JPH07501219A

JPH07501219A - 心糸状虫に対するプロテアーゼワクチン

Info

Publication number: JPH07501219A
Application number: JP5509382A
Authority: JP
Inventors: グリーブ，ロバート・ビー; リッチャー，ジェニファー; フランク，グレン・アール; サカナリ，ジュディー
Original assignee: ザ・コロラド・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファンデーション
Priority date: 1991-11-12
Filing date: 1992-11-12
Publication date: 1995-02-09
Also published as: WO1993010225A1; CA2123420A1; EP0635058A1; EP0635058A4; AU675214B2; AU3072392A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】心糸状虫に対するプロテアーゼワクチン技術公団本発明は線虫に起因する動物宿主中のフィシリア症、例えばイヌに最も一般に発生する寄生虫の予防および治療に関する。心糸状虫の感染は線虫のジロフィラリア・イミチス（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ　１ｍｍ１ｔｉｓ）によるもので、本発明の治療および予防法は、特にこの症状に適用するため、この生物に付随する特異的メタロプロテアーゼおよび／またはシスティンプロテアーゼを用いる。

背景技術り、１ｍｍ１　ｔ　ｉ　ｓに起因する心糸状虫感染はアフリカを除く世界の殆どの地域で広く分布するイヌの問題である。現在の治療法は一般に感染生物を直接殺すようにデザインされた薬剤による化学療法である。この治療は受け入れられてはいるが、そのような治療に伴う固有の毒性のために、宿主を感染から免疫学的に防御するか、化学療法をより毒性のすくない薬剤に取り替えることが好ましい。

本発明はそのような目標をめざすものである。

その他のフィラリア線虫感染はさらに重大な意味をもち、心糸状虫の場合と似た感染因子の生活サイクルか関係している。例えば、より重要なのはヒトに感染する他の糸状虫であり、全世界で２億Å以上かそのような感染を有すると推定される。ヒトに感染する糸状虫には、Ｂｒｕｇｉａ　ｍａｌａｙｉ、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ　ｂａｎｃｒｏｆｔｉおよび０ｎｃｈｏｃｅｒｃａ　ｖｏｌｖｕｌｕｓか含まれる。これらはヒトにおける失明や象皮病をひきおこす重大な寄生虫である。現在フィラリア線虫感染に対する有効なワクチンは得られていない。

感染因子のライフサイクルはこれらの病気の全てにおいて似ているので、心糸状虫の感染を例として説明する。そのライフサイクルは次ぎのとおりである。

心糸状虫感染、特にイヌにおける感染は、一般に第３齢期（Ｌ３）の線虫り。

１ｍｍ１ｔｉｓが、蚊を媒体として皮下組織に侵入することによりひき起こされる。これらの幼虫か動物の組織に伝達されると、そのライフサイクルが継続して脱皮により第４齢期（Ｌ４）幼虫になり、これが心臓および肺動脈へ移動して、その場所で成虫になる。Ｌ３幼虫は脱皮を起こすまでは接種された場所に留まっている。Ｌ４幼虫は皮膚組織および筋肉を移動し、感染後５０〜７０日間は第５齢幼虫に脱皮することはない（Ｇｒｉｅｖｅ、Ｒ，ら、Ｅｐｉｄｅｍ　Ｒｅｖ　（１９８３）、５　：　２２０−２４６）。長さ１２−１２−２Ｏ雄）および２５２５−３１ａ雌）の成虫のり、１ｍｍ１ｔｉｓは、その存在部位で、ミクロフィラリア（ｍｉｃｒｏｆ　ｉ　Ｉａｒｉａｅ）と呼ばれる運動性の有害形態の胚を生産し、この胚は長さがわずか０．　３ｎ＋ｍＬかなく、毛細管ベッドを横切って血管系を循環する。コノミクロフィラリアは蚊に吸われて蚊媒体内でそのライフサイクルを継続スる。

したがって、Ｌ３からＬ４への移行が動物宿主での感染サイクルの初期ステップである。移行のためには脱皮過程が必要であり、この過程についてはＡｂｒａｈａｍ、Ｄ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ（１９９０）　７０：３１４−３２２において研究されている（この文献の内容は参照により本明細書に含まれる）。この研究では、脱皮の間の幼虫の形態が観察され、そしてこの過程に必要とみられる温度とアルブミンの役割が検討された。

Ｌ３齢幼虫は、捨て去られる表皮と上クチクラを含み、そして幼虫の体壁はＬ４期の表皮と上クチクラに包まれている。この脱皮の過程で、脱皮過程で用いられると推定される酵素を他の成分と共に含む排泄性−分泌性（Ｅ−３）プロダクトが形成される。

種々の寄生性ぜん虫（ｆｌｅｌｍｉｎｔｈ）の排泄性−分泌性プロダクトは研究されている。それらの多くに、プロテアーゼ類が見つかっている。Ｓｃｈ　ｉ　ｓ　ｔｏｓｏｍａ　ｍａｎｓｏｎｉおよびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｔｉｕｍ　ｄｏｕｔｈｉｔｔｉは、皮膚を分解することができるエラスターゼ類を生産する（Ｍｃｋｅｒｒｏｗ、Ｊ、Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ　（１９８２）　５３：２４９＋Ｍｃｋｅｒｒｏｗ、Ｊ、Ｈ，、ｅｔａｔ、、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９８５）２３１：４７；Ａｍ１ｒｉ、Ｐ。

、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ　（１９８８）２８：１１３）ＯＦａｓｃｉｏｌａ　Ｈｅｐａｔｉｃａもまた、いくつかの蛋白分解酵素を放出する（Ｄａｌｔｏｎ、Ｊ、Ｐ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ　（１９８９）３５：１６１）、鉤虫Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ　ｃａｎｉｎｕｍの成虫は、組織溶解性プロテアーゼおよび抗凝固剤として作用するプロテアーゼを放出する（Ｈｏｔｅｚ、Ｐ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９８５）２６０ニア３４３）。Ｔｏｘｏｃａｒａｃａｎｉｓの幼虫は、細胞外マトリックス成分を分解するプロテアーゼを分泌する（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、　Ｂ、　Ｄ、　、　ｅｔ　ａｌ、　、　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＰａｒａｓｉｔｏｌ　（１９８９）６９：３０）。

多くのフィラリア線虫もまた、細胞外マトリックス成分を分解するプロテアーゼを生産することが知られていて、その例には０ｎｃｈｏｃｅｒｃａ　ｃｅｒｖｉｐｅｉｄｉｓ、Ｏ，ｃｅｒｖｉｃａｌｉｓおよびＢｒｕｇｉａ　ｍａｌａｙｉが含まれる（Ｌａｃｋｅｙ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ、、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＰａｒａｓｉｔｏｌ　（１９８９）６８：１７６；Ｐｅｔｒａｌａｎｄａ、１、、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ　（１９８６）１９：５１）ｏＢｒｕｇｉａ　ｍａｌａｙｉ、　Ｏ，ｃｅｒｖｉｃａｌｉｓおよび０．ｃｅｒｖｉｐｅｄｉｓの場合には、プロテアーゼ活性はコラゲナーゼをふくんでいる。Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの脱皮過程においては、コラゲナーゼとロイシンアミノペプチダーゼが、Ｒｏｇｅ　ｒ　ｓ、　Ｗ、Ｐ、　、Ｊ、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ　（１９８２）１２：４９５、およびＧａｍｂ　Ｉ　ｅ、　Ｈ，Ｒ、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ　（１９８９）３３．４９により見いだされている。

