JPH0731483A - 昆虫細胞による可溶性ＩｇＥ結合受容体α鎖の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖を効率よく製造す
ることができる方法を提供する。 【構成】 可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖をコードする遺伝
子がバキュロウィルスプロモーターの制御下に連結され
ているバキュロウィルス発現ベクターを組み込んだ組み
換えバキュロウィルスを感染させた昆虫細胞を培養し、
その培養物から可溶性ＦｃεＲＩα鎖を採取することを
特徴とする、可溶性ＦｃεＲＩα鎖の製造方法。 【効果】 哺乳類細胞ＣＨＯを使用する場合に比べて約
５０倍多く可溶性ＦｃεＲＩα鎖を発現することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は可溶性ヒトＩｇＥ結合受
容体α鎖（可溶性ＦｃεＲＩα鎖）の昆虫細胞宿主を用
いた製造方法、並びにこの方法に使用する発現ベクタ
ー、及び該発現ベクターにより形質転換された昆虫細胞
に関する。本発明の方法により製造される可溶性Ｆｃε
ＲＩα鎖は体外診断薬、例えばＩ型アレルギー抗原の診
断薬等に利用できるものと期待される。

【０００２】

【従来の技術】ヒトの即時型（アナフィラキシー型）ア
レルギー（またはＩ型アレルギーとも呼ばれる）反応
は、およそ以下のような機序で起こると考えられてい
る。アレルギー抗原が体内に侵入すると、その抗原に対
する特異的なＩｇＥ抗体が体内に産生され、産生された
ＩｇＥは、好塩基球、肥満細胞表面に存在する抗体特異
的な受容体（ＦｃεＲＩ）を介して結合する。ＦｃεＲ
Ｉと結合したＩｇＥが抗原と特異的に反応することによ
り、受容体の凝集が起こり、蓄えられていたヒスタミン
などの活性アミンが細胞から放出され、続いてロイコト
リエン、プロスタグランジンや種々のサイトカインが合
成放出され、これらの物質により種々のアレルギー反応
が誘発される。この一連の反応のうち、鍵を握る物質の
ひとつはＦｃεＲＩといっても過言ではない。

【０００３】ＦｃεＲＩは１分子のα鎖、１分子のβ鎖
および２分子のγ鎖から構成される４量体として細胞膜
上に存在する。これらのサブユニットのうちＩｇＥとの
結合に必要十分な機能を持つ分子はα鎖である〔Kinet,
J.P.(1990), Curr.OpinionImmunol.2. p499-505 〕。
ヒトのα鎖をコードしているｃＤＮＡ配列は清水らによ
って報告された〔Shimizu, A., Tepler, I., Benfey,
P.N., Berenstein, E.H., Siraganian, R.P., and Rede
r, P.(1988)Proc.Natul.Acad.Sci.U.S.A.85, p1907-191
1、特公表平３−５０２８７８〕。

【０００４】公表されている配列によればヒトα鎖は２
２１のアミノ酸から成り立っていると考えられるが、分
離精製したα鎖は５０〜６０キロダルトンであること、
これをＮグリカナーゼなどの酵素処理により糖鎖を除去
することにより分子量が小さくなることから、α鎖は著
しく糖鎖修飾された形で生体中において合成されてい
る。またコードされている配列から２箇所の分子内ジス
ルフィド結合を持つことが予想され、分子内に膜貫通領
域を持つ膜蛋白質であることが示された。このα鎖遺伝
子をＣＯＳ７細胞を用いて一過性に発現させるために
は、γ鎖の同時発現のみで十分であった。

