JPH0731B2 - 担子菌等の凍結保存方法 - Google Patents
担子菌等の凍結保存方法Info
- Publication number
- JPH0731B2 JPH0731B2 JP1233722A JP23372289A JPH0731B2 JP H0731 B2 JPH0731 B2 JP H0731B2 JP 1233722 A JP1233722 A JP 1233722A JP 23372289 A JP23372289 A JP 23372289A JP H0731 B2 JPH0731 B2 JP H0731B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- basidiomycetes
- wood flour
- frozen
- mycelium
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は特にキノコが属する担子菌に用いて好適な担子
菌等の凍結保存方法に関する。
菌等の凍結保存方法に関する。
従来、シイタケ、エノキタケ等のキノコが属する担子菌
の保存方法としては、斜面培地（スラント）を用いた保
存方法が知られている。
の保存方法としては、斜面培地（スラント）を用いた保
存方法が知られている。
この方法は傾斜させた試験管の中に寒天培地によるスラ
ントを形成し、この上に担子菌の菌糸を生長させた後、
スラントを低温で保存するもので、保存温度は通常５℃
前後である。
ントを形成し、この上に担子菌の菌糸を生長させた後、
スラントを低温で保存するもので、保存温度は通常５℃
前後である。
しかし、この方法は保存中に培地から水分が蒸散するた
め、保存期間は通常６ケ月から１年が限度である。ま
た、継代培養によって菌糸の生理学的及び遺伝学的な変
異の拡大を生ずるため、食用キノコの種菌製造や担子菌
を使用する医薬品等の有用物質生産にしばしば支障をき
たすとともに、学術研究における原菌株の保存にも不都
合となる問題があった。
め、保存期間は通常６ケ月から１年が限度である。ま
た、継代培養によって菌糸の生理学的及び遺伝学的な変
異の拡大を生ずるため、食用キノコの種菌製造や担子菌
を使用する医薬品等の有用物質生産にしばしば支障をき
たすとともに、学術研究における原菌株の保存にも不都
合となる問題があった。
この問題を解決するため、スラントから菌糸を寒天ごと
に切出し、その細片をグリセロール水溶液を入れた容器
（アンプル）に浮遊させた後、液体窒素等を用いた低温
下で凍結保存する方法も行われている。
に切出し、その細片をグリセロール水溶液を入れた容器
（アンプル）に浮遊させた後、液体窒素等を用いた低温
下で凍結保存する方法も行われている。
この方法は担子菌の変異拡大を懸念することなく長期間
保存可能であるが、菌体試料のアンプルの封入、さらに
凍結のプログラムフリージング、即ち、細胞内外におけ
る水の結晶化の遅延目的や生成する結晶を微細な状態に
抑えるために、プログラムフリーザー等の特殊な装置を
用いて１分間に１〜２℃の温度勾配により−30℃程度の
低温領域まで緩やかに下降させるなど、煩雑な操作を必
要とする。しかも、万が一、液体窒素の補充を怠った
り、装置の故障等により温度が上昇した場合には菌糸が
死滅してしまう。また、同一アンプルからの試料はその
使用が一回に制限され、保存作業の手軽さと安全性に欠
ける難点があった。
保存可能であるが、菌体試料のアンプルの封入、さらに
凍結のプログラムフリージング、即ち、細胞内外におけ
る水の結晶化の遅延目的や生成する結晶を微細な状態に
抑えるために、プログラムフリーザー等の特殊な装置を
用いて１分間に１〜２℃の温度勾配により−30℃程度の
低温領域まで緩やかに下降させるなど、煩雑な操作を必
要とする。しかも、万が一、液体窒素の補充を怠った
り、装置の故障等により温度が上昇した場合には菌糸が
死滅してしまう。また、同一アンプルからの試料はその
使用が一回に制限され、保存作業の手軽さと安全性に欠
ける難点があった。
なお、担子菌の菌株に対する凍結乾燥による保存方法も
提案されているが、現在のところ生存率の向上が課題で
