CN117849327A - 用于检测苏金单抗抗药性抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种用于检测苏金单抗抗药性抗体的样品预处理方法及其应用。本申请提供的样品预处理方法通过酸解液对样品进行二次酸解处理，可以有效降低样品中游离IL‑17A的干扰，简单有效地解决了游离IL‑17A影响苏金单抗抗药性抗体检测的问题。
Description
技术领域
本申请涉及生物检测领域，具体涉及用于检测样品的预处理方法，尤其是用于检测苏金单抗抗药性抗体的样品预处理方法及其应用。
背景技术
随着生物技术的发展，单克隆抗体(mAb)已成为现代医学中重要的治疗药物。mAb具有治疗多种疾病和病症的潜力，但是mAb的重复使用可能引起高度的免疫原性。药物免疫原性体现在刺激生成抗药性抗体(anit-drug antibodies, ADA)。ADA可以改变药物的药代动力学和药效，从而降低药物疗效，甚至有可能会抵消药物的治疗效果或对患者造成严重的不良事件。因此，准确的ADA检测是必要的。
苏金单抗，又称为司库奇尤单抗(Secukinumab，商品名: Cosentyx)，是一种全人源IgG1抗IL-17A单克隆抗体，可选择性抑制IL-17A诱导的炎症级联反应，用于治疗强直性脊柱炎(AS)、银屑病关节炎(PsA)和中度至重度斑块型银屑病。
在苏金单抗抗药性抗体检测过程中，面临的一个主要挑战在于靶点分子IL-17A的干扰。尽管给药前IL-17A浓度不会显著影响ADA检测，但给药后，一方面由于苏金单抗迅速与血液中可溶性IL-17A结合，导致血液中游离IL-17A水平迅速降低，进而引发内在负反馈机制导致IL-17A分泌增多；另一方面IL-17A与苏金单抗结合导致清除显著减慢，从而导致总IL-17A水平显著升高。在ADA检测过程中需要采用酸解等方式将ADA-苏金单抗复合物解离开，形成游离的ADA以便于检测，但该过程同时还会释放苏金单抗结合的IL-17A分子，造成样品中游离IL-17A水平显著升高，而IL-17A会直接与捕获试剂和检测试剂桥连而出现假阳性信号。
现有解决上述问题的技术方法主要是采用抗IL-17A的抗体或者IL-17受体来进行干扰的解除。但该技术存在较大的缺陷和不足。首先，由于需采用诸如抗IL-17A的抗体或者IL-17受体的去除试剂来去除干扰，对于试剂及费用有高要求；其次由于采用的去除试剂是针对IL-17A的抗体，而苏金单抗也是针对IL-17A的抗体，因此有可能会产生交叉反应，从而降低检测的信号，导致假阴性结果产生的可能性；第三，一般涉及去除IL-17A的去除试剂的反应性也仅仅接近苏金单抗与IL-17A的亲和力，而给药后的苏金单抗的浓度水平很高，从而导致需要加入大量的去除试剂，而且效果也不太理想。
因此，仍然需要开发能够有效检测样品中苏金单抗抗药性抗体而不受高浓度游离IL-17A干扰的方法。
发明内容
针对上述问题，经过反复摸索，本申请的发明人开发了一种用于检测动物的体液样品(例如，人的体液样品，如血液、血浆、血清等)中苏金单抗抗药性抗体的样品预处理方法，由此开发了不受高浓度游离IL-17A干扰的用于检测苏金单抗抗药性抗体的方法。此外，本申请还提供了由此制备的相关产品及其应用。
具体地，本申请提供了如下技术方案：
第一方面，本申请提供了一种用于检测苏金单抗抗药性抗体的样品预处理方法，其包括利用酸解液对样品进行二次酸解处理的步骤。
具体地，所述二次酸解处理的步骤包括：利用酸解液对样品进行第一次酸解处理，使样品中的苏金单抗抗药性抗体解离出来；使第一次酸解处理后的样品与预先包被苏金单抗的固相载体接触，形成苏金单抗抗药性抗体-苏金单抗复合物；以及利用酸解液对与预先包被苏金单抗的固相载体接触后的样品进行第二次酸解处理，使苏金单抗抗药性抗体-苏金单抗复合物中的苏金单抗抗药性抗体解离出来。
第二方面，本申请提供了用于检测苏金单抗抗药性抗体的方法，其包括采用第一方面所提供的样品预处理方法对样品进行预处理的步骤。
此外，本申请提供了用于检测苏金单抗抗药性抗体的方法还包括采用酶联免疫吸附测定技术检测样品中苏金单抗抗药性抗体的步骤。
第三方面，本申请提供了一种用于检测苏金单抗抗药性抗体的试剂盒，其包括：包含200 mM至400 mM醋酸的酸解液；和预先包被苏金单抗的固相载体，其中所述苏金单抗的浓度为9 μg/mL至11 μg/mL。