【０００５】この分子内の膜貫通領域を除去した形で発
現できるようにしたｃＤＮＡをＣＨＯ細胞を用いて安定
的に発現させたところ、約４０〜５０キロダルトンのも
のが細胞外に分泌産生された。この可溶化されたα鎖は
ＩｇＥとの高い親和性の結合活性を持っており、Ｎグリ
カナーゼによって糖鎖を除去したものも同様のＩｇＥに
対する高い親和性を示した〔Blank, U., Ra, C., and K
inet, J.-P.(1991)J.Biol.Chem. 266, p2639-2646 〕。
しかしながらＣＨＯ形質転換体で産生された可溶性Ｆｃ
εＲＩα鎖の産生量は約１００μｇ／ｌ程度であり、実
用性に乏しいことから、さらに大量に産生可能な系の構
築が望まれている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、可溶
性ヒトＦｃεＲＩα鎖を効率よく多量に製造することが
できる方法を提供するものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
め、本発明は、可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖をコードする
遺伝子がバキュロウィルスプロモーターの制御下に連結
されているバキュロウィルス発現ベクターを提供する。
本発明はさらに、前記バキュロウィルス発現ベクターを
組み込んだ組み換えバキュロウィルスを提供する。本発
明はさらに、前記の組み換えバキュロウィルスを昆虫細
胞に感染させ、感染細胞を培養し、その培養物から可溶
性ヒトＦｃεＲＩα鎖を採取することを特徴とする可溶
性ＦｃεＲＩα鎖の製造方法を提供する。

【０００８】

【具体的な説明】組換えバキュロウィルスを発現ベクタ
ーとして用いた発現系はSmith らにより開発された系で
あるが（Smith et al., Mol.Cell.Biol., 3:2156-2165,
1983 、特開昭６０−３７９８８）、バキュロウィルス
を利用し昆虫細胞を宿主として外来蛋白質を産生させる
系では、哺乳類細胞などと同様に蛋白合成され、高次構
造形成され、糖鎖修飾が起こることから、ヒト由来の糖
鎖修飾される分泌蛋白質を、活性をもった形で分泌産生
させることが期待できる。

【０００９】しかしながら組換えバキュロウィルスを発
現ベクターとして用いた発現系では、糖鎖修飾の様式が
厳密な意味において哺乳類細胞を宿主として用いた場合
と異なっており、糖鎖修飾が発現させようとする蛋白質
の活性、生体内安定性に関与している場合には、糖鎖修
飾が異なるために活性を持たなくなることが懸念され
る。つまり天然体ならば、糖鎖修飾されるような蛋白質
を組換えバキュロウィルスを発現ベクターとして用いた
発現系で発現させた場合に、その組換え産物が活性を持
つか否かを予測することは困難である。

【００１０】可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖の場合には糖鎖
修飾されなくても、そのＩｇＥとの結合活性は変化しな
いものの、異なった糖鎖修飾された場合にはＩｇＥとの
結合活性を失ってしまうことが懸念される。可溶性ヒト
ＦｃεＲＩα鎖を組換えバキュロウィルスを発現ベクタ
ーとして用いた発現系で発現させるためには、バキュロ
ウィルス染色体に該遺伝子を適当なプロモーターの制御
下に置いた形で導入することが必要である。

【００１１】ここで可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖遺伝子と
しては、本発明においては、公表されているヒトＦｃε
ＲＩα鎖遺伝子のアミノ酸配列のうち、分泌シグナル配
列、及び１−１７２アミノ酸をコードし、下流に翻訳終
止コドンを導入したものを具体例として用いているが、
他の１例としては、公表されているヒトＦｃεＲＩα鎖
遺伝子のアミノ酸配列１９０−２１０に存在すると考え
られている膜貫通配列を取り除いたものであり、かつ１
５１残基目に存在するシステイン残基をコードする領域
までを含むものを用いることもできる。

【００１２】またこれらの遺伝子断片は、ヒト肥満細胞
もしくはヒト肥満細胞株例えばＫＵ８１２株から調製し
たｐｏｌｙＡ−ＲＮＡを鋳型とし、通常の方法によって
合成したｃＤＮＡを、適当なベクターに導入し、標識し
た核酸を用いてスクリーニングして得られるものを用い
てもよく、ここからpolymerase chain reaction(PCR)法
により、目的とする断片のみを取り出す、目的とする断
片の前後にｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異法によって制限酵
素部位を導入し、その制限酵素で切断する方法によって
も取り出すことが出来る。またｃＤＮＡが持つ制限酵素
部位を利用するなどの方法も考えることが出来る。

【００１３】さらに、合成したｃＤＮＡを適当なプライ
マーを用いて直接ＰＣＲ法にかけることにより、目的と
する遺伝子断片を増幅させることによっても得ることが
可能である。増幅させた断片は適当なベクターに組み込
むことにより、安定的に供給されうることは自明であ
る。