Ｄ、１ｍｍ１ｔｉｓに関してのプロテアーゼ活性は、Ｍａｋｉ、Ｊ、、ｅｔａｌ、、Ｊ　Ｈｅ１ｍ１ｎｔｈｏｌ　（１９８６）６０：３１−３７によりり、１ｍｍ１ｔｉｓ成虫の可溶性抽出物中に、およびＴｏｍａｓｈｉｒｏ、Ｗ、に、。

ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ　（１９８７）７３：１４９−１５４によりミクロフィラリアの抽出物中に、検出されている。しかしながら、Ｄ、１ｍｍ１ｔｉｓのＬ３およびＬ４の可溶性抽出物中や、これらの幼虫期の排泄性−分泌性（Ｅ−３）プロダクトについての研究は、従来なされていない。

さらに、コラーゲンか線虫の表皮の主要な構成成分を形成することは、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ、　Ｂ、ｍａｌａｙｉおよびＢ、ｐａｈａｎｇｉについてされた研究により知られている。

光朋二別示本発明は動物宿主におけるフィラリア線虫感染の予防および治療、ならびに該感染の原因寄生虫のＬ３およびＬ４期に存在するプロテアーゼの精製およ単離されたものに関する。そのような線虫の一つはり、１ｍｍ１ｔｉｓであり、これはイヌの心糸状虫の原因である。他の重要な病気も上に列挙した線虫により生じる。

本発明はフィラリア線虫に起因する動物の病状を解消する方法を提供し、そのような方法およびｉｎ　ｖｉｔｒｏでも有用な材料を提供する。

したがって、ひとつの観点において本発明は、ヒトを含む動物をフイラリア線虫感染から防御する方法を提供し、該方法は、関連するフイラリγ線虫のＬ３からＬ４期への転移に特異的なメタロプロテアーゼおよび／またはシスティンプロテアーゼを、動物を感染から免疫学的に効果的に防御するために動物に有効量投与することからなる。そのための特徴的メタロプロテアーゼは、Ｌ３またはＬ４の排泄性−分泌性材料中、またはＬ３またはＬ４幼虫のライセード中から得ることができる。システィンプロテアーゼはＬ３またはＬ４幼虫のライセード中から得ることができる。

別の観点において、本発明はヒトを含む動物の線虫フイラリア感染の治療に関し、該方法は有効量のメタロプロテアーゼインヒビターおよび／またはシスティンプロテアーゼインヒビターを該動物に投与することから成る。

別の観点において、本発明はＬ３またはＬ４の排泄性−分泌性プロダクトに対する、またはＬ３またはＬ４幼虫のライセード中のメタロプロテアーゼに対する、またはＬ３またはＬ４幼虫のライセード中のシスティンプロテアーゼに対する免疫特異的な抗体、並びにそのような抗体を含有する医薬組成物およびワクチンに関する。

さらに別の観点において、本発明はフィラリア寄生虫のＬ３／Ｌ４−付随メタロプロテアーゼおよびシスティンプロテアーゼの単離および精製されたものに関する。それら精製されたプロテアーゼは感染個体の診断のために抗体の存在もしくは不存在をアッセイするためにも、そしてｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞培養物の増殖を調節するためにも、さらに他の治療的応用のためにも有用である。

凹面Ω皿巣ｌ説■ 図１はＬ３／Ｌ４のＥ−８からのプロテアーゼ活性の溶出パターンである。

図２はＬ４ライセードからのプロテアーゼ活性の溶出パターンである。

、ｌＩを　るためのモード本明細書において使用する、Ｌ３およびＬ４排泄性−分泌性調製物の、またはＬ３もしくはＬ４ライセードの「メタロプロテアーゼＪとは、Ｌ３３幼虫からＬ４のフィシリア感染性線虫に脱皮する間に得られる排泄性−分泌性プロダクトまたはＬ３もしくはＬ４４幼虫の全幼虫ライセードに特徴的なメタロプロテアーゼ酵素を意味する。少なくとも一種の「システィンプロテアーゼ」もＬ３ライセードおよびＬ４ライセード中に見いだされる。以下には、Ｄ、１ｍｍ１ｔｉｓからのＥ−Ｓ調製物およびライセード調製物を例示するが、同様のＥ−３調製物およびライセード調製物は、背景技術の項で述べたような他の種々のフイラリア寄生虫からも得られ、そのようなフィラリア寄生虫の例には、特にＢ、ｍａｌａｙｉ、Ｗ、ｂａｎｃｒｏｆｔＬ　Ｏ，ｖｏｌｖｕｌｕｓ、　Ｄｉｐｅｔａｌｏｎｅｍａ　ｐｅｒｓｔａｎｓ、　Ｄ、５ｔｒｅｐｔｏｃｅｒｃａ、Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ　ｏｚｚａｒｄｉ、およびＬｏａ　ｌｏａが含まれる０幼虫培畏吻Ω凋製Ｅ−３ｇ製物またはＬ３もしくはＬ４のライセードの供給源として、適当な条件下で寄生虫をｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養することができる。例えば、Ｉ）、１ｍｍ１ｔｉｓはＡｂｒａｈａｍ、Ｄ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ　（１９８７）７３・３７７−３８３に記載されたようにして培養できる。簡単に述べると、蚊（Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔ　ｉ）のＬｉｖｅｒｐｏｏ１種（黒目種）に、実験感染させた一匹のイヌから得たミクロフイラリア血を与えて感染させる。血を与えてから１５日後、蚊を麻酔し体表面を消毒し、そして、ＮＣＴＣ−１３５とイスコツの改良ダルベツコ培地（シグマ社）に２．５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ　；　１１００Ｉ１／ｍｌのゲンタマイシン、５０μｇ／ｍ＋のスルファシアシン：および１０μｇ／ｍｌのトリメトプリムを加えたものとの１・１混合物で満たしたロートの網の上にのせる。９０分間のインキュベートの後、幼虫をロートから回収する。

培養物は培地１ｍｌ当たりＬ３幼虫１０匹の濃度で、５％ＣＯ２および飽和湿度に維持する。このＬ３幼虫を、前記培地中に２０％ウシ胎児血清を加えたものの中で３７℃にて１−８日間培養する。