此外，本申请提供的用于检测苏金单抗抗药性抗体的试剂盒还包括用于进行酶联免疫吸附测定技术检测样品中苏金单抗抗药性抗体的其他试剂。
第四方面，本申请还提供了第三方面所提供的试剂盒在检测苏金单抗抗药性抗体中的应用。
可见，本申请提供了用于检测苏金单抗抗药性抗体的样品预处理方法和用于检测苏金单抗抗药性抗体的方法，通过对样品进行二次酸解处理，无需额外试剂就可解决样品中高浓度游离IL-17A干扰的问题，即，解决了样品中高浓度游离IL-17A影响苏金单抗免疫原性检测的问题。
已知健康人血清中游离IL-17A浓度约为6.5-58.09pg/mL，而强直性脊柱炎患者血清中游离IL-17A浓度会有所升高，给予苏金单抗后，强直性脊柱炎患者血清中IL-17A由于负反馈调节和消除速度变慢而显著提高，因此苏金单抗抗药性抗体检测时要求方法对游离IL-17A耐受水平需不低于58.09pg/mL；文献报道强直性脊柱炎患者血清中IL-17A浓度约为168.22±71.86 pg/mL，使用本申请提供的检测方法，在保证各参数满足法规(例如《药物免疫原性研究技术指导原则》)要求前提下，在游离IL-17A浓度达到1000 pg/mL时仍然不影响苏金单抗抗药性抗体的检测，满足强直性脊柱炎患者血清样品的检测要求。
具体实施方式
本文所用的“样品”，意指来自动物的体液样品，包括血液、血清，血浆，培养上清，细胞/组织裂解液，脑脊液，尿液，汗液，灌洗液等生物学样品，特别是来自人的体液样品，例如人血液、血清、血浆等。
具体而言，本申请提供了如下技术方案：
第一方面，本申请提供了一种用于检测苏金单抗抗药性抗体的样品预处理方法，其包括利用酸解液对样品进行二次酸解处理的步骤。
在具体的实施方案中，本申请提供的用于检测苏金单抗抗药性抗体的样品预处理方法，包括以下步骤：利用酸解液对样品进行第一次酸解处理，使样品中的苏金单抗抗药性抗体解离出来；使第一次酸解处理后的样品与预先包被苏金单抗的固相载体接触，形成苏金单抗抗药性抗体-苏金单抗复合物；以及利用酸解液对与预先包被苏金单抗的固相载体接触后的样品进行第二次酸解处理，使苏金单抗抗药性抗体-苏金单抗复合物中的苏金单抗抗药性抗体解离出来。
在具体的实施方案中，所述酸解液包含200 mM至400mM的醋酸，优选300 mM的醋酸。
在具体的实施方案中，所述酸解液的pH为pH 1.0至pH 4.0，优选pH 2.0 至pH3.0。
在具体的实施方案中，所述第一次酸解中使用的酸解液为300 mM的醋酸（pH3.0），所述样品与所述酸解液的体积比为1: 40至1:60，优选为1:50。
在具体的实施方案中，所述第二次酸解中使用的酸解液为300 mM的醋酸（pH2.0），所述样品与所述酸解液的体积比换算为1:1至1:3，优选为1:1.5。
在具体的实施方案中，所述第一次酸解处理的条件如下：于20℃至30℃静置温育样品30分钟至45分钟。
在具体的实施方案中，所述预先包被苏金单抗的固相载体中苏金单抗的浓度为9μg/mL至11 μg/mL，优选9.5 μg/mL至10.5 μg/mL，最优选10 μg/mL。
在具体的实施方案中，所述第一次酸解处理后的样品与所述预先包被苏金单抗的固相载体中苏金单抗的体积比换算为1:1。
在具体的实施方案中，所述第二次酸解处理的条件如下：于20℃至30℃，以300rpm至500 rpm，优选350rpm的转速振荡温育2小时以上，优选2小时至2.5小时。
在具体的实施方案中，所述样品为动物的体液样品，例如血液、血清或血浆。
在具体的实施方案中，所述样品为人血清。
另一方面，本申请提供了一种用于检测苏金单抗抗药性抗体的方法，其包括采用第一方面所提供的样品预处理方法对样品进行预处理的步骤。
在具体的实施方案中，本申请提供的用于检测样品中苏金单抗抗药性抗体的方法，包括采用第一方面所提供的样品预处理方法对样品进行预处理的步骤和采用酶联免疫吸附测定技术定性检测样品中苏金单抗抗药性抗体的步骤。
在具体的实施方案中，所述样品为动物的体液，例如血液、血清或血浆。
在具体的实施方案中，所述样品为人血清。
第三方面，本申请还提供了一种用于检测苏金单抗抗药性抗体的试剂盒，其包括：酸解液，所述酸解液包含200 mM至400 mM的醋酸，优选300 mM的醋酸；和预先包被苏金单抗的固相载体，其中所述苏金单抗的浓度为9 μg/mL至11 μg/mL。
