型ＴＮＦは反応性分子に対して少なくとも２つの結合部位を有する、上記方法 。
5. ５．前項までの請求の範囲のいずれか１項に記載に生理活性型のＴＮＦの検出方 法であって、捕捉性反応物と検出性反応物はポリクローナル抗ＴＮＦ抗体または モノクローナル抗ＴＮＦ抗体よりなる、上記方法。
6. ６．請求の範囲第５項に記載の生理活性型のＴＮＦの検出方法であって、抗ＴＮ Ｆ抗体はＴＮＦ／リセブター結合を中和する物質（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｒｓ） である、上記方法。
7. ７．請求の範囲第６項に記載の生理活性型のＴＮＦの検出方法であって、抗ＴＮ Ｆ中和抗体はＭａｂ−７８抗体である、上記方法。
8. ８．請求の範囲第１項から第４項までのいずれか１項に記載の生理活性型のＴＮ Ｆの検出方法であって、捕捉性反応物と検出性反応物はＴＮＦリセブターまたは 合成分子または組換え分子である、上記方法。
9. ９．前項までの請求の範囲のいずれか１項に記載の生理活性型のＴＮＦの検出方 法であって、基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）はマイクロタイタープレートまたはポ リスチレン管またはポリビニルクロリド管よりなり、検出システムは、蛍光性化 合物または化学発光性化合物または放射性化合物またはコロイド性金属または着 色ラテックス粒子の酵素性分子よりなる、上記方法。
10. １０．請求の範囲第９項に記載の生理活性型のＴＮＦの検出方法であって、酵素 性分子はペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ウレアーゼ、ベータガ ラクトシダーゼよりなる群からなり、コロイド性金属は金、銀、銅、白金、水酸 化銅、水酸化アルミニウム、酸化バナジウム、水酸化マグネシウムよりなる群か らなる、上記方法。
11. １１．請求の範囲第１０項に記載の生理活性型のＴＮＦの検出方法であって、検 出性反応物を発色性または蛍光性基質と反応させ、シグナルを読むことにより測 定が実施される、上記方法。
12. １２．以下のものよりなる試料中の生理活性型のＴＮＦを検出するキット：−オ リゴマー型のＴＮＦ分子とのみ反応することができ、リセプターと複合体を形成 しているＴＮＦやモノマー型のＴＮＦとは反応しない、基体上に固定された捕捉 性反応物、 −上記試料をインキュベートするための溶液、−オリゴマー型のＴＮＦとのみ反 応することができ、リセプターと複合体を形成しているＴＮＦや検出システムと 結合したモノマー型のＴＮＦとは反応しない検出性反応物、 −洗浄液、 −基準試料。
13. １３．請求の範囲第１２項に記載の試料中の生理活性型ＴＮＦの検出のためのキ ットであって、捕捉性反応物と検出性反応物はＭａｂ−７８抗体よりなり、キッ トはまた総ＴＮＦの検出システムも含有する、上記キット。