CN116593718B - 用于检测司库奇尤单抗抗药性抗体的试剂 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种用于检测样品中司库奇尤单抗抗药性抗体的试剂，其制备方法及其相关用途。所述试剂含有能够结合所述司库奇尤单抗抗药性抗体的捕获试剂、用于检测的检测试剂和IL‑17A结合分子。所述试剂可以很好地解决内源性IL‑17A对司库奇尤单抗免疫原性检测的影响。
Description
技术领域
本申请涉及生物检测领域，具体涉及一种用于检测样品，尤其是人血样中的司库奇尤单抗抗药性抗体的可去除内源性IL-17A干扰的试剂。
背景技术
在司库奇尤单抗类药物抗药性抗体(ADA)检测过程中，面临的1个主要挑战就是靶点分子IL-17A的干扰。尽管给药前IL-17A浓度不会显著影响ADA检测，但给药后，一方面由于药物迅速和血液中可溶性的IL-17A结合，导致血液中游离的IL-17A水平迅速降低，进而引发内在负反馈机制导致IL-17A分泌增多；另一方面IL-17A与药物结合导致清除显著减慢，从而导致总的IL-17A水平显著升高。在ADA检测过程中需要采用酸解等方式将ADA-药物复合物解离开，形成游离的ADA以便于检测，但该过程的同时也会释放药物结合的IL-17A分子，造成样品中的游离的IL-17A水平显著升高，可以直接与捕获试剂和检测试剂桥连而出现假阳性信号。
现有解决上述问题的技术方法主要是采用抗IL-17A的抗体来进行干扰的解除。但该技术存在较大的技术缺陷和不足。首先，由于采用去除的试剂是针对IL-17A的抗体，而药物司库奇尤单抗也是针对IL-17A的抗体，在方法学研究中需要设置阳性对照(抗司库奇尤单抗的抗体)，而阳性对照有可能与去除IL-17A的抗体产生交叉反应，从而降低阳性对照的信号，导致假阴性结果产生的可能性；其次，一般涉及去除IL-17A的单抗试剂的反应性也仅仅接近司库奇尤单抗与IL-17A的亲和力，而给药后的司库奇尤单抗的浓度水平很高，从而导致需要加入大量的去除抗体试剂，而且效果也不太理想。
发明内容
针对上述问题，经过反复摸索，本申请的发明人开发了一种用于检测人血样(例如血液、血浆、血清等)中司库奇尤单抗抗药性抗体的可去除内源性IL-17A干扰的试剂。
具体地，本申请提供了如下技术方案：
在第一方面，本申请提供了一种用于检测样品中司库奇尤单抗抗药性抗体的试剂，其含有能够结合所述司库奇尤单抗抗药性抗体的捕获试剂、用于检测的检测试剂和IL-17A结合分子。
在第二方面，本申请提供了制备第一方面所述的试剂的方法，其包括：
将所述IL-17A结合分子用缓冲液，例如PBS，例如含有1% BSA无脂肪酸的PBS稀释成终浓度至少为约20µg/mL的筛选稀释液；
将所述捕获试剂用所述筛选稀释液稀释成终浓度为约2000 ng/mL的捕获试剂工作液；
将所述检测试剂用所述筛选稀释液稀释成终浓度为约2000 ng/mL的检测试剂工作液；以及
将所述捕获试剂工作液和所述检测试剂工作液按1:1混合成所述试剂。
在第三方面，本申请提供了第一方面所述的试剂或者根据第二方面所述的方法制备的试剂用于检测样品中司库奇尤单抗抗药性抗体的用途。
开发了一种用于检测人血清中司库奇尤单抗抗药性抗体的Master Mix工作液。所述工作液可以很好地解决内源性IL-17A对司库奇尤单抗免疫原性检测的影响，优势包括以下的一项或多项：
在Master Mix工作液中加入IL-17A受体，去除内源性IL-17A干扰的效率更高。健康人血清中游离IL-17A为约10ng/mL，银屑病患者体内游离IL-17A会有所升高，给予司库奇尤单抗后银屑病患者体内IL-17A由于负反馈调节和消除速度变慢而显著提高，因此ADA检测时IL-17A特异性需至少做到10ng/mL，未使用IL-17A受体去干扰时，内源性IL-17A的浓度为2 ng/mL时即呈现假阳性，干扰ADA的检测，无法满足银屑病患者血清样品的检测，使用至少20 µg/mL 的IL-17A受体去干扰后，在保证阳性对照的信号不降低的情况下，内源性IL-17A的浓度达20 ng/mL时依旧不影响ADA的检测，满足银屑病患者血清样品的检测要求。
具体实施方式
司库奇尤单抗为人白介素-17A (IL-17A)拮抗剂，属于一种新型生物制剂，常为注射液类制剂。主要用于治疗其他医学方法治疗无效的斑块状银屑病，以及中重度银屑病、强直性脊柱炎。司库奇尤单抗应用在临床时，有靶向性好、起效快、维持时间长、副作用小、对患者身体影响小等优点。但在治疗之前，需要检查肝肾功能，以及明确是否合并恶性肿瘤，或结核等感染性疾病，完全排除后才可以进行，以免这些因素影响司库奇尤单抗的药物效果。