代替的かつ好ましい方法としては、血を与えてから１０日後、蚊を麻酔し、断頭して幼虫を、Ｓｅｒｕ−ｍａｘ（シグマ社）２０％を含む培地中に出して回収し、脱皮をおこさせる。４８時間後、幼虫を回収し、Ｓｅｒｕ−ｍａｘを含まない培地で５回洗浄し、そして￥地中で再培養する。

Ｌ３およびＬ４のＥ−３の−１Ｌ３のＥ−８はＳｅｒｕ−ｍａｘを含まない培地で４８ないし９６時間培養したものから集める。Ｌ４のＥ−３は同様の培養条件で９６ないし１４４時間培養したものから集める。Ｅ−３を含む培地を集め、０．４５μｍのフィルターでろ過する。１０ｋｄの排除限界の限外ろ過により、Ｅ−３を濃縮して緩衝液をｐＨ７，２のＰＢＳに交換して、１０ｋｄを超える分子量のフラクションを得る。

Ｌ３ライセードおよびＬ４ライセードの−１可溶性の幼虫抽出物は、２日目に、洗浄直後の脱皮前に集めたＬ３から、および血清不含培地で６日目に集めたＬ４から調製する。ＰＢＳ中の１０，０００幼虫のベレットを、音波式組織破砕器を用いて高周波で１０秒間１０回破砕する。

音波処理した幼虫は１２．ＯＯＯＸｇで５分間遠心し、上清を集める。

Ｅ−５およびライセードの　のＥ−３および全幼虫可溶性抽出物のタンパク質濃度は、Ｍｉｃｒｏ　ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて測定することが出来る。全てのサンプルはさらに分析するまで一２０℃に保持する。

Ｌ３およびＬ４　Ｅ−８調製物のまたはＬ３またはＬ４ライセードの「メタロプロテアーゼＪは、フィラリア線虫寄生虫の第３齢もしくは第４齢幼虫の排泄性− 分泌性プロダクト中、またはＬ３またはＬ４ライセード中に見られるプロテアーゼ酵素であって、合成基質ｈ−フェニルアラニン−ＡＭＣ（以下、ｈ−Ｆ−ＡＭＣ）に対する活性により確認され、１．１０−フェナントロリンおよびＥＤＴＡのようなメタロプロテアーゼインヒビターにより阻害されるものを意味する。

メタロプロテアーゼ活性は、前記Ｂ、ｍａｌａｙｉ、Ｏ，ｃｅｒｖｉｃａｌｉＳおよびＯ，ｃｅｒｖｉｐｅｄｉｓ等のある種の第３齢幼虫のＥ−Ｓプロダクト中に報告されている。その活性はＬ３およびＬ４ライセード中にも存在する。

本発明は、上記のようにして調製されるＬ３またはＬ４ライセードの中の「システィンプロテアーゼ（類）」にも関する。本発明のシスティンプロテアーゼは、Ｚ−バリンーロインンーアルギニンーＡＭＣ（以下、Ｚ−ＶＬＲ−ＡＭＣ）を加水分解する能力を特徴とし、この活性はＥ６４により阻害される。この場合も、Ｄ、１ｍｍ１ｔｉｓを以下の説明に用いるが、他のフィラリア線虫を用いることも可能である。

これらの酵素は、以下にさらに記載するように適当な基質を用いたアッセイで溶出フラクションをモニターしながらクロマトグラフィーにより精製、単離された形で得ることができる。

Ｌ３およびＬ４　Ｅ−３Ｒ製物のメタロプロテアーゼや、Ｌ３またはＬ４ライセードのメタロプロテアーゼまたはシスティンプロテアーゼをワクチン材料を提供するために十分な量で得ることは、実用的には容易でないから、大量調製が望ましいときは代替製造方法が好ましい。特に、全長のメタロプロテアーゼまたはシスティンプロテアーゼのためには、組み換えによる生産が最も実際的方法であり、メタロプロテアーゼまたはシスティンプロテアーゼの活性を中和する抗体を誘発させることの出来る免疫サブユニットのためには、通常の固相ペプチド合成が好ましいであろう。しかしながら、そのような場合でも、免疫サブユニットの直列繰り返しを得るためには、組み換え法による生産が好ましい。直列繰り返しの生産は、材料の免疫原性を高めるであろう。さらに、サブユニットワクチンは、免疫原性付与配列とつながった融合タンパク質としても、組み換え法で製造できるであろう。

み　え　による′告関連するメタロプロテアーゼまたはシスティンプロテアーゼの生産のために必要な組み換え配列は、５ａｋａｎａｒｉ、Ｊ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ、、ＰｒｏｃＮａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（１９８９）８６：４８６３の記載と同様の方法で得ることが出来る。この方法では、メタロプロテアーゼまたはシスティンプロテアーゼをコードする遺伝子を、寄生虫のＬ３またはＬ４期の全ｍＲＮＡからオリゴヌクレオチドブライマー、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）および適当なプローブを用いて調製したｃＤＮＡから単離する。

プロテアーゼをコードする遺伝子の供給源としては、Ｄ、１ｍｍ１　ｔ　ｉ　ｓのゲノミックＤＮＡもしくはｃＤＮＡが用いられる。メタロプロテアーゼ遺伝子の単離のためには、バクテリアのメタロプロテアーゼであるサーモリシンおよびヒトメタロプロテアーゼのメンバー（ストロメリシン、ストロメリシン■、およびＰｕｍｐ−１を含む）のコンセンサス配列に基づいてプライマーをデザインする。

これらの高度に相同性の遺伝子は全てメタロプロテアーゼであり、それらの配列を含むｃＤＮＡは報告されている（Ｍｕｌｌｅｒ、Ｄ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉ。

ｃｈｅｍ　Ｊ　（１９８８）２５３＋１８７−１９２およびＱｕａｎｔｉｎ、Ｂ。

、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９８９）２８：５３２７−５３３４）。プライマーは活性部位を含む保存された領域に基づいてデザインできる。ＰＣＲによる増幅は前記５ａｋａｎａｒｉ　ｅｔ　ａｌ、に記載されたようにして行い、反応生成物をアガロース／ＮｕＳ　ｉ　ｅｖｅ　（ＦＭＣ）に負荷する。上記の報告された配列に基づいてデザインした別のプローブを用いて、サザンプロット法により関連する増幅遺伝子産物を同定する。フラグメントをゲルから切りだし、ｒｇｌａｓｓ　ｍｉ　ｌｋＪ　（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）で抽出し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にライゲートし、５ｅｑｕｅｎａｓｅ　（ＵＳＢ）およびＳＫプライマーとＫＳプライマーを用いて両方向に配列決定するＳａｎｇｅ　ｒのダイチオキシ法を用いて、コード鎖および非コード鎖両者の配列をめる。得られた遺伝子フラグメントを次いでプローブとして用いて、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。プローブは標準的ランダムプライム法で３２Ｐ標識しておく。

システィンプロテアーゼ遺伝子のための同様なプローブの調製のためには、Ｅａｋｉｎ、Ａ、Ｅ、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐａｒａｓｉｔ。