【００１４】１−１７２アミノ酸をコードし、下流に翻
訳終止コドンを導入した可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖遺伝
子断片は、多核体遺伝子プロモーターを持つ適当なベク
ター、例えばｐＡｃＹＭ１、のプロモーターの下流に挿
入し、得られたベクターをバキュロウィルスが感染可能
な昆虫細胞、例えば夜盗蛾由来の培養細胞、例えばＳｆ
−９、に野生型バキュロウィルスＤＮＡとともに感染さ
せる。

【００１５】ここで上記感染は、燐酸カルシウム沈殿
法、電気穿盤遺伝子導入法、デキストラン法などの一般
に培養細胞で用いられている導入法により、培養細胞に
ＤＮＡを導入する方法により行なわれる。

【００１６】感染後、適当な培地、例えば血清を含むＧ
ｒａｃｅ培地において感染細胞を４８から７２時間培養
することにより、培養上清中に可溶性ヒトＦｃεＲＩα
鎖遺伝子断片が導入された染色体を持つ組換えバキュロ
ウィルスを回収することができる。組換えバキュロウィ
ルスは培養上清から、例えばプラークアッセイ法、プラ
ークハイブリダイーゼーション法を用いることにより単
離することができる。

【００１７】単離したバキュロウィルスは、適当なＭＯ
Ｉで感染する細胞、例えばＳｆ−９に感染させ、培養を
行なうことにより、増殖させることが可能である。ここ
で感染とは組換えバキュロウィルスをＳｆ−９等の細胞
と１時間程度接触させることにより成立する。可溶性ヒ
トＦｃεＲＩα鎖は、単離、増殖させた組換えバキュロ
ウィルスを、ＭＯＩ＝５〜１０で例えばＳｆ−９に感染
させ、２７℃に於て７２時間培養することにより、感染
した細胞から培養上清中に分泌発現し、培養上清は細胞
を遠心等により分離することにより得ることができる。

【００１８】得られた培養上清から、可溶性ヒトＦｃε
ＲＩα鎖は硫安沈殿法などにより濃縮可能であり、得ら
れた沈殿物を例えばゲル濾過等のカラムクロマトグラフ
ィーにかけることにより、感染により生じる組換えバキ
ュロウィルスや、培地に含まれる例えば血清アルブミン
などと分離することが可能である。

【００１９】このようなカラムクロマトグラフィーによ
り分離したヒト可溶性ＦｃεＲＩα鎖は、さらに他のカ
ラムクロマトグラフィーにかけることにより分離精製す
ることが可能である。この際抗可溶性ヒトＦｃεＲＩα
鎖モノクローナル抗体を結合させた樹脂を用いたアフィ
ニティーカラムクロマトグラフィーにかけることにより
単一の分子種にまで精製することが可能である。また同
様にＩｇＥを結合させた樹脂を用いたアフィニティーカ
ラムクロマトグラフィーにかけることにより単一の分子
種にまで精製することが可能である。

【００２０】この際に他のアフィニティーカラムクロマ
トグラフィー、例えばレンチルレクチンカラムクロマト
グラフィーにかけることにより、効率良く精製すること
が可能である。上記記載の方法により作成された可溶性
ヒトＦｃεＲＩα鎖遺伝子を導入した組換えバキュロウ
ィルス、ＡｃＮＴＶをＳｆ−９細胞に感染させ、感染さ
せた培養上清４００mlから２mgの可溶性ヒトＦｃεＲＩ
α鎖を回収することができ、この発現量は報告されてい
るＣＨＯのものと比較すると約５０倍量であり、このこ
とから本発明の効果は明らかである。

【００２１】このような方法で発現、精製したヒト可溶
性ＦｃεＲＩα鎖の、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動から推定される分子量は３５kDであり、ＣＨＯな
どの哺乳類培養細胞で産生されたものと比較すると小さ
く、過剰な糖鎖付加が起こっていないことは明白であ
る。また産生されたヒト可溶性ＦｃεＲＩα鎖とＩｇＥ
との結合活性は、ＣＨＯで産生されたものと変わらぬこ
とが、ＣＨＯで産生されたヒト可溶性ＦｃεＲＩα鎖と
のＩｇＥ結合競合活性により明らかとなり、組換えバキ
ュロウィルスで産生されたヒト可溶性ＦｃεＲＩα鎖
は、そのＩｇＥとの特異的な結合活性を利用した、各種
の診断、治療に利用することができる。