在具体的实施方案中，所述酸解液的pH为pH 1.0至pH 4.0，优选pH 2.0 至pH3.0。
在具体的实施方案中，所述酸解液独立地包含pH 3.0的300 mM的醋酸和pH 2.0的300 mM的醋酸。
在具体的实施方案中，本申请提供的试剂盒还包括用于进行酶联免疫吸附测定技术定性检测样品中苏金单抗抗药性抗体的其他试剂，例如各种缓冲液，包括中和试剂、稀释液、封闭液、洗板液、终止液等，检测试剂，例如酶标二抗(如，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(SA-HRP))及其显色底物(如，邻苯二胺(OPD))。
此外，第四方面，本申请还提供了第三方面所提供的试剂盒在检测苏金单抗抗药性抗体中的应用。
实施例
以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。在不背离本申请精神和实质的情况下，对本申请方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。
若未特别指明，实施例中所用的试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
以下实施例中使用的试剂信息以下表1所示。
表1 试剂信息
实施例1
在本实施例中，通过本申请提供的预处理方法对人血清样品进行预处理，并采用采用酶联免疫吸附测定技术检测样品中的苏金单抗抗药性抗体，其原理简要阐述如下：
1)将酸处理后的样品加入预先包被苏金单抗的96孔酶标板中，温育过夜，确保样品中ADA与固相载体中苏金单抗形成ADA-苏金单抗复合物，洗板后加入酸解液从该复合物中解离出ADA；2)将中和试剂以及酸解离后的样品加入另一块96孔酶标板中，室温避光震荡温育，封闭洗板后加入检测试剂，室温震荡温育并洗板后加入酶标二抗，室温避光震荡温育，洗板后加入显色底物显色，室温避光震荡温育后加入终止液终止反应，于BioTek读板机读取仪器信号值。仪器信号值的大小与抗药性抗体浓度成正比。将100%正常健康人血清根据所需浓度用稀释液进行稀释作为阳性对照样品。
具体操作流程步骤如下：
1. 酶标板的包被和封闭
将苏金单抗用包被稀释液稀释至约10 μg/mL，作为捕获工作液加入ELISA酶标板中，100μL/孔，封板后于2℃至8℃静置过夜。
用洗板液以每次不少于300 μL/孔洗板3次后，将封闭试剂(I-Block试剂)加入已包被苏金单抗的ELISA酶标板中，300μL/孔，封板后于22℃至28℃封闭至少2 hr。
2. 样品的酸处理
将所有待测血清样品用酸解液I (300 mM HAC，pH 3.0)以1:50的体积比进行酸处理，震荡混匀后，于室温静置30 min至45 min。
3. 样品温育和解离
用洗板液以每次不少于300 μL/孔洗板3次后，在步骤1中制备好的ELISA 酶标板中加入中和试剂30 μL/孔，再加入在步骤2中酸处理后的样品，100 μL/孔，封板后20℃至30℃温育过夜。
用洗板液以每次不少于300 μL/孔洗板3次后，在捕获了ADA的ELISA酶标板中加入酸解液II (300 mM HAC，pH 2.0)，150μL /孔，封板后于室温避光并以350rpm的转速振荡温育20 min至40min。
4. 转板温育和封闭
在另一块新的ELISA 酶标板中加入中和试剂，20μL/孔，按照板图中样品顺序，加入步骤3解离后的样品，60μL/孔，封板后于室温避光并以350 rpm的转速振荡温育2.0 hr至2.5hr。
用洗板液以每次不少于300 μL/孔洗板3次后，将封闭液加入已捕获ADA的ELISA酶标板中，300 μL/孔，封板后于22℃至28℃封闭至少1 hr。
5. 检测
用洗板液以每次不少于300 μL/孔洗板3次后，将检测工作液(用稀释液将Bio-Drug稀释至约100ng/mL)加入在步骤4中已封闭的ELISA 酶标板中，50 μL/孔，封板后于室温以350 rpm的转速振荡温育1.0 hr至1.5hr。