１　（１９９０）３９・１−８に開示されている配列に基づいてプライマーをデザインする。その他、ゲノムＤＮＡからのプローブの製造は上記の方法で行うことができる。

ｃＤＮＡライブラリーは、４８〜７２時間培養した第３齢期幼虫から単離したｍＲＮＡから構築される。ｍＲＮＡの単離は、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、Ｐ、および５ａｃｃｈｉ、Ｎ、、Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　（１９８７）１６２：１５６−１５９の一工程の酸性チオシアン酸グアニジン／フェノール／クロロホルム抽出法で行う。ＲＮＡはオリゴ−ｄＴセルロースカラムに通過させ、ポリ−ＡＲＮＡを標準的方法で溶出させる。ｃＤＮＡは、Ｇｕｂｌｅｒ、Ｕ、およびＨＯｆ　ｆｍａｎ、Ｂ、Ｊ、、Ｇｅｎｅ　（１９８３）２５：２６３のような標準的方法を用いて、ｍＲＮＡから調製する。ｃＤＮＡは内部ＥｃｏＲＩサイトのメチル化処理を施し、ｃＤＮＡの末端にＥｃｏＲＩリンカ−を付加し、そして再度ホスファターゼで処理する。処理したｃＤＮＡは、λ−ｇｔｌｌアーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）へ挿入して、Ｇｉｇａｐａｃ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてパッケージジグするための粘着クローニング末端を生じさせるため、ＥｃｏＲＩで消化されたリンカ−を有している。標準的方法を用いてライブラリーを滴定しそしてブレーティングしてスクリーニングする。

ライブラリーは、上記のようにして得られるプローブを用いて、または異種プローブを用いてスクリーニングしてよく、或は発現産物をＥ−Ｓプロダクトもしくはライセードから調製したプロテアーゼに対して調製した抗体を用いてスクリーニングしてもよい。選択したクローンをプラーク法で精製し、そして単離したコード配列を用いて組換えプロテアーゼを製造する。

クローニングしたＤＮＡは直接発現ベクター中で用いてもよく、あるいは標準的固相法を用いてＤＮＡを合成することにより、該遺伝子の全体もしくは部分を供給するための任意の態様の遺伝子を得ることができる。

例えば、プロテアーゼに対するＤＮＡコード配列は、天然遺伝子によりコードされるアミノ酸配列のフトンを含む、オーバーラツプオリゴヌクレオチドから合成法により調製することかできる。そのようなオリゴヌクレオチドは標準的方法で調製して、完全ならしくは部分的コート配列に組み立てることができる。例えば、Ｅｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）２９２＋７６５；Ｎａｍｂａｉｒ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８４）２２３：１２９９；Ｊａｙ　ｅｔ　ａｌｌ、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９８４）２５９＋６３１１を参照。

このように、フィラリア線虫のメタロプロテアーゼまたはシスティンプロテアーゼをコードする配列を含むＤＮＡ分子は、任意の適当なベクター中にクローニングして、該プロテアーゼのコート配列を含まないベクター（例えば、他のライブラリークローン）を実質的に含まない組成物として維持することができる。当業者には多くのクローニングベクターが知られており、適当なりローニングベクターの選択は、好みの問題である。クローニングのための組換えＤＮＡベクターおよびそのようなベクターにより形質転換される宿主細胞の例には、バクテリオファージλ（Ｅ、ｃｏｔ　ｉ）、ｐＢＲ３２２（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）、ｐＡｃＹｃ１７７　（Ｅ、ｃｏ　Ｉ　ｉ）　、ｐＫＴ２３０　（グラム陰性バクテリア）、ｐＢＧ１１０６（グラム陰性バクテリア）、ｐＬＡＦＲｌ　（グラム陰性バクテリア）、ｐＭＥ２９０　（Ｅ、ｃｏ　ｌ　ｉ以外のグラム陰性バクテリア）、ｐＨＶ１４　（Ｅ、ｃｏｔ　ｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、ｐＢＤ９（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ｐＩ　Ｊ６１　（Ｓｔ　ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　、ｐＵＣ６（Ｓｔ　ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクチノファージψＣ３１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ＹＩｐ５　（ｙｅａｓ　ｔ）　、ＹＣｐ１９　（ｙｅａｓ　ｔ）　、およびウシパピローマウィルス（哺乳類細胞）が含まれる。

発現のためには、プロテアーゼ遺伝子のコード配列を、プロモーター、リポソーム結合サイト（バクテリアでの発現のため）および、所望によりオペレーター（これらを集合的に本明細書中で調節配列と呼ぶ）の支配下に置いて、ベクターで形質転換された宿主細胞中で、プロテアーゼコード配列がＲＮＡに転写されるようにする。コート配列はシグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでも含まなくてもよい。バクテリアにおいては、プロテアーゼは好ましくはいかなる天然のシグナルペプチドも含まないコード配列の発現により、またはリーダー配列が翻訳後のプロセシングにより除去される場合は、真核細胞システムのリーダー配列を含むコード配列の発現により生産される。プロテアーゼはまた融合タンパク質の形で発現させることもでき、その場合異種アミノ酸配列がＮ−末端もしくはＣ −末端に発現される。例えば米国特許４，４３１，７３９および４．　４２５゜４３７を参照。

組換えベクターは、ベクター中でプロテアーゼコード配列が適当な調節配列と共に存在するように構築され、その際、調節配列に対するコード配列の位置と方向は、コート配列か調節配列のコントロール下に（すなわち該ＤＮＡ分子に対して調節配列部分に結合するＲＮＡポリメラーゼにより）転写されるようにされる。

調節配列は、上記クローニングベクターのようなベクターに挿入する前にコード配列にライゲートさせておいてもよい。その代わりに、調節配列および該調節配列の下流に適当な制限酵素部位を有する発現ベクターに、コード配列を直接クローニングしてもよい。線虫以外におけるプロテアーゼコード配列の発現のためには、調節配列はコート配列に対して異種のものであろう。宿主細胞が原核細胞であるなら、コード配列がイントロン不含のもの、すなわちｃＤＮＡであることか必要である。選択した宿主細胞が線虫細胞であるなら、調節配列はプロテアーゼコート配列に対して異種でも同種でも良く、そしてコード配列はイントロンを含むゲノムＤＮＡであっても、あるいはｃＤＮＡであってもよい。酵母でもゲノミックとｃＤＮＡのいずれのコード配列も発現できる。