【００２２】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。実施例１．可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖遺伝子断片を持つ
プラスミドの調製 ヒトＦｃεＲＩα鎖遺伝子断片を持つプラスミドＢＳ−
ＳＫ（＋）ｈｅｒαから、ＤＮＡ合成機（8700DNA Synt
hesizer, MilliGen ／Biosearch)を用いて合成したプラ
イマーＤＮＡを用い、ＰＣＲ反応により目的とする可溶
性ヒトＦｃεＲＩα鎖遺伝子断片を調製した。プライマ
ーとしてはＮＴＶプライマーとＰＡＳプライマーを作製
した。それぞれの配列は以下に示すものである。

【００２３】ＮＴＶプライマー；５′−AAAAACTCGAGATG
GCTCCTGCCATGGAATCCCCTACT（配列番号：１） ＰＡＳプライマー；５′−AAAAAGGATCCTTAAGCTTTTATTAC
AGTAATGTTGA(配列番号：２） ＰＣＲ反応は次に示す条件で行なった。１００μｌの反
応液〔１ngプラスミドＢＳ−ＳＫ（＋）ｈｅｒαＤＮ
Ａ、１μＭＮＴＶプライマー、１μＭＰＡＳプライマ
ー、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM
ＫＣｌ、１．５mMＭｇＣｌ₂ 、０．００１％ ｇｅｌａ
ｔｉｎ、２００μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＣＴ
Ｐ、２００μＭ ｄＧＴＰ、２００μＭ ｄＴＴＰ、
２．５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ（宝酒造）〕を調製し、ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ（Perkin Elmer Cetus社）を用いて、９４
℃にて１分間、５０℃にて２分間、７２℃にて３分間の
反応を３０サイクル行なわせた。

【００２４】反応液の一部２０μｌを０．８％アガロー
スにアプライし電気泳動を行なった。分離した約０．６
kbのＤＮＡ断片をアガロースからＧｅｎｅＣｌｅａｎキ
ット（BIO101社）を用いて１６μｌのＴＥ溶液〔１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１mM ＥＤＴＡ〕中
に回収した。そこに１０Ｘの反応緩衝液〔１００mMＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、７０
mM ＭｇＣｌ₂ 〕を２μｌ加え、ＢａｍＨＩ，ＸｈｏＩ
をそれぞれ１μｌ加え３７℃において１時間反応させ
た。

【００２５】反応液を６５℃、１０分間処理することに
より酵素を熱失活させた後、その一部５μｌをＢａｍＨ
ＩおよびＸｈｏＩで切断したクローニングベクターｐＴ
３Ｔ７Ｕ１９Ｘ（特願平３−１０６６００号）１０ngと
ともにＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社）Ａ液３
０μｌおよびＢ液６μｌと混合し、１６℃、１時間反応
させ両ＤＮＡを連結させた。得られたＤＮＡ溶液１０μ
ｌを用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Stratagene社）を
Ｈａｎａｈａｎの方法〔DNA cloning:A practical appr
oach (ed.D.M.Glover), vol.1, p109-, IRC press (188
5)〕に従って形質転換させ、Ｘ−Ｇａｌを含むＬ−ａｍ
ｐプレートに蒔き、白色のコロニーを選択することによ
りアンピシリン耐性で、βガラクトシダーゼ欠損のコロ
ニーを選択した。

【００２６】選択したコロニーをＬ−ａｍｐ培地で培養
し、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３を感染させることに
より組換え体ファージを調製した。調製した組換え体か
ら一本鎖ＤＮＡを調製し、調製したＤＮＡ約０．８μｇ
をDNA Sequencing System/Taq polymerase（アプライド
バイオシステム社）を用い、メーカーの推奨する条件に
従い反応させ、反応産物をDNA sequencer Model 370A
(version 1.30、アプライドバイオシステム社）を用い
て分析し塩基配列を決定した。

【００２７】またアルカリ溶菌法により調製した組換え
体プラスミドＤＮＡ約１μｇをＭ１３ＲＰ１プライマー
（アプライドバイオシステム社）を用い、Ｃｙｃｌｉｎ
ｇｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（アプライドバイオシステム
社テクニカルマニュアル）によりメーカーの推奨する方
法に従い反応させ、反応産物をDNA sequencer Model 37
0A (version 1.30、アプライドバイオシステム社）を用
いて分析し塩基配列を決定した。