あり、実用化はされていない。
提案されているが、現在のところ生存率の向上が課題で
あり、実用化はされていない。
本発明はこのような従来技術に存在する課題を解決した
担子菌等の凍結保存方法の提供を目的とするものであ
る。
担子菌等の凍結保存方法の提供を目的とするものであ
る。
本発明に係る担子菌等の凍結保存方法は、鋸屑を主体と
する保存用木粉系培地により生長させた菌糸に対して、
特殊な配慮を講ずることなく低温下で急激に凍結し、長
期の保存後に自然解凍しても菌糸に損傷を生ずることな
く復元できることを基本とするものである。このような
木粉系培地による凍結保存の原理は十分に解明されてい
ないが、木粉系培地における培地水分は大部分が鋸屑
材の内外に分散域は吸収されているため、凍結による氷
の生成が主に鋸屑で起こること、培地の水分含量（通
常60〜70％程度）が少ないため、水分活性が低くなり培
地が急激に凍結しても菌糸にほとんど損傷を生じないこ
となどが考えられる。
する保存用木粉系培地により生長させた菌糸に対して、
特殊な配慮を講ずることなく低温下で急激に凍結し、長
期の保存後に自然解凍しても菌糸に損傷を生ずることな
く復元できることを基本とするものである。このような
木粉系培地による凍結保存の原理は十分に解明されてい
ないが、木粉系培地における培地水分は大部分が鋸屑
材の内外に分散域は吸収されているため、凍結による氷
の生成が主に鋸屑で起こること、培地の水分含量（通
常60〜70％程度）が少ないため、水分活性が低くなり培
地が急激に凍結しても菌糸にほとんど損傷を生じないこ
となどが考えられる。
また、木粉系培地に凍結保護剤としてグリセロール等の
多価アルコールを添加して培養した菌糸では凍結処理に
よる損傷に対しての耐性は格段と向上し、概ね10回以上
の反復処理の繰返しによっても菌糸生存の確保が確認さ
れた。このことは超低温貯蔵装置等に一時的な故障を生
じても保存菌株の安全性を保証し得ることを意味してい
る。なお、凍結保護剤を添加しない場合には菌糸培養
後、凍結・解凍を２回以上反復すると菌糸生存率は次第
に低下する。
多価アルコールを添加して培養した菌糸では凍結処理に
よる損傷に対しての耐性は格段と向上し、概ね10回以上
の反復処理の繰返しによっても菌糸生存の確保が確認さ
れた。このことは超低温貯蔵装置等に一時的な故障を生
じても保存菌株の安全性を保証し得ることを意味してい
る。なお、凍結保護剤を添加しない場合には菌糸培養
後、凍結・解凍を２回以上反復すると菌糸生存率は次第
に低下する。
保存用木粉系培地の調製は、保存しようとする担子菌又
は木粉系培地で生育可能な糸状菌の種類に対応して鋸屑
に米糠、フスマ等の栄養材を混合し、さらに前記凍結保
護剤を添加して水分を調整し、試験管等の小型の培養容
器に収容して滅菌する。
は木粉系培地で生育可能な糸状菌の種類に対応して鋸屑
に米糠、フスマ等の栄養材を混合し、さらに前記凍結保
護剤を添加して水分を調整し、試験管等の小型の培養容
器に収容して滅菌する。
鋸屑の樹種としては、ブナ等の広葉樹が良好である。な
お、スギ等の針葉樹の場合は鋸屑を野積みするととも
に、散水して６ケ月程度放置し、菌糸に対する生育阻害
物質が流出或は分解されたものを使用する。
お、スギ等の針葉樹の場合は鋸屑を野積みするととも
に、散水して６ケ月程度放置し、菌糸に対する生育阻害
物質が流出或は分解されたものを使用する。
栄養材としては、キノコ栽培に通常用いられる米糠、フ
スマ、コーンブラン等、あるいはこれらの混合物を、保
存しようとする担子菌等の種類に合わせて調合する。必
要に応じて酵母エキス等の微生物の培養に用いられる培
地素材や有機化合物及び無機化合物を添加する。
スマ、コーンブラン等、あるいはこれらの混合物を、保
存しようとする担子菌等の種類に合わせて調合する。必
要に応じて酵母エキス等の微生物の培養に用いられる培
地素材や有機化合物及び無機化合物を添加する。
凍結保護剤としは、グリセロールやエチレングリコール
のような多価アルコールが効果を有する。これらは添加
濃度に比例して保護効果を増強するが、培地乾量当たり
５％以上添加すると濃度に比例して培養過程での菌糸生