多くの原核発現ベクターが、当該技術分野で知られている。例えば、米国特許４．４４０，８５９；４，４３６，８１５．４，４３１，７４０．４，４３１゜７３９．４，４２８，９４１；４，４２５，４３７；４，４１８，１４９．４゜４１１．９９４．４，３６６．２４６：４，３４２，８３２を参照。しかしながら、好ましい発現ベクターは真核細胞システムで使用するものである。酵母発現ベクターは当該技術分野で知られている。米国特許４，４４６，２３５；４，４４３．５３９．４，４３０，４２８を参照。ヨーロッパ特許明細書１０３，４０９．１００，５６１．９６．４９１も参照。組換えプロテアーゼは、上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞をプロテアーゼが生産される条件下で培養することにより生産することができる。ヒトコラゲナーゼのｃＤＮＡはクローニングされており、真核細胞で活性型として発現されている（Ｍｕｌ　ｌｅｒ、Ｄ、ｅｔａｔ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　（１９８８）２５３＋１８７−１９２）、プロテアーゼは次いで宿主細胞から単離され、精製される。もし発現システムがプロテアーゼを培養培地中に分泌するならば、所望のタンパク質は細胞を含まない培地から直接精製可能である。プロテアーゼが分泌されない場合は、細胞ライセードから単離される。適当な培養条件および回収方法の選択は、当業者の技術範囲であり；後記の例示に似た精製法を使用してよい。

抗体Ω生産本発明の天然または組換えプロテアーゼのいずれも、ポリクローン性、モノクローン性のいずれの抗体の生産にも使用できる。ポリクローン性抗体が所望であれば、精製したプロテアーゼを用いて選ばれた哺乳類動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマその他）を免疫し、その後免疫動物から血清を採取し、公知の方法にしたがって処理する。目的のプロテアーゼの他、種々の抗原に対するポリクローン性抗体を含む組成物は、目的のプロテアーゼを結合したカラムを通過させることにより、プロテアーゼ抗体以外の抗体を実質的に除去することができる。

洗浄の後、カラムからポリクローン性抗体を溶出する。モノクローナル抗体もまた、当業者により容易に製造できる。ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の製造の一般方法は知られている。不滅の抗体製造細胞ラインの製造は、融合以外の技術でも行うことができ、例えば、Ｂリンパ球の発ガン性ＤＮＡによる直接形質転換、あるいはニブシュタイン−バールウィルスによる形質転換が可能である。例えば、５ｃｈｒｅｉｅｒ、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、　ハイブリドーマ技術（ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ　ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ）（１９８０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、モノクローナル抗体およびＴ細胞ハイブリドーマ（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　Ｔ−ＣＥＬＬ　ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ）（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、モノクローナル抗体（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ）（１９８０）を参照。

モノクローナル抗体製造のための不滅化Ｂ細胞の供給源を免疫するために、抗原としてメタロプロテアーゼまたはシスティンプロテアーゼ（天然または合成）を採用して、プロテアーゼの異なる部位のエピトープを認識するモノクローナル抗体のパネルが得られる。プロテアーゼの活性部位結合領域内のエピトープを認識する抗体は、抗体と酵素基質との間の競合アッセイにより容易に突き止めることができる。Ｚ−ＶＬＲ−ＡＭＣ（システィンプロテアーゼ用）またはｈ−Ｆ−ＡＭＣ（メタロプロテアーゼ用）のような人工的基質を用いることもできる。そのような抗体は、ｉｎ　ｖｉｖｏでプロテアーゼとその基質との結合を阻害することができるならば、治療薬としての可能性を有する。プロテアーゼの一つの部位を認識する抗体は、例えば、細胞ライセードまたは培養培地がら所望プロテアーゼを精製するため、そしてその同定のためにも有用である。一般に、当該技術分野で知られているとおり、プロテアーゼ抗体はカラムまたはラテックス粒子のような固相支持体に固定（不動化）し、プロテアーゼを含む溶液と接触させて、溶液から分離する。固定化抗体に結合したプロテアーゼをその後溶出する。

Ｌ３およびＬ４プロテアーゼの　および　１上記のとおり、Ｌ３およびＬ４ライセードに特徴的なシスティンプロテアーゼおよびこれらのライセードに特徴的なメタロプロテアーゼ、並びにＬ３／Ｌ４Ｅ−３は、所望の寄生線虫の適当な幼虫期を出発材料として用いることにより、細胞培養による組換え法により生産してシスティンプロテアーゼもしくはメタロプロテアーゼ遺伝子の発現によるプロテアーゼを単離することにより、あるいはアーゼまたはペプチドの起源により異なるであろう。

天然供給源から単離する場合は、ライセードまたはＥ−３材料はクロマトグラフィー技術に付され、典型的にはクロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、アフィニティーリガンドとしてプロテアーゼに対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、サイズによる分離カラム、逆相カラム、その他により行う。精製方法の最適化は通常の技術範囲内であり、例えば、カラムから溶出されたフラクションは、メタロプロテアーゼまたはシスティンプロテアーゼのための蛍光基質を用いる活性測定により、アッセイすることができる。Ｄ、１ｍｍ１　ｔ　ｉ　ｓのメタロプロテアーゼのためには、ｈ−Ｆ−ＡＭＣが適当な基質であり、該寄生虫のシスティンプロテアーゼのためには、Ｚ−ＶＬＲ−ＡＭＣの使用が適当である。プロテアーゼの特異性及び性質は、メタロプロテアーゼまたはシスティンプロテアーゼを特徴づけることか知られている種々のインヒビターによるアッセイも行って確認することができる。他の種のライフリア線虫のメタロプロテアーゼまたはシスティンプロテアーゼのためには、これらの基質の修飾体か適当であろう：適当な基質は、本明細書中でり、１ｍｍ１ｔｉｓ種について例示するようにして粗抽出物の予備的アッセイを行うことにより、確かめることができる。

プロテアーゼが組換え法により生産される場合は、同様の技術を使用できるが、但し、一般に出発材料はプロテアーゼをより高度に濃縮された状態で含んでいる。また、固相合成で調製したペプチドの単離のためには、不純物の性質が異なるから、精製操作を修飾することが適当である。一般に、透析またはその他のサイズによる分離法か適当である。

種々のフィラリア線虫種のシスティンプロテアーゼおよびメタロプロテアーゼの精製および単離された形を、抗体の製造に使用しくそのような抗体はまた免疫アッセイや分離技術に使用可能である）、抗体の存在、不存在を知るための免疫アッセイ用試薬として使用し、そしてｉｎ　ｖｉｔｒｏでの細胞培養の制御のために細胞外マトリックスの形成または状態の調節に使用することができる。

゛会断における　°および−　されたプロテアーゼのイ用精製および単離されたプロテアーゼは、ライフリア線虫の種に対する抗体の存在、不存在を診断する免疫アッセイに有用である。そのようなアッセイは、宿主生物の病気状態の評価のためまたは、免疫操作における抗体タイターのアッセイのために用いることができる。アッセイは、ＲＩＡＳＥＬＩＳＡおよび蛍光標識アッセイを含む標準的免疫学的方法で行われる。アッセイは直接法でも競合法でもよく、そして固相に対する結合による分離法を用いても免疫学的複合体形成による沈降反応による分離法を用いてもよい。免疫アッセイを行うために適当な多くの方法が当該分野でよく知られている。