白介素-17家族的细胞因子被分别命名为白介素-17A到白介素-17F。还找到了它们的受体家族：白介素-17受体A到白介素-17受体E。这些白介素-17细胞因子可以结合到相对应的受体成员上从而介导不同的炎症反应。该家族中最具代表性的成员为白介素-17A(IL-17A)，在机体受感染或损伤处，迁移过来的淋巴细胞会分泌白介素-17A。虽然白介素-17A在宿主抗感染和组织修复过程中起到扩大免疫防御反应保护自身机体的作用，但是，在很多自身免疫病病人和肿瘤病人当中，白介素-17A又是高表达的，由于它可以诱导很多炎症因子的表达，过高的白介素-17A水平对于疾病的病理发展起到恶化作用。很多动物实验也证明，白介素-17A缺失或者抗体中和白介素-17A，可以有效的抑制多种自身免疫病病理程度。
本文所用的“IL-17A结合分子”包括能够结合IL-17A的任何天然的或合成的物质，例如各种抗IL-17A抗体和IL-17A受体，例如天然受体或合成的受体。白介素IL-17受体(IL-17R)家族由5个成员组成：IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD、IL-17RE。IL-17R由27个氨基酸的N-末端信号肽、293氨基酸胞外结构域、21个氨基酸的跨膜结构域和525个氨基酸异常长的胞质尾巴构成的单程跨膜蛋白。IL-17受体家族成员之间可以组合成不同的复合物，如IL-17RA与IL-17RC复合体介导细胞对IL-17A与IL-17F的反应，IL-17RA与IL-17RB复合体介导细胞对IL-17E的反应。IL-17RA作为这个家族迄今为止最大的分子，编码的基因位于染色体22上，是至少4个配体传递信号的通用亚基。其他受体的编码基因位于染色体3上。L-17RA广泛表达，特别是在造血组织中表达水平高。IL-17RB能结合IL-17B与IL-17E，它主要表达于各种内分泌组织及肾、肝和TH2细胞。IL-17RD负调控FGF介导的Ras-MAPK及PI3K信号通路。人的IL-17RD也能抑制FGF依赖的ERK激活与FGF依赖的增殖,但鼠的IL-17RD却能结合TAK1激活MAP2K4-JNK信号通路。IL-17受体家族中被了解最少的成员是IL-17RE，近来研究表明IL-17C可能是它的配体。
具体而言，本申请提供了如下技术方案：
在第一方面，本申请提供了一种用于检测样品中司库奇尤单抗抗药性抗体的试剂，其含有能够结合所述司库奇尤单抗抗药性抗体的捕获试剂、用于检测的检测试剂和IL-17A结合分子。
在具体的实施方案中，所述IL-17A结合分子为IL-17A受体。
在具体的实施方案中，所述样品为人的体液，例如血液、血清或血浆。
在具体的实施方案中，所述捕获试剂为生物素标记的司库奇尤单抗，例如生物素标记的Cosentyx。
在具体的实施方案中，所述检测试剂为钌元素标记的司库奇尤单抗，例如钌元素标记的Cosentyx。
在具体的实施方案中，所述捕获试剂、所述检测试剂和所述IL-17A结合分子的重量百分比为约1：1：10。
在优选的实施方案中，所述试剂中的IL-17A结合分子的浓度为至少约20 µg/mL。
在第二方面，本申请提供了制备第一方面所述的试剂的方法，其包括：
将所述IL-17A结合分子用缓冲液，例如PBS，例如含有1% BSA无脂肪酸的PBS稀释成终浓度至少为约20 µg/mL的筛选稀释液；
将所述捕获试剂用所述筛选稀释液稀释成终浓度约为2000 ng/mL的捕获试剂工作液；
将所述检测试剂用所述筛选稀释液稀释成终浓度为约2000 ng/mL的检测试剂工作液；以及
将所述捕获试剂工作液和所述检测试剂工作液按1:1混合成所述试剂。
在具体的实施方案中，所述IL-17A结合分子为IL-17A受体。
在具体的实施方案中，所述捕获试剂为生物素标记的司库奇尤单抗，例如生物素标记的Cosentyx。
在具体的实施方案中，所述检测试剂为钌元素标记的司库奇尤单抗，例如钌元素标记的Cosentyx。
在第三方面，本申请提供了第一方面所述的试剂或者根据第二方面所述的方法制备的试剂用于检测样品中司库奇尤单抗抗药性抗体的用途。
在具体的实施方案中，所述样品为人的体液，例如血液、血清或血浆。
实施例
以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。在不背离本申请精神和实质的情况下，对本申请方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。