【００２８】両者の方法により決定した配列のうち、構
造遺伝子部分が既に報告されているヒトＦｃεＲＩα鎖
遺伝子のものと異なっておらず、翻訳開始コドンの前に
ＮＴＶプライマーによって導入されたＸｈｏＩサイトが
あり、かつコードされているアミノ酸配列の２５番目の
バリンを第１位とした場合に第１７２位のアラニンをコ
ードするコドンの直後にＰＡＳプライマーによって導入
された翻訳終了コドンＴＡＡとＢａｍＨＩサイトがある
ことが確認された組換え体プラスミドｐＮＴＶ２を得
た。

【００２９】実施例２．ヒト可溶性ＦｃεＲＩα鎖遺伝
子断片の単離 ＫＵ８１２細胞（４×１０⁷ 細胞）からTotal RNA Sepa
rator Kit(Clontech社）を用い、メーカーの推奨する方
法に則り、ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡからmRNA
Separator Kit (Clontech社）を用い、メーカーの推奨
する方法に従いｐｏｌｙＡ ＲＮＡを精製した。４０μ
ｇのｐｏｌｙＡ ＲＮＡを得ることが出来た。このうち
５μｇを用い、Time Saver cDNA 合成キット（ファルマ
シア社）を用い、メーカーの推奨する方法に従い、二本
鎖ｃＤＮＡを合成した。

【００３０】得られたｃＤＮＡ液（１５０μｌ）の内の
一部、１０μｌを用いて、前述のＮＴＶプライマー、Ｐ
ＡＳプライマーを用い、１００μｌの反応液（１μＭ
ＮＴＶプライマー、１μＭ ＰＡＳプライマー、１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM ＫＣｌ、
１．５mM ＭｇＣｌ₂ 、０．００１％ ｇｅｌａｔｉ
ｎ、２００μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＣＴＰ、２
００μＭ ｄＧＴＰ、２００μＭ ｄＴＴＰ、２．５Ｕ
ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
〔宝酒造〕）を調製し、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙ
ｃｌｅｒを用いて、９４℃にて１分間、５０℃にて２分
間、７２℃にて３分間の反応を３０サイクル行なわせ
た。

【００３１】反応液の一部２０μｌを０．８％アガロー
スにアプライし電気泳動を行なった。分離した約０．６
kbのＤＮＡ断片をアガロースからＧｅｎｅＣｌｅａｎキ
ットを用いて１６μｌのＴＥ溶液〔１０mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．５）、１mMＥＤＴＡ〕中に回収した。そ
こに１０Ｘの反応緩衝液〔１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH７．５）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、７０mM ＭｇＣｌ
₂ 〕を２μｌ加え、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩをそれぞれ１
μｌ加え３７℃において１時間反応させた。

【００３２】反応液を６５℃、１０分間処理することに
より酵素を熱失活させた後、その一部５μｌをＸｈｏ
Ｉ、ＢａｍＨＩで切断したクローニングベクターｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ（＋）、１０ngとともにＤＮＡ
ライゲーションキット、Ａ液３０μｌ、Ｂ液６μｌと混
合し、１６℃、１時間反応させ両ＤＮＡを連結させた。
得られたＤＮＡ溶液１０μｌを用いて大腸菌ＸＬｌ−ｂ
ｌｕｅをＨａｎａｈａｎの方法に従って形質転換させ、
Ｘ−Ｇａｌを含むＬ−ａｍｐプレートに蒔き、白色のコ
ロニーを選択することによりアンピシリン耐性で、βガ
ラクトシダーゼ欠損のコロニーを選択した。

【００３３】コロニーから調製したプラスミドＤＮＡ
１．５μｇをDye primer cycling sequencing kit(アプ
ライドバイオシステム社）を用い、Ｍ１３ＲＰ１または
−２１Ｍ１３プライマーをもちいて、メーカーの推奨す
る条件に従い反応させ、反応産物をＤＮＡ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３７３Ａを用いて分析し挿入断
片の塩基配列を決定した。挿入された断片は報告の配列
と同じ配列を持ち、翻訳開始コドンＡＴＧの直前にＸｈ
ｏＩサイトがあり、第２４位のバリンを第１位とした場
合に１７２位に存在するアラニンのコドンの直下に翻訳
停止コドンとＢａｍＨＩサイトが挿入されていることが
確認された。このようにして得られたプラスミドは、実
施例２においてｐＮＴＶ２の代わりに用いることが出来
ることは明らかである。