ワクチンのための　１および　されたプロテアーゼの本発明のプロテアーゼは、宿主生物を対応するライフリア線虫の感染から防御するために免疫するワクチンとしても有用である。プロテアーゼは標準的薬品製剤として全身的に、そして典型的には注射により投与される。注射は、静脈注射、筋肉内注射、腹腔内注射または他の非経口投与であってよい。注射のために適当な単体には、生理食塩水、ハンクス液、リンゲル液その他が含まれ、免疫法に従うアジュバントを含めても含めなくてもよい。一般に、ワクチンは、ライフリア感染因子のＬ３からＬ４への脱皮に要求されるプロテアーゼを効果的に除去するために有効な抗体タイターを生じるのに十分な用量で投与される。

公゛ターによる　の冶本発明のプロテアーゼは寄生性線虫のライフサイクルの進行に必要であるから、これらの酵素のインヒビターを適当な用量で感染宿主に投与すると、感染の進行を阻害もしくは停止させる。インヒビターは適当な医薬組成物に処方され、そのような組成物は例えば、レミントンズ・フ７−マシューティカル・サイエンシス（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅＳ）、最新版、Ｍａｃｋ出版社、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに記載されている。投与は好ましくは経口処方によるが、注射投与、経皮投与または経粘膜投与を使用することも可能である。

以下の実施例は説明のためのもので、発明を限定するためのものではない。

実施例ＩＤ、１ｍｍ１ｔｉｓのプロテアーゼ活　の！「Ｄ、１ｍｍ１ｔｉｓを１ｍｌあたり幼虫１００匹の濃度で、ＮＣＴＣ−１３５と抗生物質（Ｎｌ）を含有するイスコツの改良ダルベツコ培地（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）との１：１ａ合物中で、ラットの血管平滑筋細胞により分泌されトリチウムブロリンで標識された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）モデル上で、培養した。８時間毎に５０μｍのサンプルを採取し、シンチレーションカウンターによりマトリックスから遊離したトリチウム量を計測した。５３期に関して、ＥＣＭから遊離されたトリチウムの１分間あたりのカウント数は、８時間後のｌＸｌ０’　ｃｐｍから５６時間後には約２Ｘ１０’ 　ｃｐｍに緩やかに増加し、その後脱皮がおこった。トリチウムの遊離の大きな増加（マトリックスの分解を示唆する）は、ＬＳの脱皮の時に生じ、Ｃｐｍは６４時間後に約５Ｘ１０’　ｃｐｍに増加し、７２時間後には８Ｘ１０’　ｃｐｍに達した。Ｌ４により生じるマトリックスの分解は、５６時間目のＬＳの脱皮にいたる迄のＬＳと同様で、この後Ｌ４によるｃｍｐはほんの僅かしか増加し続けなかった（７２時間後に＜４Ｘ１０’　ｃｐｍ）。合計としては、Ｌ３培養物は全ＥＣＭの２０％を分解しＬ４培養物は１３％を分解した。

分解されたＥＣＭの成分は、既に文献に記載されているようにして残存ＥＣＭを連続酵素消化して調べた（Ｍｃｋｅｒｒｏｗ、Ｊ、Ｈ，、ｅｔ　ａｔ、、Ｌａｂ　Ｉｎｖｅｓｔ　（１９８３）４９：１９５−２００）。

結果を表１に示す。Ｌ３ライセードおよびＬ４ライセードの両者ともにＥＣＭの分解された主成分はコラ−ケンであった。しかしながら、ＬＳのライセードはＬ４のライセードに比較してほぼ２倍のコラーゲンを分解した。

表よＥＭＣ構成タンパク質の分解パーセント（幼虫１００匹分のライセード／ｍ１）ＬＳ　Ｌ４糖タンパク質　２２　２０エラスチン　１０　８コラーゲン　６１　３８これらの実験において、ＥＭＣの非寄生虫由来分解のコントロールは、Ｎｌのみ、蚊媒体、またはＣ，ｅｌｅｇａｎｓを用いた。蚊媒体は非感染蚊の頭部を寄生虫を含む場合と同様に処理して調製した。Ｃ，ｅｌｅｇａｎｓの成虫および幼虫は、Ｅ、ｃｏｌｉの０Ｐ５０株をまいたＮＧＭアガロースプレートから回収し、Ｄ、１ｍｍ１ｔｉｓの幼虫の場合と同じ濃度でＭ９培地にいれて、２６℃でインキュベートした。蚊媒体をコントロールとしたのは、蚊由来のプロテアーゼが観察された分解に影響をしていないことを確認するためである。非寄生性の線虫Ｃ，６１ｅｇａｎｓは、組織侵入線虫に対する比較として、運動性自体が標識の遊離を引き起こさないことを確認するコントロールとして用いた。

ＬＳおよびＬ４からのライセードは、ＰＢＳに入れた幼虫に氷上で１０秒間の高周波を１０回あてて音波処理して調製した。反応当たり１０μｇのタンパク質を含むライセードを、蛍光発生化合物の７−アミド−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）（Ｂａｃｈｅｍ）に結合した何種かのアミノ酸からなる人工基質に対して試験した。基質のあるものは、Ｚと略記されるベンジルオキシカルボニル基によりエキソペプチダーゼ活性から保護した：保護されていない基質は、頭にｈをつけて示す。試験した基質は、Ｚ−Ｖａ　Ｉ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＡＭＣ，ｈ−Ｐｈｅ− ＡＭＣ，Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣ，およびＺ　−Ａ　ｒ　ｇ　−Ａ　ｒ　ｇ −ＡＭＣ（それぞれ、Ｚ−ＶＬＲ−ＡＭＣ，ｈ−Ｆ−ＡＭＣ，Ｚ−ＦＲ−ＡＭＣ，およびＺ−ＲＲ−ＡＭＣと略記する）である。ライセードを各基質と３時間インキュベートして、加水分解されたＡＭＣを蛍光により測定した。ＡＭＣの開裂は、■、Ｓ−２スペクトロフルオロメーター（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を用いて、励起波長３８０ｎｍおよび発光検出波長４６０ｎｍで測定した。初期的基質スクリーニング反応系は、１０μｍの基質（ＤＭＳＯ中５繭）、９８０μＩのＰＢＳ、　ｐＨ７゜２、および１０μｍのＬＳとＬ４の混合可溶性抽出物で構成した。いくつかの追加の基質も試験したが開裂しなかった：Ｚ−ＧＰＬＧＰ−ＡＭＣ，Ｚ−ＧＰＲ−ＡＭＣ，Ｚ−ＡＲＲ−ＡＭＣ，Ｚ−ＡＲ−ＡＭＣ，Ｚ−Ｒ− ＡＭＣおよびｈ−Ｌ−ＡＭＣｏＬかしながら、以下の仕事は前記の４種の基質で行った。２−のジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、Ｚ−ＶＬＲ−ＡＭＣの加水分解を２倍増加することが見いだされたが、しかしｈ−Ｆ−ＡＭＣの加水分解は阻害することが表２に示されている。したがって、Ｚ−ＶＬＲ−ＡＭＣがこのシスティンプロテアーゼの基質であり、ｈ−Ｆ−ＡＭＣがメタロプロテアーゼの基質である。