若未特别指明，实施例中所用的试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 检测司库奇尤单抗抗药性抗体的方法
本实施例的方法通过将血清样品进行酸解处理并于MSD平台上采用桥联式电化学发光技术(Bridging-ECLIA)定性检测人血清中的抗药抗体，其原理简要阐述如下：
将酸解后的血清样品与碱性中和试剂、Master Mix工作液于圆孔聚丙烯板中孵育形成生物素-药物~抗药抗体~药物-钌元素桥联式复合物，将孵育后的桥联式复合物转入到MSD 链霉亲和素微孔板中进行抓捕形成MSD微孔板-链霉亲和素~生物素-药物~抗药抗体~药物-钌元素桥联式复合物；洗板后加入MSD Read Buffer T(2x)，于MSD读板机上读取仪器信号，仪器信号值的大小与抗药性抗体浓度成正比；阳性对照样品用100%正常健康人血清配制(低、高浓度阳性对照样品配制：将阳性对照样品，配制于 100%混合人血清中得到浓度为50ng/mL和10000ng/mL的阳性对照样品)。结合其他临床研究的经验与相关报道，靶蛋白IL-17A会在给药后负反馈调节而升高，因此在Master Mix中加入高浓度的IL-17A受体，其能有效去除内源性IL-17A或rh IL-17A(即重组人IL-17A)的干扰，并且不影响ADA PC((Positive Control)，即阳性质控样品)的表现。
具体操作流程步骤如下：
1．样品酸处理
将分析批次中的样品用酸解液(300 mM HAc)或确证酸解液(含50μg/mL司库奇尤单抗的300 mM HAc)以1:50进行酸处理，于室温下以600 RPM振荡20~30min。所述样品是指待测样品或验证样品或系统适用性样品。待测样品是指临床试验采集的人血清样品；验证样品是指使用100%混合人血清配制的不同浓度的ADA阳性对照样品，例如灵敏度样品、精密度样品、耐药性样品、选择性样品、特异性样品等；系统适用性样品指的是阴性对照样品(100%混合人血清)以及低、高浓度阳性对照样品(将阳性对照样品，即兔抗司库奇尤单抗多克隆抗体(上海迈泰君奥生物技术有限公司提供，货号：ZJ-06-049)配制于 100%混合人血清(国内募集健康人个体血清混合而成，批号：HuSe10Nov2022)中得到浓度为50ng/mL和10000ng/mL的阳性对照样品)。系统适用性样品用于监控分析批通过与否。
2．Master Mix工作液配制
将IL-17A受体(重组人IL-17A受体胞外区-Fc融合蛋白，厂家：上海迈泰君奥生物技术有限公司，货号: ZJ-01-134)用稀释液，即含有1% BSA无脂肪酸的PBS，稀释成终浓度为0µg/mL、1 µg/mL、5 µg/mL、10 µg/mL、20 µg/mL和30 µg/mL的筛选稀释液；将捕获试剂浓缩液(Stock Bio-Cosentyx)(军科正源生物分析部使用生物素标记Cosentyx(瑞士诺华医药公司, 商品名：Cosentyx)所得)分别用各浓度的筛选稀释液稀释成终浓度为约2000 ng/mL的捕获试剂工作液；并将检测试剂浓缩液(Stock Ru-Cosentyx)(军科正源生物分析部使用钌元素标记Cosentyx所得)分别用各浓度的筛选稀释液稀释成终浓度约为2000 ng/mL的检测试剂工作液；最后将捕获试剂工作液和检测试剂工作液按1:1的体积比混合成MasterMix工作液，其中最终配制的Master Mix工作液含有6个不同浓度的IL-17A受体，即0µg/mL、1 µg/mL、5 µg/mL、10 µg/mL、20 µg/mL和30 µg/mL的IL-17A受体。
3．样品温育
1) 在圆孔聚丙烯板(厂家：Greiner Bio-one；货号：650201)中加入中和试剂(1MTris (pH 9.5))，30µL/孔；
2) 在圆孔聚丙烯板中加入上述配制好的Master Mix工作液，50µL/孔；
3) 在圆孔聚丙烯板中按照板图中样品顺序，单孔加入上述酸处理后的样品，80µL/孔；
4) 封板后于室温下以600 RPM避光振荡温育2.0 ~2.5hr。
4．MSD微孔板封闭
在MSD微孔板(厂家：Meso Scale Discovery；货号：L15SA-1)中加入封闭液，150µL/孔，于室温下以600 RPM避光振荡温育至少30min。
5．洗板
MSD微孔板封闭完成后，用洗板液(1xPBST)以不少于300μL/孔洗板3次，并于洁净纸上拍干。
6．转板加样