【００３４】実施例３．可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖の発
現プラスミドの作製 可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖遺伝子を持つプラスミドｐＮ
ＴＶ２ １μｇを１０μｌの反応液中〔１０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１００mM ＮａＣｌ、７mM
ＭｇＣｌ₂ 、１２Ｕ ＸｈｏＩ、１０Ｕ ＢａｍＨＩ〕
で３７℃において１時間反応させた。反応終了後フェノ
ール／クロロホルムによりＤＮＡを抽出した後、エタノ
ール沈殿法により回収した。このＤＮＡ断片をＤＮＡプ
ランティングキット〔宝酒造〕を用いて、メーカーの推
奨する方法により平滑末端化した。反応液を０．８％ア
ガロース電気泳動にかけ、分離した約１０kbの断片をア
ガロース小片からＧｅｎｅＣｌｅａｎキットを用いて１
０μｌのＴＥ液中に回収した。

【００３５】一方バキュロウィルス発現ベクターである
ｐＡｃＹＭ１（Matsuura，Y.ら、J.Gen.Virol. 68, p12
33) １μｇを１０μｌの反応液中〔１０mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．５）、１５０mM ＮａＣｌ、７mM Ｍｇ
Ｃｌ₂ 、１０Ｕ ＢａｍＨＩ〕で３７℃において１時間
反応させた。反応液を０．８％アガロース電気泳動にか
け、分離した約１０kbの断片をアガロース小片からＧｅ
ｎｅＣｌｅａｎキットを用いて１０μｌのＴＥ液中に回
収した。この回収した断片を含む溶液２μｌと、ｐＮＴ
Ｖ２から回収した断片を含む溶液３μｌとをそれぞれＤ
ＮＡライゲーションキットＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌと
混合し、１６℃、１時間反応させ両ＤＮＡを連結させ
た。

【００３６】得られたＤＮＡ溶液１０μｌを用いてそれ
ぞれ大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅをＨａｎａｈａｎの方法に
従って形質転換させ、Ｌ−ａｍｐプレートに蒔き、アン
ピシリン耐性のコロニーを選択した。コロニーのプラス
ミドＤＮＡの制限酵素部位を調べそれぞれの断片が連結
されたプラスミドを持つ形質転換体を選別することによ
りバキュロウィルス発現ベクターであるｐＡｃＹＭ１−
ＮＴＶを得た。

【００３７】実施例４．可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖発現
組換えウィルスの単離 夜盜蛾腸培養細胞であるＳｆ−９細胞株にバキュロウィ
ルス発現ベクターであるｐＡｃＹＭ１−ＮＴＶ、１０μ
ｇと天然型バキュロウィルスＤＮＡ１μｇを燐酸カルシ
ウム沈殿法により感染させた。感染の方法は松浦（実験
医学８刊、ｐ２８１−２８４，１９９０）の方法に従っ
た。感染後プラークアッセイ法によりポリヘドリンを合
成していないプラークを選択した。このプラークアッセ
イを３回行なうことにより組換えウィルスを単離した。

【００３８】単離したウィルスをＭＯＩ（multiplicity
of infection)＝１でＳｆ−９細胞に感染させ、１０％
ＦＣＳを含むＧｒａｃｅ培地(Gibco社）中で７２時間培
養し、培養上清の一部をウェスターンプロッティング法
により分析することにより、可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖
発現組換えウィルスであるＡｃ−ＮＴＶを単離した。

【００３９】単離したウィルスをＭＯＩ（multiplicity
of infection)＝１でＳｆ−９細胞に感染させ、１０％
ＦＣＳを含むＧｒａｃｅ培地(Gibco社）中で７２時間培
養し培養上清を回収することにより、約１×１０⁸ pfu
／mlの組換えウィルスを回収した。

【００４０】実施例５．発現及び発現産物の精製 組み換えウィルスをＭＯＩ（multiplicity of infectio
n)＝５でＳｆ−９細胞（４×１０⁸ 細胞）に感染させ、
１０％ＦＣＳを含むＧｒａｃｅ培地(Gibco社）中４００
mlで７２時間培養し培養上清を回収した。回収した上清
中に硫安を飽和濃度６０％となるように加えた後、４℃
で２時間保温した。１００００rpm で３０分間遠心し、
沈殿物を回収した。