Ｌ３可溶性抽出物によるＺ−ＶＬＲ−ＡＭＣおよびｈ−Ｆ−ＡＭＣの加水分解に対する２＋ｒＭ　ＤＴＴの影響 −されたＡＭＣのナノモル　■日＋ＤＴＴ　−ＤＴＴｈ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ９９，０（１６，７）　３２６．４　（２５，０）Ｚ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ　− Ａｒ　−ＡＭＣ５４，６１，７３２，６２，６データは２連サンプルの平均値であり、カッコ内に範囲が示されている。

したがって、測定においてはｈ−Ｆ−ＡＭＣを用いる場合を除き、２ｄｊ　ＤＴＴをＰＢＳに含ませた。

さらに、反応混合物には、１０μｍの５ｍＭ基質、１０μｌの幼虫可溶性抽出物またはＥ−３（濃度１　ｕ　ｇ／ｍｌ）および９８０μ＋のＰＢＳ、ｐＨ７，，２を含ませた。ライセードまたはＥ−３を基質と３７℃で所定時間インキュベートした後、加水分解されたＡＭＣをＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ＬＳ−２フイルターフルオロメーターにより、前記励起波長および発光波長で測定した。ｈ−Ｆ −ＡＭＣについては、Ｌ３ライセードは３時間のインキュベート後に約２０μｍｏｌのＡＭＣを遊離したが、Ｌ４ライセードは１０μｍｏｌよりやや小量を遊離した。Ｚ−質ではなく　、Ｚ−ＶＬＲ−ＡＭＣからはどちらのライセードからも約５μｍｏｌのＡ、ＭＣか遊離した。

排泄性−分泌性材料も、これらの基質に対する活性を試験した。反応当たり２μ ｇのタンパク質を用いて、ＬＳのＥ−３組成物は３時間後に反応混合物力たり約９．ｃｚｍｏｌのＡＭＣをｈ−Ｆ−ＡＭＣから遊離したが、Ｌ４のＥ−５組成物は約２μｍｏ１しか遊離シナカッタ。Ｚ−ＶＬＲ−ＡＭＣ，Ａ−ＦＲ−ＡＭＣまたはＺ−ＲＲ−ＡＭＣ基質からはＡＭＣの遊離は生じながった。

合成基質Ｚ−ＶＬＲ−ＡＭＣおよびｈ−Ｆ−ＡＭＣに対するインヒビターの影響も、上記のようにして調製したＬＳおよびＬ４のライセードを用いて調べた。

ｈ−Ｆ−ＡＭＣはメタロプロテアーゼに対する基質であることが示され；　Ｚ− ＶＬＲ−ＡＭＣはシスティンプロテアーゼの基質であることが示された（ＤＴＴはシスティンプロテアーゼ活性を増加させ；酸化条件はこの活性を阻害した）（表２参照）。ＬＳまたはＬ４ライセード１０μｌ　（全タンパク質１０μｇ）を、５０μＭ合成ペプチド基質１０μｍ、ｐＨ７，２のＰＢＳ緩衝液９６０μＩ　（Ｚ−ＶＬＲ−ＡＭＣを用いる場合は２ｍＭ　ＤＴＴを含み、ｈ−Ｆ−ＡＭＣを用いる場合はＤＴＴを含まない）と混合した。反応混合物に２０μｌの試験インヒビターを添加した、このインヒビターの最終濃度は次ぎのとおりである：ＰＭＳＦ、２ｍＭ：１，１０−フェナントロリン、１０ｍＭ；、ＮＥＭ、２ｍＭ；Ｅ −６４，ｘｏｒｒＭ；ベスタチン、１ｍＭ；シスタチン、４μＭ；およびＥＤＴＡ、２ｍ。インヒビジョンはインヒビター不在下でのコントロールに比較して残存する活性のパーセントとして計算した。結果を表３　（ＬＳ）および表４　（Ｌ４）に示す。

表３Ｌ３ライセードの残存活性のコントロールに対するパーセント基質Ｚ−ＶＬＲ−ＡＭＣｈ−Ｆ−ＡＭＣＰＭＳＦ　６３　１１ＮＥＭ　５４　２２Ｅ６４　１２　１００１、　１Ｏ−Ｐｈｅ　３１　８ベスタチン　６２　１００ンスタチン　６０　１００ＥＤＴＡ　２１　５Ｌ４ライセードの残存活性のコントロールに対するパーセント基質Ｚ−ＶＬＲ−ＡＭＣｈ−Ｆ−ＡＭＣＰＭＳＦ　９２　２ＯＮＥＭ　２０　２３Ｅ６４　１５　７８１、　１Ｏ−Ｐｈｅ　２４　５ベスタチン　８０　８８シスタチン　６０　９７ＥＤＴＡ　１８　４Ｅ６４は強力なシスティンプロテアーゼインヒビターであるが、メタロプロテアーゼ基質のｈ−Ｆ−ＡＭＣに対して実質的に影響がなかった；しかしながら、システィンプロテアーゼ基質のＺ−ＶＬＲ−ＡＭＣに対しては非常に効果的インヒビターであった。

Ｌ４ライセードの種々の蛍光発生合成基質に対する効果は、ＤＴＴの存在および不存在下でも試験した。ＤＴＴはＺ−ＶＬＲ−ＡＭＣＳＺ−ＦＲ−ＡＭＣおよびＺ−ＲＲ−ＡＭＣに関しては活性を増大するようであった。ＤＴＴはシスティンプロテアーゼ類の活性を増大し、メタロプロテアーゼ類を阻害することが知られている。

Ｌ３のＥ−８によるｈ−Ｆ−ＡＭＣの加水分解についても、同じインヒビターに対する効果を、実質的に上記のようにして試験した。反応成分は、Ｌ３のＥ−８を１０μｍ　（すなわち、全タンパク質１０μｇＬ最終濃度５０μＭを与える１０ｔｔｌ（７）ｈ−Ｆ−ＡＭＣ，ｐＨ７，２（７）ＰＢＳ９６０μｌおよび上記ライセードと同じ最終濃度を与えるための２０μｍのインヒビターからなった。

表５に示す阻害パターンは、ライセードにより得られたものと似ていた。

表５Ｌ３のＥ−５の残存活性のコントロールに対するパーセント基質ｈ−Ｆ−ＡＭＣＰＭＳ　Ｆ　２２ＮＥＭ　２６Ｅ６４　７９１．１Ｏ−Ｐｈｅ５ベスタチン　８０シスタチン　９８ＥＤＴＡ　５これらのデータを総合すると、ライセードおよびＥ−ＳＩＮ製物はメタロプロテアーゼを含むが、システィンプロテアーゼについてはライセードのみが有意な量で含むことを示している。