長を抑制し、培養は長期化する。抑制効果はグリセロー
ルよりもエチレングリコールが強い、このため、凍結保
護剤の添加濃度は５〜12％程度、好ましくは10％前後が
適当である。
のような多価アルコールが効果を有する。これらは添加
濃度に比例して保護効果を増強するが、培地乾量当たり
５％以上添加すると濃度に比例して培養過程での菌糸生
長を抑制し、培養は長期化する。抑制効果はグリセロー
ルよりもエチレングリコールが強い、このため、凍結保
護剤の添加濃度は５〜12％程度、好ましくは10％前後が
適当である。
木粉系培地の水分含量は、培地水分を低く調製するほど
凍結・解凍処理に対する菌糸の耐性が向上するが、水分
含量の低い培地では菌糸の生長が遅延する。したがっ
て、培地の水分含量は培地乾量当たり56〜70％程度、好
ましくは60〜64％程度に調製する。
凍結・解凍処理に対する菌糸の耐性が向上するが、水分
含量の低い培地では菌糸の生長が遅延する。したがっ
て、培地の水分含量は培地乾量当たり56〜70％程度、好
ましくは60〜64％程度に調製する。
一方、このように調製滅菌した木粉系培地には担子菌又
は本木粉系培地で生育可能な糸状菌の菌糸を接種する。
菌株の接種源としては斜面培地で生育させた菌糸を利用
できる。なお、食用キノコの場合には、栽培に用いられ
る組成の培地で生育させた菌糸を用いてもよい。また、
本木粉系培地で培養・保存が可能な糸状菌の種類は保存
しようとする担子菌等が木材資化能を欠如していても差
し支えなく、例えばマツタケやシメジのような菌根性担
子菌の保存にも用いることができる。
は本木粉系培地で生育可能な糸状菌の菌糸を接種する。
菌株の接種源としては斜面培地で生育させた菌糸を利用
できる。なお、食用キノコの場合には、栽培に用いられ
る組成の培地で生育させた菌糸を用いてもよい。また、
本木粉系培地で培養・保存が可能な糸状菌の種類は保存
しようとする担子菌等が木材資化能を欠如していても差
し支えなく、例えばマツタケやシメジのような菌根性担
子菌の保存にも用いることができる。
菌糸の接種後は培養を行う。そして、培地の所定範囲、
望ましくは全域に全糸が蔓延したとき、凍結保存する。
凍結保存装置としては、超低温貯蔵庫（ディープフリー
ザー）が簡便であり、凍結保存温度は−60℃以下、望ま
しくは標準温度として−80℃〜−95℃の範囲に設定す
る。なお、液体窒素貯蔵容器も使用できる。このような
凍結保存に際しては特別な温度プログラムを必要とせ
ず、培養容器自身をそのまま常温から貯蔵庫内に移すだ
けの操作でよい。凍結した菌株の使用に当たっては、試
料（培養容器）を貯蔵庫から取出して自然解凍する。そ
して、斜面培地等に接種後、残りは再び凍結して保存で
きる。
望ましくは全域に全糸が蔓延したとき、凍結保存する。
凍結保存装置としては、超低温貯蔵庫（ディープフリー
ザー）が簡便であり、凍結保存温度は−60℃以下、望ま
しくは標準温度として−80℃〜−95℃の範囲に設定す
る。なお、液体窒素貯蔵容器も使用できる。このような
凍結保存に際しては特別な温度プログラムを必要とせ
ず、培養容器自身をそのまま常温から貯蔵庫内に移すだ
けの操作でよい。凍結した菌株の使用に当たっては、試
料（培養容器）を貯蔵庫から取出して自然解凍する。そ
して、斜面培地等に接種後、残りは再び凍結して保存で
きる。
このような凍結保存方法によって、シイタケ等の木材腐
杞担子菌をはじめマツタケ等の菌根性担子菌、マッシュ
ルームのような腐生性担子菌、子嚢菌、不完全菌、接合
菌等、多くの糸状菌を５年以上の長期間にわたって凍結
保存できるとともに、必要に応じて同一菌株の解凍・凍
結の反復的な繰返しによる菌株使用が可能である。
杞担子菌をはじめマツタケ等の菌根性担子菌、マッシュ
ルームのような腐生性担子菌、子嚢菌、不完全菌、接合
菌等、多くの糸状菌を５年以上の長期間にわたって凍結
保存できるとともに、必要に応じて同一菌株の解凍・凍
結の反復的な繰返しによる菌株使用が可能である。
また、凍結・解凍に対する特別な温度プログラム操作は
必要なく、菌株保存における操作の特段の簡便化を達成
できる。