【００４１】回収した沈殿物をＴＢＳ（２０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ〔pH７．５〕、１５０mMＮａＣｌ）に溶解さ
せた後、同溶液に対して４℃、１夜透析した。透析後液
を回収し、ＴＢＳで平衡化したセファクリルＳ２００カ
ラム（２．６cm×６０cm）にかけＴＢＳにて分離した。
分子量３万から４万付近に相当する分画を集めた。

【００４２】抗ＦｃεＲＩαモノクローナル抗体カラム
の作製を以下のように行なった。ＢｒＣＮ−ａｃｔｉｖ
ａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ファルマシア社
製）を１mM塩酸中で室温で１５分間膨潤させた。１mM塩
酸を用いてグラスフィルター上で膨潤ゲルの洗浄と膨潤
を繰り返した後、カップリング緩衝液（０．５Ｍ塩化ナ
トリウム、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム pH８．３）で洗
浄した。

【００４３】直ちにこのゲル２mlを、カップリング緩衝
液に溶解した精製抗ＦｃεＲＩαモノクローナル抗体溶
液２ml（５mg／ml）に加え、室温で２時間穏やかに攪拌
した。上清を除き、０．２Ｍグリシン塩酸、pH８．０に
ゲルを懸濁し、室温で２時間穏やかに攪拌した。次にこ
れをカップリング緩衝液と０．５Ｍ塩化ナトリウムを含
む０．１Ｍ酢酸緩衝液 pH４．０で繰り返し洗浄し、抗
ＦｃεＲＩαモノクローナル抗体カラムを得た。

【００４４】ゲル濾過により得られた画分の抗ＦｃεＲ
Ｉαモノクローナル抗体カラムによる精製を以下のよう
に行なった。０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０mMトリ
ス塩酸緩衝液 pH７．６で平衡化した抗ＦｃεＲＩαモ
ノクローナル抗体カラムに、培養上清をゲル濾過して得
られたＦｃεＲＩαを含む画分をかけ、平衡化に用いた
緩衝液にてカラムを充分に洗浄した。次に、３Ｍチオシ
アン酸ナトリウムと０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０
mMトリス塩酸緩衝液 pH７．６でカラムからの溶出を行
ない、溶出された画分を０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む
２０mMトリス塩酸緩衝液 pH７．６に対して直ちに透析
し、可溶性ＦｃεＲＩα断片精製標品を得た。

【００４５】実施例６．精製標品の純度検定 精製標品の純度検定をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法を用いて以下のように行なった。精製標品を
濃縮し、試料用緩衝液（２％ドデシル硫酸ナトリウム、
５％２−メルカプトエタノール、７％グリセロール、
０．００５％ブロムフェノールブルーを含む６２．５mM
トリス塩酸緩衝液 pH６．８）に懸濁し、１００℃で５
分間煮沸した。

【００４６】この試料を分離ゲル濃度が１０−２０％の
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用濃度勾配平
板ゲル（第一化学薬品株式会社製）を用いて電気泳動
し、銀染色キット（第一化学薬品株式会社製）でゲルを
染色して蛋白質の検出を行なった。その結果、分子量３
０ｋ〜３５ｋ付近に広がった単一のバンドが検出された
（図２）。

【００４７】実施例７．ＩｇＥとの結合活性の測定 ９６穴プレート（Nunc Immuno Module Maxisorp F16)に
１００μｌ／wellの割合でｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅ
ｒ（０．３mg／ｌ ＣＨＯ細胞由来の可溶性ＦｃεＲＩ
α鎖、１. ５９ｇ／ｌ Ｎａ₂ ＣＯ₃ 、２．９３ｇ／ｌ
ＮａＨＣＯ₃、pH９．３５）を加え、４℃で一昼夜保
温した。その後、ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを捨
て、２００μｌ／wellの割合でＴＴＢＳ溶液〔２０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）、９ｇ／ｌ ＮａＣｌ、
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０〕を加えることにより、各
ｗｅｌｌを洗浄した。この洗浄操作をもう一度繰り返し
た。