実施例２Ｄ　１ｍｍ１Ｈｓか゛の　ロチアーゼノー１前記のようにして調製したＬ３ライセード、Ｌ４ライセードまたはＬ３／Ｌ４のＥ−８をサイズ排除クロマトグラフィーにて処理した。

４８ないし１４４時間目に集めた、ｓ、ｏｏｏ匹の幼虫のＬ　３／Ｌ　４のＥ− ８を、０．　０５Ｍ１−ＩＪ７．／塩酸、ｐＨ６，８，０，１５Ｍ　ＮａＣｌ中で７５μ目こ濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィーを行うために、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｍｏｄｅｌ　３３８　ＨＰＬＣに設置した７、５Ｘ７５ｍｌのガードカラム（Ｂ　ｅ　ｃ　ｋｍａｎ、Ｆｕｌ　Ｉｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を有するＴＳＫ３，０００　ＳＷ　７．５Ｘ３００ｍ＋のカラムに注入した。移動相には同じ緩衝液を用い、流速は０．５ｍｌ／分とし、検出器は２２０ｎｍにセットした。１２分目から始めて１分毎のフラクションを採取した。ゲルろ過分子量マーカー（ＮＷ −ＧＦ−２００）（Ｓｉｇｍａ）を用いてカラムの基準化を行った。

Ｓ３５メチオニンで代謝的に標識しておいたＬ　３／Ｌ　４のＥ−３を集め、上記の条件下でクロマトグラフィーし、フラクションを標準的技術で還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥに付した。図１は、フラクションの活性をアッセイするためにｈ−Ｆ−ＡＭＣを基質として用いた場合のクロマトグラムを示し、２０μｌの各フラクションをｐＨ７，２のＰＢＳ　９７０ｍ１中で５ｍＭのｈ−Ｆ−ＡＭＣと１時間インキュベートした。酵素活性のピークはフラクション１０に存在し、その分子量は約４９−５８ｋｄに相当した。フラクション１０を５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析すると、変性および還元条件下では、５８．３０および２２ｋｄに三つの主バンドが生じ、２８．２６および１９ｋｄに三つの副バンドが生じた。

１４４時間後のＬ４幼虫６，０００匹から調製したライセードを用いて、同様の分離を行った。フラクションをＺ−ＶＬＲ−ＡＭＣおよびｈ−Ｆ−ＡＭＣの両者を基質として用いてアッセイした。結果を図２に示す。ｈ−Ｆ−ＡＭＣに対する活性（メタロプロテアーゼ）は４９−５４ｋｄに相当する位置に溶出され；Ｚ− ＶＬＲ−ＡＭＣに対する活性は３ｌ−３４ｋｄに相当する位置に溶出された。

Ｘ！　蚕　萄黍　基　金フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　９１５０　９１５２−４Ｂ（７２）発明者　フランク、グレン・アールアメリカ合衆国コロラド用８０５２４．フォート・コリンズ、アボッツフォード　３０２４Ｉ（７２）発明者　サカナリ、シュディーアメリカ合衆国カリフォルニア州９５００３゜アブトス、マル・ヴイスタ・ドライブ３１５０

Claims

【特許請求の範囲】

１．フィラリア線虫のＬ３またはＬ４のうイセートからまたはＬ３／Ｌ４排泄性 −分泌性材料からの単離により得ることができる、精製および単離されたプロテアーゼ少なくとも一種またはその免疫原性サブユニットの動物宿主を免疫するために有効な量を含んでなる、動物宿主をフィラリア線虫感染から防御するように免疫するための獣医用医薬組成物。
２．フィラリア線虫のＬ３またはＬ４のうイセートからまたはＬ３／Ｌ４排泄性 −分泌性材料からの単離により得ることができるプロテアーゼ少なくとも一種のインヒビターの有効量を含んでなる、動物宿主におけるフィラリア線虫感染を治療もしくは軽減するために有用な獣医用または医薬用組成物。
３．プロテアーゼがメタロプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼである請求項１または２記載の組成物。
４．線虫がＤ．ｉｍｍｊｔｉｓフィラリア線虫である請求項１または２記載の組成物。
５．下記免疫を必要とする宿主に、フィラリア線虫のＬ３またはＬ４のうイセートからまたはＬ３／Ｌ４排泄性−分泌性材料からの単離により得ることができる、精製および単離されたプロテアーゼ少なくとも一種またはその免疫原性サブユニットの該宿主の免疫に有効な量を投与することよりなる、フィラリア線虫に感染しやすい動物宿主を、該感染から防御するために免疫する方法。
６．フィラリア線虫のＬ３またはＬ４のうイセートからまたはＬ３／Ｌ４排泄性 −分泌性材料からの単離により得ることができるプロテアーゼ少なくとも一種のインヒビターの有効量を宿主動物に投与することよりなる、動物宿主におけるフィラリア線虫感染の治療または軽減方法。
７．プロテアーゼがメタロプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼである請求項５または６記載の方法。
８．線虫がＤ．ｉｍｍｉｔｉｓフィラリア線虫である請求項５または６記載の方法。
９．Ｄ．ｉｍｍｉｔｌｓフィラリア線虫のＬ３またはＬ４のうイセートからまたはＬ３／Ｌ４排泄性−分泌性材料からの単離により得ることができる、システインプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼであるプロテアーゼ少なくとも一種と特異的免疫反応性を有する抗体。
１０．Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓの感染性フィラリア線虫のＬ３またはＬ４のうイセートからまたはＬ３／Ｌ４排泄性−分泌性材料からの単離により得ることができる、システインプロテアーゼまたはメタロプロテァーゼである精製および単離されたプロテアーゼ。
１１．フィラリア線虫のＬ３またはＬ４のうイセートまたはし３／Ｌ４排泄性一分泌性材料をカラムクロマトグラフィー操作に付し、カラムから溶出するフラクションを、精製すべきプロテアーゼに特徴的な合成基質に対するタンパク分解活性に関してアッセイすることからなる、フィラリア線虫のＬ３またはＬ４のうイセートからまたはＬ３／Ｌ４排泄性−分泌性材料からプロテアーゼを精製する方法。
１２．プロテアーゼがシステインプロテアーゼであり、基質がＺ−ＶＬＲ−ＡＭＣであるか、またはプロテアーゼがメタロプロテアーゼであり、基質がｈ−Ｆ− ＡＭＣである、請求項１１記載の方法。
１３．請求項１０の精製されたプロテアーゼの免疫原性サブユニットから実質的になるペプチド。
１４．請求項１０のプロテアーゼをコードする精製および単離されたＤＮＡまたはその相補体。
１５．組換え宿主細胞に形質転換したとき請求項１０のプロテアーゼをコードするＤＮＡを発現することができる発現システム。
１６．請求項１５の発現システムで形質転換された組換え宿主細胞。
１７．請求項１５の細胞を該コード配列を発現させうる条件下で培養して、細胞培養物からプロテアーゼを採取することよりなる、プロテアーゼ酵素の調製方法。