必要なく、菌株保存における操作の特段の簡便化を達成
できる。
さらにまた、凍結用貯蔵庫等の事故時においても菌株に
損傷等の支障を生ぜず、安定に保存可能であり、安全性
及び信頼性を保証できるとともに、品質及び収量も非保
存菌による栽培と同等の成果を得る。
損傷等の支障を生ぜず、安定に保存可能であり、安全性
及び信頼性を保証できるとともに、品質及び収量も非保
存菌による栽培と同等の成果を得る。
以下には、本発明に係る好適実施例を具体的に示す。
（実施例１） （Ａ）培地 ブナの鋸屑1.5gと米糠0.48gを混合し、これに培地水分
含量の10％に当たるグリセロールを溶解した水溶液を加
え、培地の水分含量の最終濃度が64％となる木粉系培地
を調製する。この際、水分含量は鋸屑と米糠の水分量を
別に温度80℃恒温で乾燥して秤量した値を補正して調整
した。
含量の10％に当たるグリセロールを溶解した水溶液を加
え、培地の水分含量の最終濃度が64％となる木粉系培地
を調製する。この際、水分含量は鋸屑と米糠の水分量を
別に温度80℃恒温で乾燥して秤量した値を補正して調整
した。
そして、この培地を内径15.5mmのフラクションコレクタ
用試験管に、深さが5cmとなるように詰め、シリコ栓を
して温度120℃下で10分間滅菌した。
用試験管に、深さが5cmとなるように詰め、シリコ栓を
して温度120℃下で10分間滅菌した。
（Ｂ）接種及び培養 （Ａ）で得た培地の上面に、予め斜面培地で培養した木
材腐朽担子菌であるエノキタケ（Flammul−ina veltipe
s）及びヒラタケ（Pleurohus ostre−atus）の菌糸体か
ら切出した３〜5mm角の小片を接種し、温度25℃下で３
週間培養した。
材腐朽担子菌であるエノキタケ（Flammul−ina veltipe
s）及びヒラタケ（Pleurohus ostre−atus）の菌糸体か
ら切出した３〜5mm角の小片を接種し、温度25℃下で３
週間培養した。
（Ｃ）凍結及び菌糸の復元 （Ｂ）における培養後の試験管は、温度−85℃に設定し
たディープフリーザーの中に移して凍結し、５年間保存
した。また、この保存期間中、６ケ月毎に試験管を取出
し、室温に放置して解凍するとともに、鋸屑菌糸塊の小
量をPDA斜面培地（ポテトを用いた寒天培地）上に接種
して温度25℃で培養したところ、全ての菌糸塊から栄養
菌糸が復元した。解凍した試験管はこのような接種源と
して使用した後、再び凍結保存し、菌糸の復元を繰返し
た。
たディープフリーザーの中に移して凍結し、５年間保存
した。また、この保存期間中、６ケ月毎に試験管を取出
し、室温に放置して解凍するとともに、鋸屑菌糸塊の小
量をPDA斜面培地（ポテトを用いた寒天培地）上に接種
して温度25℃で培養したところ、全ての菌糸塊から栄養
菌糸が復元した。解凍した試験管はこのような接種源と
して使用した後、再び凍結保存し、菌糸の復元を繰返し
た。
（Ｄ）結果 ３年間凍結保存した後、（Ｃ）により復元したエノキタ
ケ及びヒラタケの菌糸を、850ccビンに収容した食用キ
ノコの鋸屑培地によって裁培し、同一菌株で３年間継代
培養したものと比較したところ、いずれも継代培養した
ものと同等の収量が得られ、キノコの形状にも凍結保存
による変異は認められなかった。
ケ及びヒラタケの菌糸を、850ccビンに収容した食用キ
ノコの鋸屑培地によって裁培し、同一菌株で３年間継代
培養したものと比較したところ、いずれも継代培養した
ものと同等の収量が得られ、キノコの形状にも凍結保存
による変異は認められなかった。
（実施例２） （Ａ）培地 実施例１（Ａ）と同じである。
（Ｂ）接種及び培養 実施例１の供試菌株に代え、木材腐朽担子菌として、シ
イタケ（Lentinus edodes）、ナメコ（Ph−oliota name
ko）、アミスギタケ（Favolus arcul−arius）、カワラ
タケ（Coriolus versicolor）、マンネンタケ（Ganoder
ma lucidum）、ヒイロクケ（Trametes sanguinea）、腐
生性担子菌として、ツクリタケ（Agaricus bisporu
s）、ネナガノヒトヨタケ（Coprinus cinereus）、菌根