将圆孔聚丙烯板中样品按照板图转入MSD微孔板中，50μL/孔，封板后于室温下以600 RPM避光振荡温育1.0 ~ 1.5hr。
7．洗板
MSD微孔板温育完成后，用洗板液(1xPBST)以不少于300μL/孔洗板3次，并于洁净纸上拍干。
8．检测
将配制好的MSD Read Buffer T (2x)工作液(MSD Read Buffer T (4x)购买自Meso Scale Discovery；货号：R92TC-1，使用超纯水将MSD Read Buffer T (4x)按1:1稀释成MSD Read Buffer T (2x)工作液)加入MSD微孔板中，150μL/孔，15min内将MSD微孔板放入MESO QUICKPLEX SQ120中进行检测。
表1：试剂信息
实施例2 Master Mix工作液的优化
将兔抗司库奇尤单抗多克隆抗体用100%混合健康人血清配制为浓度为400~3.1ng/mL的样品，分别命名为样品STD01~STD08；并且将重组人 1L-17A (上海迈泰君奥生物技术有限公司；货号：ZJ-01-070)用100%混合健康人血清配制为浓度为100~1ng/mL的样品，分别命名为1L-17A 01~ 1L-17A 08。
将样品STD01~STD08和1L-17A 01~ 1L-17A 08按照实施例1的方法，通过在MESOQUICKPLEX SQ120中进行检测，得到的检测结果如表2所示。
表2
表2中的实验结果表明，Master Mix工作液中加入6个不同浓度的1L-17A受体后，ADA检测灵敏度一致，均可达到12.5ng/mL；1L-17A受体浓度为0μg/mL、1μg/mL、5μg/mL和10μg/mL时，内源性1L-17A的浓度为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/m时即呈现假阳性，干扰ADA的检测，无法满足银屑病患者血清样品的检测要求，1L-17A受体浓度为20μg/mL、30μg/mL时，内源性1L-17A的浓度高达20ng/mL时依旧不影响ADA的检测，完全满足银屑病患者血清样品的检测要求。因此选择含有至少20μg/mL 1L-17A受体的Master Mix工作液即可满足在ADA的信号不降低的情况下，1L-17A特异性做到至少20ng/mL的要求。
上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本申请作了详尽的描述，且在本申请基础上在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。
Claims (7)
1.IL-17A受体在制备用于检测样品中司库奇尤单抗抗药性抗体的试剂中的用途，其特征在于，所述样品为人的血清，所述试剂还含有能够结合所述司库奇尤单抗抗药性抗体的捕获试剂和用于检测的检测试剂，其中所述捕获试剂为生物素标记的司库奇尤单抗，所述检测试剂为钌元素标记的司库奇尤单抗，并且所述试剂中所述IL-17A受体的浓度为至少20µg/mL。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述生物素标记的司库奇尤单抗为生物素标记的Cosentyx。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述钌元素标记的司库奇尤单抗为钌元素标记的Cosentyx。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述捕获试剂、所述检测试剂和所述IL-17A受体的重量百分比为约1：1：10。
5.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述试剂通过包括以下的方法制备：
将所述IL-17A受体用缓冲液稀释成终浓度至少为20 µg/mL的筛选稀释液；
将所述捕获试剂用所述筛选稀释液稀释成终浓度为约2000 ng/mL的捕获试剂工作液；
将所述检测试剂用所述筛选稀释液稀释成终浓度为约2000 ng/mL的检测试剂工作液；以及
将所述捕获试剂工作液和所述检测试剂工作液按1:1混合成所述试剂。
6.如权利要求5所述的用途，其中所述缓冲液为PBS。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述PBS为含有1% BSA无脂肪酸的PBS。
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