【００４８】洗浄後、２００μｌ／wellの割合でブロッ
キング溶液〔２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）、
９ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ〕を加え、４℃で一
昼夜保温し、ブロッキングを行なった。ブロッキング溶
液を捨て、先に述べたＴＴＢＳ溶液による洗浄操作を３
度繰り返した。次に、あらかじめ用意しておいた活性測
定用の一連のサンプル希釈液を、８０μｌ／wellの割合
で加え、速やかに２０μｌのＩｇＥ溶液〔１０ng／２０
μｌ ヒトＩｇＥ（ヤマサ醤油）、２０mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．４）、９ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０、０．２％ ＢＳＡ〕を加え、軽く攪
拌した。

【００４９】室温で２時間保温した後、先に述べたＴＴ
ＢＳ溶液による洗浄操作を３度繰り返した。次に、ＴＴ
ＢＳ−０．２％ ＢＳＡ溶液を用いて１０００倍に希釈
したPeroxidase conjugated IgG Fraction Goat Anti-H
uman IgE（Epsilon Chain Specific：CAPPEL社）を１０
０μｌ／well加え、室温で２時間保温した。

【００５０】ＴＴＢＳ溶液による洗浄操作を４度繰り返
した後、TMB Peroxidase Substrate(KIRKEGAARD & PERR
Y LABOBATORIES社）とPeroxidase Solution B(KIRKEGAA
RD &PERRYLABOBATORIES社）を等量混合したものを、１
００μｌ／well加えて室温で１０分間保温し、１０％ｗ
／ｖのＨ₂ ＳＯ₄ を２５μｌ／well加えて、反応を停止
した。その後、Ａ４５０を測定することにより、精製し
た可溶性ＦｃεＲＩα鎖の測定を行なった。

【００５１】これにより、活性のある可溶性ヒトＦｃε
ＲＩα鎖がサンプル中に存在する場合、ヒトＩｇＥと結
合することにより、ＥＬＩＳＡプレートにコートされた
ＣＨＯ細胞由来の可溶性ＦｃεＲＩα鎖と結合するヒト
ＩｇＥが減少するためにＡ４５０の測定値が陽性コント
ロールに比べて低下する。この系に、スタンダードとし
て、ＣＨＯ細胞由来の可溶性ＦｃεＲＩα鎖をＴＴＢＳ
−０．２％ ＢＳＡ溶液にて希釈した液をサンプル希釈
液の代わりに用いることにより、サンプル中の可溶性ヒ
トＦｃεＲＩα鎖の定量を行なうことができる。

【００５２】この方法により、４００mlから精製した可
溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖は、２mgのＣＨＯ産生の可溶性
ヒトＦｃεＲＩα鎖に相当するＩｇＥ結合活性を持つこ
とが明かとなった。

【００５３】

【発明の効果】上記のごとく、本発明によれば可溶性Ｉ
ｇＥ結合受容体α鎖を昆虫細胞において効率よく発現・
分泌させることができる。

【００５４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAAACTCGA GATGGCTCCT GCCATGGAAT CCCCTACT 38

【００５５】配列番号：２ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAAAGGATC CTTAAGCTTT TATTACAGTA ATGTTGA 37

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明の発現生成物である可溶性Ｆｃε
ＲＩα鎖を示す電気泳動図であり、図面に代る写真であ
る。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 柳田 光昭 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 谷田 以誠 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 長谷川 明 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 羅 智靖 東京都文京区本郷２−１−１ 順天堂大学 医学部免疫学教室内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 可溶性ヒトＩｇＥ結合受容体α鎖（可溶
   性ＦｃεＲＩα鎖）をコードする遺伝子がバキュロウィ
   ルスプロモーターの制御下に連結されているバキュロウ
   ィルス発現ベクター。
2. 【請求項２】 前記可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖が完全な
   ＦｃεＲＩα鎖の１位のアミノ酸Ｖａｌから１７２位の
   アミノ酸Ａｌａまでのアミノ酸配列から成るものであ
   る、請求項１に記載の発現ベクター。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載の発現ベクターを
   組み込んだ組換えバキュロウィルス。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の組み換えバキュロウィ
   ルスを昆虫細胞に感染させた後、感染細胞を培養し、そ
   の培養物から可溶性ＦｃεＲＩα鎖を採取することを特
   徴とする可溶性ＦｃεＲＩα鎖の製造方法。