性担子菌として、イロガワリ（Boletus pulverulentu
s）、イバリシメジ（Lyophyllum tylicolor）、シメジ
モドキ（Rhodopyllus clypeatus）、子嚢菌として、ア
カパンカビ（Neurospora crassa）、不完全菌として、
コウジカビ（Aspergillus oryzae）、クロコウジカビ
（Aspergillus niger）を接種した。なお、培養期間を
２〜４週間とした点を除き実施例１（Ｂ）と同じであ
る。
イタケ（Lentinus edodes）、ナメコ（Ph−oliota name
ko）、アミスギタケ（Favolus arcul−arius）、カワラ
タケ（Coriolus versicolor）、マンネンタケ（Ganoder
ma lucidum）、ヒイロクケ（Trametes sanguinea）、腐
生性担子菌として、ツクリタケ（Agaricus bisporu
s）、ネナガノヒトヨタケ（Coprinus cinereus）、菌根
性担子菌として、イロガワリ（Boletus pulverulentu
s）、イバリシメジ（Lyophyllum tylicolor）、シメジ
モドキ（Rhodopyllus clypeatus）、子嚢菌として、ア
カパンカビ（Neurospora crassa）、不完全菌として、
コウジカビ（Aspergillus oryzae）、クロコウジカビ
（Aspergillus niger）を接種した。なお、培養期間を
２〜４週間とした点を除き実施例１（Ｂ）と同じであ
る。
（Ｃ）凍結及び菌糸の復元，結果 本実施例（Ｂ）で得た保存菌株を用いて、実施例１
（Ｃ）と同様に３年間凍結保存し、解凍してからPDA斜
面培地に接種したところ、全てから復元菌糸が発生し
た。
（Ｃ）と同様に３年間凍結保存し、解凍してからPDA斜
面培地に接種したところ、全てから復元菌糸が発生し
た。
（実施例３） （Ａ）培地 グルコース1g、フラクトース1g、乾燥酵母（エビオス）
0.5gを水100mlに溶解・懸濁し、pHを5.6に調整した液体
培地を鋸屑1.5gに加え、水分含量が68％になるように調
製するとともに、最終濃度が５％となるようにグリセロ
ールを添加する。そして、試験管に収容し、シリコ栓を
して温度120℃下で10分間滅菌した。
0.5gを水100mlに溶解・懸濁し、pHを5.6に調整した液体
培地を鋸屑1.5gに加え、水分含量が68％になるように調
製するとともに、最終濃度が５％となるようにグリセロ
ールを添加する。そして、試験管に収容し、シリコ栓を
して温度120℃下で10分間滅菌した。
（Ｂ）接種及び培養 （Ａ）の培地上面に、予めグルコース・エビオス斜培面
地（培地組成：グルコース２％、％エビオス0.5％、寒
天1.5％）で培養したマツタケの菌糸体から切出した小
片を接種し、温度25℃下で３ケ月間培養した。
地（培地組成：グルコース２％、％エビオス0.5％、寒
天1.5％）で培養したマツタケの菌糸体から切出した小
片を接種し、温度25℃下で３ケ月間培養した。
（Ｃ）凍結保存及び菌糸の復元，結果 本実施例（Ｂ）で得た保存菌株を用いて、実施例１
（Ｃ）と同様に１年間凍結保存し、解凍してからグルコ
ース・エビオス斜面培地に接種して培養したところ、菌
糸塊から復元菌糸が得られた。
（Ｃ）と同様に１年間凍結保存し、解凍してからグルコ
ース・エビオス斜面培地に接種して培養したところ、菌
糸塊から復元菌糸が得られた。
以上、各種実施例を挙げたが、本発明はこのような実施
例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しな
い範囲において任意に変更実施できる。
例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しな
い範囲において任意に変更実施できる。
Claims (3)
- 【請求項１】凍結保護剤であるグリセロール又はエチレ
ングリコール等の多価アルコールによって滅菌した少な
くとも鋸屑を含む保存用木粉系培地に、担子菌又は木粉
系培地で生育可能な糸状菌の菌糸を接種して培養を行