用洗板液以每次不少于300μL/孔洗板3次后，将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(SA-HRP)工作液(用I-Block将SA-HRP以约1:5000稀释)加入ELISA 酶标板中，100μL/孔，封板后于室温避光并以350rpm的转速振荡温育20 min至30 min。
用洗板液以每次不少于300μL/孔洗板3次后，将邻苯二胺(OPD)显色底物液加入ELISA 酶标板中，100μL/孔，于室温避光温育20min至30min。
将终止液以50μL/孔加入ELISA酶标板中，轻微振荡混匀，确保各孔边缘无橙-黄色现象，并于5 min内将ELISA 酶标板放入BioTek读板机中进行检测，检测波长设置为490nm。
根据上述操作流程步骤对含不同ADA浓度的血清样品进行检测，以确定该方法的灵敏度和特异性，结果如表2所示。
表2
临界值：按照《药物免疫原性研究技术指导原则》要求，通过验证试验数据统计获取用于判定检测结果阴阳性的数值。
吸光度：BioTek读板机读数数值。
信噪比：样品仪器响应值与阴性对照样品响应值的比值。
由表2可知，本发明的检测方法，在灵敏度满足国家药监局药审中心发布的《药物免疫原性研究技术指导原则》及临床检测要求的情况下，可耐受1000pg/mL的游离IL-17A对方法及样品检测结果的影响。
上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本申请作了详尽的描述，且在本申请基础上在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种用于检测苏金单抗抗药性抗体的样品预处理方法，其包括利用酸解液对样品进行二次酸解处理的步骤，所述二次酸解处理的步骤包括：
利用酸解液对样品进行第一次酸解处理，使样品中的苏金单抗抗药性抗体解离出来；
使第一次酸解处理后的样品与预先包被苏金单抗的固相载体接触，形成苏金单抗抗药性抗体-苏金单抗复合物；和
利用酸解液对与预先包被苏金单抗的固相载体接触后的样品进行第二次酸解处理，使苏金单抗抗药性抗体-苏金单抗复合物中的苏金单抗抗药性抗体解离出来。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述酸解液包含200 mM至400 mM的醋酸。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述酸解液的pH为pH 1.0至pH 4.0。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述第一次酸解处理的条件如下：使用pH 3.0的300mM的醋酸，以1: 40至1:60的体积比，于20℃至30℃静置温育样品30分钟至45分钟；
其中所述预先包被苏金单抗的固相载体中苏金单抗的浓度为9 μg/mL至11 μg/mL；
其中所述第一次酸解处理后的样品与所述预先包被苏金单抗的固相载体中苏金单抗的体积比为1:1；和/或
其中所述第二次酸解处理的条件如下：使用pH 2.0的300 mM的醋酸，以1: 1至1:3的体积比，于20℃至30℃，以300 rpm至500 rpm的转速振荡温育样品2小时至2.5小时。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述样品为血液、血清或血浆。
6.一种用于检测苏金单抗抗药性抗体的方法，其包括采用权利要求1至4中任一项所述的样品预处理方法对样品进行预处理的步骤。
7.如权利要求6所述的方法，其还包括采用酶联免疫吸附测定技术检测样品中苏金单抗抗药性抗体的步骤。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中所述样品为血液、血清或血浆。
9.一种用于检测苏金单抗抗药性抗体的试剂盒，其包括：
酸解液，所述酸解液包含200 mM至400 mM的醋酸；和
预先包被苏金单抗的固相载体，其中所述苏金单抗的浓度为9 μg/mL至11 μg/mL；
其中所述酸解液的pH为pH 1.0至pH 4.0。
10.权利要求9所述的试剂盒在检测苏金单抗抗药性抗体中的应用。
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