い、菌糸が所定範囲に蔓延した後、−80℃〜−95℃に設
定した超低温下で凍結保存するとともに、凍結保存した
菌糸を解凍し、解凍した菌糸の一部を継代又は栽培用培
地に対する接種源として用いた後、その残部を再凍結す
ることを特徴とする担子菌等の凍結保存方法。 - 【請求項２】凍結保護剤の添加濃度は５〜12％に設定す
ることを特徴とする請求項１記載の担子菌等の凍結保存
方法。 - 【請求項３】保存用木粉系培地の水分含量は培地乾量当
たり56〜70％に設定することを特徴とする請求項１記載
の担子菌等の凍結保存方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1233722A JPH0731B2 (ja) | 1989-09-08 | 1989-09-08 | 担子菌等の凍結保存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1233722A JPH0731B2 (ja) | 1989-09-08 | 1989-09-08 | 担子菌等の凍結保存方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0398575A JPH0398575A (ja) | 1991-04-24 |
| JPH0731B2 true JPH0731B2 (ja) | 1995-01-11 |
Family
ID=16959540
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1233722A Expired - Lifetime JPH0731B2 (ja) | 1989-09-08 | 1989-09-08 | 担子菌等の凍結保存方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0731B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9102962B2 (en) * | 2007-10-16 | 2015-08-11 | Shiu Nan Chen | Production method for solid cultured active mushroom mycelium and fruit-body metabolites (AMFM) products thereof |
| CN103563651B (zh) * | 2013-10-23 | 2015-09-09 | 沈阳师范大学 | 蛹虫草可结实性生产种源长久保藏方法 |
| CN103718830B (zh) * | 2013-12-27 | 2015-08-19 | 湖南农业大学 | 一种工厂化生产用杏鲍菇菌种超低温保存方法 |
| CN111394252A (zh) * | 2020-03-27 | 2020-07-10 | 江苏华绿生物科技股份有限公司 | 一种保藏菌种活化转接方法 |
| CN113388522A (zh) * | 2021-06-08 | 2021-09-14 | 福建傲农生物科技集团股份有限公司 | 一种粪肠球菌保存方法及冷冻保存用保存剂 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6251927A (ja) * | 1985-09-02 | 1987-03-06 | 日立機電工業株式会社 | きのこ菌糸の保存方法 |
-
1989
- 1989-09-08 JP JP1233722A patent/JPH0731B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 根井外喜男編「微生物の保存法」財団法人東京大学出版会（１９７８．４．３０）Ｐ．３２１〜３２２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0398575A (ja) | 1991-04-24 |
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